丙烯酸酯化的透明质酸

摘要

本发明涉及具有以下结构的丙烯酸酯化透明质酸产物及其生产方法：

权利要求

1.用于制备丙烯酸酯化透明质酸产物的方法，包括以下步骤：a)制备包含透明质酸的水成液，其中将pH保持在pH 7-11；

b)制备包含丙烯酰氯和有机溶剂的有机液；和c)混合(b)的有机液和(a)的水成液，其中将pH保持在pH 7-11。

2.权利要求1的方法，其中所述步骤c)中的混合通过搅拌完成。

3.权利要求1的方法，其中所述步骤a)的水成液包含磷酸盐缓冲液。

4.权利要求1的方法，其中通过使用缓冲液和/或逐滴添加稀NaOH将步骤c)保持在pH 7-11。

5.权利要求1的方法，其中在步骤a)期间将温度保持在0℃-15℃。

6.权利要求1的方法，其中在步骤c)期间将温度保持在0℃-5℃。

7.权利要求1的方法，其中通过逐滴添加NaOH来调节步骤a)的水成液的pH。

8.权利要求1的方法，其中通过缓冲液和/或逐滴添加NaOH来调节步骤a)的水成液的pH。

9.权利要求1的方法，进一步包括回收步骤。

10.权利要求9的方法，其中所述回收步骤包括沉淀步骤。

11.权利要求9的方法，其中所述回收步骤进一步包括对反应混合物的过滤步骤和对滤出液的沉淀。

说明书

丙烯酸酯化的透明质酸

发明领域

[0001] 本发明涉及用于产生丙烯酸酯化的透明质酸(acrylated hyaluronic acid(HA))的方法、该方法的产物和这些产物的用途。

[0002] 发明背景

[0003] 透明质酸(HA)是天然的线性糖类聚合物，其属于非硫酸化的(non-sulfated)糖胺聚糖类。它由β-1，3-N-乙酰葡糖胺和β-1，4-葡糖醛酸的重复二糖单元组成，具有多至6MDa的分子量(MW)。HA存在于透明软骨、滑膜关节液(synovialjoint fluid)和真皮和表皮皮肤组织中。可以从天然组织包括脊椎动物的结缔组织，从人脐带和从鸡冠(cocks’comb)中提取HA。然而，现今优选的是通过微生物方法制备透明质酸以使转移传染剂的潜在风险最小化，并且增加产物均匀性、品质和可用性(美国专利No.6,951,743；WO03/0175902)。

[0004] 已经鉴定了HA在体内的多种功能。它在生物体中作为对许多组织(例如皮肤、腱、肌肉和软骨)细胞的机械支持而发挥重要作用。HA参与了关键的生物学过程，例如组织的湿润，和润滑。还猜想它在许多生理功能中具有作用，例如粘附、发育、细胞运动性、癌、血管发生和愈伤。由于HA独特的物理和生物学性质(包括粘弹性、生物相容性、生物可降解性)，将HA广泛应用在化妆品、眼科学、风湿病学、药物和基因递送、愈伤以及组织工程中现有的和正在发展的应用中。在这些应用中的一些中HA的使用受到下述事实的限制，即在室温也就是大约20℃HA溶于水，在体内其被透明质酸酶迅速降解，和难以将其加工成生物材料。因此引入了HA的交联，从而改进HA的物理和机械性质及其体内滞留时间。

[0005] 可以将丙烯酸酯化的HA用于进行酶介导的交联和产生水凝胶形式的材料。交联的HA可以用在化妆品、生物医学和药物应用中。通过交联HA，可以设计用于特定应用的具有特定性质的化合物。丙烯酸酯化的HA提供官能化的反应性基团，其能够通过迈克尔型加成进一步修饰来引入用于不同应用的生物活性肽。

[0006] 通过合成缩水甘油基甲基丙烯酸酯-HA(glycidyl methacrylate-HA)(GMHA)缀合物(conjugate)来引入HA上的丙烯酸酯基团。GMHA衍生物可用于制备HA仿生水凝胶，以促进组织修复和愈伤。也已经发现缀合的甲基丙烯酸酯基团的量的增加与交联密度的增加和降解速率的下降一致，并且对人主动脉上皮细胞的细胞相容性(cytocompatability)和增殖的作用不显著。已经通过如下方法制备了GMHA衍生物：在过量三甲胺和溴化四丁铵存在下，于室温，用6倍、10倍和20倍摩尔(molar)过量的缩水甘油基甲基丙烯酸酯6
过夜处理发酵衍生的HA(～2X10 分子量)在蒸馏水中的1％w/v溶液，继而在60℃温育1小时。例如，通过将1.0g HA溶解(dissolution)在100ml蒸馏水中来制备具有六倍摩尔过量GM的GMHA。向所述溶液添加2.2ml三乙胺、2.2ml缩水甘油基甲基丙烯酸酯和2.2g溴化四丁铵，并且搅拌过夜，继而在60℃温育一小时。通过这种方法获得了5％的甲基丙烯酸酯化(methacrylation)。使用10倍和20倍摩尔过量获得了7和11％的丙烯酸酯化(acrylation)(Leach and Schmidt，2005，Biomaterials26，125-135；Yonese et al.，2002，Chem.Pharm.Bull.50，1341-1348；Schmidt et al.，2003，Biotechnology andBioengineering 82(5)，578-589)。

[0007] 也已通过将HA溶解在pH11.0的碳酸盐缓冲液中制备了GMHA缀合物。将缩水甘油基甲基丙烯酸酯添加至上述溶液，并将混合物在室温搅拌7天。用HCl将所得溶液的pH调至7.0。将其过滤并冷冻干燥(Yonese，2001，Journalof Controlled Release 73，173-181)。将GMHA缀合物进一步与丙烯酸羟乙基酯交联以制备水凝胶。

[0008] 还已经通过下述方法引入了HA上的丙烯酸酯基团，即通过对HA上存在的羧基进行修饰来合成N-3-氨基丙基甲基丙烯酰胺-HA缀合物。随后将天然和酶法降解的HA用于化学修饰。使用N-(3-氨丙基)甲基丙烯酸酰胺作为丙烯酸酯化剂对两种HA进行了修饰。在作为偶联剂的N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide)(EDCI)的存在下，氨基丙基与HA的羧基反应，导致形成在另一端带有丙烯基侧基的酰胺键。在典型的反应中将HA溶于蒸馏水。向溶液中加入EDCI然后是N-3-氨基丙基甲基丙烯酸酰胺。将反应混合物在pH6.5温育两小时，然后是随后添加EDCI和N-3-氨基丙基甲基丙烯酸酰胺，再进一步在室温温育2小时。将溶液过滤，相对于NaCl然后是水进行透析，并最终冻干以产生甲基丙烯酸酯化的HA。达到的丙烯酸酯化的程度大约是10％(Tirelli et al.，2003，Biomaterials，24，893-900；Kim and Park2002，Journal of Controlled Release，80，69-77)。

[0009] 已经通过向用NaOH调节为pH8的1％HA在去离子水中的溶液添加甲基丙烯酸酐(～20倍)，并且在冰上反应24小时而合成了甲基丙烯酸酯化的透明质酸(HAMA)。将修饰的多糖沉淀并且用乙醇洗涤以去除甲基丙烯酸酐。在所述方法中可以实现多至17％的甲基丙烯酸酯化。实现的低％甲基丙烯酸酯化(17％)是因为甲基丙烯酸酐与HA羟基的低反应性(Smeds and Grinstaff2001，Journal of Biomedical Materials Research，54，115-121；Langer et al.，2005，Biomacromolecules，6，386-391)。

[0010] 用于丙烯酸酯化HA的已知方法是费时并且复杂的，本领域中需要更简单的用于丙烯酸酯化HA的方法。本发明的目的是提供用于丙烯酸酯化透明质酸的简单方法。

[0011] 发明概述

[0012] 本发明涉及产生丙烯酸酯化的透明质酸的方法，所述方法包括步骤：

[0013] (a)制备包含透明质酸的pH7-11的水成液(aqueous liquid)；

[0014] (b)制备包含丙烯酰氯(acryl chloride)和二氯甲烷/乙醚的有机液(organicliquid)；和

[0015] (c)将(b)的有机液与(a)的水成液混合，其中将pH保持在7-11。

[0016] 本发明还涉及具有以下结构的丙烯酸酯化的透明质酸产物：

[0017]

[0018] 本发明的方法非常快速，因为使用的丙烯酸酯化试剂的反应性非常高，由此降低了常规反应时间。使用本发明的方法实现的％丙烯酸酯化要高得多。与使用复杂方法的迄今为止报导的17％相比，使用所述简单快速的方法能够在短得多的反应时间(1-2小时)内达到>90％的丙烯酸酯化。这是不使用任何偶联剂时达到的最高％丙烯酸酯化。另外，相较于已经报导的规程，在本发明的方法中获得的副产物少得多，并且能够容易地去除。

[0019] 发明详述

[0020] 本发明涉及产生丙烯酸酯化的透明质酸的方法，包括以下步骤：a)制备包含透明质酸的水成液，其中将pH保持在7-11；b)制备包含丙烯酰氯(acryloylchloride)和有机溶剂的有机液；和c)混合(b)的有机液和(a)的水成液，其中将pH保持在7-11。

[0021] 在本发明的方法中，能够将HA可控地丙烯酸酯化和交联以形成高度水合并且可降解的水凝胶，所述水凝胶具有多种特性，用于在愈伤、组织工程支架和多种其它生物医学应用中的不同用途。

[0022] HA钠盐的结构式如下所示：

[0023]

[0024] “透明质酸”在本文定义为非硫酸化的糖胺聚糖，其由通过交替的β-1，4和β-1，3糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重复二糖单元组成，其天然存在于细胞表面、脊椎动物结缔组织的胞外基质(basicextracellular substance)中、关节的滑液中、眼球内液(endobulbar fluid of the eye)中、人脐带组织中和公鸡冠中。透明质酸也称为乙酰透明质酸(hyaluronan)、透明质酸盐(hyaluronate)或HA。术语乙酰透明质酸和透明质酸在本文可互换使用。

[0025] 本文中可理解的是，术语“透明质酸”包含具有不同分子量的N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸的一组多糖，或者甚至所述多糖的降解的部分。

[0026] 本发明描述了避免使用相转移催化剂和偶联剂的用于丙烯酸酯化HA的简单方法。本发明解决的问题是如何以简单快速的方法制备丙烯酸酯化的透明质酸中间物，用于制造基于交联HA的水凝胶。

[0027] 本发明使用的HA可以是任何可用的HA，包括源自天然组织的HA，所述天然组织包括脊椎动物的结缔组织、人脐带和公鸡冠。在具体的实施方式中，透明质酸或它们的盐是重组产生的，优选通过革兰氏阳性细菌或宿主细胞，更优选通过芽孢杆菌属(genus Bacillus)的细菌来重组产生。在另一个实施方式中，HA从链球菌属(Streptococcus)细胞获得。

[0028] 宿主细胞可以是适合用于重组产生透明质酸的任何芽孢杆菌属细胞。芽孢杆菌属宿主细胞可以是野生型芽孢杆菌属细胞或其变体。在本发明的实践中有用的芽孢杆菌属细胞包括，但不限于Bacillus agaraderhens、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。尤其适合用于重组表达的突变枯草芽孢杆菌细胞在WO98/22598中描述。无被囊的(non-encapsulating)芽孢杆菌属细胞尤其适用于本发明。

[0029] 在优选的实施方式中，芽孢杆菌属宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的实施方式中，芽孢杆菌属细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的实施方式中，芽孢杆菌属细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的实施方式中，芽孢杆菌属细胞是迟缓芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的实施方式中，芽孢杆菌属细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的实施方式中，芽孢杆菌属细胞是枯草芽孢杆菌细胞。在最优选的实施方式中，芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌A164Δ5(参见美国专利No.5,891,701)或枯草芽孢杆菌168Δ4。

[0030] 透明质酸的平均分子量可以使用本领域的标准方法来测定，例如由Uenoet al.，1988，Chem.Pharm.Bull.36，4971-4975；Wyatt，1993，Anal.Chim.Acta272，1-40；和Wyatt Technologies，1999，“Light Scattering University DAWNCourse Manual”及“DAWN EOS Manual”Wyatt Technology Corporation，SantaBarbara，California描述的方法。

[0031] 在优选的实施方式中，本发明的透明质酸或它们的盐具有约10,000-约10,000,000Da的分子量。在更优选的实施方式中，其具有约25,000-约5,000,000Da。在最优选的实施方式中，透明质酸具有约50,000-约3,000,000Da的分子量。

[0032] 在本发明的方法中，使用的丙烯酰氯可以是任何可用的丙烯酰氯。

[0033] 丙烯酰氯具有以下结构：

[0034]

[0035] 其中，在具体的实施方式中，R1选自下组：氢、甲基、氯和COCl；R2选自下组：氢、甲基、苯基、氯、2-氯苯基、COCl和CH2COCl；并且R3选自下组：氢、甲基、氯、4-硝基苯基、3-三氟甲基苯基和苯乙烯基部分。

[0036] 丙烯酰 氯，也称 作2-丙烯 酰氯(2-propenoyl chloride)或 氯丙烯 酸(acrylicacid chloride)是澄清的浅黄色可燃液体，具有刺鼻气味。它属于酰基氯类(acidchlorides group)的化合物，因此是丙烯酸的衍生物。这种化合物将产生酰基氯的常规反应：它将与水剧烈反应产生丙烯酸。与醇反应将导致酯的形成，而与胺反应将产生酰胺。丙烯酰氯最常应用在有机合成中，用于将丙烯酸部分引入其它化合物中。其还广泛用于制备丙烯酸酯单体和聚合物。

[0037] 在本发明的具体实施方式中，丙烯酰氯选自下组：丙烯酰氯、甲基丙烯酰氯、丁烯酰氯(crotonyl chloride)、肉桂酰氯、富马酰氯、衣康酰氯、3，3-二甲基丙烯酰氯、三氯丙烯酰氯、2-氯肉桂酰氯、反式-4-硝基肉桂酰氯、反式-3-(三氟甲基)肉桂酰氯、反式-3-(三氟甲基)肉桂酰氯和亚肉桂基丙二酰氯(cinnamylidenemalonyl chloride)。

[0038] 在本发明的方法中，根据下文所示反应将HA与丙烯酰氯反应：

[0039]

[0040] 其中R1选自下组：氢、甲基、氯和COCl；并且R2包含选自下组的结构：氢、甲基、苯基、氯、2-氯苯基、COCl和CH2COCl；并且R3选自下组：氢、甲基、氯、4-硝基苯基、3-三氟甲基苯基和苯乙烯基部分。

[0041] 在本发明的具体实施方式中，以下述方式制备a)的水成液：将HA溶于水，特别是去离子水，以形成包含HA的水成液。向所述包含HA的水成液逐滴添加氢氧化钠。重要的是将HA的羟基去质子化(deprotonate)。将所述水成液在低温放置一段时间以确保羟基转化成氢氧根离子。

[0042] 在本发明的具体实施方式中，在溶解HA之后将水成液的温度降低至大约0℃-5℃并且在反应过程中保持在0℃-15℃。在本发明更具体的实施方式中，在反应过程中将水成液的温度保持在0℃-5℃。

[0043] 在本发明的具体实施方式中，在所述方法的第一个步骤期间将pH保持在7-11。在本发明更具体的实施方式中，将pH保持在8-10。在本发明最具体的实施方式中，将pH保持在8.5-9.5。通过缓冲液和/或通过添加稀氢氧化钠来保持pH。

[0044] 通过混合丙烯酰氯和低沸点不混合溶剂(low-boiling immiscible solvent)来制备有机液。所述低沸点不混合溶剂可以选自下组：乙醚和二氯甲烷。

[0045] 丙烯酸酯化主要依赖于溶液的pH。在具体的实施方式中，将丙烯酰氯逐滴添加至HA溶液。一些丙烯酸将会形成，由此pH降低，因而有必要添加碱来提高pH。在具体的实施方式中，通过使用缓冲液和/或通过添加NaOH优选1N-5N NaOH将pH保持在7-11。在本发明的具体实施方式中，在反应过程中将pH保持在7.5-10。在本发明的更具体实施方式中，在反应过程中将pH保持在7.5-9.5。在最具体的发明中，将pH保持在8-9。

[0046] 用于本发明的最适pH是8-9.5。在添加丙烯酰氯的过程中保持pH稳定可能是困难的，因为pH改变非常迅速，原因是丙烯酰氯与水相对迅速地反应形成丙烯酸。

[0047] 为了在HA与丙烯酰氯反应的过程中能够将pH保持在8-9.5，发现使用注射泵(syringe pump)来添加丙烯酰氯能够解决问题并且以500-1000μL/小时持续添加丙烯酰氯。通过使用注射泵，添加的丙烯酰氯量较小，因此pH能够被容易地保持。因此在具体实施方案中，使用注射泵来保持pH稳定。

[0048] HA与丙烯酰氯以摩尔为基础的比例优选是1:10-1:60。在优选的实施方式中，按照大约1:12的比例，用120微升丙烯酰氯(1.48mmol)处理25ml去离子水中的50mg HA(0.125mmol)，产生HA的17％丙烯酸酯化。在另一个优选的实施方式中，按照大约1:25的比例，用更高量的丙烯酰氯(250微升，3.07mmole)处理相同浓度的HA(0.125mmole)，产生HA的34％丙烯酸酯化。在更优选的实施方式中，按照大约1:50的比例，用500微升丙烯酰氯(6.15mmol)处理0.125mmol HA，产生HA的90％丙烯酸酯化。

[0049] 在丙烯酰氯的全部加入之后，搅拌液态反应混合物以确保完全反应。

[0050] 反应结束之后，通过添加过量的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇或异丙醇来沉淀丙烯酸酯化的HA产物。为了纯化衍生的产物，将其离心并用溶剂例如乙醇、甲醇或丙酮洗涤。可以对产物进行透析以提供基本上纯的丙烯酸酯化的HA产物。

[0051] 可以将丙烯酸酯化的HA配制成干粉，例如，通过冻干或通过喷雾干燥。

[0052] 本发明还涉及具有以下结构的丙烯酸酯化的HA：

[0053]

[0054] 其中R1选自下组：氢、甲基、氯和COCl；并且R2包含选自下组的结构：氢、甲基、苯基、氯、2-氯苯基、COCl和CH2COCl；并且R3选自下组：氢、甲基、氯、4-硝基苯基、3-三氟甲基苯基和苯乙烯基部分。

[0055] 在具体的实施方式中，本发明公开了具有以下结构的丙烯酸酯化的HA：

[0056]

[0057] 可以通过质子NMR来表征丙烯酸酯化的HA产物。由丙烯酸酯质子5.66ppm(1H)对于(to)透明质酸的N-乙酰基质子(-NHCOCH3，3H，2.0ppm)的积分值(integration value)来测定％丙烯酸酯化。

[0058] 可以将丙烯酸酯化的HA用于进行酶介导的交联并且产生水凝胶形式的材料。

[0059] 酶介导的交联/聚合的实例：

[0060] 已经将过氧化物酶(辣根(Horseradish))用作酶催化剂来介导分子内或分子间的丙烯基官能团的聚合/交联。

[0061] 过氧化物酶和漆酶类的酶能够催化上述HA缩水甘油基丙烯酸酯和HA-丙烯酸酯的交联反应。

[0062] 与可供选择的化学方法相比，化学修饰的HA聚合物的酶促交联反应是温和并且环境友好的。

[0063] 先前已经报导了辣根过氧化物酶(HRP)介导甲基丙烯酸甲酯的自由基聚合(Kalra，B.；Gross，R.A.；Green Chemistry，2002，4，174-178)。所述反应能够在水中在室温进行。作为一个实例，在水介质中进行的HRP介导的丙烯酸钠(sodium acrylate)的聚合在24小时之内以多至88％的产率产生聚(丙烯酸钠)，其具有大约119KDa的Mw。

[0064] 在具体的实施方式中，酶是辣根过氧化物酶、大豆过氧化物酶和木质素过氧化物酶之一。

[0065] 在具体的实施方式中，酶是重组酶。

[0066] 在具体的实施方式中，酶是嗜热酶。

[0067] 在具体的实施方式中，酶是中温酶(mesophilic enzyme)。

[0068] 在本发明的具体实施方式中，用于聚合/交联本发明的丙烯酸酯化的透明质酸产物的方法包括组合：

[0069] a)权利要求1的丙烯酸酯化的透明质酸产物；

[0070] b)过氧化物源；

[0071] c)引发剂；

[0072] d)酶，和

[0073] e)溶剂。

[0074] 可用于本发明的过氧化物源可以是具有氧-氧键的任何化合物，例如过氧化苯甲酰(benzoyl peroxide)、碱金属和碱土金属过氧化物、单和二烷基过氧化物、过氧化氢双TMS醚(hydrogen peroxide bis-TMS ether)、有机和无机过酸或过氧化氢。在反应条件下产生具有氧-氧键的化合物的试剂也是如本文使用的术语过氧化物源。过氧化氢是优选的，因为它仅产生水作为副产物。

[0075] 在本发明的具体实施方式中，过氧化物源可以是过氧化氢或烷基过氧化物。

[0076] 在本发明的具体实施方式中，丙烯酸酯化的透明质酸产物是甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、苯乙烯，和丙烯酸及其盐中的一种。

[0077] 在本发明的具体实施方式中，引发剂是β-二羰基化合物或β-二酮。

[0078] 在具体实施方式中，溶剂是水或有机溶剂，或它们的混合物。

[0079] 在具体实施方式中，在惰性气氛中进行聚合/交联。

[0080] 实施例

[0081] 实施例1

[0082] 将高分子量透明质酸(700,000-1,000,000道尔顿，50mg)溶解在去离子水(25ml)中。将温度降至0℃。

[0083] 向上述溶液添加一滴0.33N NaOH。pH从5.4变为9.5。在这个pH下将溶液搅拌30分钟。制备等量的丙烯酰氯(100-500μL)和二氯甲烷(100-500ml)的混合物。将其在一小时中逐滴添加至透明质酸反应混合物。逐滴添加丙烯酰氯的过程中，通过逐滴添加1N-5N NaOH将pH保持在8-9。

[0084] 在丙烯酰氯完全加入之后，将溶液再搅拌一小时。在整个反应中保持低温(0-5℃)。进行过滤。使用大量过量的冷乙醇(500ml-1000ml)沉淀滤出液，并用乙醇洗涤。将其离心，透析，并冻干。

[0085] 实施例2

[0086] 将高分子量透明质酸(700,000-1,000,000道尔顿，50mg)溶于pH8.0的0.25-2.0M磷酸盐缓冲液(25ml)。将温度降至0℃。在这个pH下将溶液搅拌30分钟。将等量的丙烯酰氯(100-500μL)和二氯甲烷(100-500ml)的混合物在一小时中逐滴添加至透明质酸反应混合物。在丙烯酰氯完全加入之后，将溶液再搅拌一小时。在整个反应中保持低温(0-5℃)。过滤所得产物。使用大量过量的冷乙醇(500ml-1000ml)沉淀滤出液，并用乙醇洗涤。将其离心，透析，并冻干。

[0087] 实施例3

[0088] 将高分子量透明质酸(700,000-1,000,000道尔顿，50mg)溶于去离子水(25ml)中。将温度降至0℃。

[0089] 向上述溶液中添加一滴0.33N NaOH。pH从5.4变为9.5。在这个pH下将溶液搅拌30分钟。使用注射泵逐滴添加丙烯酰氯(100-500μL)。丙烯酰氯的添加速率是500-2000μL/小时。通过逐滴添加1N-5N NaOH将pH保持在8-9。

[0090] 在丙烯酰氯完全加入之后，将溶液再搅拌一小时。在整个反应中保持低温(0-5℃)。对反应混合物进行过滤。使用大量过量的冷乙醇(500ml-1000ml)沉淀滤出液，并用乙醇洗涤。将其离心，透析，并冻干。

[0091] 使用上述方法，通过用不同量的用于丙烯酸酯化的丙烯酰氯进行处理，获得了具有不同丙烯酸酯化百分比的不同的丙烯酸酯化透明质酸衍生物。通过比较2.02(3H，-NHCOCH3)和5.6(1H，如下所示引入的丙烯基部分的HA质子)的信号来计算％丙烯酸酯化：

[0092]