来自海洋的多粘类芽孢杆菌产中性蛋白酶及其方法

摘要

本发明是一种来自海洋的多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxaisolate L1-9)产中性蛋白酶方法，其步骤包括菌株活化、种子液的制备、产酶培养基的制备和产酶发酵培养和粗酶液的制备。该方法所产中性蛋白酶的适合反应温度为40℃，pH值为7.0；该酶在50℃以下保温20min有酶活性，在60℃以上酶活性减弱；在pH值5.0～7.0时稳定，在pH值4.0以下或9.0以上时酶活下降；金属离子Ag+、Zn2+、Cu2+、Fe3+能抑制蛋白酶的活性，而Na+、K+能提高蛋白酶活性。

权利要求

1.一种来自海洋的多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)产中性蛋白酶方法，其特征在于，其步骤如下：(1)菌株活化：在超净台无菌操作条件下，取多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)菌株，划线接种到PDA斜面培养基上25℃下恒温培养24h；所述的PDA斜面培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，海水1000ml；

(2)种子液的制备：在无菌条件下将5ml PD液体培养基加入到步骤(1)所述活化好的多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)PDA斜面上，冲洗下菌苔并倒入装有45mlPD液体培养基的250ml三角瓶中，25℃，190r/min的条件，振荡培养24h，得种子液；所述的PD液体培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，海水1000ml；

(3)产酶培养基的制备：用海水按豆饼粉2％、麸皮3％、玉米粉4％、Na2HPO4·12H2O

0.4％、KH2PO4 0.03％、CaCl2 0.1％、Na2CO3·10H2O0.1％的重量百分比配制成产酶液体培养基，调节pH值为6.0，分装在500mL三角瓶中，每瓶装液量为70mL，121.5℃灭菌20min；

(4)产酶培养和粗酶液的制备：在无菌条件下按5％的接种量将种子液接种到产酶液体培养基中，在温度为25℃、转速为190r/min条件下，振荡培养42h；将培养后的菌液在

4℃、10000r/min条件下，离心20min，收集上清液即得粗酶液。

2.一种如权利要求1所述的来自海洋的多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)产中性蛋白酶方法所产中性蛋白酶，其特征在于，该酶适合反应温度为40℃，pH值为7.0；该酶在50 ℃以下保温20min有酶活性，在60℃以上酶活性减弱；

+ 2+

在pH值5.0～7.0时稳定，在pH值4.0以下或9.0以上时酶活下降；金属离子Ag、Zn 、

2+ 3+ + +

Cu 、Fe 能抑制蛋白酶的活性，Na、K 能提高蛋白酶活性。

说明书

来自海洋的多粘类芽孢杆菌产中性蛋白酶及其方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种海洋细菌产蛋白酶方法，特别是一种来自海洋的多粘类芽孢杆菌产中性蛋白酶方法，本发明还涉及该方法所产中性蛋白酶。

背景技术

[0002] 蛋白酶是催化蛋白质水解的酶类的总称。蛋白酶种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。

[0003] 中性蛋白酶可广泛应用于皮革脱毛，蛋白水解，果酒、啤酒和饮料中蛋白质的去除。同时细菌蛋白酶在细菌生长过程中具有非常重要的作用，其不仅仅与细菌生长的营养有关，而且还可以破坏宿主蛋白质，是细菌抵抗和侵袭其他病原物的重要物质，如昆虫和线虫的体壁含有蛋白质，细菌寄生于昆虫或线虫上后分泌蛋白酶，降解昆虫或线虫体壁中的蛋白质而杀死昆虫和病原线虫，因而蛋白酶在植物病原线虫和植物真菌性病害的防治上具有重要作用。但目前报道的具有杀昆虫和线虫作用的产蛋白酶微生物主要来自于陆源微生物。而陆源微生物经过多年的分离筛选，得到产新型物质或具有新功能微生物的几率越来越低。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用来自海洋的多粘类芽孢杆菌产中性蛋白酶的新方法，该方法操作简单、所产中性蛋白酶活性较强。

[0005] 本发明还提供了下种如上所述方法所产的中性蛋白酶。

[0006] 本发明所涉及的菌株多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)为公知公用菌株，该菌株已于2008年9月30日在Genebank公开，登录号为FJ178378，该菌株的16S rRNA序列已公开，网址为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore&cmd＝search&term＝FJ178378。公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。而且发明人已经于2007年在《河南农业科学》中公开发表了一篇名为《3株抗植物病原真菌的海洋细菌的分离筛选》的论文，该论文中也公开了本发明所涉及的菌株多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)(论文中称之为L1-9菌株)以及其分离培养方法与抗菌用途。

[0007] 本发明是以上述来自海洋的多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolate L1-9)菌株为基础，研究其产中性蛋白酶的方法及其所产的中性蛋白酶。

[0008] 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种来自海洋的多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)产中性蛋白酶方法，其特点是，其步骤如下：

[0009] (1)菌株活化：在超净台无菌操作条件下，取多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)菌株，划线接种到PDA斜面培养基上25℃下恒温培养24h；所述的PDA斜面培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，海水1000ml；

[0010] (2)种子液的制备：在无菌条件下将5ml PD液体培养基加入到步骤(1)所述活化好的多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)PDA斜面上，冲洗下菌苔并倒入装有45mlPD液体培养基的250ml三角瓶中，25℃，190r/min的条件，振荡培养24h，得种子液；所述的PD液体培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，海水1000ml；

[0011] (3)产酶培养基的制备：用海水按豆饼粉2％、麸皮3％、玉米粉4％、Na2HPO4·12H2O0.4％、KH2PO4 0.03％、CaCl2 0.1％、NaCO3·10H2O0.1％的重量百分比配制成产酶液体培养基，调节pH值为6.0，分装在500mL三角瓶中，每瓶装液量为70mL，121.5℃灭菌20min；

[0012] (4)产酶培养和粗酶液的制备：在无菌条件下按5％的接种量将种子液接种到产酶液体培养基中，在温度为25℃、转速为190r/min条件下，振荡培养42h；将培养后的菌液在4℃、10000r/min条件下，离心20min，收集上清液即得粗酶液。

[0013] 本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还公开了一种如以上技术方案所述的来自海洋的多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)产中性蛋白酶方法所产中性蛋白酶，其特点是，该酶适合反应温度为40℃，pH值为7.0；该酶在50℃以下保温20min有酶活性，在60℃以上酶活性减弱；在+ 2+ 2+pH值5.0～7.0时稳定，在pH值4.0以下或9.0以上时酶活下降；金属离子Ag、Zn 、Cu 、
3+ + +
Fe 能抑制蛋白酶的活性，Na、K 能提高蛋白酶活性。

[0014] 以下 是发 明人 所做 的多 粘类 芽孢 杆菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolateL1-9)相关实验及其结果。

[0015] 1、关于中性蛋白酶发酵条件。

[0016] 1.1、不同培养基对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)产中性蛋白酶的影响。

[0017] 选取5种培养基作为对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxaisolate L1-9)进行优化产酶的出发培养基，培养基pH值设为7.0。每种培养基配100mL分装入两个三角瓶中，装瓶量50ml。按5％接种量接种，于摇床振荡培养，转速为180r/min，温度28℃，时间为44h。培养结束后离心取上清液进行酶活测定，从而筛选出最佳培养基。

[0018] 五种配方：

[0019] (1)牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L。

[0020] (2)豆饼粉2％，麸皮3％，玉米粉4％，Na2HPO4·12H2O 0.4％，KH2PO40.03％，CaCl20.1％，NaCO3·10H2O 0.1％。

[0021] (3)玉米粉5％，豆饼粉3％，Na2HPO4 0.4％，KH2PO4 0.03％，MgSO4·7H2O 0.02％，CaCl2 0.3％。

[0022] (4)蔗糖0.1％，豆饼粉0.4％，酵母膏0.1％，酪素1％，MgSO4 0.05％，CaCO30.4％，KH2PO4 0.03％。

[0023] (5)脱脂奶粉1％。

[0024] 1.2、不 同 培 养 时间 对 多 粘 类芽 孢 杆 菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolateL1-9)产中性蛋白酶的影响。

[0025] 选取上述实验最佳产蛋白酶培养基为发酵培养基，用试管进行发酵，装液量5ml，接种量5％，温度28℃，转速180r/min，培养总时间为48h，其中每隔2h取出2支试管，离心取上清测酶活，得出最佳产酶时间。

[0026] 1.3、不同培 养温度对 多粘类芽 孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)产中性蛋白酶的影响。

[0027] 将发酵液的培养温度分别调节为15℃，20℃，25℃，28℃，30℃，35℃，37℃，培养基pH值为7.0，装瓶量50ml，接种量5％，转速为180r/min，培养时间为最佳时间。

[0028] 取不同温度摇床培养获得的发酵液进行酶活力测定，通过比较获得最佳温度。

[0029] 1.4、不同pH值对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)产中性蛋白酶的影响。

[0030] 配制液体最佳培养基，用PHS-3C型PH计分别调PH值分别为：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，9.5、10.0、10.5、11.0每个PH值分别做2个平行。装瓶量
50ml，接种量为5％，摇床转速为180r/min，培养温度为28℃，培养时间为最佳时间。

[0031] 取不同pH摇床培养获得的发酵液进行酶活力测定，通过比较获得最佳pH。

[0032] 1.5、不同接种量对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)产中性蛋白酶的影响。

[0033] 配制液体最佳培养基，将发酵液的接种量分别调节为1％，3％，5％，7％，9％，11％，13％，15％。其余培养条件不变。

[0034] 取不同接种量摇床培养获得的发酵液进行酶活力，通过比较获得接种量。

[0035] 1.6、不同装液量对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)产中性蛋白酶的影响。

[0036] 配制液体最佳培养基，用500ml的三角瓶进行发酵，将发酵液的装液量分别调节为50，60，70，80，90，100，110，120ml/瓶，其余培养条件不变。

[0037] 取不同装瓶量培养获得的发酵液进行酶活力测定，通过比较获得最佳装液量。

[0038] 1.7、不同摇 床转速对 多粘类芽 孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)产中性蛋白酶的影响。

[0039] 配制液体最佳培养基，摇床转速分别调节为160，170，180，190，200，210，220r/min，其余培养条件不变。

[0040] 取不同转速摇床培养获得的发酵液进行酶活力，通过比较获得最佳转速。

[0041] 2、关于中性蛋白酶的性质。

[0042] 2.1、温度对酶活反应的影响。

[0043] 准备好的酶反应体系分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃温度下反应相应时间后测定其活性。比较不同温度下酶的活性，确定最佳的酶反应温度。

[0044] 2.2、酶热稳定性的测定。

[0045] 准备好酶的反应体系分别在0℃，10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃和80℃下保温20min，后于相应的标准温度下反应相应的时间，测定酶活性。求出酶保持稳定的温度范围。

[0046] 2.3、pH对酶活反应的影响。

[0047] 取pH值为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的不同缓冲液代替标准缓冲液进行酶反应，测定蛋白酶活性。求出酶反应的最适pH值。

[0048] 2.4、酸碱稳定性。

[0049] 将酶液在pH值分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的缓冲液中40℃处理2h，再将酶液pH值调到中性后，按标准条件进行酶反应，测定其酶活性。求出酶的pH值稳定性范围。

[0050] 2.5、金属离子对酶活性的影响。

[0051] 选取十种不同离子的化合物：NaCl，CaCcl，Kcl，FeCl3.6H2O，FeSO4.7H2O，Co(NO3).6H2O，ZnSO4.H2O，AgNO3，MnCl2.4H2O，CuSO4.5H2O，化合物用反应的标准缓冲液配成0.1M浓度，然后再稀释成10mM，用此溶液代替标准缓冲液进行酶反应，使金属离子终浓度为5mM。以不加金属离子的缓冲液为对照，测定不同处理的酶活性。

[0052] 3、比色法测定多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolate L1-9)产中性蛋白酶活性。

[0053] 3.1 实验试剂。

[0054] ①福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入10g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、2.5g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、70mL蒸馏水、5mL85％磷酸及10mL浓盐酸，充分混匀后小火沸腾回流10h。取下回流冷却器，在通风橱中加5g硫酸锂、2.5mL蒸馏水及数滴液体溴(99％)，开口继续沸腾15min，以便除去多余的溴(如果冷却后仍有绿色需要再加溴水煮沸)，冷却后加去离子水定容到200mL。混匀，过滤，制得的试剂应为金黄色液体，置于棕色瓶中暗处保存。

[0055] 使用溶液：1份福林试剂与两份水混合，摇匀。

[0056] ②0.4mol/L碳酸钠溶液(Na2CO3)

[0057] 称取无水碳酸钠4.244g，用去离子水溶解并定容至100mL。

[0058] ③0.4mol/L三氯乙酸(CCl3.COOH)

[0059] 称取三氯乙酸6.54g用水溶解并定容至100mL。

[0060] ④1％酪蛋白溶液：称取酪素1.000g精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，慢慢加入pH7.2的磷酸盐缓冲溶液80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液在冰箱贮存，有效期为3d。

[0061] 3.2 制备酪氨酸标准曲线。

[0062] ①取10支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。

[0063] ②分别吸取不同浓度酪氨酸溶液1mL放入另10支试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试剂使用液1mL，充分摇匀，于40℃水浴中保温20min。

[0064] ③用UV-754型分光光度计，以0号管作对照，在680nm处测定吸光值。

[0065] ④以光密度为纵坐标，酪氨酸含量(微克数)为横坐标，绘制标准曲线。

[0066] 表1 不同浓度酪氨酸标准溶液的配制

[0067]

[0068] 3.3 中性蛋白酶活性的测定。

[0069] 采用Folin—酚试剂法测定中性蛋白酶活性。在试管中加入粗酶液1.00mL，40℃水浴预热2min，再加入1％酪素溶液1.00mL摇匀，于40℃水浴中准确保温10min，加入0.4mol/L三氯乙酸溶液2.00mL并摇匀，取出静置10min，然后3500r/min离心5min，取上清夜1.00mL加入5.00mL0.4mol/L碳酸钠溶液，加福林试剂使用液1.00mL，40℃水浴显色
20min。对照组先加三氯乙酸溶液再加酪素溶液，其他步骤相同。最后使用UV-754型分光光度计再680nm波长下测定其吸光光度，以每min产生1μg酪氨酸所需的酶量为一个酶活单位。

[0070] 4、结果与分析。

[0071] 4.1 酪氨酸标准曲线。

[0072] 以酪氨酸的浓度为横坐标，OD值为纵坐标可以得出酪氨酸的标准曲线，其回归方程为y＝0.0149x-0.0301，R2＝0.9982。参照图1。

[0073] 4.2 不同培养基对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)产中性蛋白酶的影响。

[0074] 以培养基编号为横坐标，以每毫升发酵液所测定的酶活力单位大小为纵坐标，制作多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)在不同培养基中产酶情况的柱型图。参照图2。

[0075] 结果表明，不同培养基对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxaisolate L1-9)产中性蛋白酶能力有较大影响，菌株在不同培养基中的产酶能力不同。通过酶活力的测定比较表明，多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolate L1-9)在2号培养基产酶最高达到70.4U，其次为3号培养基达44.4U。在1号培养基中基本不产酶，酶活性最底。表明2号培养基为产蛋白酶的最佳培养基，并且2号培养基为豆饼粉2％，麸皮3％，玉米粉4％，Na2HPO4·12H2O 0.4％，KH2PO4 0.03％，CaCl2 0.1％，NaCO3·10H2O 0.1％。为天然培养基，原料易寻找、成本廉价、便于实验室制作，可做为本实验的产酶培养基配方。所以选定2号培养基为多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)的最佳培养基。

[0076] 4.3 不同培养时间对 多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)产中性蛋白酶的影响。

[0077] 选择2号培养基为供试培养基。分别测定多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)培养不同时间的中性蛋白酶活性。以培养时间为横坐标，以发酵液所测定的酶活力单位大小为纵坐标，制作多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)在不同时间培养的产中性蛋白酶情况的折线图。参照图3。

[0078] 结果显示，开始就有少量蛋白酶产生，以后酶活性逐渐升高，培养42h的酶活性达到最高，为38.39U，再往后酶活性开始降低。

[0079] 4.4.不同培养温度对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxaisolate L1-9)产酶的影响。

[0080] 温度对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)产中性蛋白酶有很大影响，测定不同培养温度下多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)发酵液的酶活力的大小。以培养温度为横坐标，以每毫升发酵液所测定的酶活力单位大小为纵坐标，制作菌株在不同温度培养的产中性蛋白酶情况的折线图，见图4。

[0081] 结果显示，当培养温度为25℃时，发酵液的酶活力单位达35.25U，达到各个温度段的最大值。当温度升高或降低时产酶量下降，因此可以确定多粘类芽孢杆菌L1-9菌株最佳产酶温度为25℃。

[0082] 4.5 不同pH值对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)产酶的影响。

[0083] 以培养pH值为横坐标，以每毫升发酵液所测定的酶活力单位大小为纵坐标，制作多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolate L1-9)菌株在不同pH值培养条件下产酶情况的折线图，见图5。

[0084] 测定结果表明，当培养基的PH值为6.0和9.0时出现两个产酶高峰，6.0酶活性达到43.98U，pH9.0酶活性达41.94U。起始pH为4.0时酶活最低为18.30U，表明该菌在较酸的环境中不利于产酶。起始pH4.5以上时酶活变化平缓，表明pH对该菌的产酶影响不大。出现两个产酶高峰表明该菌可分泌多种蛋白酶，在不同的起始pH下表达不同的蛋白酶。

[0085] 4.6 不同接种量对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)产酶的影响。

[0086] 通过测定不同接种量下多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxaisolate L1-9)发酵液的酶活，通过比较表明多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolate L1-9)在不同接种量下产酶能力有所差别。

[0087] 以接种量为横坐标，以每毫升发酵液所测定的酶活力单位大小为纵坐标，制作多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolate L1-9)菌株在不同接种量培养条件下产蛋白酶情况的折线图，见图6。

[0088] 结果表明，当接种量为5％时，发酵液的酶活力单位达44.35U，达到各个接种量的最大值。

[0089] 4.7 不同装液量对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)菌株产酶的影响。

[0090] 以装液量为横坐标，以每毫升发酵液所测定的酶活力单位大小为纵坐标，制作多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)菌株在不同装液量培养条件下产中性蛋白酶情况的折线图。见图7。

[0091] 测 定 结 果 表 明，当 装 液 量 为 70ml时( 三 角 瓶 为500ml容 量)，发酵液的酶活40.16U，达到各个装液量的最大值。因此确定多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolate L1-9)菌株产酶的最适装液量为70ml。

[0092] 4.8摇床转速对多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolateL1-9)菌株产酶的影响。

[0093] 通过改变摇床转速可以达到改变通氧量的目的。测定不同摇床转速下发酵液的酶活，并且根据酶活大小的比较，得出相应的最佳摇床转速。

[0094] 以摇床转速为横坐标，以每毫升发酵液所测定的酶活力单位大小为纵坐标，制作多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolate L1-9)菌株在不同摇床转速下培养的产酶情况的折线图，见图8。

[0095] 测定结果表明，多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolate L1-9)菌株是好氧菌，摇床的转速对产酶的影响比较显著，当摇床转速设定为190r/min时，其发酵液的酶活为56.85U，达到各个转速的最大值，说明产酶状况最为理想。随着转速的加快或减缓，测定的值都出现下降，表明菌株产酶能力降低。因此其最佳摇床转速为190r/min。

[0096] 5.中性蛋白酶性质的研究。

[0097] 5.1 温度对酶活反应的影响。

[0098] 将酶反应体系分别在不同的温度环境中进行反应，测定蛋白酶的活性。以温度为横坐标，以酶活为纵坐标，制作温度对酶活反应影响的折线图，参照图9。图9表明，温度对酶活反应的影响比较显著。随着温度的上升，蛋白酶活性逐渐上升，40℃时蛋白酶活性达到最高，为56.36U。温度再升高时酶活性开始下降。本实验表明分离得到的中性蛋白酶的最佳反应温度为40℃。

[0099] 5.2 酶热稳定性的测定。

[0100] 将准备好粗酶液分别在不同的温度下保温20min，在相应的标准温度下反应，测定酶活性。结果表明40℃以下的温度处理对酶的活性影响不大，50℃处理时酶的活性开始下降，80℃酶活性已很低。表明该酶在40℃以下比较稳定，50℃以上表现不稳定。参照图10。

[0101] 5.3 pH对酶活反应的影响。

[0102] 将中性蛋白酶液于不同pH的缓冲液反应体系中进行反应，pH不同酶活性不同。开始酶活性随着pH的升高而升高，当pH8.0时酶活性最高达到56.95U，pH9.0时酶活开始下降，随pH的升高而降低。这一结果表明酶的反应最佳pH为8.0。参照图11。

[0103] 5.4 酸碱稳定性。

[0104] 将粗酶液在不同pH值的缓冲液中40℃处理2h，再将酶液pH值调到中性后，按标准条件进行酶反应，测定其酶活性。结果表明，pH7.0时蛋白酶活性最高，达47.55U。起始pH3时该酶活性随pH的升高而升高，pH在8.0时急剧下降，说明该酶在中性环境中比较稳定。参照图12。

[0105] 5.5 金属离子对酶活性的影响。

[0106] 选取十种不同离子的化合物，测定含有5mmol不同离子缓冲液的反应体系中的蛋+ + 2+白酶活性。结果表明，不加金属离子的酶的活性为33.78U，含有Na，K，Co 离子处理时高于
2+
对照，分别为39.32U，45.26U，45.15U，说明这三种金属离子对蛋白酶活性有促进作用。Mn
3+ + 2+ 2+ 2+
对酶活性影响不大。金属离子Fe ，Ag 对蛋白酶的影响较大，有抑制作用。Ca ，Fe ，Cu ，
2+
Zn 离子次之。参照图13。

[0107] 5.6 本发明多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolate L1-9)所产中性蛋白酶和其它中性蛋白酶一样，可广泛应用于皮革脱毛，蛋白水解，果酒、啤酒和饮料中蛋白质的去除。同时还可以破坏宿主蛋白质，是细菌抵抗和侵袭其他病原物的重要物质，如昆虫和线虫的体壁含有蛋白质，细菌寄生于昆虫或线虫上后分泌蛋白酶，降解昆虫或线虫体壁中的蛋白质而杀死昆虫和病原线虫。

[0108] 以下是发明人所做的本发明多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacilluspolymyxa isolate L1-9)所产中性蛋白酶对植物病原线虫的致死作用实验。

[0109] 在装有1.5ml不同浓度酶液的凹玻皿中分别加入甘薯茎线虫、南方根结线虫40条，将凹玻皿放入大培养皿中保湿，于25℃恒温培养箱中培养，于48h后观测线虫的死亡情况，线虫的死活鉴定采用NaCl检测法，计算校正死亡率。设空白产酶培养基为对照，每处理重复3次。

[0110] 结果表明：酶也处理后的线虫死亡率明显高于对照。不同浓度的蛋白酶对线虫的致死作用不同，酶浓度越高线虫的死亡率越高，酶液原液48h后甘薯茎线虫、南方根结线虫的校正死亡率分别达到了68.5％和73.3％稀释5倍后的死亡率也分别达到了40.2％和50.1％。说明该蛋白酶对两种植物病原线虫具有较强的致死作用。

[0111] 表1 不同浓度酶液处理48h后两种线虫的校正死亡率(％)

[0112]酶液浓度 甘薯茎线虫 南方根结线虫
原液 68.5 73.3
2倍稀释液 52.3 66.4
5倍稀释液 40.2 50.1

附图说明

[0113] 图1为酪氨酸标准曲线图。

[0114] 图2为不同培养基对多粘类芽孢杆菌L1-9菌株产酶性能的影响结果图。

[0115] 图3为不同培养时间对多粘类芽孢杆菌L1-9菌株产蛋白酶的影响结果图。

[0116] 图4为不同培养温度对多粘类芽孢杆菌L1-9菌株产酶的影响图。

[0117] 图5为不同pH值对多粘类芽孢杆菌L1-9菌株产酶的影响结果图。

[0118] 图6为不同接种量对多粘类芽孢杆菌L1-9菌株产酶的影响结果图。

[0119] 图7为不同装液量对多粘类芽孢杆菌L1-9菌株产酶的影响结果图。

[0120] 图8为摇床转速对多粘类芽孢杆菌L1-9菌株产酶的影响结果图。

[0121] 图9为温度对酶活反应的影响结果图。

[0122] 图10为酶热稳定性的测定结果图。

[0123] 图11为pH对酶活反应的影响结果图。

[0124] 图12为酶酸碱稳定性的测定结果图。

[0125] 图13为金属离子对酶活性的影响结果图。

具体实施方式

[0126] 以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

[0127] 实 施 例1。 一 种 来 自 海 洋 的 多 粘 类 芽 孢 杆 菌L1-9(Paenibacillus polymyxaisolate L1-9)产中性蛋白酶方法，其步骤如下：

[0128] (1)菌株活化：在超净台无菌操作条件下，取多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)菌株，划线接种到PDA斜面培养基上25℃下恒温培养24h；所述的PDA斜面培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，海水1000ml；

[0129] (2)种子液的制备：在无菌条件下将5ml PD液体培养基加入到步骤(1)所述活化好的PDA斜面培养基中，冲洗下菌苔并倒入装有45mlPD液体培养基的250ml三角瓶中，25℃，190r/min的条件，振荡培养24h，得种子液；所述的PD液体培养基的组成为：马铃薯
200g，葡萄糖20g，海水1000ml；

[0130] (3)产酶培养基的制备：用海水按豆饼粉2％、麸皮3％、玉米粉4％、Na2HPO4·12H2O0.4％、KH2PO4 0.03％、CaCl2 0.1％、NaCO3·10H2O0.1％的重量百分比配制成产酶液体培养基，调节pH值为6.0，分装在500mL三角瓶中，每瓶装液量为70mL，121.5℃灭菌20min；

[0131] (4)产酶发酵培养和粗酶液的制备：在无菌条件下按5％的接种量将种子液接种到产酶液体培养基中，在温度为25℃、转速为190r/min条件下，振荡培养42h；将发酵培养后的菌液在4℃、10000r/min条件下，离心20min，收集上清液即得粗酶液。

[0132] 实施例2。一种如实施例1所述的来自海洋的多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)产中性蛋白酶方法所产中性蛋白酶，该酶适合反应温度为40℃，pH值为7.0；该酶在50℃以下保温20min有酶活性，在60℃以上酶活性减弱；在pH值5.0～+ 2+ 2+ 3+7.0时稳定，在pH值4.0以下或9.0以上时酶活下降；金属离子Ag、Zn 、Cu 、Fe 能抑制+ +
蛋白酶的活性，而Na、K 能提高蛋白酶活性。