制备藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法

摘要

本发明公开了一种制备藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，通过应用藻胆蛋白beta155裂合酶催化藻蓝胆素与藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明的方法应用生物过程生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法。藻红蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。

权利要求

1.一种制备藻红蓝蛋白荧光蛋白质的方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)用基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的beta155裂合酶基因all5339和Anabaena sp.PCC7120或M.laminosus PCC7603中的藻红蓝蛋白脱辅基蛋白基因pecB克隆于pCDFDuet-1中，得到beta155裂合酶和藻红蓝蛋白脱辅基蛋白表达质粒；

(2)用基因工程方法将PCB生物合成酶基因hol和pcyA同时克隆于pACYCDuet-1中，得到PCB生物合成酶质粒；

(3)将beta155裂合酶和藻红蓝蛋白脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的藻红蓝蛋白荧光蛋白质。

说明书

制备藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及制备藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法。

背景技术

[0002] 藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约
620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650～660nm的可见光，发射约660～
670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB)；PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB)；PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB)；CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。

[0003] PEC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley AJ，Glazer AN.Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvestingpolypeptidephycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host.J Bacteriol.2002；184(17)：4666～4671)。PCB生物合成基因由ho1和pcyA组成，可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产PCB(F.T.Landgraf，C.Forreiter，et al.Recombinant holophytochrome inEcherichia coli[J].FEBS Letters，2001，508：459-462)。与前人的方法不同，我们发现Anabaena sp.PCC7120中all5339基因编码beta155裂合酶，在其它蓝藻中也存在同源的beta155裂合酶。这些beta155裂合酶能催化PCB与PEC的beta亚基及其同源蛋白质的155位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合，从而生成具有优良荧光性质的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。在绝大部分的蓝藻和红藻中，都存在有编码CPE脱辅基蛋白、CPC脱辅基蛋白、APC脱辅基蛋白、beta155裂合酶以及PCB生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏PE而具有异形胞的蓝藻中存在PEC；隐藻中没有藻胆体，不存在上述基因中的APC的基因。

[0004] 藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。目前使用的藻胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取(高纯度藻胆蛋白的分离方法，CN1344723，2002.04.17。一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，CN1563083，2005.01.12)。本方法不利用藻类作为原料，而是利用基因工程方法生产藻红蓝蛋白。藻红蓝蛋白类荧光蛋白质具有优良的荧光性质，为了发展藻红蓝蛋白类新型荧光探针，可以分子设计藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。本方法为藻红蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域奠定了基础。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供分子设计制备藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法。它是应用beta155裂合酶催化PCB与藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，从而制备藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。将含有beta155裂合酶基因、藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因和PCB生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿主菌，得到相应的工程菌，通过如此设计的基因工程菌生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。

[0006] 为实现上述发明目的，本发明的技术方案是这样的：一种制备藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，包括下述步骤：

[0007] (1)用基因工程方法，将beta155裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta155裂合酶表达质粒

[0008] (2)用基因工程方法将藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒

[0009] (3)用基因工程方法将PCB生物合成酶基因ho1和pcyA或其同源基因同时克隆于第三个表达载体中或分别克隆于第三、第四个表达载体中，得到PCB合成质粒；

[0010] (4)将beta155裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。

[0011] 本发明的目的也可以这样实现：一种制备藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，包括下述步骤：

[0012] (1)用基因工程方法，将beta155裂合酶基因或其同源基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因同时克隆于表达载体中，得到beta155裂合酶和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白表达质粒；

[0013] (2)用基因工程方法将PCB生物合成酶基因ho1和pcyA或其同源基因同时克隆于第二个表达载体中，得到PCB合成质粒；

[0014] (3)将beta155裂合酶和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白表达质粒、PCB生物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质。

[0015] 上述的制备藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的方法中所述的宿主菌为大肠杆菌。所述的beta155裂合酶基因是指与Anabaena sp.PCC7120中all5339基因同源的基因。所述的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指与Anabaena sp.PCC7120或M.laminosus sp.PCC7603中pecB基因同源的基因。

[0016] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：

[0017] 1、不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，大肠杆菌繁殖快，可以大大缩短周期；

[0018] 2、与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；

[0019] 3、通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质类似的蛋白，提取方便；

[0020] 4、方便进行藻胆蛋白分子设计，有利于发展荧光藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料。

附图说明

[0021] 图1为本发明中All5339催化下生成的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质的吸收与荧光光谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。

具体实施方式

[0022] 下面以实例对本发明作进一步详细地说明。

[0023] 实施例1

[0024] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0025] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0026] (2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-pecB，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0027] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(ho1和pcyA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1-pcyA，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PcyA。

[0028] 即脱辅基蛋白基因pecB在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，ho1处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0029] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0030] (4)将pCDFDuet-all5339、pET30-pecB 和pACYCDuet-ho1-pcyA转 入 大 肠 杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，2+
加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。其吸收与荧光光谱见附图1中所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。

[0031] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下：

[0032] 从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养基，37℃振荡培养过夜；取100μL饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37℃振荡培养至OD600＝0.3～0.4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10min；离心1min(10000g，4℃)弃去上清，收集沉淀菌体；用1mL预冷的0.1mol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体，离心
30s(10000g，4℃)去上清，菌体沉淀用100μL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬，放置于冰上，加入一定量的构建好的质粒，混匀后冰浴放置30min，42℃热休克90s，冰浴5min后加入
300μL LB培养基，37℃低速振荡培养45min，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基平板上，倒置于37℃培养箱至形成可见的单克隆菌斑。

[0033] 提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱和；分别从中取100μL转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37℃振荡培养至OD600＝0.5-0.7时，冰浴约30min，加入IPTG诱导表达；避光、20℃、150转/分，表达约12小时。离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株进行大量表达。

[0034] 实施例2

[0035] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0036] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0037] (2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB(C84A)克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-pecB(C84A)，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0038] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(ho1和pcyA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1-pcyA，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PcyA。

[0039] 即脱辅基蛋白基因pecB(C84A)在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和XhoI；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，ho1处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在第二个多克隆位点，在Nde I和XhoI之间。

[0040] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0041] (4)将pCDFDuet-all5339、pET30-pecB(C84A)和pACYCDuet-ho1-pcyA转 入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，2+
加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0042] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0043] 实施例3

[0044] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0045] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0046] (2)将M.laminosus sp.PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-pecB，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0047] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(ho1和pcyA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1-pcyA，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PcyA。

[0048] 即脱辅基蛋白基因pecB在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，ho1处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0049] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0050] (4)将pCDFDuet-all5339、pET30-pecB 和pACYCDuet-ho1-pcyA转 入 大 肠 杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，2+
加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0051] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0052] 实施例4

[0053] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0054] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0055] (2)将M.laminosus sp.PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB(C84A)克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-pecB(C84A)，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0056] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(ho1和pcyA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1-pcyA，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PcyA。

[0057] 即脱辅基蛋白基因pecB(C84A)在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bg1 II和XhoI；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，ho1处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在第二个多克隆位点，在Nde I和XhoI之间。

[0058] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0059] (4)将pCDFDuet-all5339、pET30-pecB(C84A)和pACYCDuet-ho1-pcyA转 入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，2+
加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0060] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0061] 实施例5

[0062] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-pecB-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白B。

[0063] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0064] (2)将藻蓝胆素生物合成酶基因(ho1和pcyA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1-pcyA，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PcyA。

[0065] 即脱辅基蛋白基因pecB和裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，pecB处于第一个多克隆位点，酶切位点是EcoR I和Pst I，all5339处于第二个多克隆位点酶切位点是BglII和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，ho1处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在第二个多克隆位点，在NdeI和Xho I之间。

[0066] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0067] (3)将pCDFDuet-pecB-all5339和 pACYCDuet-ho1-pcyA转 入 大 肠 杆 菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(i soprophylthio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，加2+
入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0068] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0069] 实施例6

[0070] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB(C84A)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-pecB(C84A)-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白B。

[0071] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0072] (2)将藻蓝胆素生物合成酶基因(ho1和pcyA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1-pcyA，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PcyA。

[0073] 即脱辅基蛋白基因pecB(C84A)和裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，pecB(C84A)处于第一个多克隆位点，酶切位点是EcoR I和Pst I，all5339处于第二个多克隆位点酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，ho1处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在第二个多克隆位点，在Nde I和XhoI之间。

[0074] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0075] (3)将 pCDFDuet-pecB(C84A)-all5339和pACYCDuet-ho1-pcyA 转 入 大 肠 杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，2+
加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0076] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0077] 实施例7

[0078] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因和M.laminosus sp.PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-pecB-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白B。

[0079] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0080] (2)将藻蓝胆素生物合成酶基因(ho1和pcyA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1-pcyA，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PcyA。

[0081] 即脱辅基蛋白基因pecB和裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，pecB处于第一个多克隆位点，酶切位点是EcoR I和Pst I，all5339处于第二个多克隆位点酶切位点是BglII和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，ho1处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在第二个多克隆位点，在NdeI和Xho I之间。

[0082] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0083] (3)将pCDFDuet-pecB-all5339和 pACYCDuet-ho1-pcyA转 入 大 肠 杆 菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，2+
加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0084] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0085] 实施例8

[0086] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因和M.laminosus sp.PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB(C84A)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-pecB(C84A)-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶和藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白B。

[0087] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0088] (2)将藻蓝胆素生物合成酶基因(ho1和pcyA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1-pcyA，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PcyA。

[0089] 即脱辅基蛋白基因pecB(C84A)和裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，pecB(C84A)处于第一个多克隆位点，酶切位点是EcoR I和Pst I，all5339处于第二个多克隆位点酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，ho1处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0090] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0091] (3)将 pCDFDuet-pecB(C84A)-all5339和pACYCDuet-ho1-pcyA 转 入 大 肠 杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，2+
加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0092] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0093] 实施例9

[0094] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0095] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0096] (2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-pecB，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0097] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因之一ho1克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1，在大肠杆菌中能表达HO1。

[0098] 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pcyA，在大肠杆菌中能表达PcyA。

[0099] 即脱辅基蛋白基因pecB在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，ho1在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0100] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0101] (4)将pCDFDuet-all5339、pET30-pecB 和pACYCDuet-ho1、pETDuet-pcyA转 入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细2+
胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0102] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0103] 实施例10

[0104] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0105] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0106] (2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB(C84A)克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-pecB(C84A)，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0107] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因之一ho1克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1，在大肠杆菌中能表达HO1。

[0108] 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pcyA，在大肠杆菌中能表达PcyA。

[0109] 即脱辅基蛋白基因pecB(C84A)在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和XhoI；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，ho1在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0110] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0111] (4)将pCDFDuet-all5339、pET30-pecB(C84A)和pACYCDuet-ho1、pETDuet-pcyA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体2+
细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0112] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0113] 实施例11

[0114] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0115] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0116] (2)将，M.laminosus sp.PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-pecB，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0117] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因之一ho1克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1，在大肠杆菌中能表达HO1。

[0118] 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pcyA，在大肠杆菌中能表达PcyA。

[0119] 即脱辅基蛋白基因pecB在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，ho1在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0120] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0121] (4)将pCDFDuet-all5339、pET30-pecB 和pACYCDuet-ho1、pETDuet-pcyA转 入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细2+
胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0122] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0123] 实施例12

[0124] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0125] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0126] (2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB(C84A)克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-pecB(C84A)，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0127] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因之一ho1克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1，在大肠杆菌中能表达HO1。

[0128] 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pcyA，在大肠杆菌中能表达PcyA。

[0129] 即脱辅基蛋白基因pecB(C84A)在pET30中是在EcoRV和Xho I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和XhoI；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，ho1在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0130] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0131] (4)将pCDFDuet-all5339、pET30-pecB(C84A)和pACYCDuet-ho1、pETDuet-pcyA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体2+
细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0132] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0133] 实施例13

[0134] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0135] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0136] (2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-pecB，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0137] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(ho1和pcyA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1-pcyA，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PcyA。

[0138] 即脱辅基蛋白基因pecB在pCOLADuet-1第一个多克隆位点，在EcoR I和Pst I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，ho1处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0139] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0140] (4) 将 pCDFDuet-all5339、pCOLADuet-pecB 和 pACYCDuet-ho1-pcyA 转 入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，2+
加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0141] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0142] 实施例14

[0143] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0144] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0145] (2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB(C84A)克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-pecB(C84A)，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0146] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(ho1和pcyA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1-pcyA，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PcyA。

[0147] 即脱辅基蛋白基因pecB(C84A)在pCOLADuet-1第一个多克隆位点，在EcoR I和PstI两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，ho1处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0148] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0149] (4)将pCDFDuet-all5339、pCOLADuet-pecB(C84A)和pACYCDuet-ho1-pcyA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细2+
胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0150] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0151] 实施例15

[0152] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0153] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0154] (2)将M.laminosus sp.PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-pecB，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0155] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(ho1和pcyA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1-pcyA，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PcyA。

[0156] 即脱辅基蛋白基因pecB在pCOLADuet-1第一个多克隆位点，在EcoR I和Pst I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，ho1处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0157] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0158] (4) 将 pCDFDuet-all5339、pCOLADuet-pecB 和 pACYCDuet-ho1-pcyA 转 入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细胞，2+
加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0159] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0160] 实施例16

[0161] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0162] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0163] (2)将M.laminosus sp.PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB(C84A)克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-pecB(C84A)，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0164] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因(ho1和pcyA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1-pcyA，在大肠杆菌中能同时表达HO1和PcyA。

[0165] 即脱辅基蛋白基因pecB(C84A)在pCOLADuet-1第一个多克隆位点，在EcoR I和Pst I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，它们在同一个载体pACYCDuet-1中，ho1处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0166] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0167] (4)将pCDFDuet-all5339、pCOLADuet-pecB(C84A)和pACYCDuet-ho1-pcyA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细2+
胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0168] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0169] 实施例17

[0170] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0171] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0172] (2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-pecB，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0173] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因之一ho1克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1，在大肠杆菌中能表达HO1。

[0174] 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pcyA，在大肠杆菌中能表达PcyA。

[0175] 即脱辅基蛋白基因pecB在pCOLADuet-1第一个多克隆位点，在EcoR I和Pst I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，ho1在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0176] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0177] (4)将pCDFDuet-all5339、pCOLADuet-pecB和pACYCDuet-ho1、pETDuet-pcyA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细2+
胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0178] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0179] 实施例18

[0180] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0181] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0182] (2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB(C84A)克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-pecB(C84A)，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0183] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因之一ho1克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1，在大肠杆菌中能表达HO1。

[0184] 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pcyA，在大肠杆菌中能表达PcyA。

[0185] 即脱辅基蛋白基因pecB(C84A)在pCOLADuet-1第一个多克隆位点，在EcoR I和PstI两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，ho1在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0186] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0187] (4) 将 pCDFDuet-all5339、pCOLADuet-pecB(C84A) 和 pACYCDuet-ho1、pETDuet-pcyA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白2+
B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0188] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0189] 实施例19

[0190] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0191] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0192] (2)将，M.laminosus sp.PCC7603中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-pecB，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0193] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因之一ho1克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1，在大肠杆菌中能表达HO1。

[0194] 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pcyA，在大肠杆菌中能表达PcyA。

[0195] 即脱辅基蛋白基因pecB在pCOLADuet-1第一个多克隆位点，在EcoR I和Pst I两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，ho1在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0196] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0197] (4)将pCDFDuet-all5339、pCOLADuet-pecB和pACYCDuet-ho1、pETDuet-pcyA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B；离心收集菌体细2+
胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0198] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0199] 实施例20

[0200] (1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp.PCC7120的全序列已经测定完成，M.laminosus sp.PCC7603部分序列已经测定。Anabaena sp.PCC7120在GeneBank中编号为：BA000019，M.laminosus sp.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为：M34254，可从所查到序列中找到所需基因；通过基因工程方法，将Anabaena sp.PCC7120中的all5339基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-all5339，在大肠杆菌中能表达beta155裂合酶。

[0201] 根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模版，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。

[0202] (2)将Anabaena sp.PCC7120中的藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白基因pecB(C84A)克隆于Novagen公司的表达载体pCOLADuet-1中，所得质粒叫pCOLADuet-pecB(C84A)，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻红蓝蛋白B。

[0203] (3)将藻蓝胆素生物合成酶基因之一ho1克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-ho1，在大肠杆菌中能表达HO1。

[0204] 将藻蓝胆素生物合成酶基因之一pcyA克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-pcyA，在大肠杆菌中能表达PcyA。

[0205] 即脱辅基蛋白基因pecB(C84A)在pCOLADuet-1第一个多克隆位点，在EcoR I和PstI两个酶切位点之间；裂合酶基因all5339在pCDFDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是Bgl II和Xho I；PCB合成酶基因是2个(ho1和pcyA)，ho1在pACYCDuet-1中，处于第一个多克隆位点，在Nco I和Pst I之间，pcyA在pETDuet-1中第二个多克隆位点，在Nde I和Xho I之间。

[0206] 基因插入载体的步骤为：根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模版；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1∶1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4～6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。

[0207] (4) 将 pCDFDuet-all5339、pCOLADuet-pecB(C84A) 和 pACYCDuet-ho1、pETDuet-pcyA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7.0的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.5至0.8，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1mmol/L，20℃至37℃振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白2+
B；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni 亲和层析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻蓝胆素-藻红蓝蛋白B。

[0208] 将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。

[0209] 上述制备方法适用于采用各种蓝藻中的beta155裂合酶、藻红蓝蛋白类脱辅基蛋白、藻蓝胆素生物合成酶基因或其同源基因以及链霉亲和素基因来制备链霉亲和素标记的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质，但涉及到微生物菌种公开的问题，本发明只选用了GenBank中已公开全序列的蓝藻Anabaena sp.PCC7120和已经部分测序的M.laminosus sp.PCC7603为例对本发明方法加以说明，本领域的技术人员可以根据上述公开的内容采用其它原料实施本发明。