鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂盒

摘要

本发明公开了一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂盒。本发明的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒，包括引物和探针，其中所述引物包括4条引物，它们的核苷酸序列分别是序列表中序列1、序列2、序列4和序列5；所述探针包括2条，它们的核苷酸序列分别是序列表中序列3和序列6；所述探针的5’端带有荧光物质，3’端带有淬灭物质；所述2条探针的5’端的荧光物质不同。本发明的试剂盒能快速鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，且对仪器要求简单，费用低，操作简单，在结核病的早期诊断和鉴别诊断方面具有广泛的应用前景。

权利要求

1.鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒，包括进行PCR扩增的引物和探针，其特征在于：所述引物包括4条引物，分别为引物1、2、3和4，所述引物1和引物2能与结核分枝杆菌的特异片段结合，所述引物3和引物4能与分枝杆菌特异片段结合；所述探针包括

2条，分别为探针1和探针2，所述探针1能与结核分枝杆菌特异片段结合，并且其结合位置位于所述引物1和引物2与结核分枝杆菌特异片段结合位置之间；所述探针2能与分枝杆菌特异片段结合，并且其结合位置位于所述引物3和引物4与分枝杆菌特异片段结合位置之间；所述探针1和所述探针2的5’端带都有荧光物质，3’端都带有淬灭物质，所述探针1和所述探针2的5’端的荧光物质不同；

所述结核分枝杆菌的特异片段为IS6110；

所述分枝杆菌特异片段为编码65kDa蛋白的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物1的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列2，所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列4，所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列5；所述探针1的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述探针2的核苷酸序列为序列表中的序列6。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光物质为FAM、HEX、TET、TAMRA、CY3、VIC、CY5、Texas Red或JOE。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述淬灭物质为TAMRA、Dabcyl或Eclipse。

说明书

鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂

盒

技术领域

[0001] 本发明涉及鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂盒。

背景技术

[0002] 结核病(Tuberculosis)是当今全球范围对人类最具威胁的感染性疾病之一，本世纪80年代中期以来在全球出现回升趋势，据世界卫生组织报道，我国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。目前我国全年龄组结核菌感染率为44.5％，全国约5.5亿人受到了结核菌感染，结核菌感染率高于全球人口感染率为1/3的水平。同时，非结核分枝杆菌(NTM)病也呈逐年上升趋势，2000年卫生部组织的流调数据显示，NTM菌株分离率上升至11.1％，NTM病临床表现与结核病相似，在无菌种鉴定结果的情况下，经常被误诊为结核病。大量研究以及临床治疗病例表明多数传统抗痨药对NTM病很少或没有疗效，传统的菌种鉴定和药敏试验方法烦琐、费时，延误病人的治疗。因此，结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌区分检测对结核病的早期诊断、鉴别诊断、个体化的有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。

[0003] 结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的区分目前仍然依靠传统的分离培养的方法，通常需要1-4周的时间才能得到确切的结果，这样大大的延误了病人的治疗，给病人造成额外的经济负担和精神负担。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂盒。

[0005] 本发明所提供的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒，包括进行PCR扩增的引物和探针，其中，所述引物包括4条引物，分别为引物1、2、3和4，所述引物1和引物2能与结核分枝杆菌的特异片段结合，所述引物3和引物4能与分枝杆菌特异片段结合；所述探针包括2条，分别为探针1和探针2，所述探针1能与结核分枝杆菌特异片段结合，并且其结合位置位于所述引物1和引物2与结核分枝杆菌特异片段结合位置之间；所述探针
2能与分枝杆菌特异片段结合，并且其结合位置位于所述引物3和引物4与分枝杆菌特异片段结合位置之间；所述探针1和所述探针2的5’端带都有荧光物质，3’端都带有淬灭物质，所述探针1和所述探针2的5’端的荧光物质不同。

[0006] 所述结核分枝杆菌的特异片段可选自如下：IS6110、16s、IS986、MTP40、38kDa、IS1081和ESAT-6。所述分枝杆菌特异片段可选自如下：16s、dnaj基因、编码65kDa蛋白的核苷酸序列、编码38kDa蛋白的核苷酸序列和编码32kDa蛋白的核苷酸序列。

[0007] 所述引物1的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1，所述引物2的核苷酸序列具体可为序列表中的序列2，所述引物3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列4，所述引物4的核苷酸序列具体可为序列表中的序列5；所述探针1的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3，所述探针2的核苷酸序列具体可为序列表中的序列6。

[0008] 所述引物1的核苷酸序列还可为序列表中的序列7，所述引物2的核苷酸序列还可为序列表中的序列8，所述引物3的核苷酸序列还可为序列表中的序列10，所述引物4的核苷酸序列还可为序列表中的序列11；所述探针1的核苷酸序列还可为序列表中的序列9，所述探针2的核苷酸序列还可为序列表中的序列12。

[0009] 所述荧光物质为FAM、HEX、TET、TAMRA、VIC、CY5、Texas Red或JOE。所述淬灭物质为TAMRA、Dabcyl或Eclipse。

[0010] 所述探针合成时，荧光物质和淬灭物质被标记在探针的末端，所用荧光物质和淬灭物质可进行选择，能提供合成服务的公司有：宝生物工程有限公司、上海生工生物工程技术服务有限公司、上海基康生物技术有限公司、ABI公司等。

[0011] 本发明的另一个目的是提供一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法。

[0012] 本发明所提供的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

[0013] 用所述的试剂盒中的引物和探针对待测菌株的核酸进行荧光定量PCR扩增，检测所得到的PCR产物的荧光信号；如果能检测到探针1的荧光信号，则待测菌为结核分枝杆菌；如果不能检测到探针1的荧光信号，而能检测到探针2的荧光信号，则待测菌为非结核分枝杆菌。

[0014] 所述非结核分枝杆菌为如下表1所示。

[0015] 表1.非结核分枝杆菌

[0016]Mycobacterium abortus 流产分枝杆菌
Mycobacterium abscessus 脓肿分枝杆菌
Mycobacterium acnes 痤疮分枝杆菌
Mycobacterium acnes 粉刺分枝杆菌)
Mycobacterium acuminatum 尖形分枝杆菌

[0017]Mycobacterium adamsoni 亚当斯氏分枝杆菌
Mycobacterium adamsoni 亚氏分枝杆菌
Mycobacterium africanum 非洲分枝杆菌
Mycobacterium agreste 乡村分枝杆菌
Mycobacterium agri 田野分枝杆菌
Mycobacterium agri 土地分枝杆菌
Mycobacterium aichiense 爱知分枝杆菌
Mycobacterium album 白色分枝杆菌
Mycobacterium alvei 蜂房分枝杆菌
Mycobacterium ammethystinum 紫晶分枝杆菌
Mycobacterium anabanti 攀登分枝杆菌
Mycobacterium anaerobium 厌氧分枝杆菌
Mycobacterium aquae 水分枝杆菌
Mycobacterium asiaticum 亚细亚分枝杆菌
Mycobacterium asiaticum 亚洲分枝杆菌
Mycobacterium asteroids 星状分枝杆菌
Mycobacterium aurum 金色分枝杆菌
Mycobacterium austroafricanum 南非分枝杆菌
Mycobacterium avium 鸟分枝杆菌
Mycobacterium avium subsp.avium 鸟分枝杆菌鸟亚种
Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis 鸟分枝杆菌副结核亚种Mycobacterium avium subsp.silvaticum 鸟分枝杆菌森林土壤亚种
Mycobacterium avium subsp.suis 鸟分枝杆菌猪亚种
Mycobacterium balnei 巴尔内氏分枝杆菌
Mycobacterium balnei 巴氏分枝杆菌
Mycobacterium berol inensis 柏林分枝杆菌
Mycobacterium bifidum 两形分枝杆菌
Mycobacterium blattelae 蟑螂分枝杆菌
Mycobacterium brevicale 短小分枝杆菌
Mycobacterium brumae 冬天分枝杆菌
Mycobacterium brunense 深褐色分枝杆菌
Mycobacterium butanitrificans 生丁硝分枝杆菌
Mycobacterium butyricum 丁酸分枝杆菌
Mycobacterium butyricum 酪酸分枝杆菌
Mycobacterium butyricum 乳酪分枝杆菌
Mycobacterium caesius 青灰分枝杆菌

[0018]Mycobacterium carotenum 胡萝卜素分枝杆菌
Mycobacterium catenaformis 链状分枝杆菌
Mycobacterium celatum 隐藏分枝杆菌
Mycobacterium chelonae 龟分枝杆菌
Mycobacterium chelonae subsp.abscessus 龟分枝杆菌脓肿亚种
Mycobacterium chelonae subsp.chelonae 龟分枝杆菌龟亚种
Mycobacterium chitae 千田分枝杆菌
Mycobacterium chlorophenolicum 氯酚红分枝杆菌
Mycobacterium cholesterolicum 胆固醇分枝杆菌
Mycobacterium chubuense 楚布分枝杆菌
Mycobacterium citreochromogenum 柠檬产色分枝杆菌
Mycobacterium citreum 柠檬色分枝杆菌
Mycobacterium coelicolor 天蓝色分枝杆菌
Mycobacterium coerulatus 似天蓝分枝杆菌
Mycobacterium coeruleum 蓝色分枝杆菌
Mycobacterium confluentis 汇合分枝杆菌
Mycobacterium convolutum 旋卷分枝杆菌
Mycobacterium cookii 库克氏分枝杆菌
Mycobacterium cookii 库氏分枝杆菌
Mycobacterium cornutum 角状分枝杆菌
Mycobacterium crystallophagum 嗜晶体分枝杆菌
Mycobacterium cuculi 布谷鸟分枝杆菌
Mycobacterium cuneatum 楔形分枝杆菌
Mycobacterium cyaneum 蓝色分枝杆菌
Mycobacterium denitrificans 反硝化分枝杆菌
Mycobacterium diastaticum 淀粉酶分枝杆菌
Mycobacterium diernhoferi 迪氏分枝杆菌
Mycobacterium dimorphum 两形分枝杆菌
Mycobacterium duvalii 杜氏分枝杆菌
Mycobacterium duvalii 杜瓦氏分枝杆菌
Mycobacterium engbaekii 恩氏分枝杆菌
Mycobacterium enteritidis 肠炎分枝杆菌
Mycobacterium enzymicum 酶分枝杆菌
Mycobacterium eos 曙光分枝杆菌
Mycobacterium equi 马分枝杆菌
Mycobacterium erythrogenes 产红分枝杆菌

[0019]Mycobacterium fallax 诡诈分枝杆菌
Mycobacterium farcinogenes 鼻疽分枝杆菌
Mycobacterium farcinogenes 产鼻疽分枝杆菌
Mycobacterium farcinogenes subsp.senegalen 产鼻疽分枝杆菌塞内加尔亚种Mycobacterium farcinogenes subsp.tchadense 产鼻疽分枝杆菌乍得亚种Mycobacterium ferrosiliceum 铁硅分枝杆菌
Mycobacterium filamentosum 丝状分枝杆菌
Mycobacterium filiforme 线形分枝杆菌
Mycobacteriumfimi 肥料分枝杆菌
Mycobacterium fimi 粪肥分枝杆菌
Mycobacterium flavescens 微黄分枝杆菌
Mycobacterium flavoviride 黄绿分枝杆菌
Mycobacterium flavum 黄色分枝杆菌
Mycobacterium flavum var.pseudoramnosum 假分枝杆菌
Mycobacterium flavum var.pseudoramnosum 假分枝状枝杆菌
Mycobacterium flavum var.tortuosum 黄色分枝杆菌多曲变种
Mycobacterium fluorescens 荧光分枝杆菌
Mycobacterium fortuitum 偶发分枝杆菌
Mycobacterium fortuitum 偶然分枝杆菌
Mycobacterium fortuitum subsp.acetamidolyticum 偶发分枝杆菌解乙酰氨亚种Mycobacterium fortuitum subsp.fortuitum 偶发分枝杆菌偶发亚种
Mycobacterium fortuitum subsp.fortuitum 偶然分枝杆菌偶然亚种
Mycobacterium fortuitum subsp.pelegrinum 偶然分枝杆菌外来亚种
Mycobacterium friedmanii 费氏分枝杆菌
Mycobacterium friedmanii 佛德曼氏分枝杆菌
Mycobacterium friedmanii 弗里德曼氏分枝杆菌
Mycobacterium fuscum 褐色分枝杆菌
Mycobacterium gadium 地斯分枝杆菌
Mycobacterium gallinarum 分枝杆菌
Mycobacterium gastri 胃分枝杆菌
Mycobacterium genavense 日内瓦分枝杆菌
Mycobacterium giae 盖?氏分枝杆菌
M???ycobacterium gilvum 浅黄分枝杆菌
M???ycobacterium gordonae 戈登分枝杆菌
Mycobacterium graminis 草分枝杆菌
Mycobacterium graminis 禾草分枝杆菌

[0020]Mycobacterium granulosum 颗粒分枝杆菌
Mycobacterium granulosum 粒状分枝杆菌
Mycobacterium griseum 灰色分枝杆菌
Mycobacterium habana 哈瓦那分枝杆菌
Mycobacterium haemophi lum 嗜血分枝杆菌
Mycobacterium hastilis 标枪分枝杆菌
Mycobacterium hastilis 矛形分枝杆菌
Mycobacterium hepatodystrophicans 胀肝分枝杆菌
Mycobacterium hiberniae 爱尔兰分枝杆菌
Mycobacterium hodgkinii 何杰金氏分枝杆菌
Mycobacterium hodgkinii 霍金氏分枝杆菌
Mycobacterium hominis 人型分枝杆菌
Mycobacterium humidus 潮湿分枝杆菌
Mycobacterium hyalinum 透明分枝杆菌
Mycobacterium insidiosum 诡诈分枝杆菌
Mycobacterium insidiosum 谲诈分枝杆菌
Mycobacterium intermedium 中间分枝杆菌
Mycobacterium intracellulare 胞内分枝杆菌
Mycobacterium johnei 约氏分枝杆菌
Mycobacterium kansasii 塔萨斯分枝杆菌
Mycobacterium komossense 科莫斯分枝杆菌
Mycobacterium lacticola 乳生分枝杆菌
Mycobacterium lacticum 乳酸分枝杆菌
Mycobacterium lactis 乳分枝杆菌
Mycobacterium leprae 麻风分枝杆菌
Mycobacterium lichenifoeme 也衣分枝杆菌
Mycobacterium limosus 淤泥分枝杆菌
Mycobacterium linens 广展分枝杆菌
Mycobacterium lipolyticum 解脂分枝杆菌
Mycobacterium lipoptenae 扁蝇分枝杆菌
Mycobacterium liquefaciens 夜化分枝杆菌
Mycobacterium luteum 藤黄分枝杆菌
Mycobacterium luteum 无色分枝杆菌
Mycobacterium madagascariense 马达加斯加分枝杆菌
Mycobacterium malmoense 马尔摩分枝杆菌
Mycobacterium marianum 海分枝杆菌

[0021]Mycobacterium marianum 海鱼分枝杆菌
Mycobacterium mesentericum 肠膜分枝杆菌
Mycobacterium methanicum 甲烷分枝杆菌
Mycobacterium michiganensis 密执安分枝杆菌
Mycobacterium microti 田鼠分枝杆菌
Mycobacterium moriokaense 莫里奥卡分枝杆菌
Mycobacterium mucogenicum 产粘液分枝杆菌
Mycobacterium mucosum 粘分枝杆菌
Mycobacterium muris 鼠分枝杆菌
Mycobacterium murisepticum 鼠败血分枝杆菌
Mycobacterium neoaurum 新金色分枝杆菌
Mycobacterium nigrum 黑色分枝杆菌
Mycobacterium nonchromogenicum 不产色分枝杆菌
Mycobacterium nonchromogenicum 无色分枝杆菌
Mycobacterium nubilum 云雾状分枝杆菌
Mycobacterium obuense 奥布分枝杆菌
Mycobacterium oligonitrophilum 嗜寡氮分枝杆菌
Mycobacterium paraffinicum 石蜡分枝杆菌
Mycobacterium parafortuitum 副偶然分枝杆菌
Mycobacterium parasmegmatis 副包皮垢分枝杆菌
Mycobacterium parasmegmatis 副耻垢分枝杆菌
Mycobacterium paratuberculosis 副结核分枝杆菌
Mycobacterium pasteurianum 巴氏分枝杆菌
Mycobacterium pasteurianum 巴斯德氏分枝杆菌
Mycobacterium paurometabolum 稍变分枝杆菌
Mycobacterium peregrinum 外来分枝杆菌
Mycobacterium periplaneticum 蟑螂分枝杆菌
Mycobacterium perrugosum 崎岖分枝杆菌
Mycobacterium petroleophilum 嗜石油分枝杆菌
Mycobacterium phlei 草分枝杆菌
Mycobacterium piscium 鱼分枝杆菌
Mycobacterium planum 平滑分枝杆菌
Mycobacterium plumosus 羽状分枝杆菌
Mycobacterium porcinum 猪分枝杆菌
Mycobacterium poriferae 多孔分枝杆菌
Mycobacterium pulveris 灰尘分枝杆菌

[0022]Mycobacterium putricum 腐臭分枝杆菌
Mycobacterium pyogenes 化脓分枝杆菌
Mycobacterium pyogenes 酿脓分枝杆菌
Mycobacterium pyogenes bovis 牛化脓性分枝杆菌
Mycobacterium pyogenes bovis 牛酿脓分枝杆菌
Mycobacterium radicicola 根瘤分枝杆菌
Mycobacterium radicicola 生根内分枝杆菌
Mycobacterium rhodesiae 罗德岛分枝杆菌
Mycobacterium rhodochrous 胭脂红分枝杆菌
Mycobacterium rhodochrous 紫红色分枝杆菌
Mycobacterium rubiacearum 茜草分枝杆菌
Mycobacterium rubropertinctum 深红分枝杆菌
Mycobacterium rubrum 红色分枝杆菌
Mycobacterium rubrum nitrosum 亚硝酸红色分枝杆菌
Mycobacterium runyonii 润氏分枝杆菌
Mycobacterium salivarium 唾液分枝杆菌
Mycobacterium salmoniphilum 喜鲑分枝杆菌
Mycobacterium scrofulaceum 瘰疬分枝杆菌
Mycobacterium segmentosum 横裂分枝杆菌
Mycobacterium senegalense 塞内加尔分枝杆菌
Mycobacterium sepedonica 腐烂分枝杆菌
Mycobacterium sepedonica 坏腐分枝杆菌
Mycobacterium shanghaiense 上海分枝杆菌
Mycobacterium shimoidei 石氏分枝杆菌
Mycobacterium simiae 猿分枝杆菌
Mycobacterium simiae 猿猴分枝杆菌
Mycobacterium simplex 单纯分枝杆菌
Mycobacterium smaragdina 翠绿分枝杆菌
Mycobacterium smaragdina 绿柱玉分枝杆菌
Mycobacterium smegmatis 包皮垢分枝杆菌
Mycobacterium smegmatis 耻垢分枝杆菌
Mycobacterium sphagni 泥炭藓分枝杆菌
Mycobacterium stercoris 粪堆分枝杆菌
Mycobacterium szulgai 斯氏分枝杆菌
Mycobacterium szulgai 苏加分枝杆菌
Mycobacterium terrae 土地分枝杆菌

[0023]Mycobacterium terrae 土分枝杆菌
Mycobacterium testudinis 龟分枝杆菌
Mycobacterium thamnopheos 蛇分枝杆菌
Mycobacterium thermoresistible 抗热分枝杆菌
Mycobacterium tokaiense 东海分枝杆菌
Mycobacterium tomidae 托氏分枝杆菌
Mycobacterium tortuosum 多曲分枝杆菌
Mycobacterium triviale 次要分枝杆菌
Mycobacterium triviale 通俗分枝杆菌
Mycobacterium tropidonoti 赤炼蛇分枝杆菌
Mycobacterium tropidonoti 水蛇分枝杆菌
Mycobacterium tumescens 肿胀分枝杆菌
Mycobacterium ulcerans 溃疡分枝杆菌
Mycobacterium ulcerogenes 产溃疡分枝杆菌
Mycobacterium vaccae 母牛分枝杆菌
Mycobacterium vadosum 浅滩分枝杆菌
Mycobacterium valentiae 瓦伦西亚分枝杆菌
Mycobacterium viridis 绿色分枝杆菌
Mycobacterium xenopi 蟾蜍分枝杆菌
Mycobacterium xenopi 蟾分枝杆菌

[0024] 使用本发明的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒能快速鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，且对仪器要求简单，费用低，操作简单，在结核病的早期诊断和鉴别诊断方面具有广泛的应用前景。

附图说明

[0025] 图1为实施例1中结核分枝杆菌FAM通道和HEX通道扩增曲线图。

[0026] 图2为实施例1中堪萨斯分枝杆菌FAM通道和HEX通道扩增曲线图。

[0027] 图3为实施例2中结核分枝杆菌FAM通道和HEX通道扩增曲线图。

[0028] 图4为实施例2中堪萨斯分枝杆菌FAM通道和HEX通道扩增曲线图。

具体实施方式

[0029] 实施例1、结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的鉴别

[0030] 鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒由如下部分组成：提取核酸的试剂、PCR反应试剂、引物、探针、阳性标本对照和阴性标本对照及说明书。其中的引物为引物P1和P2，引物P3和P4，探针1的5’端带有FAM荧光标记，3’端带有Eclipse荧光淬灭基团。探针2的5’端带有HEX荧光标记，3’端带有Eclipse荧光淬灭基团。

[0031] 引物P1和P2是针对结核分枝杆菌IS6110序列设计，引物P1和P2的核苷酸序列如下：

[0032] 引物P1：5’-AAGCCCGCAGGACCACGAT-3’(序列表中的序列1)；

[0033] 引物P2：5’-CGTAGGCGTCGGTGACAAAGG-3’(序列表中的序列2)。

[0034] 探针1的序列如下：

[0035] 5’-CCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCG-3’(序列表中的序列3)。

[0036] 引物P3和P4是针对分枝杆菌65kDa蛋白的核苷酸序列设计的，引物P3和P4的核苷酸序列如下：

[0037] 引物P3：5’-AGACCAAGGAGCAGATCGCT-3’(序列表中的序列4)；

[0038] 引物P4：5’-CGCATACCCTCGGTGAGCT-3’(序列表中的序列5)。

[0039] 探针2的序列如下：

[0040] 5’-TGATGACACCCTCGTTGCCGACC-3’(序列表中的序列6)。

[0041] 以结核分枝杆菌的核酸和堪萨斯分枝杆菌的核酸作为模板。结核分枝杆菌的核酸和堪萨斯分枝杆菌的核酸(结核PCR检测参考品)购自中国生物制品鉴定所。

[0042] 反应体系如下：2×Real time taqman buffer(博奥公司)10μl，Taq酶0.3μl，引物P1和P2(10uM)各0.6μl，探针1(10uM)0.8μl；引物P3和P4(10uM)各1.2μl，探针2(10uM)0.8μl；模板2μl，H2O 2.5μl。

[0043] 在ABI 7700进行反应检测，程序如下：先94℃ 3min，然后94℃ 15sec、60℃30sec进行40个循环，荧光信号采集点在60℃ 30sec。

[0044] PCR扩增结果如图1和2所示，表明以结核分枝杆菌核酸为模板进行扩增时，FAM通道出现扩增信号；以堪萨斯分枝杆菌(非结核分枝杆菌)核酸为模板进行扩增时，FAM通道没有扩增信号，仅有HEX通道有扩增信号。

[0045] 实施例2、结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的鉴别

[0046] 鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒由如下部分组成：提取核酸的试剂、PCR反应试剂、引物、探针、阳性标本对照和阴性标本对照及说明书。其中的引物为引物P1和P2，引物P3和P4，探针1的5’端带有FAM荧光标记，3’端带有Eclipse荧光淬灭基团。探针2的5’端带有HEX荧光标记，3’端带有Eclipse荧光淬灭基团。

[0047] 引物P1和P2是针对结核分枝杆菌MTP40序列设计，引物P1和P2的核苷酸序列如下：

[0048] 引物P1：5’-CAAGTTGGGTCTGGTCGAATTC-3’(序列表中的序列7)；

[0049] 引物P2：5’-CACACCTCGCAATTGAAGTTGA-3’(序列表中的序列8)。

[0050] 探针3的序列如下：

[0051] 5’-TGAGGTCATGTCGCCAACCACGCC-3’(序列表中的序列9)。

[0052] 引物P3和P4是针对分支杆菌16s序列的核苷酸序列设计的，引物P3和P4的核苷酸序列如下：

[0053] 引物P3：5’-GGATTGACGGTAGGTGGAGAAG-3’(序列表中的序列10)；

[0054] 引物P4：5’-TTCACGAACAACGCGACAAAC-3’(序列表中的序列11)。

[0055] 探针2的序列如下：

[0056] 5’-CCAACTACGTGCCAGCAGCCGC-3’(序列表中的序列12)。

[0057] 以结核分枝杆菌的核酸和堪萨斯分枝杆菌的核酸作为模板。结核分枝杆菌的核酸和堪萨斯分枝杆菌的核酸(结核PCR检测参考品)购自中国生物制品鉴定所。

[0058] 反应体系如下：2×Real time taqman buffer(博奥公司)10μl，Taq酶0.3μl，引物P1和P2(10uM)各0.6μl，探针1(10uM)0.8μl；引物P3和P4(10uM)各1.2μl，探针2(10uM)0.8μl；模板2μl，H2O2.5μl。

[0059] 在ABI 7700进行反应检测，程序如下：先94℃ 3min，然后94℃ 15sec、60℃30sec进行40个循环，荧光信号采集点在60℃ 30sec。

[0060] PCR扩增结果如图3和4所示，表明以结核分枝杆菌核酸为模板进行扩增时，FAM通道出现扩增信号；以对堪萨斯分枝杆菌(非结核分枝杆菌)核酸为模板进行扩增时，FAM通道没有扩增信号，仅有HEX通道有扩增信号。

[0061] 序列表

[0062] <110>博奥生物有限公司清华大学

[0063] <120>鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂盒[0064] <130>CGGNARW81966

[0065] <160>12

[0066] <210>1

[0067] <211>19

[0068] <212>DNA

[0069] <213>人工序列

[0070] <220>

[0071] <223>

[0072] <400>1

[0073]

[0074] <210>2

[0075] <211>21

[0076] <212>DNA

[0077] <213>人工序列

[0078] <223>

[0079] <400>2

[0080]

[0081] <210>3

[0082] <211>24

[0083] <212>DNA

[0084] <213>人工序列

[0085] <220>

[0086] <223>

[0087] <400>3

[0088]

[0089] <210>4

[0090] <211>20

[0091] <212>DNA

[0092] <213>人工序列

[0093] <220>

[0094] <223>

[0095] <400>4

[0096]

[0097] <210>5

[0098] <211>19

[0099] <212>DNA

[0100] <213>人工序列

[0101] <220>

[0102] <223>

[0103] <400>5

[0104]

[0105] <210>6

[0106] <211>23

[0107] <212>DNA

[0108] <213>人工序列

[0109] <220>

[0110] <223>

[0111] <400>6

[0112]

[0113] <210>7

[0114] <211>22

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