一种现场培养微生物用于快速生化需氧量检测的方法

摘要

本发明提供了一种现场培养微生物用于快速生化需氧量检测的方法。现场培养微生物是指以流动体系中载流的管路为载体，以含有有机物和微生物的水样在管路中的流动为前提，使水样中微生物吸附在管路内壁表面的方法。以流动分析体系中载流的管路为载体进行环境水体中微生物的现场吸附，一方面所吸附的微生物对该水体中的有机物具有特异性的降解能力，所得结果更具有针对性；另一方面，微生物在管路内壁的吸附状态最接近于其自然生存的状态，微生物的活性得到了最大的保持。以往BOD传感器的生物膜使用寿命一般不超过3个月，且维护烦琐；本发明的方法省去了微生物实验室培养，微生物膜的制备、保存，活化等诸多问题，所吸附的微生物在连续的分析测试过程中能始终保持其生理活性状态，应用前景非常广阔。

权利要求

1.一种现场培养微生物用于快速生化需氧量检测的方法，其特征在于条件和步骤如下：

1)所使用的装置：

计算机(1)、第一数据线(2)、电化学工作站(3)、第二数据线(4)、氧电极(5)、出液口(6)、进液口(7)、载流管(8)、蠕动泵(9)、四位三通电磁阀(10)、第一进样管(11)、第二进样管(12)、第三进样管(13)、水样杯(14)、缓冲溶液杯(15)、标准溶液杯(16)、进样泵(17)、水源(18)、出样管(19)和恒温水浴(20)；其中，计算机(1)、电化学工作站(3)和氧电极(5)分别通过第一数据线(2)、第二数据线(4)顺次连接；氧电极(5)具有一个进液口(7)和一个出液口(6)；四位三通电磁阀(10)分别连接第一进样管(11)、第二进样管(12)、第三进样管(13)和出样管(19)；第一进样管(11)、第二进样管(12)、第三进样管(13)分别插入水样杯(14)、缓冲溶液杯(15)、标准溶液杯(16)中；出样管(19)与蠕动泵(9)、载流管(8)和氧电极(5)的进样口(7)依次连接；水源(18)的水样经进样泵(17)注入水样杯(14)中，载流管(8)放置于恒温水浴(20)中；

2)现场培养微生物

水样杯(14)中预先通过进样泵(17)从水源(18)注入水样，水样杯(14)中的空气饱和的水样经过第一进样管(11)、四位三通电磁阀(10)、出样管(19)和蠕动泵(9)到达载流管(8)内；此时进样泵(17)以同蠕动泵(9)一致的流量从水源(18)向水样杯(14)中补充水样，恒温水浴(20)开启，用来保证流经载流管(8)的水样温度恒定；含有微生物的水样在流经载流管(8)时，其中的微生物逐步的吸附在载流管(8)的内壁上，完成现场培养微生物；

3)体系的清洗

缓冲溶液杯(15)中的空气饱和的缓冲溶液通过第二进样管(12)，四位三通电磁阀(10)、出样管(19)和蠕动泵(9)到达载流管(8)，用来清洗体系中残留的有机物，直到电化学工作站(3)检测氧电极(5)输出的电流信号达到稳定，此时的稳定值代表着空气饱和的缓冲溶液中溶解氧的含量；

4)标准溶液检测

首先进行步骤3)的体系的清洗工作，然后配制所需浓度的标准溶液置于标准溶液杯(16)中，空气饱和的标准溶液经第三进样管(13)、四位三通电磁阀(10)、出样管(19)和蠕动泵(9)到达载流管(8)中，标准溶液中的溶解氧被管路内壁吸附的微生物消耗，因此电化学工作站(3)检测氧电极(5)输出的电流信号降低，电流信号降低值代表被载流管(8)内壁吸附的好氧性微生物消耗的氧的含量；

5)判断现场培养微生物的完成

重复上述步骤2)和步骤4)，直到进行步骤4)时电化学工作站(3)检测氧电极(5)输出的电流信号降低值与前两次测定结果一致时，表面载流管(8)内壁吸附的微生物的量达到恒定，此时现场培养微生物的准备工作完成，更换体系中的第一进样管(11)和出样管(19)以进行下一步的工作；

6)标准曲线的制定

配制一系列浓度的标准溶液并分别置于标准溶液杯(16)中，重复步骤4)，一一进行标准曲线的制定；此时对应每个浓度的标准溶液都有相应的电流降低值，因此可绘制一条电流响应-生化需氧量的标准曲线；

7)水样测试

当现场培养工作及标准曲线制定完成后，即可进行水样的测试，每次测试前都需进行上述步骤3)的工作，以保证体系被缓冲溶液清洗干净，氧电极(5)表面的溶解氧含量达到稳定；水样杯(14)中的空气饱和的水样经第一进样管(11)、四位三通电磁阀(10)、出样管(19)和蠕动泵(9)到达载流管(8)，其中的溶解氧被载流管(8)内壁所吸附的微生物消耗，导致电化学工作站(3)检测到的氧电极(5)的电流值降低，降低值根据上述标准曲线便可换算出该水样的生化需氧量的含量。

说明书

一种现场培养微生物用于快速生化需氧量检测的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种现场培养微生物检测生化需氧量(BOD)的方法。它是基于流动分析体系中以流通的管路为基体吸附水样中的耗氧微生物用于快速检测BOD的方法。

背景技术

[0002] 生化需氧量是分析水体有机污染物含量的重要指标，是水质常规监测中最重要的参数之一。现行的标准稀释法(BOD5法)存在许多不足之处，如时间长、工作量大、操作繁琐、受干扰因素多、重复性差且不能及时反映水质变化，不能实现水质的在线监测。

[0003] 自1977年日本科学家Isao Karube研制出首台BOD微生物传感器后，国内外许多研究组开发了基于不同微生物、不同固定化方法的BOD微生物膜传感器，已有数百篇相关的论文、专利。这类BOD传感器中微生物膜的制备方法一般为：培养所需要的微生物，如Trichosporon cutaneum，Pseudomonas putida，Bacillus licheniformis或混合微生物，如活性污泥，BODseed等。培养的微生物经离心、定量后吸附在纤维素膜、透析膜等表面，或是采用溶胶-凝胶类聚合物包埋微生物制得生物膜。使用时，将生物膜紧贴于氧电极表面，含有有机污染物的水样流过微生物膜表面时发生反应，依据微生物呼吸作用的强弱与有机物含量成比例，从而检测水样的BOD值。这种方法因微生物的种类、数量及固定化材料的性质等限制了BOD生物传感器的应用。如，生物膜需要特定的制备技术、低温储藏、保存及使用寿命不长、使用前需较长的活化等带来应用上的困难。另一方面，环境水体中有机污染物的组分和含量差别很大，而传感器所固定的微生物对不同的有机物表现出来的呼吸速率明显不同，因而限制了BOD生物传感器的适用范围。水体中的微生物具有很强的吸附能力，几乎能在任何介质表面吸附并保持其生物活性的稳定。在近些年的生物电池研究领域，科学家们已经从活性污泥中针对性的富集到电活性微生物用于生物燃料电池的发电研究。为此，采用环境水体中的好氧微生物为构建BOD传感器的微生物源，针对性的检测该类水体，将在最大程度上解决BOD生物传感器在测量实际样品时的实用性问题。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种基于现场培养的微生物检测BOD的方法。现场培养微生物具体是指一种以流动分析体系中载流的管路为基体，以含有有机物和微生物的水样在管路中的流动为前提，使得水样中的耗氧微生物吸附在管路内壁方法。基于此方法检测BOD是用现场培养的微生物替代以往覆盖在电极表面的生物膜。具体是将吸附有现场培养微生物的管路连接在流动分析体系中，其出水口处连接有氧电极。当含有有机物的水样在流经此管路后，其溶解氧被管壁所吸附的好氧性微生物消耗，且消耗量与该水样的有机物含量在线性相关，据此换算水样的BOD值。

[0005] 一种现场培养微生物检测BOD的方法，其特征在于条件和步骤如下：

[0006] (1)本方法所使用的装置

[0007] 如图1所示，所使用的装置有：计算机1、第一数据线2、电化学工作站3、第二数据线4、氧电极5、出液口6、进液口7、载流管8、 蠕动泵9、四位三通电磁阀10、第一进样管11、第二进样管12、第三进样管13、水样杯14、缓冲溶液杯15、标准溶液杯16、进样泵17、水源18、出样管19和恒温水浴20；其中，计算机1、电化学工作站3和氧电极5分别通过第一数据线2、第二数据线4顺次连接；氧电极5具有一个进液口7和一个出液口6；四位三通电磁阀10分别连接第一进样管11、第二进样管12、第三进样管13和出样管19；第一进样管11、第二进样管12、第三进样管13分别插入水样杯14、缓冲溶液杯15、标准溶液杯16中；出样管19与蠕动泵9、载流管8和氧电极5的进样口7依次连接；水源18的水样经进样泵17注入水样杯14中，载流管8放置于恒温水浴20中；

[0008] 本发明的流动分析体系是指蠕动泵以固定流速使空气饱和的水样流过管路，到达氧电极并检测水样中剩余溶解氧的一套分析方法，流动分析体系具体的说就是指水样杯14、缓冲溶液杯15或标准溶液杯16中的水样、缓冲溶液或标准溶液分别经过第一进样管
11、第二进样管12和第三进样管13、四位三通电磁阀10、出样管19、蠕动泵9流经载流管8到达氧电极5表面的分析方法；

[0009] 本发明的电化学检测溶解氧是指水样、缓冲溶液或标准溶液中的溶解氧在到达氧电极5时，被电化学工作站3转变成电流信号并通过计算机1进行监测的方法。

[0010] (2)现场培养微生物

[0011] 水样杯14中预先通过进样泵17从水源18注入水样，水样杯14中的空气饱和的水样经过第一进样管11、四位三通电磁阀10、出样管19和蠕动泵9到达载流管8内；此时进样泵17以同蠕动泵9一致的流量从水源18向水样杯14中补充水样。恒温水浴20开启，用来保证流 经载流管8的水样温度恒定；含有微生物的水样在流经载流管8时，其中的微生物逐步的吸附在载流管8的内壁上，完成现场培养微生物；

[0012] (3)体系的清洗

[0013] 缓冲溶液杯15中的空气饱和的缓冲溶液通过第二进样管12，四位三通电磁阀10、出样管19和蠕动泵9到达载流管8，用来清洗体系中残留的有机物，直到电化学工作站3检测氧电极5输出的电流信号达到稳定，此时的稳定值代表着空气饱和的缓冲溶液中溶解氧的含量；

[0014] (4)标准溶液检测

[0015] 首先进行步骤(3)的体系的清洗工作，然后配制所需浓度的标准溶液置于标准溶液杯16中，空气饱和的标准溶液经第三进样管13、四位三通电磁阀10、出样管19和蠕动泵9到达载流管8中，标准溶液中的溶解氧被管路内壁吸附的微生物消耗，因此电化学工作站
3检测氧电极5输出的电流信号降低，电流信号降低值代表被载流管8内壁吸附的好氧性微生物消耗的氧的含量；

[0016] (5)判断现场培养微生物的完成

[0017] 重复上述(2)和(4)的步骤，直到进行步骤(4)时电化学工作站3检测氧电极5输出的电流信号降低值与前两次测定结果一致时，表明载流管8内壁吸附的微生物的量达到恒定，此时现场培养微生物的准备工作完成，更换体系中的第一进样管11和出样管19以进行下一步的工作；

[0018] (6)标准曲线的制定

[0019] 配制一系列浓度的标准溶液并分别置于标准溶液杯16中，重复步骤(4)，一一进行标准曲线的制定；此时对应每个浓度的标准溶液都有相应的电流降低值，因此可绘制一条电流响应-BOD的标准曲线；

[0020] (7)水样测试

[0021] 当现场培养工作及标准曲线制定完成后，即可进行水样的测试，每次测试前都需进行上述步骤(3)的工作，以保证体系被缓冲溶液清洗干净，氧电极5表面的溶解氧含量达到稳定；水样杯14中的空气饱和的水样经第一进样管11、四位三通电磁阀10、出样管19和蠕动泵9到达载流管8，其中的溶解氧被载流管8内壁所吸附的微生物消耗，导致电化学工作站3检测到的氧电极5的电流值降低，降低值根据上述标准曲线便可换算出该水样的BOD含量。

[0022] 本发明具有以下优点：以往快速BOD测定中使用的生物膜中所固定的微生物均是在实验室内特定培养的，对不同种类的环境水样的针对性不强。因此，大部分所建立的方法仅仅应用于实验室研究。本发明所提出的以流动分析体系中载流的管路为载体进行环境水体中微生物的现场吸附，一方面所吸附的微生物对该水体的有机物具有特异性的降解能力，所得结果更具有针对性，另外这一体系更适合快速BOD的在线检测，将更好地改善快速BOD的实用性；

[0023] 以往快速BOD传感器是将微生物膜覆盖在氧电极表面，依据有机物和溶解氧向电极表面扩散时氧被微生物消耗而测量，测量信号取决于微生物的呼吸速率。而本发明中所提出的方法是以流动分析体系中的管路为微生物吸附的载体，以氧电极为探针进行电化学检测。一方面，所吸附的微生物的种类和数量成数量级地增加，水样中的有机物被微生物消耗，同时溶解氧浓度明显下降；另一方面，避免了微生物h膜贴在氧电极表面对氧的扩散阻碍，使得这一方法的检测灵敏度将大大增加；

[0024] 以往快速BOD传感器生物膜的使用寿命一般不超过3个月，并且在实际应用中传感器的日常维护烦琐；本发明的方法省去了前期的微生物实验室培养，微生物膜的制备、保存，使用前的活化等诸多问题，另外，所吸附的微生物在连续的分析测试过程中能始终保持其生理活性状态，使用寿命大大延长，因此实际应用前景非常广阔。

附图说明

[0025] 图1是本发明提供的基于现场培养微生物用于BOD检测的流程示意图。

[0026] 实施例1 检测牛奶厂水样

[0027] 样品杯14中预先注入300ml牛奶厂水样，并以3L/min的速率对其进行空气饱和。载流管8为长180cm，材料为乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(EVA)的塑料管，内径为1.2mm。载流管8放置于恒温水浴中，温度为30°C。培养开始后，蠕动泵9以1.0ml/min的流量从水样杯14中输送水样经载流管8到达氧电极5表面，同时，水源18的水样经进样泵17以1.0ml/min的流量向水样杯14中补给。培养进行48h后，将BOD5为20.0mg/L的GGA标 准溶液注入标准溶液杯16中，5mM的磷酸盐缓冲溶液注入缓冲溶液杯15中，并对二者进行3L/min的空气饱和。更改四位三通电磁阀10的流通方向，用磷酸盐缓冲溶液清洗载流管8，使电化学工作站3检测氧电极5输出的电流达到稳定，此时信号为684nA。将上述的20.0mg/L的GGA标准溶液连续地输送到载流管8中，电化学工作站3检测到氧电极5输出的电流从
684nA逐渐降低到507nA。上述过程每隔4小时重复一次。在现场培养进行到60h时，电化学工作站3检测到氧电极5输出的电流从673nA逐渐降低到471nA，此结果与前面52h，56h的结果一致。现场培养微生物的准备工作完成，更换体系中的第一进样管11和出样管19，准备用于实际水样的测试。分别配制BOD含量为0.0，8.0，16.0，32.0，48.0mg/L的GGA标准溶液于标准溶液杯16中并按上述流程依次检测，电化学工作站3检测氧电极5的电流变化值并计算标准曲线。按如上检测流程测定将该牛奶厂水样按体积比1∶19稀释后注入水样杯14中测量。根据所得标准曲线计算牛奶厂水样BOD为246±12.3mg/L。按国标方法对该水样进行5日生化培养得到BOD5为290±43.5mg/L。

[0028] 上述蠕动泵9，进样泵17型号为BT100-1J，电化学工作站3型号为CHI832b，恒温水浴20和氧电极5为自制。

[0029] 实施例2检测城市污水处理厂经沉降的生化曝气池水样

[0030] 水样杯14中预先注入300ml城市污水处理厂经沉降的生化曝气池水样，并以3L/min的速率对其进行空气饱和。载流管8为长120cm，内径为1.6mm的玻璃管。首先将载流管8的内壁用HF/NH4F溶液(1.7％∶2.3％，w∶w)腐蚀，使之粗糙化。载流管8放置于恒温水浴中，温度为37℃。培养开始后，蠕动泵9以0.5ml/min的流量从水样杯14中输送水样经载流管8到达氧电极5表面，同时，水源18的水样经进样泵17以0.5ml/min的流量向水样杯14中补给。现场培养建立24h后，将BOD5为5.0mg/L的GGA标准溶液注入标准溶液杯16中，5mM的磷酸盐缓冲溶液注入缓冲溶液杯15中，并对二者进行3L/min的空气饱和。更改四位三通电磁阀10的流通方向，用磷酸盐缓冲溶液清洗载流管8，使电化学工作站3检测氧电极5输出的电流达到稳定，此时信号为666nA。将上述的5.0mg/L的GGA标准溶液连 续地输送到载流管8中，电化学工作站3检测到氧电极5输出的电流从666nA逐渐降低到
562nA。上述过程每隔2小时重复一次。在现场培养进行到32h时，电化学工作站3检测到氧电极5输出的电流从666nA逐渐降低到527nA，此结果与前面28h，30h的结果一致。现场培养微生物的准备工作完成，更换体系中的第一进样管11和出样管19，准备用于实际水样的测试。分别配制BOD含量为0.0，2.0，4.0，8.0，10.0mg/L的GGA标准溶液于标准溶液杯16中并按上述流程依次检测，电化学工作站3检测氧电极5的电流变化值并计算标准曲线。按如上检测流程测定该污水处理厂生化曝气池水样并根据所得标准曲线计算水样BOD为6.3±0.6mg/L。按国标方法对该水样进行5日生化培养得到BOD5为6.6±1.2mg/L。

[0031] 上述蠕动泵9，进样泵17型号为BT100-1J，电化学工作站3型号为CHI832b，恒温水浴20和氧电极5为自制。

[0032] 实施例3检测污水处理厂经初沉、粗过滤的水样

[0033] 水样杯14中预先注入300ml污水处理厂经初沉、粗过滤的水样，并以3L/min的速率对其进行空气饱和。载流管8为长120cm，内径为1.6mm的玻璃管。首先将载流管8的内壁用HF/NH4F溶液(1.7％∶2.3％，w∶w)腐蚀，使之粗糙化。清洗干净的玻璃管中注入1M NaOH并连续超声30min，然后用去离子水充分清洗。将2mg的羧基化的多壁碳纳米管(MWNTs)溶于10ml 1.0mg/mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)和0.5M NaCl的水溶液中超声3小时。15000rpm离心10min后收集MWNTs-PDDA复合体并用去离子水充分清洗。将MWNTs-PDDA复合体溶于水中并超声使之溶解，然后迅速将此混合液注入载流管8中并停留30min，处理后的载流管用去离子水 充分清洗后连接在分析体系中。载流管8放置于恒温水浴中，温度为37℃。培养开始后，蠕动泵9以1.0ml/min的流量从水样杯14中输送水样经载流管8到达氧电极5表面，同时，水源18的水样经进样泵17以1.0ml/min的流量向水样杯14中补给。体系建立18h后，BOD5为20.0mg/L的GGA标准溶液注入标准溶液杯16中，5mM的磷酸盐缓冲溶液注入缓冲溶液杯15中，并对二者进行3L/min的空气饱和。更改四位三通电磁阀10的流通方向，用磷酸盐缓冲溶液清洗载流管8，使电化学工作站3检测氧电极5输出的电流达到稳定，此时信号为647nA。将上述的20.0mg/L的GGA标准溶液连续地输送到载流管8中，电化学工作站3检测到氧电极5输出的电流从647nA逐渐降低到
411nA。上述过程每隔1小时重复一次。在现场培养进行到20h时，电化学工作站3检测到氧电极5输出的电流从658nA逐渐降低到417nA，此结果与前面18h，19h的结果基本一致。
现场培养微生物的准备工作完成，更换体系中的第一进样管11和出样管19，准备用于实际水样的测试。分别配制BOD含量为0.0，8.0，16.0，32.0，48.0mg/L的GGA标准溶液于标准溶液杯16中并按上述流程依次检测，电化学工作站3检测氧电极5的电流变化值并计算标准曲线。按如上检测流程测定该污水处理厂初沉水样并根据所得标准曲线计算水样BOD为
31.4±1.8mg/L。按国标方法对该水样进行5日生化培养得到BOD5为28.2±3.4mg/L。

[0034] 上述蠕动泵9，进样泵17型号为BT100-1J，电化学工作站3型号为CHI832b，恒温水浴20和氧电极5为自制。