一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒

摘要

本发明涉及一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的AGT引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照DNA，其特征是，所述的AGT引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为：F：5′-GCCGTTTCTCCTTGGTCT-3′和R：5′-GCAAGACGTTTATTACTAACACAAG-3′；所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为：F：5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R：5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’。本发明能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水肿的预防和治疗，有利于进入高原人群健康；该试剂盒使用简单，操作方便，检测快速。

权利要求

1.一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的AGT引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照DNA，其特征是，所述的AGT引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为：F：5’-GCCGTTTCTCCTTGGTCT-3’和vR：5’-GCAAGACGTTTATTACTAACACAAG-3’；

所述的Beta-act in引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为：F：5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R：5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’；

所述的PCR反应液，含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SYBR染料、Ex Taq酶；

用Beta-actin的上下游引物在PTC-200PCR仪中进行目的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆载体pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序验证；从证实含Beta-actin基因片段的菌液中提取质粒作为定值标准品；所述的定值标准

4 5 6

品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每管体积200μl，浓度分别为1×10、1×10、1×10、

7 8

1×10、1×10 拷贝/μl；

所述的健康对照DNA是从拟进入高原前的人员的静脉血中提取的白细胞DNA，并且该人员到高原后在一周内没有发生高原肺水肿，DNA浓度为50ng/μl；所述的AGT引物混合液为100μl；其中上游引物和下游引物各50μl，浓度均为10pmol/μl；

所述的Beta-actin引物混合液为400μl；其中上游引物和下游引物各200μl，浓度均为10pmol/μl；

所述的无菌去离子水为1500μl。

说明书

一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂

盒

技术领域

[0001] 本发明涉及检测用的试剂盒，具体涉及一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，用于评定人体高原肺水肿的易感性。

背景技术

[0002] 高原肺水肿(high altitude pulmonary edema，缩写HAPE)是一种特发于高原低氧环境的肺水肿，起病急，进展快，危害大，如果救治不及时，可在较短的时间内发展至呼吸衰竭，甚至死亡，是严重威胁进入高原人群健康和生命的急性重症高原病。近年的调查表明，在从平原进入海拔3000米以上高原的汉族人群中，高原肺水肿的发病率高达0.4％-2％。高原肺水肿发病有明显的家族和个体易感倾向，环境因素和遗传因素均可以影响高原肺水肿的发生。近年来，遗传因素在高原肺水肿发病机制中的作用逐渐受到重视【张雪峰，高原施工人群急性重型高原病患病率调查，《高原医学杂志》，2005；15(3)：7-8；陈有，高原肺水肿发病机制研究进展，《高原医学杂志》，2005，15(2)：62-64；高钰琪，高原肺水肿的发病机制及防治，《人民军医》，2005；482(2)：108-111】。

[0003] 肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，缩写为RAS)在血压调节、电解质平衡及高原肺水肿发病中具有非常重要的作用，它由一系列肽类激素及相应的酶组成。其中AGT经肾素分解形成血管紧张素I，再经血管紧张素转换酶作用形成有生物活性的八肽血管紧张素II，可引起血管收缩，刺激肾脏对钠重吸收，最终导致高原肺水肿。人类血管紧张素原(angiotensinogen，缩写为AGT) 基因位于1号染色体q42～43，全长13kb，包括启动子的5′侧翼序列、5个外显子和4个内含子及第1外显子前端的多个调节片段【沈志霞，血管紧张素原基因多态性与原发性高血压之间的关系，《中国现代医学杂志》，2008，18(06)：722-725】。目前有文献报道，一些基因的拷贝数与疾病的易感性相关，并是一些疾病的遗传标记【Braude I，Large scale copy numbervariat ion(CNV)at
14q12 is associated with the presence of genomicabnormalities in neoplasia，《BMC Genomics》，20067：138.】，关于AGT拷贝数与高原肺水肿易感的相关性尚无报道。 [0004] 通过SYBR(即SYBR GREEN染料，缩写SYBR)定量PCR(聚合酶链反应)的方法检测AGT拷贝数，发现AGT拷贝数与高原肺水肿易感性之间存在相关性。具体做法是： [0005] (1)健康对照组标本(25例)：在成都采集拟进入高原人员静脉血2ml(EDTA抗凝)，然后与他们一起乘飞机达到拉萨(海拔3658米)，并观察他们在拉萨一周内没有发生高原肺水肿；

[0006] (2)高原肺水肿病例组标本(25例)：为与健康对照组标本年龄匹配，按高原病诊断标准【我国高原病命名、分型及诊断标准，《高原医学杂志》，1996：2-4】符合高原肺水肿诊断标准的病例。样本收集过程中遵循“赫尔辛基”宣言，本研究得到了收集对象的知情同意，采集静脉血2ml(EDTA抗凝)。

[0007] (3)分别用上海生工生物技术服务有限公司UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒(货号SK1342)提取健康对照组标本和高原肺水肿病例组标本血液白细胞DNA，然后采用定量PCR(SYBR染料法)的方法分别扩增健康对照组标本和高原肺水肿病例组标本的AGT基因和核基因编码的看家基因Beta-actin；再 分别计算每例标本的AGT拷贝数与Beta-actin的拷贝数的比值，结果经SPSS12.0(一种统计软件)中的独立样本T检验进行检验，以P<0.05为相差显著，并通过该软件计算出95％的可信区间，以分别得到健康对照组和高原肺水肿病例组AGT/Beta-actin拷贝数的参考值，结果发现在高原肺水肿病例组中AGT/Beta-actin的拷贝数比值显著升高(表1)。

[0008] 表1　高原肺水肿病例组和健康对照组中AGT/Beta-actin拷贝数比值 [0009]健康对照组(n＝25) 高原肺水肿病例组(n＝25)
AGT/Beta-actin 0.0909±0.0227 0.1107±0.0227▲
95％可信区间 0.0806-0.1012 0.1003-0.1210

[0010] ▲高原肺水肿病例组vs健康对照组：P＝0.007

发明内容

[0011] 本发明的目的是提供一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水肿的预防和治疗，减轻急性重症高原病的威胁。

[0012] 本发明所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的AGT引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照DNA，其特征是，

[0013] 所述的AGT引物混合液中的上游引物(F)和下游引物(R)的序列为：

[0014] F：5′-GCCGTTTCTCCTTGGTCT-3′和R：5′-GCAAGACGTTTATTACTAACACAAG-3′； [0015] 所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为： [0016] F：5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R：5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’； [0017] 所述的PCR反应液，含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs(脱氧核苷三磷酸)、SYBR 染料、Ex Taq酶；

[0018] 所述的定值标准品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200PCR仪中进行目的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆载体pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序验证；从证实含Beta-actin基因片段的菌液中提取质粒。 [0019] 所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述的健康对照DNA是采集拟进入高原前的人员的静脉血2ml(EDTA抗凝)，并且到高原后在一周内没有发生高原肺水肿，然后，提取血液白细胞DNA，再将DNA浓度调为50ng/μl。 [0020] 所述的通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述的AGT引物混合液为100μl；其中上游引物和下游引物各50μl，浓度均为10pmol/μl。 [0021] 所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述的Beta-actin引物混合液为400μl；其中上游引物和下游引物各200μl，浓度均为10pmol/μl。

[0022] 所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述的定4 5
值标准品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每管体积200μl，浓度分别为1×10、1×10、
6 7 8
1×10、1×10、1×10 拷贝/微升。

[0023] 所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述的无菌去离子水为1500μl。

[0024] 本发明建立了利用定量PCR(SYBR染料法)方法检测来AGT拷贝数的方法，能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水肿的预防 和治疗，减轻急性重症高原病的威胁，有利于进入高原人群健康；该试剂盒使用简单，操作方便，检测快速。 具体实施方式

[0025] 本发明所述的通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的AGT引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照DNA；

[0026] 试剂盒中的AGT引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为：

[0027] F：5′-GCCGTTTCTCCTTGGTCT-3′和R：5′-GCAAGACGTTTATTACTAACACAAG-3′； [0028] 试剂盒的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为： [0029] F：5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R：5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’； [0030] 试剂盒中的PCR反应液，含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs(脱氧核苷三磷酸)、SYBR染料、Ex Taq酶，均直接购于宝生物工程(大连)有限公司，货号DRR041S。

[0031] 试剂盒中的定值标准品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200PCR仪中进行目的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆载体pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序验证；从证实含Beta-actin基因片段的菌液中提取质粒。 [0032] 试剂盒中的健康对照DNA是采集拟进入高原前的人员的静脉血2ml(EDTA抗凝)，并且到高原后在一周内没有发生高原肺水肿，然后，提取血液白细胞DNA，再将DNA浓度调为50ng/μl。

[0033] 试剂盒中的AGT引物混合液为100μl；其中上游引物和下游引物各50μl，浓度均为10pmol/μl。

[0034] 试剂盒中的Beta-actin引物混合液为400μl；其中上游引物和下游引物各200μl，浓度均为10pmol/μl。

[0035] 试剂盒中的定值标准品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每管体积200μl，浓度4 5 6 7 8
分别为1×10、1×10、1×10、1×10、1×10 拷贝/μl。

[0036] 试剂盒中的无菌去离子水为1500μl。

[0037] 试剂盒中的定值标准品用Beta-actin上下游引物，在PTC-200PCR仪中进行扩增，条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s......其中94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s循环29次，72℃终末延伸8min，PCR产物经电泳检测后用将目的片段(扩增产物)插入克隆载体pMD18-T(购于宝生物工程有限公司)中，并将阳性克隆增菌后测序验证；

[0038] 从证实含有Beta-actin基因片段的菌液中提取质粒，采用分光光度仪测得质粒浓度，再算出摩尔浓度(质量除以碱基数÷324.5÷10)，再乘以阿拂加的罗常数23 8
(6.02×10 )，得到质粒的浓度为1×10 拷贝/μl。将质粒进行倍比稀释(共稀释五个梯度)。稀释后将标准品(即上述质粒)分别装在200μl小管内，于-20℃的冰箱内保存，避免质粒反复冻融导致降解；

[0039] 健康对照DNA，在成都采集拟进入高原人员静脉血2ml，然后与他们一起乘飞机达到拉萨，并观察他们一周且在这周内没有发生高原肺水肿，抽取静脉血2ml(EDTA抗凝)并提取血液白细胞DNA。

[0040] 该试剂盒的使用说明：

[0041] 第一步，待测个体样品准备，采用上海生工生物技术服务有限公司UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒(货号SK1342)提取待测个体静脉血液中白细胞基因组总DNA，然后用紫外分光光度仪对DNA进行定量；

[0042] 第二步，PCR反应体系配制，共配制十管；

[0043] 第一管到第五管为定值标准品，共5管，浓度分别为：

[0044] 取10μl浓度为1×108拷贝/μl的质粒；

[0045] 取10μl浓度为1×108拷贝/μl的质粒，加入90μl无菌去离子水，混匀得到浓7
度为1×10 拷贝/μl的质粒；

[0046] 取10μl浓度为1×107拷贝/μl的质粒，加入90μl无菌去离子水，混匀得到浓6
度为1×10 拷贝/μl的质粒；

[0047] 取10μl浓度为1×106拷贝/μl的质粒，加入90μl无菌去离子水，混匀得到浓5
度为1×10 拷贝/μl的质粒；

[0048] 取10μl浓度为1×105拷贝/μl的质粒，加入90μl无菌去离子水，混匀得到浓4
度为1×10 拷贝/μl的质粒；

[0049] 各取0.5μl浓度从1×104至1×108拷贝/μl的标准品，然后，每管都依次加入Beta-actin引物混合液1μl，PCR反应液12.5μl，无菌去离子水11μl，混匀； [0050] 第六管为待测个体AGT的扩增，取待测个体的DNA 0.5μl，然后依次加入AGT引物混合液1μl，PCR反应液12.5μl，无菌去离子水11μl，混匀；

[0051] 第七管为待测个体看家基因Beta-actin的扩增，取待测个体的DNA 0.5μl，然后依次加入Beta-actin引物混合液1μl，PCR反应液12.5μl，无菌去离子水11μl，混匀； [0052] 第八管为空白对照，分别取Beta-actin引物混合液1μl，PCR反应液12.5μl，无菌去离子水11.5μl，混匀；

[0053] 第九管为健康对照样本AGT的扩增，取对照DNA 0.5μl，然后依次加入AGT 引物混合液1μl，PCR反应液12.5μl，无菌去离子水11μl，混匀；

[0054] 第十管为健康对照样本看家基因Beta-actin的扩增，取对照DNA 0.5μl，然后依次加入Beta-actin引物混合液1μl，PCR反应液12.5μl，无菌去离子水11μl，混匀； [0055] 第三步，PCR扩增条件，将第二步的十管已经混匀的物质分别放入Opticonmonitor1定量PCR仪中，均按以下条件进行PCR反应：95℃预变性10s；95℃变性5s，60℃退火延伸
20s，读板，重复39个循环；

[0056] 其中，AGT引物扩增产物长度为444bp，序列如下：

[0057] gccgtttctccttggtctaagtgtgctgcatggagtgagcagtagaagcctgcagcggcacaaatgcacctcccagtttgctgggtttattttagagaatgggggtggggaggcaagaaccagtgtttagcgcgggactactgttccaaaaagaattccaaccgaccagcttgtttgtgaaacaaaaaagtgttcccttttcaagttgagaacaaaaattgggttttaaaattaaagtatacatttttgcattgccttcggtttgtatttagtgtcttgaatgtaagaacatgacctccgtgtagtgtctgtaataccttagttttttccacagatgcttgtgatttttgaacaatacgtgaaagatgcaagcacctgaatttctgtttgaatgcggaaccatagctggttatttctcccttgtgttagtaataaacgtcttgc； [0058] Beta-actin引物扩增产物长度为180bp，序列如下：

[0059] cgggaaatcgtgcgtgacatcaagaagctgtgctacgtcgccctggacttcgagcgggagatggccatggtggccyccagctcctccctggagaagagctacaagctgctcgatggccaggtcatcaccatcggcaacgagcggttccactgccccgaggcgctcttccagccttccttc。

[0060] 第四步，数据分析，PCR反应结束后，定量PCR仪通过比较待测标本的Ct值与标准曲线Ct值，自动生成每例样本AGT和Beta-actin的拷贝数，然后，用AGT拷贝数除以Beta-actin拷贝数，分别求得待测个体和对照的 AGT/Beta-actin拷贝数比值，如果对照的AGT/Beta-actin(第九管/第十管)拷贝数比值位于0.0806-0.1012之间时，提示我们实验准确性和灵敏度可信，当此时待测个体AGT/Beta-actin(第六管/第七管)的拷贝数比值位于高原肺水肿易感者的该基因拷贝数(0.1003-0.1210)之间时，提示我们该个体有可能就是高原肺水肿的易感个体。

[0061] 第一至第五管为定值标准品的扩增，以获得标准曲线；

[0062] 第六、七管是为了获得待测个体的AGT基因和Beta-actin基因的拷贝； [0063] 第八管为空白对照管，以检测整个PCR过程中是否有污染；

[0064] 第九、十管是为了获得健康对照的AGT基因和Beta-actin基因的拷贝数。

[0065] 序列表

[0066] <110>中国人民解放军第三军医大学

[0067] <120>一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒

[0068] <130>

[0069] <140>200810232915.X

[0070] <141>2008-10-24

[0071] <160>6

[0072] <170>PatentIn 3.3

[0073] <210>1

[0074] <211>18

[0075] <212>DNA

[0076] <213>人工合成

[0077] <221>AGT上游引物

[0078] <400>1

[0079] gccgtttctc cttggtct 18 [0080] <210>2

[0081] <211>25

[0082] <212>DNA

[0083] <213>人工合成

[0084] <221>AGT下游引物

[0085] <400>2

[0086] gcaagacgtt tattactaac acaag 25