一种抑制乳腺癌细胞体外生长和治疗乳腺癌的药物

摘要

本发明给出了一种治疗乳腺癌的药物，它包括三氧化二砷和粉防己碱两种组份，粉防己碱含量为5～40mg/ml，三氧化二砷含量为0.9～7.5mg/ml；粉防己碱剂量为5mg·kg-1·d-1，三氧化二砷剂量为0.3mg·kg-1·d-1；其成分中还可包括氟尿嘧啶和/或多糖。本发明的另一技术方案为一种抑制乳腺癌细胞体外生长的药物，其粉防己碱含量为0.5～4ug/ml，三氧化二砷含量为0.09～0.75ug/ml。本发明的有益效果在于三氧化二砷和粉防己碱两药联合使用时可以降低三氧化二砷毒性，效果优于单独用药；在上述浓度范围内，联合用药产生协同作用，且协同作用有可重复性；大于或小于此浓度范围，则属于相加甚至拮抗作用。

权利要求

1.一种治疗乳腺癌的药物，其特征在于它包括三氧化二砷和粉防己碱两种组份，所说的粉防己碱含量为5～40mg/ml，所说的三氧化二砷含量为0.9～7.5mg/ml。

2.如权利要求1所述的治疗乳腺癌的药物，其特征在于所说的粉防己碱含量为10mg/ml，所说的三氧化二砷含量为2mg/ml。

3.如权利要求1或2所述的治疗乳腺癌的药物，其特征在于所说的粉防己碱剂量为每人每天每公斤体重给药5mg，三氧化二砷剂量为每人每天每公斤体重给药0.3mg。

4.如权利要求1或2或3所述的治疗乳腺癌的药物，其特征在于其成分中还包括氟尿嘧啶(5-Fu)和/或多糖，所说的氟尿嘧啶(5-Fu)含量为0.9ug/ml，所说的多糖含量为

50ug/ml。

5.一种抑制乳腺癌细胞体外生长的药物，其特征在于它包括三氧化二砷和粉防己碱两种组份，所说的粉防己碱含量为0.5～4ug/ml，所说的三氧化二砷含量为0.09～0.75ug/ml。

6.如权利要求5所述的抑制乳腺癌细胞体外生长的药物，其特征在于所说的粉防己碱含量为2ug/ml，所说的三氧化二砷含量为0.5ug/ml。

7.如权利要求5或6所述的抑制乳腺癌细胞体外生长的药物，其特征在于其成分中还包括氟尿嘧啶(5-Fu)和/或多糖，所说的氟尿嘧啶(5-Fu)含量为0.9ug/ml，所说的多糖含量为50ug/ml。

说明书

一种抑制乳腺癌细胞体外生长和治疗乳腺癌的药物

技术领域

[0001] 本发明涉及抗癌药物技术领域，具体地说是一种抑制乳腺癌细胞体外生长和治疗乳腺癌的药物。

背景技术

[0002] 现有技术中有关于三氧化二砷和粉防己碱作用于人乳腺癌细胞的不同研究，例如，张氏等(张丽娜，王留兴，樊青霞等.As2O3对乳腺癌细胞系MDA-MB-435s作用的研究[J].中国误诊学杂志.2007，6，7(12)：2688-2691)研究不同浓度三氧化二砷对人乳腺癌细胞系MDA-MB-435s的生长抑制作用，发现As2O3剂量依赖性抑制细胞生长，并观察到典型的细胞凋亡形态学特征性改变；琼脂糖凝胶电泳呈现凋亡DNA梯状条带；As2O3作用组的凋亡指数明显高于阴性对照组(P<0.05)。他们认为As2O3具有抑制乳腺癌MDA-MB-435s细胞生长的作用，其机理与诱导细胞凋亡有关。

[0003] 再如，孙氏等(孙新臣，王俊杰，甄永苏等.粉防己碱增加人乳腺癌细胞对X射线敏感性及其机理研究[J].中华放射医学与防护杂志.2003，6，23(3)：160-162.)研究发现，在p53突变型MCF27ADR细胞中，Tet显著增加X射线的杀伤作用，其增敏比为1.51；在X射线照射后，细胞明显阻滞于G2期，Tet可以降低这种阻滞。而在p53野生型MCF-7细胞中，Tet增加X射线的杀伤作用不明显增敏比为1.10；在X射线照射后，细胞阻滞于G1期，部分阻滞于G2期，加入Tet，对于这种阻滞作用降低也不明显。进一步研究显示，MCF-7/PADR细胞在受到X射线照射后，其Cyclin B1与Cdc2蛋白表达水平明显降低，Tet可以逆转X射线对Cyclin B1与Cdc2蛋白的表达的抑制作用。分裂指数结果显示Tet可以促使阻滞于G2期的MCF-7/PADR细胞进入M期。结论：Tet是一种G2期阻滞清除剂，能显著增加X射线对人乳腺癌细胞的杀伤作用，这种作用在p53突变型细胞中更明显。

[0004] 但未有三氧化二砷和粉防己碱联合作用的报道，在其他肿瘤的治疗或其他疾病的治疗研究中也无三氧化二砷和粉防己碱联合使用的报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种抑制乳腺癌细胞体外生长和治疗乳腺癌的药物，该药物以粉防己碱和三氧化二砷联合作用，以期产生协同作用，降低三氧化二砷的毒性，得到较好的抗癌效果。

[0006] 本发明的技术方案如下，一种治疗乳腺癌的药物，其特征在于它包括三氧化二砷和粉防己碱两种组份；

[0007] 上述的治疗乳腺癌的药物，其特征在于所说的粉防己碱含量为5～40mg/ml，所说的三氧化二砷含量为0.9～7.5mg/ml；

[0008] 上述的治疗乳腺癌的药物，其特征在于所说的粉防己碱含量为20ug/ml，所说的三氧化二砷含量为4ug/ml。

[0009] 以上所述的治疗乳腺癌的药物，其特征在于所说的粉防己碱剂量为每人每天每公斤体重给药5mg，三氧化二砷剂量为每人每天每公斤体重给药0.3mg。

[0010] 以上所述的治疗乳腺癌的药物，其特征在于其成分中还包括氟尿嘧啶(5-Fu)和/或多糖Polysaeeharide，所说的氟尿嘧啶(5-Fu)含量为0.9ug/ml，所说的多糖Polysaeeharide含量为50ug/ml。

[0011] 本发明的另一技术方案如下，一种抑制乳腺癌细胞体外生长的药物，其特征在于它包括三氧化二砷和粉防己碱两种组份。

[0012] 上述的抑制乳腺癌细胞体外生长的药物，其特征在于所说的粉防己碱含量为0.5～4ug/ml，三氧化二砷含量为0.09～0.75ug/ml。

[0013] 上述的抑制乳腺癌细胞体外生长的药物，其特征在于所说的粉防己碱含量为2ug/ml，所说的三氧化二砷含量为0.5ug/ml。

[0014] 以上所述的抑制乳腺癌细胞体外生长的药物，其特征在于其成分中还包括氟尿嘧啶(5-Fu)和/或多糖Polysaeeharide，所说的氟尿嘧啶(5-Fu)含量为0.9ug/ml，所说的多糖Polysaeeharide含量为50ug/ml。

[0015] 本发明的有益效果在于：1、三氧化二砷和粉防己碱两药联合使用时可以降低三氧化二砷毒性；2、三氧化二砷和粉防己碱的联合作用效果优于单独用药；3、两药联合使用时，作用于体外生长的乳腺癌细胞时本发明所说的粉防己碱含量为0.5～4ug/ml，所说的三氧化二砷含量为0.09～0.75ug/ml；作用于人体的乳腺癌细胞时，本发明所说的粉防己碱含量为5～40ug/ml，所说的三氧化二砷含量为0.9～7.5ug/ml，该浓度范围内，联合用药产生协同作用；4、大于或小于此浓度范围，虽然联合作用效果优于单独用药，但仍属于相加甚至拮抗作用。从实施例可以肯定地看出实验趋势向符，协同作用有可重复性。

附图说明

[0016] 本发明有如下附图：

[0017] 图1 0.375ug/ml的三氧化二砷与不同浓度的粉防己碱联合作用对MCF-7细胞体外生长的抑制率柱状图

[0018] 图2 0.75ug/ml的三氧化二砷与不同浓度的粉防己碱联合作用对MCF-7细胞体外生长的抑制率柱状图

[0019] 图3 2.5ug/ml的粉防己碱与不同浓度三氧化二砷联合作用对MCF-7细胞体外生长的抑制率柱状图

[0020] 图4 3ug/ml的粉防己碱与不同浓度三氧化二砷联合作用对MCF-7细胞体外生长的抑制率柱状图

[0021] 图5 0.375ug/ml的三氧化二砷与不同浓度的粉防己碱联合作用的Q值曲线图，其中粉防己碱2ug/ml和三氧化二砷0.375ug/ml合并用药时Q值最大，协同效果最佳[0022] 图6 0.75ug/ml的三氧化二砷与不同浓度的粉防己碱联合作用的Q值曲线图[0023] 图7 2.5ug/ml的粉防己碱与不同浓度三氧化二砷联合作用的Q值曲线图，其中粉防己碱2.5ug/ml和三氧化二砷0.18ug/ml合并用药时Q值最大，协同效果最佳[0024] 图8 3ug/ml的粉防己碱与不同浓度三氧化二砷联合作用的Q值曲线图，其中粉防己碱3ug/ml和三氧化二砷0.18ug/ml合并用药时Q值最大，协同效果最佳[0025] 图9A1 对照组的流式直方图

[0026] 图9A2 粉防己碱组的流式直方图

[0027] 图9A3 三氧化二砷组的流式直方图

[0028] 图9A4 联合用药组的流式直方图

[0029] 图9B 柱状分析图

[0030] 图10A 正常对照组扫描电镜观察到的人乳腺癌细胞MCF-7，

[0031] 图10B 三氧化二砷0.1875ug/mL单独用药扫描电镜观察到的人乳腺癌细胞MCF-7[0032] 图10C 粉防己碱3ug/ml单独用药扫描电镜观察到的人乳腺癌细胞MCF-7[0033] 图10D 联合用药组扫描电镜观察到的人乳腺癌细胞MCF-7

[0034] 图11A 对c-myc表达的影响

[0035] 图11B 对c-fos表达的影响

[0036] 图11C 对Bc1-2表达的影响

[0037] 图11D 对Caspase-3表达的影响

[0038] 图11E 对P53表达的影响

[0039] 图11F 对RB表达的影响

[0040] 图12 裸鼠移植瘤生长曲线

[0041] 图13 4组裸鼠移植瘤重量比较

[0042] 图14 患者的乳腺肿瘤生长曲线

具体实施方式

[0043] 本发明以体外和体内生长的人乳腺癌细胞系MCF-7及乳腺癌患者为研究对象，以粉防己碱和三氧化二砷单独和联合作用为处理因素，筛选产生协同作用的浓度，[0044] 以下为本发明的几个实施例：

[0045] 实施例1 细胞生长抑制率实验

[0046] 本实施例以人乳腺癌细胞系MCF-7为研究对象，以粉防己碱和三氧化二砷单独和联合作用为处理因素，采用细胞生长抑制率实验观察是否产生协同作用，筛选产生协同作用的浓度。

[0047] 1实验方法

[0048] 1.1分组

[0049] 本试验分为甲乙两部分：

[0050] 甲：选择粉防己碱0.5ug/ml，1ug/ml，2ug/ml，4ug/ml，8ug/ml五个浓度，三氧化二砷0.375ug/mL，0.75ug/mL两个浓度单独与联合用药。具体如下：

[0051]

[0052] 乙：选择三氧化二砷0.0469ug/mL，0.0937ug/mL，0.1875ug/mL，0.375ug/mL，0.75ug/mL五个浓度，粉防己碱2.5ug/mL和3ug/mL两个浓度单独与联合用药。具体如下：

[0053]

[0054] 1.2细胞培养

[0055] MCF-7细胞接种在含10％胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml的DMEM培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱内培养，用胰酶消化，传代。

[0056] 1.3细胞生长抑制率试验

[0057] MCF-7细胞于对数生长期，0.25％胰蛋白酶消化细胞，用完全培养液制成单细胞4
悬液，调整细胞浓度为1×10 个/ml，接种于96孔培养板，每孔加200μl细胞悬液，置于
37℃、5％CO2培养箱内培养24h，镜下观察细胞贴壁，更换培养液，分别加入对照组，粉防己碱和三氧化二砷单独及联合用药组培养液。继续培养，72h时用MTT法检测。

[0058] MTT法检测方法为：中止培养前4h每孔加MTT(5mg/ml)20μl，4h后翻转96孔培养板弃去全部培养液，每孔加DMSO200μl，振荡10min，结晶物充分溶解后，酶标仪(波长490nm)测定各孔吸光度(OD值)，计算细胞抑制率：细胞抑制率＝(对照组平均OD值—实验组平均OD值)/对照组平均OD值×100％，连续测到96h。

[0059] 1.4统计学处理

[0060] 采用公知的SAS统计软件对数据进行多元统计分析：计量资料的实验结果以平均值±标准差(x±s)表示，两组采用独立样本t检验，多组采用方差分析比较各组间差异。半数增殖抑制浓度(IC50)用直线相关分析及回归，分析时间浓度效应用析因实验设计。

[0061] 2实验结果

[0062] 两药联用效果优于单药使用，联合用药时随着两药比例不同，效果有差异(参见表1、2，图1～图4)。

[0063] 表1 甲实验各组的抑制率(％)

[0064]

[0065] 表2 乙实验各组的抑制率(％)

[0066]

[0067] 联合用药的结果有三个，包括相加作用，拮抗作用和协同作用。一个药物的剂量减少一定比例，可用另一药物等效剂量的相同比例代替为相加作用；一个药物的剂量减少一定比例，可用另一药物等效剂量的较少比例代替为协同作用；一个药物的剂量减少一定比例，需用另一药物等效剂量的较大的比例代替为拮抗作用。

[0068] 我们选用金氏公式：Q＝Ea+b/(Ea+Eb—Ea×Eb)来判断合用效果，其中Ea+b为合并用药的抑制率，Ea和Eb分别为A药，B药单独用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”，分母代表“期望合并效应”，Q值是两者之比。当Q＝0.85～0.55是拮抗作用，Q<0.55为明显拮抗；当0.852.00为明显协同。

[0069] 对实验结果数据经过计算，结果如下(参见表3、4、图5～图8)：

[0070] 甲实验中，三氧化二砷0.375ug/ml和粉防己碱合并用药时Q值高于三氧化二砷0.75ug/ml和粉防己碱合并用药时的Q值。

[0071] 三氧化二砷0.375ug/ml和粉防己碱各浓度合并用药时合用指数Q值呈现出抛物线的变化，从表3中可看出，粉防己碱0.5ug/ml，1ug/ml，2ug/ml，4ug/ml和三氧化二砷0.375ug/ml合并用药时合用指数Q≥1.15产生的是协同作用，其中粉防己碱2ug/ml和三氧化二砷0.375ug/ml合并用药时Q值最大。三氧化二砷0.75ug/ml和Tet各浓度合并用药时合用指数Q值变化不大，基本在0.8左右。

[0072] 乙实验中，粉防己碱3ug/ml与三氧化二砷联合作用的Q值高于粉防己碱2.5ug/ml与三氧化二砷联合作用的Q值。

[0073] 两条Q值曲线都呈现出抛物线的变化，从表4可看出，三氧化二砷0.094ug/ml、0.1875ug/ml、0.375ug/ml和粉防己碱2.5ug/ml合并用药时合用指数Q≥1.15产生的是协同作用，三氧化二砷0.045ug/ml，0.09ug/ml，0.18ug/ml，0.37ug/ml和粉防己碱3ug/ml合并用药时合用指数Q≥1.15产生的是协同作用。其中三氧化二砷0.18ug/ml和粉防己碱
3ug/ml合并用药时Q值最大。

[0074] 从MTT实验结果可得出以下结论：1、三氧化二砷和粉防己碱的联合作用效果优于单独用药；2、在两药在粉防己碱0.5～4ug/ml，三氧化二砷0.09～0.75ug/ml浓度范围内的联合用药产生协同作用；3、大于或小于此浓度范围，虽然联合作用效果优于单独用药，但仍属于相加甚至拮抗作用。因为甲和乙是两次实验，不能相互引用数据比较，可以肯定地看出两次实验趋势向符，协同作用有可重复性。

[0075] 表3 甲实验Q值

[0076]

[0077] 表4 乙实验Q值

[0078]

[0079] 实施例1 表明：粉防己碱和三氧化二砷单独用药作用于肿瘤细胞均可抑制细胞增殖。两药联合作用优于单独作用，在粉防己碱0.5～4ug/ml，三氧化二砷0.09～0.75ug/ml浓度范围内的联合用药产生协同作用。

[0080] 实施例2 细胞凋亡率检测

[0081] 1实验方法

[0082] 1.1实验分组

[0083] 本实施例的目的是观察两药物在协同作用范围内是否诱导细胞凋亡，因此实验分为正常对照组，三氧化二砷组，粉防己碱组及联合用药组。

[0084] 根据本部分实施例一的结果，选定产生协同作用的药物浓度范围，选择粉防己碱3ug/ml，三氧化二砷0.1875ug/mL两个浓度单独用药，再选择这两个浓度联合用药。

[0085] 1.2细胞培养

[0086] MCF-7细胞于对数生长期，调整细胞浓度为3×104个/ml，接种于6孔培养板，每孔加2ml细胞悬液，置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h。更换培养液，分为对照组和三氧化二砷不同浓度组，每组设6个平行孔，于培养48h后收集细胞。

[0087] 1.3流式细胞仪检测细胞凋亡

[0088] 按照试剂盒说明，用4℃预冷PBS洗细胞两次，用250uL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106个/ml，取100uL的细胞悬液于5ml流式管中，加入5uL Annexin V/FITC和10uL 20ug/mL的碘化丙锭溶液，混匀后于室温避光孵育15分钟，在反应管中加入400uLPBS，在FACS流式细胞仪上机检测。

[0089] 2实验结果

[0090] 流式检测结果显示，药物组与对照组相比，早期凋亡率明显高于对照组，且联合用药高于单独用药(P<0.01)，见表7。从流式结果直方图中可以看出早期凋亡细胞在联合用药组明显多于对照组和单独用药组。选用Q值法计算两药联合作用在对早期凋亡率的影响，得出Q＝1.31>1.15，说明两药诱导早期凋亡产生协同作用(图9)。

[0091] 表5 细胞凋亡率，存活率和坏死率(x±s)

[0092]

[0093]

[0094] 注：与正常对照组比较*P<0.01

[0095] 双标法检测细胞凋亡的流式直方图和柱状分析图参见图9。图9A1～图9A4分别为对照组、粉防己碱组、三氧化二砷组和联合用药组的流式直方图，第一象限代表Annexin V—/PI+的机械损伤细胞，第二象限代表Annexin V+/PI+的坏死细胞，第三象限代表AnnexinV—/PI—的正常细胞，第四象限代表Annexin V+/PI—的早期凋亡细胞。可以看出早期凋亡细胞在联合用药组明显多于对照组和单独用药组。图9B为柱状分析图，第一组为对照组，第二，三组分别为粉防己碱和三氧化二砷单独用药组，第四组为联合用药，可以看出联合用药凋亡率最高，计算Q＝1.31>1.15。

[0096] 本实验中用Annexin V/P1双染法定量检测细胞凋亡率，结果表明粉防己碱3ug/ml，三氧化二砷0.1875ug/mL两个浓度联合用药组的凋亡率高于单独用药组，且根据计算联合用药指数得出有协同作用。这个结果与MTT结果趋势相符，我们可以初步推断协同作用与凋亡有关。

[0097] 实施例2 表明：粉防己碱和三氧化二砷可诱导细胞凋亡，联合用药在粉防己碱0.5～4ug/ml，三氧化二砷0.09～0.75ug/ml浓度范围内产生协同作用。

[0098] 实施例3 扫描电镜观察细胞表面形态

[0099] 1实验方法

[0100] 1.1实验分组

[0101] 实验分为正常对照组，三氧化二砷0.1875ug/mL组，粉防己碱3ug/ml组及联合用药组。

[0102] 1.2细胞培养

[0103] 同实施例一

[0104] 1.3扫描电镜标本制备和观察

[0105] 在无菌环境下，取消毒好的无菌盖玻片，放入六孔板的孔中，每孔加1ml的1％(WPV)多聚赖氨酸，15分种后吸出，将六孔板晾干备用。MCF-7细胞于对数生长期，调整细胞5
浓度为1×10 个/ml，接种于6孔培养板，每孔加2ml细胞悬液，置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h。更换培养液，分为正常对照组，三氧化二砷0.1875ug/mL组，粉防己碱3ug/ml组及联合用药组。

[0106] 于培养48h后将盖玻片从培养孔内取出，0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗2次，2.5％(VPV)的戊二醛(pH7.4)中固定，将固定好的样品送中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所电镜中心进行扫描电镜观察。0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗2次、锇酸后固定、乙醇梯度脱水、醋酸异戊酯置换、临界点干燥、表面喷金后扫描电镜下观察细胞表面的超微结构。

[0107] 2实验结果

[0108] 扫描电镜观察，对照组乳腺癌细胞表面微绒毛丰富，伪足较多且粗壮，细胞完整，呈葵花状。三氧化二砷和粉防己碱的单独用药组和对照组相比，细胞表面微绒毛和伪足减少，伪足较短或断裂散在细胞周围，细胞较小。联合用药组细胞表面微绒毛和伪足消失，细胞更小，细胞表面出现塌陷，产生类似空洞的结构，部分细胞死亡(参见图10)。

[0109] 图10为扫描电镜观察到的人乳腺癌细胞MCF-7，其中，图10A为正常对照组，图10B为三氧化二砷0.1875ug/mL单独用药，图10C为粉防己碱3ug/ml单独用药，图10D为联合用药组。可以看出，联合用药组细胞状态最差，表面微绒毛和伪足消失，细胞表面出现塌陷，产生类似空洞的结构。

[0110] 从形态学上看，细胞坏死的早期形态学特征变化是细胞发生肿胀，胞浆及其中的细胞器等都发生明显肿胀，其结果是细胞膜及细胞器膜发生破溃，最后细胞中的膜结构完全消失。而与细胞坏死过程不同，细胞程序化死亡最早发生的形态学变化，包括细胞之间的连接消失，膜的特殊结构，如膜微绒毛的消失，胞浆则变的更为致密，染色质则浓缩成大大小小不等的团块状，再裂解成小片断。细胞变形，并裂解成大小不等的凋亡小体。

[0111] 细胞程序化死亡之所以区别为一种特殊形式的细胞死亡类型，主要是根据其细胞坏死的形态学特征。不同细胞在发生细胞程序化死亡的过程中，具有相似的形态特征。本部分实施例在前期做过透射电镜却并未发现凋亡小体，分析原因是联合用药组的凋亡率也只有7％左右，而且分散在不同断面，那么在特定的时间断面上看到发生凋亡的细胞几率几乎是微乎其微了。所以我们最终选择了视野较广也较直观的扫描电镜做形态分析。观察细胞发生程序化死亡时细胞连接和细胞膜的变化。

[0112] 本研究观察到乳腺癌细胞具有大量的突起和伪足，这可能是其高侵袭性的结构基础。加药后突起和伪足减少消失，这可能是前面所述细胞凋亡的早期形态变化。癌细胞的伪足在其侵袭过程中具有重要作用。癌细胞侵袭时通过丝状伪足抓住靶器官表面的突起物，进而以丝状伪足为前导向器官内侵入。和对照组相比联合用药组的细胞表面微绒毛和伪足明显减少消失，作用强于两个单独用药组，这可能是药物产生协同作用的一个作用靶点。

[0113] 实施例3 表明：粉防己碱和三氧化二砷单独用药作用于MCF-7细胞均可使细胞表面微绒毛和伪足明显减少消失，联合用药作用强于单独用药。

[0114] 实施例4 肿瘤相关基因的蛋白表达

[0115] 1实验方法

[0116] 1.1实验分组

[0117] 实验分为对照组、粉防己碱3ug/ml组、三氧化二砷0.18ug/mL组和联合用药组。分别简写为C、Tet-3、As203-0.18、Tet-3+As203-0.18。

[0118] 1.2细胞培养

[0119] 同实施例一，药物干预48h。

[0120] 1.3样本处理

[0121] 细胞终止培养，用预冷的PBS冲洗培养皿3次，在冰上用细胞刮刀小心将细胞刮下，用吸管将细胞收集于10ml的离心管，1000rmp×10min，洗涤；小心弃去上清，每个离心管加入100ul的细胞裂解液，冰上裂解20min；然后将细胞碎片连同细胞裂解液收集于1ml的EP管，低温离心13000rmp×15min。待Bradford法对样品蛋白定量后，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液100℃加热5min，使样品中蛋白变性。样品分装，保存于-80℃。

[0122] 1.4蛋白定量

[0123] 每个样品分别取5，10，15，20ul将蛋白溶液转移至4个试管中，补加实验用缓冲液，至终体积为100ul，加入1mlBradford工作液并振荡混匀，在2min后以波长595nm测光度值，计算蛋白含量。

[0124] 1.5Western blot

[0125] 电泳

[0126] 12％浓度SDS-PAGE电泳，每条泳道上样30ug蛋白，室温80mV稳压电泳，待样品至分离胶与积层胶交界处，调整电压至150mV继续电泳，待样品移至分离胶末端时，结束电泳。

[0127] 电转

[0128] 按照操作规范，制作“三明治”夹心。在电泳槽中加入转移缓冲液，低温250mA稳流电泳2.5h后凝胶中蛋白已转移至NC膜上，结束电转。将NC膜用PBST漂洗3次，5％脱脂奶粉溶于TBST中，室温封闭2h。

[0129] 一抗孵育

[0130] 将抗体1：1000用5％的脱脂奶粉稀释后。4℃孵育过夜后，室温孵育1小时[0131] 洗膜

[0132] TBST洗膜，10分钟/次，共6次

[0133] 二抗孵育

[0134] 1：10000稀释，5％脱脂奶粉(TBST)室温下避光1小时

[0135] 洗膜(避光)

[0136] TBST洗膜，10分钟/次，共6次

[0137] 扫描

[0138] Odsey-荧光成像系统扫描，在700纳米波长下扫描成像

[0139] 2实验结果

[0140] 实验结果显示参见图11，图11为肿瘤相关基因的蛋白表达Western结果，图中，A为对c-myc表达的影响，B为对c-fos表达的影响，C为对Bcl-2表达的影响，D为对Caspase-3表达的影响，E为对P53表达的影响，F为对RB表达的影响。

[0141] 实施例4表明：粉防己碱和三氧化二砷联合用药作用于MCF-7细胞可以下调P53基因表达，上调RB基因表达，上调c-myc基因表达，下调c-fos基因表达，下调Bcl-2的表达，上调caspase-3的表达。

[0142] 实施例5 对人乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤的抑制作用

[0143] 1实验方法

[0144] 1.1细胞培养与接种

[0145] MCF-7细胞株培养于DMEM培养液，其中加入10％胎牛血清，培养于37℃，5％二氧化碳孵箱，每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况。细胞大，呈贴壁生长，核大，圆形居中，细胞分化较好，生长倍增速度较慢。每隔2天传代1次，待传代足够数量后取对数生长期细7
胞配成细胞悬液，白细胞计数板计数，活细胞浓度达1.0×10/ml，准备接种至裸鼠身上。

[0146] 1.2动物模型建立、动物分组及给药方法

[0147] 取32只裸鼠，在裸鼠右侧腋部皮下接种MCF-7乳腺癌细胞1.0×107/ml，接种量0.2ml。接种7天后32只裸鼠移植瘤长径长至0.5cm左右时，将此32只成瘤裸鼠用随机数字表法随机分为粉防己碱组、三氧化二砷组、粉防己碱+三氧化二砷组(联合用药组)、对照组共4组，每组8只。

[0148] (1)粉防己碱组：给予50mg·kg-1·d-1粉防己碱溶于生理盐水0.2ml，腹腔注射，每天1次，共15天。

[0149] (2)三氧化二砷组：给予3mg·kg-1·d-1三氧化二砷溶于生理盐水0.2ml，腹腔注射，每天1次，共15天。

[0150] (3)联合用药组：给予50mg·kg-1·d-1粉防己碱和3mg·kg-1·d-1三氧化二砷溶于生理盐水0.2ml，腹腔注射，每天1次，共15天。

[0151] (4)对照组：给予生理盐水0.2ml，腹腔注射，每天1次，共15天。

[0152] 1.3观察指标及方法

[0153] (1)移植瘤生长情况

[0154] 用药前及用药后每3天测量一次移植瘤最大径和最小径，计算移植瘤体积，并据此绘制移植瘤生长曲线。

[0155] 移植瘤体积v＝a2×b/2(a最小径，b最大径)

[0156] (2)药物的抑瘤作用

[0157] 药物处理结束后1天，脱颈椎处死裸鼠，观察记录各组裸鼠右侧腋部包块形态大小，完整剥离移植瘤，称重，并计算抑瘤率。

[0158] 抑瘤率＝(1—实验组瘤重/对照组瘤重)×100％

[0159] 1.4统计学方法

[0160] 采用SAS6.12统计软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差(x±s)表示，用方差分析比较各组肿瘤重量。

[0161] 2实验结果

[0162] 2.1移植瘤生长情况

[0163] 接种人乳腺癌细胞株MCF-7 3天后于裸鼠右侧腋部皮下可见微小突起，以后逐渐明显，接种7天后32只裸鼠移植瘤长径长至0.5cm左右，然后根据各分组情况给予不同的药物。表6示，用药前及用药后每3天测量一次移植瘤最大径和最小径而计算其体积。图12示移植瘤生长曲线。

[0164] 表6 4组裸鼠移植瘤生长体积的比较(mm3，x±s)

[0165]组别 鼠 用药前 第3天 第6天 第9天 第12天 第15天
数
粉防己 8 33.60±1 59.10±2 101.63± 211.10±35291.19±41516.62±79
碱组 3.30 6.62 28.41 .14 .87 .77 [0166]
三氧化 8 37.24±1 63.76±1 129.42± 226.12±76286.36±81512.09±15
二砷组 6.70 3.88 46.38 .06 .68 2.07 联合用 8 30.30±1 53.58±3 86.22±5 192.03±12266.63±17463.36±25
药组 1.07 4.55 1.99 0.01 4.50 1.93 对照组 8 35.07±6.82.42±2 169.83± 352.73±10527.52±10850.89±19
51 9.86 47.90 0.00 6.18 8.95

[0167] 2.2药物的抑瘤作用

[0168] 药物处理结束后1天处死裸鼠后，完整剥离移植瘤称重，计算抑瘤率。表7示，粉防己碱组、三氧化二砷组移植瘤重量与对照组比较有显著降低(P<0.05)；联合用药组移植瘤重量与对照组比较，有极显著性差异(P<0.01)；联合用药组瘤重小于粉防己碱组和三氧化二砷组，但差异无统计学意义(P>0.05)，三组的抑瘤率分别为44.38％、25.72％、29.74％。提示粉防己碱组、三氧化二砷组、联合用药组均有抑制移植瘤生长的作用，联合用药组肿瘤生长抑制程度高于粉防己碱组、三氧化二砷组，但其差异无统计学意义。图13示4组裸鼠移植瘤重量比较。

[0169] 表7 4组裸鼠移植瘤重量及抑瘤率的比较

[0170] 组别 鼠数 移植瘤重量(g，x±s) 抑瘤率(％)[0171] 粉防己碱组 8 1.20±0.30* 25.72

[0172] 三氧化二砷组 8 1.13±0.43* 29.74

[0173] 联合用药组 8 0.90±0.46** 44.38

[0174] 对照组 8 1.61±0.33 /

[0175] 与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

[0176] 从本研究的移植瘤生长曲线中能直观地看到4组裸鼠移植瘤生长情况，用药后对照组的裸鼠移植瘤生长体积均大于其他三组。粉防己碱组、三氧化二砷组、联合用药组的瘤重较对照组显著降低(P<0.05或P<0.01)；三氧化二砷和粉防己碱合用时瘤重小于三氧化二砷和粉防己碱单用，但差异无统计学意义(P>0.05)。本研究结果表明，粉防己碱组、三氧化二砷组、联合用药组均有抑制移植瘤生长的作用，联合用药组肿瘤生长抑制程度高于粉防己碱组、三氧化二砷组的趋势。

[0177] 实施例5表明：粉防己碱和三氧化二砷联合用药抑制动物肿瘤生长，联合用药效果优于粉防己碱、三氧化二砷单独用药。

[0178] 实施例6 对乳腺癌患者乳腺肿瘤的抑制作用

[0179] 1实验方法

[0180] 将此32名乳腺癌患者用随机数字表法随机分为粉防己碱组、三氧化二砷组、粉防己碱+三氧化二砷组(联合用药组)、对照组共4组，每组8人。

[0181] (1)粉防己碱组：给予5mg·kg-1·d-1粉防己碱溶于生理盐水制成10mg/ml，静脉注射，每天1次，共15天。

[0182] (2)三氧化二砷组：给予0.3mg·kg-1·d-1三氧化二砷溶于生理盐水致制成2mg/ml，静脉注射，每天1次，共15天。

[0183] (3)联合用药组：给予5mg·kg-1·d-1粉防己碱和0.3mg·kg-1·d-1三氧化二砷溶于生理盐水制成每毫升溶液含10mg粉防己碱和2mg三氧化二砷，静脉注射，每天1次，共15天。

[0184] (4)对照组：给予生理盐水，静脉注射，每天1次，共15天。

[0185] 1.3观察指标及方法

[0186] 乳腺肿瘤生长情况

[0187] 用药前及用药后每3天用B超测量一次肿瘤最大径和最小径，计算肿瘤体积，并据此绘制肿瘤生长曲线。

[0188] 肿瘤体积v＝a2×b/2(a最小径，b最大径)

[0189] 1.4统计学方法

[0190] 采用SAS 6.12统计软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差(x±s)表示，用方差分析比较各组肿瘤体积。

[0191] 2实验结果

[0192] 表8示，用药前及用药后每3天测量一次肿瘤最大径和最小径而计算其体积。图14示肿瘤生长曲线。

[0193] 从本研究的肿瘤生长曲线中能直观地看到4组患者的乳腺肿瘤生长情况，用药后对照组的肿瘤生长体积均大于其他三组(P<0.01)；三氧化二砷和粉防己碱合用时肿瘤生长体积明显小于三氧化二砷和粉防己碱单用(P<0.001)。本研究结果表明，粉防己碱组、三氧化二砷组、联合用药组均有抑制移植瘤生长的作用，联合用药组肿瘤生长抑制程度高于粉防己碱组、三氧化二砷组，联合使用产生协同效果。

[0194] 表8 4组肿瘤生长体积的比较(mm3，x±s)

[0195]组别 人 用药前 第3天 第6天 第9天 第12天 第15天
数
粉防 8 3.60±1 5.10±2 7.63±28. 9.10±35. 10.19±4 12.62±7
己碱 3.30 6.62 41 14 1.87 9.77
组
三氧 8 3.8±16. 3.76±1 5.42±46. 6.12±76. 8.36±81. 9.09±15
化二
砷组 70 3.88 38 06 68 2.07
联合 8 3.30±1 3.58±3 4.02±51. 4.33±12 4.63±17 5.06±25
用药 1.07 4.55 99 0.01 4.50 1.93
组
对照 8 3.07±6. 6.42±2 9.83±47. 12.73±1 14.52±1 17.89±1
组 51 9.86 90 00.00 06.18 98.95

[0196] 实施例6 表明：粉防己碱和三氧化二砷联合用药抑制肿瘤生长，联合用药效果优于单独用药，在粉防己碱5～40mg/ml，三氧化二砷0.9～7.5mg/ml浓度范围内产生协同作用浓度范围产生协同作用。

[0197] 本发明所说的治疗乳腺癌的药物，其成分中还可包括氟尿嘧啶(5-Fu)和多糖Polysaeeharide，所说的氟尿嘧啶(5-Fu)含量为0.9ug/ml，所说的多糖Polysaeeharide含量为50ug/ml。