一种RGD多肽放射性药物及其制备方法转让专利
申请号 : CN200810239036.X
文献号 : CN101428148B
文献日 : 2010-09-01
发明人 : 王凡 , 贾兵 , 史继云
申请人 : 北京大学
摘要 :
本发明涉及一种RGD多肽放射性药物及其制备方法。所述RGD多肽放射性药物包括RGD多肽和放射性核素99mTc，所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体是将连接剂L与RGD多肽单体连接，再将两个连接有连接剂L的RGD多肽单体二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[L-c(RGDxK)]2，所述放射性核素99mTc通过一个双功能螯合剂HYNIC标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PKM，所述RGD多肽放射性药物为99mTc-HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。本发明RGD多肽放射性药物，进一步增强结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更好的诊断效果。
权利要求 :
99m
1.一种RGD多肽放射性药物，包括RGD多肽和放射性核素 Tc，其特征在于：所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体是将连接剂L与RGD多肽单体连接，再将两个连接有连接剂L的RGD多肽单体二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[L-c(RGDxK)]2，99m
所述连接剂L为PEG4或G3，所述放射性核素 Tc通过一个双功能螯合剂HYNIC标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PKM，所述药代动力学修饰分子PKM为G2、G3、G4或PEG4，所述RGD多肽放射性药物为99m
Tc-HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。
2.一种权利要求1所述的RGD多肽放射性药物的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：a、L-c(RGDxK)的制备
将Boc保护的连接剂L溶于1mL DMF中，加入NHS和DCC，室温下搅拌反应2小时；
将c(RGDxK)加入到上述反应液中，用DIEA将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜；向反应液中加入3mL 0.5M NH4OAc缓冲溶液并过滤，滤液经Zorbax C18半制备柱HPLC方法分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-L-c(RGDxK)；将Boc-L-c(RGDxK)加入到3.0mL TFA中，室温反应30分钟；旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL 0.5M NH4OAc缓冲溶液，经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物L-c(RGDxK)；
b、E[L-c(RGDxK)]2的制备
将Boc保护的谷氨酸溶于5mL DMF，加入NHS和DCC，室温搅拌10小时；滤掉副产物DCU，滤液真空蒸干得到粗产物；用3mL CH2Cl2溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓缩至1mL左右；缓慢逐滴加入到30mL乙醚中，析出白色沉淀，过滤并真空干燥得到产品；获得产物1
经 H NMR核磁谱分析确认为预期产物Boc-E(OSu)2；将Boc-E(OSu)2溶于无水1mL DMF中，加入L-c(RGDxK)；使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-E[L-c(RGDxK)]2；用无水TFA浸泡Boc-E[L-c(RGDxK)]25分钟，去除Boc-保护基团；粗产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[L-c(RGDxK)]2；
c、PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备
将Boc-PKM-OSu和E[L-c(RGDxK)]2溶于2mL DMF和H2O的混合液，使用0.1NNaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜；将反应液真空蒸干，得到粗产品并将之溶于2mL TFA，将溶液在室温下搅拌15分钟；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产品PKM-E[L-c(RGDxK)]2；
d、HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxk)]2的制备
将HYNIC-NHS和PKM-E[L-c(RGDxk)]2溶于DMF和H2O的混合液中，使用0.1N NaOH调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；
99m
e、Tc-HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxk)]2的制备
配制含TPPTS 5.0mg，tricine 6.5mg，琥珀酸二钠38.5mg，琥珀酸12.7mg和20μg的99m
HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxk)]2的混合液500μL于10mL西林瓶中，加入1.0-1.5mL的Na TcO4溶液，100℃水浴加热西林瓶反应20-25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，制成RGD多肽放射性药物；
所述HPLC方法为使用LabAlliance HPLC系统配备Zorbax C18半制备柱，梯度淋洗36分钟，流速2.5mL/min，其中流动相A为25mM NH4OAc，B为乙腈；淋洗梯度设定为起始时90％A和10％B，5分钟时85％A和15％B，30分钟时65％A和35％B，32-36分钟时50％A和50％B。
说明书 :
一种RGD多肽放射性药物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及肿瘤诊断放射性药物，特别涉及用于integrin αvβ3阳性肿瘤诊断的RGD多肽放射性药物及其制备方法。
背景技术
[0002] 肿瘤生长过程中关键的一环是肿瘤血管生成。没有新的血管生成肿瘤在长到几个厘米大小之后便不能再继续生长。肿瘤血管生成被各种蛋白分子调控，其中包括integrin αvβ3。integrin αvβ3是一种细胞外基质受体，它是由α和β两个亚基组成的异源二聚体跨膜糖蛋白。integrin αvβ3是整合素家族重要的组成成员，作为与新生血管相关的分子标志物之一，它高表达在新生血管内皮细胞表面和某些肿瘤细胞表面(成神经细胞瘤、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌和前列腺癌等)，而在已存在的血管和正常组织中不表达或表达很低。integrin αvβ3在肿瘤生长和转移过程中的高度限制表达，使其成为一个非常有吸引力的靶点，用于肿瘤的诊断和治疗。
[0003] 研究证实含有RGD(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的配体与integrin αvβ3具有高亲和力和特异性。不同放射性核素标记的RGD序列配体，如RGD环肽二聚体和四聚体等已被用于肿瘤的显像和治疗研究。RGD二聚体或四聚体比其单体具有更高的integrin αvβ3亲和力，主要源于两个因素，一是两个RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrin αvβ3相结合，或者是一个RGD模序与integrin αvβ3结合之后增加了细胞表面结合位点局部RGD浓度。如果两个RGD模序之间的距离足够长，那么它们可以同时与integrin αvβ3结合；如果两个RGD模序之间的距离不是足够长，那么它们只能增加局部RGD浓度。目前报道的RGD环肽二聚体E[c(RGDxK)]2(E代表谷氨酸，c代表环化，R代表精氨酸，G代表甘氨酸，D代表天冬氨酸，x为f或y，分别代表苯丙氨酸或酪氨酸)，其两个RGD模序之间的距离为6个键，由于距离不够长，因此E[c(RGDxK)]2的两个RGD模序很难同时与细胞表面相邻的两个的integrin αvβ3受体结合(如图1所示)。从这个意义上讲，两个RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrinαvβ3相结合具有更重要的作用。为此，有必要发明新型的RGD多肽二聚体，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以能同时与细胞表面表达的相邻的integrin αvβ3受体相结合，增强RGD多肽与integrin αvβ3的亲和力，提高肿瘤对药物的摄取，达到更好的诊治效果。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种RGD多肽放射性药物及其制备方法。该药物首先将三个甘氨酸分子(G3，G＝glycine)或四个聚乙二醇分子(PEG4，PEG＝Polyethylene glycol)与RGD单体连接，然后再将此二聚化，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以使其能同时与细胞表面表达的相邻的integrin αvβ3受体相结合(图2)，即以双价形式与integrin αvβ3结合，这样会进一步增强结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更好的99m
诊断效果。该药物通过双功能螯合剂将放射性核素 Tc标记到新型RGD环肽二聚体分子上，在体内标记药物通过RGD多肽的靶向作用浓聚到肿瘤部位，利用核医学的单光子断层显像技术，对integrin αvβ3阳性肿瘤进行显像诊断。
诊断效果。该药物通过双功能螯合剂将放射性核素 Tc标记到新型RGD环肽二聚体分子上，在体内标记药物通过RGD多肽的靶向作用浓聚到肿瘤部位，利用核医学的单光子断层显像技术，对integrin αvβ3阳性肿瘤进行显像诊断。
[0005] 本发明的目的是通过如下技术方案实现：
[0006] 一种RGD多肽放射性药物，包括RGD多肽和放射性核素99mTc，所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体是将G3或PEG4与RGD多肽单体连接，再将两个连接有G3或PEG4的RGD多肽单体二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即E[L-c(RGDxK)]2(L＝G3或99m
PEG4)，所述放射性核素 Tc通过一个双功能螯合剂HYNIC(hydrazinonicotinamide，联肼尼克酰胺)标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有PKM(药代动力学修饰分子，PKM＝G2、G3、G4或PEG4)(G2代表两个甘氨酸分子，G4为四
99m
个甘氨酸分子)，所述RGD多肽放射性药物为 Tc-HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。
PEG4)，所述放射性核素 Tc通过一个双功能螯合剂HYNIC(hydrazinonicotinamide，联肼尼克酰胺)标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有PKM(药代动力学修饰分子，PKM＝G2、G3、G4或PEG4)(G2代表两个甘氨酸分子，G4为四
99m
个甘氨酸分子)，所述RGD多肽放射性药物为 Tc-HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。
[0007] 所述连接剂L为PEG4或G3。
[0008] 所述PKM为G2或G3或G4或PEG4。
[0009] 一种RGD多肽放射性药物制备方法，包括以下步骤：
[0010] a、L-c(RGDxK)的制备
[0011] 将Boc(t-Butyl carbamate，叔丁氧羰基)保护的连接剂L溶于1mL DMF(二甲基甲酰胺)中，加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，也为HOSu)和DCC(二环己基碳二亚胺)，室温下搅拌反应2小时。将c(RGDxK)加入到上述反应液中，用DIEA(N，N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL0.5M NH4OAc缓冲溶液(pH＝7.0)并过滤，滤液经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干。获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-L-c(RGDxK)。将Boc-L-c(RGDxK)加入到
3.0mLTFA(三氟乙酸)中，室温反应30分钟。旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL0.5MNH4OAc缓冲溶液(pH＝7.0)，经Zorbax C18半制备柱HPLC方法分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干。获得产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物L-c(RGDxK)。
3.0mLTFA(三氟乙酸)中，室温反应30分钟。旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL0.5MNH4OAc缓冲溶液(pH＝7.0)，经Zorbax C18半制备柱HPLC方法分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干。获得产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物L-c(RGDxK)。
[0012] b、E[L-c(RGDxK)]2的制备
[0013] 将Boc保护的谷氨酸(E)溶于5mL DMF，加入NHS和DCC，室温搅拌10小时。滤掉副产物DCU(二环己基脲)，滤液真空蒸干得到粗产物。用3mL CH2Cl2溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓缩至1mL左右。缓慢逐滴加入到30mL乙醚中，析出白色沉淀，过滤并真空干燥1
得到产品。获得产物经 H NMR核磁谱分析确认为预期产物Boc-E(OSu)2。将Boc-E(OSu)2溶于无水1mL DMF中，加入L-c(RGDxK)。使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-E[L-c(RGDxK)]2。用无水TFA浸泡Boc-E[L-c(RGDxK)]25分钟，去除Boc-保护基团。粗产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[L-c(RGDxK)]2。
得到产品。获得产物经 H NMR核磁谱分析确认为预期产物Boc-E(OSu)2。将Boc-E(OSu)2溶于无水1mL DMF中，加入L-c(RGDxK)。使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-E[L-c(RGDxK)]2。用无水TFA浸泡Boc-E[L-c(RGDxK)]25分钟，去除Boc-保护基团。粗产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[L-c(RGDxK)]2。
[0014] c、PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备
[0015] 将Boc-PKM-OSu和E[L-c(RGDxK)]2溶于2mL DMF和H2O的混合液(1:1＝v:v)，使用0.1N NaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜。将反应液真空蒸干，得到粗产品并将之溶于2mL TFA，将溶液在室温下搅拌15分钟。产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产品PKM-E[L-c(RGDxK)]2。
[0016] d、HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备
[0017] 将HYNIC-NHS(联肼尼克酰胺)和PKM-E[L-c(RGDxK)]2溶于DMF和H2O的混合液(1:1＝v:v)中，使用0.1N NaOH调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干。
[0018] e、99mTc-HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备
[0019] 配制含TPPTS(三苯基膦三磺酸钠)5.0mg，tricine(三羟甲基甘氨酸)6.5mg，琥珀酸二钠38.5mg，琥珀酸12.7mg和20μg的HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的混合液500μL99m
于10mL西林瓶中，加入1.0-1.5mL的Na TcO4溶液(10-50mCi)，100℃水浴加热西林瓶反应20-25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，制成RGD多肽放射性药物。
于10mL西林瓶中，加入1.0-1.5mL的Na TcO4溶液(10-50mCi)，100℃水浴加热西林瓶反应20-25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，制成RGD多肽放射性药物。
[0020] 所述HPLC方法为使用LabAlliance HPLC系统配备Zorbax C18半制备柱(9.4mm x250mm，100 pore size)，梯度淋洗36分钟，流速2.5mL/min，其中流动相A为25mM NH4OAc，B为乙腈。淋洗梯度设定为起始时90％A和10％B，5分钟时85％A和15％B，30分钟时65％A和35％B，32-36分钟时50％A和50％B。
[0021] 所述RGD多肽放射性药物用于integrin αvβ3阳性肿瘤患者的显像诊断，以及对接受靶向integrin αvβ3的抗癌药物治疗患者的选择和疗效评价。
[0022] 本发明的有益效果：
[0023] 1、在本发明RGD多肽放射性药物，首先将三个甘氨酸分子(G3)或四个聚乙二醇分子(PEG4)与RGD多肽单体连接，然后再将此二聚化，即合成E[G3-c(RGDxK)]2或E[PEG4-c(RGDxK)]2，这样两个RGD模序之间的距离就从6个键增加到26个键或38个键，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以使其能同时与细胞表面表达的相邻的integrin αvβ3受体相结合(如图2所示)，即以双价形式与integrin αvβ3结合，这样会进一步增强结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更好的诊断效果。
[0024] 2、本发明不仅在两个RGD模序之间引入G3和PEG4，同时在RGD多肽分子与双功能螯合剂HYNIC之间引入PKM，即HYNIC-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，以进一步改善药代动力学性质，特别是从非肿瘤组织的清除动力学。
[0025] 3、本发明中使用HYNIC作为双功能螯合剂，同时使用tricine和TPPTS作为协同99m
配体从而使“ Tc-HYNIC核”具有更加良好的体内外稳定性。
配体从而使“ Tc-HYNIC核”具有更加良好的体内外稳定性。
[0026] 以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
[0027] 图1为结构改造前RGD环肽二聚体与integrin αvβ3受体结合示意图；
[0028] 图2为结构改造后RGD环肽二聚体与integrin αvβ3受体结合示意图；
[0029] 图3为RGD环肽二聚体及其99mTc标记物结构示意图；
[0030] 图4为不同RGD多肽体外受体竞争结合分析；
[0031] 图5为99mTc标记的不同RGD多肽于注射后不同时间在神经胶质瘤摄取的对比；
[0032] 图6为99mTc标记的不同RGD多肽于注射后不同时间在乳腺癌摄取的对比；
[0033] 图7为注射99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2后30min神经胶质瘤动物模型的γ显像图；
[0034] 图8为注射99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2后30min乳腺癌动物模型的γ显像图。
具体实施方式
[0035] 本发明实施例中所采用的材料：Dicyclcohexylcarbodiimide(DCC，N，N＇-二环己基碳二亚胺)，N-hydroxysuccinimide(NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)，succinic acid(琥珀酸)，disodium succinate hexahydrate(琥珀酸二钠)，trisodiumtriphenylphosphine-3，3＇，3＂-trisulfonate(TPPTS，三苯基膦三磺酸钠)，N，N-Dimethylform amide(DMF，N，N-二甲基甲酰胺)，tricine(三羟甲基甘氨酸)均购自美国Sigma-Aldrich公司。
HYNIC-NHS(联肼尼克酰胺)购自美国Noca-biochem公司。环化RGD多肽单体c(RGDfK)]2
99m
购自美国PeptideInternational，Inc.公司。Na TcO4洗脱液购自北京原子高科股份有限公司。
HYNIC-NHS(联肼尼克酰胺)购自美国Noca-biochem公司。环化RGD多肽单体c(RGDfK)]2
99m
购自美国PeptideInternational，Inc.公司。Na TcO4洗脱液购自北京原子高科股份有限公司。
[0036] 实施例：
[0037] 本实施例以99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2多肽放射性药物及其制备方法为例。
[0038] 99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2中，RGD环肽二聚体是将连接剂PEG4与RGD多肽单体c(RGDfK)连接，再将两个连接有PEG4的RGD多肽单体二聚化而合成的RGD环肽二99m
聚体，即E[PEG4-c(RGDfK)]2，放射性核素 Tc通过一个双功能螯合剂HYNIC标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子
99m
PEG4，所述RGD多肽放射性药物为 Tc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2，所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。
聚体，即E[PEG4-c(RGDfK)]2，放射性核素 Tc通过一个双功能螯合剂HYNIC标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子
99m
PEG4，所述RGD多肽放射性药物为 Tc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2，所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。
[0039] 99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfk)]2制备方法如下：
[0040] 预先配备Zorbax C18半制备柱，HPLC方法一：使用LabAlliance HPLC系统，配备Zorbax C18半制备柱(9.4mm x 250mm，100 pore size)，梯度淋洗36分钟，流速2.5mL/min，其中流动相A为25mM NH4OAc(pH5.0)，B为乙腈。淋洗梯度设定为起始时90％A和10％B，5分钟时85％A和15％B，30分钟时65％A和35％B，32-36分钟时50％A和50％B。
[0041] PEG4-c(RGDfK)的制备：将Boc(t-Butyl carbamate，叔丁氧羰基)保护的PEG4-OH溶于1mL DMF(二甲基甲酰胺)中，加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，也为HOSu)(3.5mg，0.03mmol)和DCC(二环己基碳二亚胺)(6.2mg，0.03mmol)，室温下搅拌反应2小时。将c(RGDfK)(26.3mg，0.02mmol)加入到以上反应液中，用DIEA(N，N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL0.5M NH4OAc缓冲溶液(pH＝7.0)并过滤，滤液经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间约为14分钟的馏分，合并收集液并冻干。获得产品Boc-PEG4-c(RGDfK)约7.5mg。ESI-MS质谱分析结果为+ +
m/z＝1665([M+H])，[C75H117N20O23] 理论值为1665.85。
m/z＝1665([M+H])，[C75H117N20O23] 理论值为1665.85。
[0042] 将上述所得Boc-PEG4-c(RGDfK)(10mg，6mol)加入到3.0mL TFA(三氟乙酸)中，室温反应30分钟。旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL0.5M NH4OAc缓冲溶液(pH＝7.0)，经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间约为14分钟的馏分，合并收集液并冻+干。获得产品PEG4-c(RGDfK)约7.0mg。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝1565.2([M+H])，+
[C70H109N20O21] 理论值为1565.80。
[C70H109N20O21] 理论值为1565.80。
[0043] E[PEG4-c(RGDfK)]2的制备：将Boc-保护的谷氨酸(E)(0.247g，1.0mmol)溶于5mL DMF，加入NHS(0.253g，2.2mmol)和DCC(0.453g，2.2mmol)，室温搅拌10小时。滤掉副产物DCU(二环己基脲)，滤液真空蒸干得到粗产物。用3mL CH2Cl2溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓缩至1mL左右。缓慢逐滴加入到30mL乙醚中，析出白色沉淀，真空干燥得到产品0.27g。1
获得产物经 H NMR核磁谱分析确认为预期产物Boc-E(OSu)2。
获得产物经 H NMR核磁谱分析确认为预期产物Boc-E(OSu)2。
[0044] 将 上 述 所 得 Boc-E(OSu)2(4.4mg，0.01mmol)溶 于 无 水1mL DMF中，加 入PEG4-c(RGDfK)(5.28mg，0.03mmol)。使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，合并收集液并冻干，得到15mg白色粉末。经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-E[PEG4-c(RGDfK)]2。ESI-MS质谱分析结果为m/z+ +
＝1913.13([M+H])，[C86H138N21O28] 理论值为1912.99。
＝1913.13([M+H])，[C86H138N21O28] 理论值为1912.99。
[0045] 用无水TFA浸泡上述产物Boc-E[PEG4-c(RGDfK)]25分钟，去除Boc-保护基团。粗产品经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，合并收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[PEG4-c(RGDfK)]2。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝+ +
1813.0([M+H])，[C81H130N21O26] 理论值为1812.99。
1813.0([M+H])，[C81H130N21O26] 理论值为1812.99。
[0046] PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 的 制 备： 将 Boc-PEG4-OSu(5.1mg，11μmol) 和E[PEG4-c(RGDfK)]2(5mg，2.76μmol)溶于2mL DMF和H2O的混合液(1:1＝v:v)，使用0.1N NaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜。然后反应液真空蒸干，得到粗产品，溶于2mL TFA，将溶液在室温下搅拌15分钟。产品经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间为16.4分钟时的馏分，合并收集液并冻干。获得预期产品PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2约2.4mg，纯度大于95％。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝+ +
2061.46([M+H])，[C92H151N22O31] 理论值为2061.1。
2061.46([M+H])，[C92H151N22O31] 理论值为2061.1。
[0047] HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(HYNIC-3PEG4-dimer)的制备：将HYNIC-OSu(2mg，4.8μmol)和PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(2.4mg，1.2μmol)溶于2mL DMF和H2O的混合液(1:1＝v:v)，使用0.1N NaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时间为20.6分钟的馏分，合并收集液并冻干，得到产物+ +
1mg。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝2364.33([M+H])，[C105H160N25O35S] 理论值为2364.1。
1mg。ESI-MS质谱分析结果为m/z＝2364.33([M+H])，[C105H160N25O35S] 理论值为2364.1。
[0048] 99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(99mTc-3PEG4-dimer)的制备：配制含TPPTS5.0mg，tricine 6.5mg，琥珀酸二钠38.5mg，琥珀酸12.7mg和20μgHYNIC-3PEG3-dimer的
99m
混合液500μL于10mL西林瓶中，加入1.0-1.5mL的Na TcO4溶液(10-50mCi)，100℃水浴加热西林瓶反应20-25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，制备出RGD多肽放射性药物
99m 99m
Tc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2( Tc-3PEG4-dimer)。
99m
混合液500μL于10mL西林瓶中，加入1.0-1.5mL的Na TcO4溶液(10-50mCi)，100℃水浴加热西林瓶反应20-25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，制备出RGD多肽放射性药物
99m 99m
Tc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2( Tc-3PEG4-dimer)。
[0049] 对依据本发明方法制备的RGD多肽放射性药物99mTc-HYNIC-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK99m
)]2( Tc-3PEG4-dimer)取样进行放射性HPLC分析(HPLC方法二：使用LabAlliance HPLC系统，配备放射性在线检测器和Zorbax C18分析柱(4.6mm x 250mm，300 pore size)，梯度淋洗25分钟，流速1.0mL/min，其中流动相A为25mM NH4OAc(pH5.0)，B为乙腈。淋洗梯度设定为起始至2分钟时90％A和10％B，5分钟时85％A和15％B，20分钟时80％A
99m
和20％B，25分钟时90％A和10％B)， Tc-3PEG4-dimer的标记率>95％，经Sep-Pak C18柱纯化后放射化学纯度>98％。
)]2( Tc-3PEG4-dimer)取样进行放射性HPLC分析(HPLC方法二：使用LabAlliance HPLC系统，配备放射性在线检测器和Zorbax C18分析柱(4.6mm x 250mm，300 pore size)，梯度淋洗25分钟，流速1.0mL/min，其中流动相A为25mM NH4OAc(pH5.0)，B为乙腈。淋洗梯度设定为起始至2分钟时90％A和10％B，5分钟时85％A和15％B，20分钟时80％A
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和20％B，25分钟时90％A和10％B)， Tc-3PEG4-dimer的标记率>95％，经Sep-Pak C18柱纯化后放射化学纯度>98％。
[0050] HYNIC-3PEG4-dimer与integrin αvβ3结合亲和力测定：高表达integrin αvβ3125
的U87MG人神经胶质瘤细胞作为实验样本，使用 I-c(RGDyK)作为integrinαvβ3受体特异性结合的放射性配基，采用竞争结合实验测定HYNIC-3PEG4-dimer的IC50值(半抑制浓度)，并设c(RGDyK)、HYNIC-PEG4-c(RGDfK)(HYNIC-PEG4-monomer)、HYNIC-PEG4-E[c(RGDfK)]2(HYNIC-PEG4-dimer)、HYNIC-E[PEG4-c(RGDfK)]2(HYNIC-2PEG4-dimer)、HYNIC-E{E[c(RGDfK)]2}2(HYNIC-tetramer)为对照。实验结果显示，c(RGDyK)，HYNIC-PEG4-monomer，HYNIC-PEG4-dimer，HYNIC-2PEG4-dimer，HYNIC-3PEG4-dimer 和 HYNIC-tetramer 竞 争
125
I-c(RGDyK)与U87MG细胞结合的IC50值分别为37.3±10.1nM，31.7±9.7nM，7.5±2.3nM，
2.9±0.7nM，2.4±0.7nM 和 2.8±0.5nM(如 图 4 所 示 )，表 明 HYNIC-2PEG4-dimer、HYNIC-3PEG4-dimer与integrin αvβ3的亲和力明显好于其它现有RGD多肽分子，说明改造后的RGD环肽二聚体E[PEG4-c(RGDfK)]2与integrin αvβ3的亲和力明显好于其单体及改造前的RGD环肽二聚体，改造后的RGD环肽二聚体能以双价形式与integrin αvβ3结合。
的U87MG人神经胶质瘤细胞作为实验样本，使用 I-c(RGDyK)作为integrinαvβ3受体特异性结合的放射性配基，采用竞争结合实验测定HYNIC-3PEG4-dimer的IC50值(半抑制浓度)，并设c(RGDyK)、HYNIC-PEG4-c(RGDfK)(HYNIC-PEG4-monomer)、HYNIC-PEG4-E[c(RGDfK)]2(HYNIC-PEG4-dimer)、HYNIC-E[PEG4-c(RGDfK)]2(HYNIC-2PEG4-dimer)、HYNIC-E{E[c(RGDfK)]2}2(HYNIC-tetramer)为对照。实验结果显示，c(RGDyK)，HYNIC-PEG4-monomer，HYNIC-PEG4-dimer，HYNIC-2PEG4-dimer，HYNIC-3PEG4-dimer 和 HYNIC-tetramer 竞 争
125
I-c(RGDyK)与U87MG细胞结合的IC50值分别为37.3±10.1nM，31.7±9.7nM，7.5±2.3nM，
2.9±0.7nM，2.4±0.7nM 和 2.8±0.5nM(如 图 4 所 示 )，表 明 HYNIC-2PEG4-dimer、HYNIC-3PEG4-dimer与integrin αvβ3的亲和力明显好于其它现有RGD多肽分子，说明改造后的RGD环肽二聚体E[PEG4-c(RGDfK)]2与integrin αvβ3的亲和力明显好于其单体及改造前的RGD环肽二聚体，改造后的RGD环肽二聚体能以双价形式与integrin αvβ3结合。
[0051] 本发明RGD多肽放射性药物中，当连接剂L为G3、药代动力学修饰分子PKM为G399m 99m
时，本发明药物为 Tc-HYNIC-G3-E[G3-c(RGDfK)]2( Tc-3G3-dimer)，其制备方法同上。
时，本发明药物为 Tc-HYNIC-G3-E[G3-c(RGDfK)]2( Tc-3G3-dimer)，其制备方法同上。
[0052] 本发明RGD多肽放射性药物中，药代动力学修饰分子也可以是G2或G4。
[0053] 图3为RGD环肽二聚体及其99mTc标记物结构示意图。
[0054] 99mTc-3PEG4-dimer和99mTc-3G3-dimer在荷瘤裸鼠生物分布：将BALB/c荷U87MG人神经胶质瘤裸鼠以及荷MDA-MB-435人乳腺癌裸鼠随机分成若干组，每组4只。各组实验裸99m
鼠分别经尾静脉注射100μL(～74kBq)不同的 Tc标记的RGD多肽，于注射后30分钟、
60分钟和120分钟按组分别处死实验裸鼠，取血及主要脏器，称重并测量放射性计数，经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。
鼠分别经尾静脉注射100μL(～74kBq)不同的 Tc标记的RGD多肽，于注射后30分钟、
60分钟和120分钟按组分别处死实验裸鼠，取血及主要脏器，称重并测量放射性计数，经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。
[0055] 在U87MG人神经胶质瘤动物模型中，99mTc-3PEG4-dimer和99mTc-3G3-dimer的肿99m 99m 99m 99m
瘤摄取大约是 Tc-PEG4-monomer( Tc-HYNIC-PEG4-monomer)和 Tc-G3-monomer( Tc-HYNIC-G3-monomer)肿瘤摄取的3倍(如图5所示)。在MDA-MB-435人乳腺癌动物
99m 99m 99m 99m
模型中， Tc-3PEG4-dimer和 Tc-3G3-dimer的肿瘤摄取明显好于 Tc-tetramer( T
99m 99m
c-HYNIC-tetramer)，并且高于 Tc-PEG4-dimer( Tc-HYNIC-PEG4-dimer)肿瘤摄取的
99m 99m
两倍(如图6所示)，这充分说明 Tc-3PEG4-dimer和 Tc-3G3-dimer是以双价形式与
99m
integrin αvβ3结合，而 Tc-PEG4-dimer是以单价形式与integrin αvβ3结合。另外，
99m 99m 99m
Tc-3PEG4-dimer和 Tc-3G3-dimer在肝和肾的摄取只为 Tc-tetramer的一半。从肿
99m 99m
瘤的摄取以及靶组织与非靶组织的放射性比值来讲， Tc-3PEG4-dimer和 Tc-3G3-dimer
99m 99m
明显优于 Tc-PEG4-dimer和 Tc-tetramer。图7为荷U87MG人神经胶质瘤裸鼠注射
99m
Tc-3PEG4-dimer的γ显像图(箭头代表肿瘤部位)，图8为荷MDA-MB-435人乳腺癌裸鼠
99m
注射 Tc-3PEG4-dimer的γ显像图，注射后30min肿瘤即清晰可见(箭头代表肿瘤部位)。
瘤摄取大约是 Tc-PEG4-monomer( Tc-HYNIC-PEG4-monomer)和 Tc-G3-monomer( Tc-HYNIC-G3-monomer)肿瘤摄取的3倍(如图5所示)。在MDA-MB-435人乳腺癌动物
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模型中， Tc-3PEG4-dimer和 Tc-3G3-dimer的肿瘤摄取明显好于 Tc-tetramer( T
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c-HYNIC-tetramer)，并且高于 Tc-PEG4-dimer( Tc-HYNIC-PEG4-dimer)肿瘤摄取的
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两倍(如图6所示)，这充分说明 Tc-3PEG4-dimer和 Tc-3G3-dimer是以双价形式与
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integrin αvβ3结合，而 Tc-PEG4-dimer是以单价形式与integrin αvβ3结合。另外，
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Tc-3PEG4-dimer和 Tc-3G3-dimer在肝和肾的摄取只为 Tc-tetramer的一半。从肿
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瘤的摄取以及靶组织与非靶组织的放射性比值来讲， Tc-3PEG4-dimer和 Tc-3G3-dimer
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明显优于 Tc-PEG4-dimer和 Tc-tetramer。图7为荷U87MG人神经胶质瘤裸鼠注射
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Tc-3PEG4-dimer的γ显像图(箭头代表肿瘤部位)，图8为荷MDA-MB-435人乳腺癌裸鼠
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注射 Tc-3PEG4-dimer的γ显像图，注射后30min肿瘤即清晰可见(箭头代表肿瘤部位)。