RNA诱导的沉默复合体介导的剪切位点及其应用

摘要

本发明公开了一种RNA诱导的沉默复合体介导的剪切位点及其应用。该位点可在设计人工微小RNA中应用。编码所述人工微小RNA前体的DNA分子中，所述人工微小RNA前体是在植物中能产生微小RNA的单链RNA，该单链RNA形成茎环结构，所述茎环结构的茎部的一个片段中含有序列表中序列1的核苷酸序列，所述茎环结构的茎部有两个碱基对不互补，所述不互补的两个碱基对对应于所述序列1的自5′末端第9和第10位。本发明还公开了一种培育抗黄瓜花叶病毒的植物的方法。利用本发明的编码人工微小RNA前体的DNA分子，从而获得高效病毒抗性的植物，是一种既经济又有效的生物工程方法。

权利要求

1.针对黄瓜花叶病毒SD株系基因组的3′UTR区域第2051/2052位点设计的人工微小RNA在抗黄瓜花叶病毒中的应用；

所述人工微小RNA的核苷酸序列为序列表中序列1。

2.人工微小RNA，其特征在于：所述人工微小RNA的核苷酸序列为序列表中序列1。

3.权利要求2所述人工微小RNA的编码基因，是编码包含黄瓜花叶病毒SD株系基因组的3′UTR区域第2051/2052位点，且与该位点两侧的黄瓜花叶病毒基因组互补，长度为

21nt的RNA的DNA分子。

4.编码人工微小RNA前体的DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

5.含有权利要求4所述的DNA分子的重组表达载体。

6.含有权利要求4所述的DNA分子的转基因细胞系。

7.含有权利要求4所述的DNA分子的重组菌。

8.一种培育抗黄瓜花叶病毒的植物的方法，是将权利要求4所述的DNA分子转入植物中，获得抗黄瓜花叶病毒的转基因植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物为烟草或拟南芥。

说明书

RNA诱导的沉默复合体介导的剪切位点及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及RNA诱导的沉默复合体介导的剪切位点及其应用。

背景技术

[0002] 植物RNA沉默系统是一种在真核生物中广泛存在的保守机制，其作用方式是经一系列复杂的合成途径产生小分子RNA并以位点特异的剪切方式使与之序列互补的靶标RNA降解。这些小RNA长度多在21-24nt，主要包括微小RNA(microRNA)和小干扰RNA(siRNA)两种。较短的microRNA前体具有的单链发夹结构，与microRNA前体结构相似的人工microRNA(artificial microRNA，amiRNA)在植物中可以高效特异诱导内源基因沉默。最近的研究表明，amiRNA作为一种有效的基因沉默工具在植物抗病毒研究中也有很好的应用潜力。

[0003] 小分子RNA介导的RNA沉默已经被广泛应用于对目标基因的敲除(Baulcombe，2004，2005)。如siRNA可直接应用于人类Hela细胞和果蝇S2细胞等体外细胞系培养物(McMaus and Sharp，2002；Tuschl et al.，1999；Zamore et al.，2000)。在植物中，有一种能将长双链RNAs(dsRNAs)或带有发夹结构的前体RNAs转化的系统，这个系统中，RNaseIII型的DCL(Dicer like protein)蛋白能够将长双链RNAs(dsRNAs)或带有发夹结构的前体RNAs剪切成siRNAs或microRNAs，然后小RNA与含有Argonaute(AGO)蛋白的复合物(RNA诱导的沉默复合体)结合(Bartel，2004；Carrington and Ambros，2003；Kim，2005；
Park et al.，2002；Zamore et al.，2005)，RNA识别与其序列互补的靶标mRNA，在反义小RNA的指导下，小RNA与RNA诱导的沉默复合体结合的复合物，通过序列互补配对机制识别靶标RNA，并在特定位点发生剪切，剪切位点通常发生在反义小RNA 5′端的第10-11个核苷酸之间，被剪切的靶标mRNA进而被降解(Khvorova et al.，2003；Llave et al.，2002a；
Schwarzet al.，2003；Vaucheret et al.，2004)。

[0004] 在拟南芥和水稻中，为了表达特异的microRNAs，以microRNA前体(人工microRNAs，amiRNAs)为基础的短发夹RNAs是诱导特异基因沉默的最有效的表达框(Alvarez et al.，2006；Chen et al.，2004；Guo et al.，2005；Ossowski et al.，2008；Parizotto et al.，2004；Schwab et al.，2006；Wang et al.，2005；Warthmann et al.，
2008；)。最近，在植物生物技术中，amiRNA作为抗病毒的方法的应用潜力已被陆续报道(Qu et al.，2007；Niu et al.，2006)。

[0005] 过去十年里，通过表达病毒来源的的正义、反义序列或互补双链来，介导的RNA沉默已广泛应用于植物抗病毒基因工程(Helliwell and Waterhouse，2005；Smithet al.，1994；Waterhouse et al.，1998)。在这些抗病毒工程中，RNA沉默是通过病毒来源的转基因RNA和侵入的病毒RNA发生共抑制，进而使植物对病毒产生很强的抗性或恢复现象(Guo and Garcia，1997；Linbo et al.，1994)。与长RNA介导的抗病毒沉默相比，amiRNA有很多优点：首先，不需要长的病毒cDNA片段，一个短的与植物基因没有同源性的amiRNA序列可以避免非特异性剪切，即“脱靶”现象。其次，amiRNA介导的抗病毒在农业生产中应用不会带来生物安全问题，在植物中表达amiRNAs，不用考虑转基因植物中的病毒序列会与非靶标病毒互补或重组(Garciaand Simon-mateo，2006)。

[0006] 在拟南芥中表达分别针对芜菁黄化病毒(TYMV)和芜菁花叶病毒(TuMV)设计的沉默抑制子——P69和HC-Pro蛋白编码序列的amiRNA，使转基因植物分别获得了对TYMV和TuMV的抗性(Niu et al.，2006)。然而，表达针对黄瓜花叶病毒(CMV)编码的沉默抑制子——2b的amiRNA转基因烟草对CMV侵染产生不同的反应，包括抗性、恢复型、延迟抗性和敏感等(Qu et al.，2007)。抗性不强的原因可能在于CMV包含三条基因组RNA和两条亚基因组RNA，CMV基因组RNA1和RNA3，以及亚基因组RNA4不是amiR2b的直接靶标，而且来源于这些非靶标RNA的siRNAs在植物细胞中快速复制，这些siRNA与RISC复合物结合，进而导致siRNA和RISC复合体的饱和，影响了amiR2b的抗病毒效率，还有一个可能就是amiR2b的靶位点不在siRISC复合体最适宜的靶标识别区域。通常认为对于某一特定mRNA靶标来说，并非所有与之互补的siRNA都同样有效，RNA沉默效率不仅取决于siRNA序列本身，也与靶标mRNA靶点周围的高级结构有关，高级结构主要影响siRNA-RISC复合物的可进入性。

[0007] 有研究表明，带有内源功能micro RNAs靶点的嵌合体李痘病毒(PPV)的侵染性，因micro RNA靶点插入位点的不同而强弱不同(Simon-Mateo and Garcia，2006)，即嵌合体PPV的毒性也依赖于micro RNA靶点序列在病毒基因组中的位置，表明某些位点较其它位点更有利于micro RNA-RISC介导的剪切。另外，在PPV嵌合体侵染的植物中发现了抵抗micro RNA-RISC剪切的选择性PPV突变体，这些突变有些发生在micro RNA的靶序列中，主要影响micro RNA5′端核苷酸与靶标mRNA的相互识别与结合，表明病毒可以进化出一种机制，在micro RNA剪切活性的的负压下来逃脱microRNA-RISC介导的RNA沉默(Simon-Mateo and Garcia，2006)。

[0008] 在动物细胞中，可以利用生物化学和生物信息学手段分析靶点的可进入性对siRNA-RISC复合体催化活性的影响(Ameres et al.，2007；Brown et al.，2005；Shao et al.，2007)。虽然通过生物信息学手段可以对靶标RNA高级结构进行计算机模拟预测并评价该结构对靶点可进入性的影响，但是，由于缺乏能够准确而稳定地预测长链RNA高级结构的方法，因此很难预测病毒RNA在自然侵染过程中的真实高级结构，因为病毒RNA不可能只存在单一的稳定结构，这就为siRNA介导的RNA沉默在医学及农业生产上的进一步应用带来了很大的障碍。

[0009] CMV是典型的三分体单链正义RNA病毒(Sugiyama，2000)，包含三个亚组：IA、IB和II(Roossinck，1999)。CMV核酸由3条基因组(RNA1、RNA2和RNA3)和2条亚基因组RNA(RNA4A和RNA4，分别由RNA2和RNA3转录而来)组成，如图1所示，其中不同RNA3′非翻译区(3′UTR)的核苷酸序列高度相似，而且3′UTR的3′端都能形成类似于tRNA的高级结构-TLS结构(tRNA like structure)(Kwon and Chung，2000；Rietveld et al.，1983)。研究表明，TLS区域存在着CMV负链RNA合成所需要的启动子，能够与病毒编码的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP，如CMV RNA1和RNA2编码的1a和2a蛋白)相互作用，因此在病毒RNA的复制过程中起重要作用，进而影响CMV的侵染(Fernandez-Cuartero et al.，1994)。鉴于CMV 3′UTR对于CMV复制的重要性以及3′UTR核苷酸序列及三维结构的保守性，因此CMV 3′UTR很适合作为RNA沉默抗病毒的靶点区域。

发明内容

[0010] 本发明的目的是提供RNA诱导的沉默复合体介导的剪切位点及其应用。

[0011] 本发明的发明人研究发现位于SD型黄瓜花叶病毒基因组RNA3的3′UTR区域2051/2052位点是RNA诱导的沉默复合体介导的剪切位点，该位点可在设计人工微小RNA中应用，人工微小RNA是有效的基因沉默工具，可用于植物抗病毒。

[0012] 其中，靶向黄瓜花叶病毒基因组RNA3的3′UTR区域2051/2052位点设计的人工微小RNA的核苷酸序列为序列表中序列1。所述人工微小RNA的编码基因，是编码包含黄瓜花叶病毒基因组的3′UTR区域第2051/2052位点，且与该位点两侧的黄瓜花叶病毒基因组互补，长度为21～24nt的RNA的DNA分子。

[0013] 为了在植物中特异表达出本发明的人工微小RNA(amiRNA)，需要构建所述编码所述amiRNA前体的DNA分子，所述人工微小RNA前体是在植物中能产生微小RNA的单链RNA，该单链RNA形成茎环结构，所述茎环结构的茎部的一个片段中含有序列表中序列1的核苷酸序列，所述茎环结构的茎部有两个碱基对不互补，所述不互补的两个碱基对对应于所述序列1的自5′末端第9和第10位。

[0014] 其中，所述植物为烟草或拟南芥。所述编码amiRNA前体的DNA分子的核苷酸序列具体可如序列表中序列2所示。

[0015] 含有上述的DNA分子的重组表达载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

[0016] 可用现有的植物表达载体构建含有所述编码amiRNA前体的DNA分子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明的所述编码amiRNA前体的DNA分子的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

[0017] 使用所述编码amiRNA前体的DNA分子构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

[0018] 本发明的另一个目的是提供一种培育抗黄瓜花叶病毒的植物的方法。

[0019] 本发明所提供的培育抗黄瓜花叶病毒的植物的方法，是将所述编码amiRNA前体的DNA分子转入植物中，获得抗黄瓜花叶病毒的转基因植物。

[0020] 所述植物可以为双子叶植物或单子叶植物，具体可为拟南芥或烟草。

[0021] 本发明的发明人发现了siRNA-RISC介导的一个剪切热点，并以该切点为靶点设计人工微小RNA，构建了含有所述编码amiRNA前体的DNA分子的植物重组表达载体，将该载体导入拟南芥和烟草中，转所述编码amiRNA前体的DNA分子的拟南芥和烟草，都表现出对CMV侵染的高度抗性，而且能够抵抗不同株系CMV的侵染。利用本发明所述编码amiRNA前体的DNA分子，从而获得高效病毒抗性的植物，是一种既经济又有效的生物工程方法。

附图说明

[0022] 图1为CMV的基因组结构

[0023] 图2为Q-CMV亚基因组克隆及含完整3′UTR的RNA13′端序列的瞬时表达与3′UTR来源的病毒小RNA的northern blot杂交检测

[0024] 图3为Q-/SD-CMV侵染不同基因型植物得到的剪切热点在Q-/SD-/FNY-CMVRNA33′UTR上的分布情况及针对不同切点设计的amiRNA

[0025] 图4为SD-CMV侵染野生型拟南芥及dcl2/3/4突变体表型分析(A)及3’UTR来源的vsiRNA的northern blot杂交检测

[0026] 图5为基于拟南芥miR159a前体骨架的人工miRNA前体

[0027] 图6为AT3G29250的表达水平

[0028] A：amiR-SD-3与AT3G29250形成有3个错配的不完全配对；

[0029] B：半定量RT-PCR实验检测AT3G29250的表达水平。

[0030] 图7为amiRNA转基因拟南芥对于SD-CMV的抗性分析

[0031] 图8为amiRNA转基因烟草对于CMV的抗性分析

具体实施方式

[0032] 实施例1、靶向于黄瓜花叶病毒基因组的3′UTR区域2051/2052位点的amiRNA的设计

[0033] 1)黄瓜花叶病毒(CMV)3′UTR能被植物内源RNA沉默途径所识别

[0034] 为了研究CMV侵染过程中3′UTR区域能否被植物RNA沉默系统识别并靶向降解，鉴于CMV基因组太长，为了更好地维持3′UTR区域的自然折叠结构，构建了包含Q-CMV完整亚基因组RNA4A和RNA4的表达载体35S-R4A和35S-R4。表达载体35S-R4A和35S-R4的构建方法如下：以pQCD2(Ding，S.W.，J.P.Rathjen，W.X.Li，R.Swanson，H.Healy，and R.H.Symons.1995.Efficient infectionfrom cDNA clones of cucumber mosaic cucumovirus RNAs in a new plasmid vector.J.Gen.Virol.76(Pt 2)：459-464)(中国科学院微生物研究所)为模板以QR4-5(5’-TCTAGAAGCGTTTAGTTGTTCACCTG-3’)和QR4-3(5’-GAGCTCTGGTCTCCTTATGGAGAAC-3’)引物进行PCR扩增得到RNA4；

[0035] 以 pQCD3(Ding，S.W.，J.P.Rathjen，W.X.Li，R.Swanson，H.Healy，and R.H.Symons.1995.Efficient infection from cDNA clones of cucumbermosaic cucumovirus RNAs in a new plasmid vector.J.Gen.Virol.76(Pt2)：459-464)(中国科学院微生物研究所)为模板，QR4A-5(5’-TCTAGAGTTTTGTATATCTGAGTTCC-3’)和QR4A-3(5’-GAGCTCTGGTCTCCTTATGGAGAACC-3’)为引物进行PCR扩增得到RNA4A，RNA4和RNA4A经测序鉴定后再经XbaI-SacI消化后，克隆到双元载体pCAMBIA-1300221(Guo，H.S.，Q.Xie，J.F.Fei，and N.H.Chua.2005.MicroRNA directs mRNA cleavageof the transcription factor NAC1 to downregulate auxin signals forarabidopsis lateral root development.Plant Cell 17：1376-1386)(中国科学院微生物研究所)中，分别命名为35S-R4和35S-R4A。

[0036] 由于RNA1没有亚基因组，从包含Q-CMV RNA1全长cDNA序列的pQCD1质粒(Ding，S.W.，J.P.Rathjen，W.X.Li，R.Swanson，H.Healy，and R.H.Symons.1995.Efficient infection from cDNA clones of cucumber mosaic cucumovirus RNAsin a new plasmid vector.J.Gen.Virol.76(Pt 2)：459-464)(中国科学院微生物研究所)经Xho I-BamHI切下RNA1 3’端962 nt的片段，克隆到双元载体pCAMBIA-1300221上，得到重组质粒35S-R1*。将含有35S-R1*、35S-R4A和35S-R4质粒的农杆菌分别注射本生烟(Nicotiana.benthamiana)进行瞬时表达，注射后1、2、3、4天(dpi)分别剪取注射叶片，提取总RNA，
10μg总RNA经甲醛变性胶电泳转膜后进行常规northern blot杂交。杂交探针为[α-32P]dCTP标记的Q-CMVRNA3 3′UTR特异的序列。同时30μg总RNA经PAGE凝胶电泳转膜后进行siRNAnorthern blot杂交，杂交探针为经[α-32P]UTP标记的Q-CMV RNA3 3′UTR特异的体外转录产物。

[0037] siRNA northern blot杂交结果如图2所示，表明注射后4天之内，Q-CMV3′UTR来源的siRNA的积累量逐渐增加，这说明Q-CMV RNA能够作为植物体内RNA沉默系统的底物被识别加工成siRNA分子。在Q-CMV RNA杂交结果中，可以很容易地检测到Q-CMV RNA1*、RNA4A和RNA4的积累，这些RNA在2-3天积累量达到峰值，第4天开始下降；并且，在Q-CMV RNA杂交信号的下方还可以检测到一些随着注射时间的延长不断增强的杂交信号，这说明有可能3′UTR在某些区域或点被集中剪切，或者说存在一些剪切热点，从而造成了特异片段的积累，使得Q-CMV RNA的积累量减少。但是这种剪切是由Dicer识别3′UTR加工引起的还是3′UTR来源的siRNA介导的siRNA-RISC复合物的剪切引起的并不清楚。

[0038] 2)CMV 3′UTR剪切热点的确定

[0039] 为了研究注射实验中得到的特异片段的来源，在Q-CMV RNA3 3′UTR最末端设计了外部引物和内部引物进行5′RLM-RACE实验，检测Q-CMV RNA3 3′UTR区域的切点分布。采用Ambion公司的First Choice RLM-RACE试剂盒，2ug 35S-R4注射本生烟第四天的总RNA直接与5’RACE RNA Adapter进行连接，具体操作参照其说明手册。得到的PCR片段连接到pGEM-T Easy载体上(Promega公司)，挑选单克隆进行测序分析。

[0040] 测序结果与Q-CMV RNA3 3′UTR进行序列比对发现，在9个测序的克隆中，有6个位于Q-CMV RNA3(M21464)2115～2116核苷酸之间，3个位于2114～2115核苷酸之间，而这两个位点都位于能形成类似tRNA的高级结构(TLS)区域内，如图3所示。

[0041] 为了研究在自然侵染条件下CMV 3′UTR区域是否也存在这种剪切热点，以及剪切热点与注射瞬时表达实验中检测到的是否一致，以Q-CMV感染野生型心叶烟(N.glutinosa)提取的总RNA为样品进行5′RACE nest-PCR，将测序结果与Q-CMV RNA33′UTR进行序列比对，得到的切点在图3中用浅灰色实心箭头标出，在全部19个克隆中检测到16个不同的切点，16个切点中只有2个位于能形成高级结构的TLS区，而且与注射实验得到的切点不一致，另外14个切点全部位于3′UTR TLS区域之外的5′端，这一区域不能形成很高级的结构。进一步分析可以发现，14个切点中的大部分(8个)都位于Q-CMV RNA3 2007～2023核苷酸之间，这是一个剪切的热点区域(hotspot region)。这一实验结果表明，在CMV自然侵染过程中，RNA3 3′UTR剪切热点主要发生在TLS区之外的3′UTR的5′端。

[0042] 由于Q-CMV在田间是一个弱毒性株系，为了使剪切热点能更好地应用于抗病毒研究，又选取了强毒力株系SD-CMV(亚组IB)，同样在RNA3 3′UTR 3′末端设计外部引物和内部引物，选择从SD-CMV自然侵染的野生型拟南芥中提取的总RNA进行5′RACE nest-PCR，将测序结果与SD-CMV RNA3 3′UTR进行序列比对，得到的切点用黑色实心箭头标于图3中，在全部31个克隆中共得到27个不同的切点，而且这27个切点全部位于TLS区域上游的5′端。其中，SD-CMV RNA3 2045～2072核苷酸之间分布有12个切点，形成一个剪切热点区域，这与在Q-CMV感染野生型心叶烟得到的剪切热点区域位置相近。

[0043] 前面检测到的切点都是在CMV侵染野生型植物中获得的，为了尽量消除那些由DCL蛋白剪切造成的切点，寻找到那些由siRNA-RISC加工的切点，用SD-CMV感染拟南芥DCL蛋白三突变体，感染10天后系统叶出现明显感病症状，如图4A所示，图4A中，“Col-0”代表野生型拟南芥，“dcl2-1/3-1/4-2”代表拟南芥DCL蛋白三突变体；“Mock”代表未感染病毒的拟南芥，“SD-CMV”代表SD-CMV病毒感染的拟南芥；突变体发育严重畸形，包括植株矮化、花序与叶片弯曲、开花延迟等。为了检测SD-CMV感染dcl2-1/3-1/4-2突变体后是否有CMV来源的小RNA(vsiRNA)的积累，随机合成了数条SD-CMV RNA3 3′UTR来源的32
21nt寡核苷酸链，经[γ- P]ATP末端标记后作为探针，分别提取SD-CMV感染后16天的野生型Col和dcl2-1/3-1/4-2突变体系统感病叶片总RNA进行northern blot杂交。杂交结果如图4B所示，在感染的野生型拟南芥Col(图4B中以“WT”表示)中检测到了大量vsiRNA的积累，而在dcl2-1/3-1/4-2突变体中也有很微弱的积累，显示在病毒诱导的基因沉默途径中的主要DCL蛋白缺失的情况下，可能DCL1会发挥部分剪切功能，当然也有可能dcl2-1/3-1/4-2并非DCL蛋白功能完全缺失突变体，或者是其它类Dicer的同源蛋白加工造成的切点。vsiRNA的少量积累为筛选vsiRNA-RISC剪切位点提供了实验依据。

[0044] 将上述SD-CMV感染的dcl2-1/3-1/4-2突变体系统感病叶总RNA进行5′RACE实验，经巢穴-PCR后进行测序，将测序结果与SD-CMV RNA3 3′UTR进行序列比对，得到的切点用黑色空心箭头标于图3中，在全部21个克隆中共得到16个不同的切点，其中有15个切点位于TLS区域上游的5′端，只有一个切点位于TLS区，而且有9个切点与SD-CMV自然侵染实验中得到的剪切热点重合，另外，综合自然侵染实验与感染dcl2-1/3-1/4-2突变体得到的切点，在图3第76~80 nt之间也能形成一个小的热点，在此区域分别在自然侵染5′RACE和突变体5′RACE实验中检测到3次剪切。另外，这一结果也显示在剪切热点区域得到的切点可能大多是siRNA介导的RISC的剪切产物，说明在CMV 3′UTR的3′末端可能由于存在类似tRNA的高级结构，使得siRNA-RISC复合物很难进入并靶向这些区域。基于以上结果，选择了一些剪切热点作为潜在的有效靶点来设计amiRNA。

[0045] 3)amiRNA的设计

[0046] 综合以上不同实验中得到的切点，SD-CMV RNA3 3′UTR区域2051/2052切点最有可能是siRNA-RISC介导的剪切热点，因为该切点分别在野生型拟南芥及dcl2/3/4突变体中分别检测到了1次和4次，不仅位于“热点区域”之内，而且该位点前后的序列在CMV不同亚组的三个株系之间都非常保守，另外该切点含有一个“U”，符合大部分miRNA介导的核酸内切酶对靶标的剪切发生在“U”之后这一规律(Huesken et al.，2005；Reynolds et al.，2004)，因此选择该切点设计amiRNA，命名为amiR-SD-3，amiR-SD-3的序列如序列表中序列
1所示。

[0047] 作为对照，设计了amiR-SD-4，其靶点位于SD-CMV RNA3 2018/2019核苷酸之间，在该位点没有检测到任何切点，虽然在2017/2018核苷酸之间在Q-CMV感染野生型烟草和SD-CMV感染拟南芥中分别检测到1次和2次剪切，而且该切点附近序列也比较保守，但没有检测到任何来自于dcl2/3/4突变体中的切点。

[0048] 实施例2、用实施例1的amiRNA培育抗黄瓜花叶病毒的转基因植物

[0049] 一、实施例1的amiRNA培育抗黄瓜花叶病毒的转基因植物

[0050] a)以miR159a前体为骨架的amiRNA前体的构建

[0051] 利用RT-PCR的方法以拟南芥基因组DNA为模板，将拟南芥miR159a的前体266bp片段扩增出来，该片段除了含有完整的pre-miR159a(184bp)之外，5′端还包含82bp的基因组序列。RT-PCR所用引物miR159-For和miR159-Rev序列如下：

[0052] miR159-For：5 ′ - CCACAGTTTGCTTATGTCGGATCC-3 ′ 和 miR159-Rev：5′-ATGTAGAGCTCCCTTCAATCC-3′。

[0053] 其中miR159-For引物5′端斜体部分为引入的XbaI位点，miR159-Rev引物划线部分为成熟的miR159 21个核苷酸序列中的18个核苷酸。

[0054] PCR扩增后得到的片段用凝胶电泳回收后与pGEM-T Easy vector(Progema)载体连接，挑选正向克隆经测序验证后得到的质粒命名为pGEM-T Easy-pre-miR159a。从该质粒上切下XbaI-SalI片段，连接到经同样酶切消化的植物表达双元载体pCAMBIA-1300221上，并将MIR159a的前体序列置于35S启动子的下游，命名为35S-pre-miR159。

[0055] 为了构建amiRNA前体，设计了以下引物，所用的引物如表1所示，其中，Forward引物中斜体部分为miR159a基因组序列中自带的BglII位点，下划线部分为构建的amiRNA的发夹结构互补链，另外在amiR-SD-3和amiR-SD-4 Forward引物中还引入了XbaI(斜体)位点。而在Reverse引物中下划线部分表示的是成熟amiRNA序列的反向完全互补序列。

[0056] 表1、amiRNA引物

[0057]

[0058]

[0059] 以pGEM-T Easy-pre-miR159a质粒为模板，以amiR-SD-3的Forward和Reverse这对引物进行PCR扩增，得到的片段连接到pGEM-T Easy vector(Progema)载体上，命名为pGEM-T Easy-pre-amiR-SD-3，进行测序，测序结果表明，编码amiRNA前体的DNA的核苷酸序列为序列表中的序列2，编码amiRNA前体的DNA转录出的amiRNAs前体，与天然的MIR159a的前体一样，是在植物中能产生微小RNA的单链RNA，该单链RNA形成茎环结构，其茎环结构的茎部的一个片段中含有序列表中序列1的核苷酸序列，其茎环结构的茎部有两个碱基对不互补，该不互补的两个碱基对对应于序列1的自5′末端第9和第10位。

[0060] 以pGEM-T Easy-pre-miR159a质粒为模板，以amiR-SD-4的Forward和Reverse这对引物进行PCR扩增，得到的片段连接到pGEM-T Easy vector(Progema)载体上，命名为pGEM-T Easy-pre-amiR-SD-4。

[0061] 将 pGEM-T Easy-pre-amiR-SD-3 和 pGEM-T Easy-pre-amiR-SD-4 经 Bgl II159
和SpeI消化后得到的amiRNA前体片段克隆到经同样酶切消化的35S-pre-miR 质粒上，用amiRNA前体代替miR159a的前体，得到的重组质粒命名为35S-pre-amiR-SD-3和
35S-pre-amiR-SD-4，其中amiRNA前体序列位于35S启动子的下游，由此便得到了amiRNA的表达载体，如图5所示。

[0062] b)抗黄瓜花叶病毒的转基因植物的获得

[0063] 分别将35S-pre-amiR-SD-3和35S-pre-amiR-SD-4转入拟南芥(Columbia)及烟草(Xanthi.nc)中。利用“花浸染”方法进行拟南芥的转化(Clough and Bent，1998)。烟草转化则采用与农杆菌共培养的方法进行，用含有20mg/L潮霉素的MS抗性培养基筛选转基因植株。4周大小的拟南芥以及3～4周大小的烟草用于病毒侵染实验。

[0064] 二、转基因植物对CMV的抗性分析

[0065] a)转基因拟南芥对CMV的抗性分析

[0066] SD-CMV病毒(Du，Q.S.，C.G.Duan，Z.H.Zhang，Y.Y.Fang，R.X.Fang，Q.Xie，and H.S.Guo.2007.DCL4 targets Cucumber mosaic virus satelliteRNA at novel secondary structures.J.Virol.81：9142-51)(中国科学院微生物研究所)侵染实验的方法如下：

[0067] 1)将感染有CMV的叶片置于无菌的预冷研钵中，按比例加入一定体积的5mMNaHPO4(pH7.2)缓冲液(1g作为毒源的新鲜叶片加入5 mlNaHPO4缓冲液)，用研钵磨碎，匀浆；

[0068] 2)接种前，将待接种植物叶片表面均匀喷布金刚砂；

[0069] 3)接种时，用手指蘸取汁液逆叶毛方向轻轻摩擦叶片，每株植物接种2～3个叶片；

[0070] 4)接种后10min向叶片表面喷洒清水，冲洗残留的金刚砂；

[0071] 5)接种后的植物保湿一天，然后在16hr光照/8hr黑暗条件下培养，培养温度为23℃，约2周后出现症状。

[0072] SD-CMV感染野生型拟南芥(Col-0)会引起严重的发育畸形，如矮化、节间距变短、花序及果荚弯曲等。选择转amiRNA基因拟南芥的T2代植株中(包含纯合与杂合体)具有高amiRNA表达水平的3个株系(图7A)进行SD-CMV攻毒实验，以野生型为对照。图7A中“amiR-SD-3”代表35S-pre-amiR-SD-3的拟南芥，“amiR-SD-4”代表35S-pre-amiR-SD-4的拟南芥。

[0073] 侵染后12天，27株野生型拟南芥中有26株出现典型的感病症状，与之相似，大部分转35S-pre-amiR-SD-4的拟南芥也表现出感病症状(图7B)。与转35S-pre-amiR-SD-4的拟南芥形成鲜明对比的是，转35S-pre-amiR-SD-3三个株系(1、2、7)的所有植物都呈现正常的发育表型。图7B中“WT”代表SD-CMV感染的野生型拟南芥；“mock”代表未感染病毒的野生型拟南芥，“amiR-SD-3”代表35S-pre-amiR-SD-3的拟南芥，“amiR-SD-4”代表35S-pre-amiR-SD-4的拟南芥。

[0074] 随后又做了酶联免疫实验(ELISA)检测感染后16天系统叶中SD-CMV CP蛋白的积累水平。利用SD-CMV CP蛋白的多克隆抗体血清(Qu，J.，J.Ye，and R.Fang.2007.Artificial microRNA-mediated virus resistance in plants.J.Virol.81：6690-6699)(中国科学院微生物所)进行ELISA实验检测SD-CMV CP蛋白的积累。碱性磷酸酶标记的羊抗兔免疫球蛋白作为二抗(购自Amersham Biosciences)。CP蛋白积累水平通过蛋白提取液与pNPP底物显色1hr后在405nm处的光吸收值来反应，检测仪器为Microplate Reader(BIO-RAD，Model 550)。

[0075] 结果如图7C所示，SD-CMV CP在转35S-pre-amiR-SD-3株系中检测不到，与观察到的表型一致。而转35S-pre-amiR-SD-4株系系统叶中则积累了较高水平的SD-CMV CP蛋白，与SD-CMV侵染的野生型植物相似，图7中“SD-CMV”代表SD-CMV感染的拟南芥；“mock”代表未感染病毒的拟南芥，WT为野生型拟南芥，“amiR-SD-3”代表35S-pre-amiR-SD-3的拟南芥，“amiR-SD-4”代表35S-pre-amiR-SD-4的拟南芥。

[0076] 同时做了第二个独立实验来监控SD-CMV侵染的T3代纯合系转基因植物中SD-CMV CP蛋白的变化动态，如表2所示，转35S-pre-amiR-SD-4株系的抗性也只有18.8-28.6％，与T2代植物的抗性结果相似。但是，转35S-pre-amiR-SD-3的转基因植物对SD-CMV保持100％的抗性。图7D显示的是SD-CMV CP蛋白在系统叶中的变化动态，转35S-pre-amiR-SD-3的转基因植物在检测期中SD-CMV CP始终维持在本底水平，而转
35S-pre-amiR-SD-4的转基因植物在侵染后，前8天SD-CMV CP水平急剧增加，8~16天维持在较高水平，与野生型对照相似。

[0077] 图7D中，“WT/Mock”代表用清水侵染的野生型拟南芥，“WT/SD-CMV”代表SD-CMV侵染的野生型拟南芥，amiR-SD-3/SD-CMV”代表SD-CMV侵染的amiR-SD-3转基因拟南芥，“amiR-SD-4/SD-CMV”代表SD-CMV侵染的amiR-SD-4转基因拟南芥，横坐标为SD-CMV侵染植物后的天数(dpi)。

[0078] 综合两组实验的结果，靶点位于检测到最多次数的可能的RISC可进入位点的amiR-SD-3对SD-CMV的抗性最佳，并且amiRNA介导的抗性是可以遗传的。

[0079] 表2.AmiRNA转基因拟南芥对于SD-CMV的抗性

[0080]

[0081] 表中表示两组独立实验检测amiRNA转基因拟南芥对SD-CMV的抗性，第一组实验为T2代转基因植株，第二组实验为T3代转基因纯和系。*I/T中分子代表ELISA阳性植株，分母代表被感染的植物总数；**R，代表抗性百分比。

[0082] b)转基因烟草对CMV的抗性分析

[0083] SD-CMV、Fny-CMV(Rizzo，T.M.and Palukaitis，P.Nucleotide sequence andevolutionary relationships of cucumber mosaic virus(CMV)strains：CMV RNA1.J.Gen.Virol.1989 70(1)：1-11)(中国科学院微生物研究所)和Q-CMV病毒(Davies，C.and Symons，R.H.Further implications for the evolutionaryrelationships between tripartite plant viruses based on cucumber mosaicvirus RNA3.Virology.1988，165(1)：216-24.)(中国科学院微生物研究所)侵染实验的方法同步骤a)。

[0084] 感染后的烟草在16hr光照/8hr黑暗条件下培养，培养温度为25℃。

[0085] 烟草是CMV的天然寄主，Q-CMV侵染烟草通常会在系统叶出现花斑等典型症状。而SD-CMV(亚组IB)和Fny-CMV(亚组IA)症状更强，包括系统叶片严重失绿、扭曲等。

[0086] 首先检测转amiRNA基因烟草对Q-CMV的抗性。根据转基因拟南芥的抗性结果，选择转35S-pre-amiR-SD-3的烟草T1代3个具有amiRNA高水平表达的株系(图8A)进行Q-CMV攻毒实验。侵染后6天，15株野生型烟草中有14株出现明显的感病症状(图8B)，转35S-pre-amiR-SD-3的烟草T1代中没有出现明显的感染症状。

[0087] ELISA检测Q-CMV CP蛋白在系统叶中的积累水平，利用Q-CMV CP蛋白的多克隆抗体血清。Q-CMV CP蛋白的多克隆抗体血清按照如下方法制备：

[0088] 以 pQCD3(Ding，S.W.，J.P.Rathjen，W.X.Li，R.Swanson，H.Healy，and R.H.Symons.1995.Efficient infection from cDNA clones of cucumbermosaic cucumovirus RNAs in a new plasmid vector.J.Gen.Virol.76(Pt2)：459-464)( 中国科学院微生物研究所)为模板，以QCP-anbibody-5和QCP-antibody-3为引物进行PCR扩增出Q CMV CP基因，QCP-anbibody-5和QCP-antibody-3的引物序列如下：GGATCCatggacaaatctggatctcc和GCGGCCGCctaagtcgggagcatccgtgag，经测序鉴定后用BamHI和NotI酶切后克隆到原核表达载体pGEX-4T-2，得到pGEX-4T-2-QCP原核表达重组质粒。将pGEX-4T-2-QCP重组质粒转入大肠杆菌DH5 a中，挑选阳性克隆至2ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，18～25℃振摇至OD600值约为0.6，将此2ml菌液加入100ml LB中，18～25℃振摇至OD600值约为0.6，然后加入IPTG至终浓度为0.1～1mM继续摇5～
8h，4℃，5000rpm离心5min收集菌体，用10×柱体积的PBS(加1％Triton-100、蛋白酶抑制剂)悬浮菌体，冰水中超声波破碎细胞(1分钟/次×5次，每次间隔1分钟)或高压破碎两次，4℃，12,000rpm离心15min，收集上清液，加DTT至其终浓度为1mM，用0.45um滤纸过滤，滤液用来过胱甘肽琼脂糖亲和层析柱。

[0089] 亲和层析柱用如下方法制备：

[0090] 1)将GST-谷胱甘肽琼脂糖凝胶(北京鼎国生物技术有限公司)混匀，取1.5ml加入层析柱中，加10ml 20％乙醇，使琼脂糖在柱中自然沉降；

[0091] 2)10ml 20％乙醇流尽后，加10ml PBS清洗柱子(5×柱体积)，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用；

[0092] 3)滤后的上清液加入亲和层析柱，室温下使混合液自然通过层析柱，保留0.5ml过滤液做PAGE电泳检测用；

[0093] 4)10ml PBS洗柱子3遍，每次临近结束时收集洗涤液0.5ml测OD值；

[0094] 5)3×柱体积洗脱液(10mM的还原型谷胱甘肽溶液)洗脱蛋白，每管收集0.5ml洗脱液；

[0095] 6)测各管洗脱液蛋白浓度；

[0096] 7)PAGE电泳检测纯度；

[0097] 将纯化的Q-CMV CP蛋白免疫兔子后得到兔的Q-CMV CP蛋白的多克隆抗体血清。

[0098] 进行ELISA实验检测Q-CMV CP蛋白的积累。碱性磷酸酶标记的羊抗兔免疫球蛋白作为二抗(购自Amersham Biosciences)。CP蛋白积累水平通过蛋白提取液与pNPP底物显色1hr后在405nm处的光吸收值来体现，检测仪器为MicroplateReader(BIO-RAD，Model550)。

[0099] 实验结果表明，在Q-CMV侵染的野生型植物系统叶中能够检测到CP蛋白的大量积累(图8C)，而转35S-pre-amiR-SD-3(lines 6，15 and 18)的所有植物都表现出正常的表型，而且检测不到Q-CMV CP蛋白的积累(图8B，C，表3)。

[0100] 表3：amiRNA转基因烟草T1代对Q-CMV侵染的抗性分析

[0101]

[0102] 表3中I/T中分子代表ELISA阳性植株，分母代表被感染的植物总数；R，代表抗性百分比。

[0103] 随后进行了两组独立的实验检测了转35S-pre-amiR-SD-3的烟草对SD-CMV的抗性。侵染后6天转35S-pre-amiR-SD-3的烟草表现出了对SD-CMV侵染的高度抗性，35S-pre-amiR-SD-3株系(lines 6，15 and 18)所有植物都表现出正常的发育表型(图
8D)；SD-CMV CP蛋白的积累检测方法同实施例4，系统叶中SD-CMV CP蛋白的积累也检测不到(图8E)。在第二组实验中也得到了相似的结果，如表4所示。两组实验中转
35S-pre-amiR-SD-3的烟草对SD-CMV的抗性百分比为91.7-100％，与在拟南芥中得到的抗性结果相似。

[0104] 同时还做了两组独立的实验检测转基因烟草对Fny-CMV的抗性，由于Fny-CMVCP蛋白与SD-CMV CP氨基酸序列高度相似(98.2％)，因此其积累也采用SD-CMV CP多克隆抗体血清，方法如实施例4中所述。

[0105] 实验结果如图8F和8G所示，由于Fny-CMV与SD-CMV 3′UTR核苷酸序列高度相似(88.9％)，而且同属亚组I，两组实验中转基因植物对Fny-CMV的抗性与对SD-CMV的抗性十分相似，即转35S-pre-amiR-SD-3的烟草对Fny-CMV的侵染呈现出高度抗性。以上检测的转基因植物的症状表型观察共持续2个月。

[0106] 表4.amiRNA转基因烟草T1代对SD-CMV和Fny-CMV的抗性分析

[0107]

[0108] 表4中I/T中分子代表ELISA阳性植株，分母代表被感染的植物总数；R，代表抗性百分比。

[0109] 图8B、D和F中，“WT”代表SD-CMV感染的野生型拟南芥；“mock”代表未感染病毒的野生型拟南芥；图8A、C、E和G中， “amiR-SD-3”代表转35S-pre-amiR-SD-3的烟草，“mock”代表未感染病毒的烟草，“Q-CMV”代表Q-CMV病毒侵染的烟草，“SD-CMV”代表SD-CMV病毒侵染的烟草，“Fny-CMV”代表Fny-CMV病毒侵染的烟草，WT为野生型烟草。

[0110] 实施例3、实施例1的amiRNA在转基因植物中的特异性分析

[0111] 为了排除amiRNA的转基因稳定表达对植物内源基因的非特异性沉默，即所谓的“脱靶”现象，将所有amiRNA的序列输入NCBI BLAST网站进行比对分析，结果发现，在amiRNA的21nt序列中，没有任何一个amiRNA能与拟南芥内源转录本的连续互补配对超过15 nt。为了进一步排除amiRNA靶向植物内源基因的可能性，同时将amiRNA序列输入“Plant miRNA Target Finder”

[0112] (http://bioinfo3.noble.org/miRNA/miRU.htm)“TIGR Arabidopsis GeneIndex1”和“TIGR Tobacco Gene Index 1”数据库进行潜在靶标基因搜索。结果表明，在拟南芥中只有一个内源转录本-AT3G29250-能与amiR-SD-3形成少于3个的不完全配对，包括错配与缺失，如图6A所示，而在烟草中没有检测到任何一个内源转录本与amiRNA序列少于3个错配。为了检测amiR-SD-3的转基因表达是否会下调拟南芥AT3G29250 mRNA的水平，以拟南芥野生型和amiR-SD-3转基因植物的总RNA为模板，设计一对引物进行半定量反转录PCR实验，以actin转录本的水平为对照，引物序列如下所示：

[0113] AT3G29250-forward ATGTCGGGGCTAAGGGAAGTTT

[0114] AT3G29250-reverse TGATACGTCCAGAGGTGCTCTT

[0115] 结果如图6B所示，表明在amiR-SD-3转基因植物中，AT3G29250转录本的表达水平与野生型对照相比并没有明显下调，说明amiR-SD-3的转基因表达并不能影响拟南芥内源AT3G29250的表达。

[0116] 序列表

[0117] <110>中国科学院微生物研究所

[0118] <120>RNA诱导的沉默复合体介导的剪切位点及其应用

[0119] <130>CGGNARW81317

[0120] <160>2

[0121] <210>1

[0122] <211>21

[0123] <212>RNA

[0124] <213>黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)

[0125] <400>1

[0126] ccacgacuga ccauuuuagc c 21[0127] <210>2

[0128] <211>184

[0129] <212>DNA

[0130] <213>人工序列

[0131] <220>

[0132] <223>

[0133] <400>2

[0134] gggctaaaat ggaaagtcgt ggcatgagtt gagcagggta aagaaaagct gctaagctat 60[0135] ggatcccata agccctaatc cttgtaaagt aaaaaaggat ttggttatat ggattgcata 120[0136] tctcaggagc tttaacttgc cctttaatgg cttttactct tcccacgact gaccatttta 180[0137] gccc 184