一种肿瘤靶向碳纳米管药物载体及其制备

摘要

本发明涉及纳米药物运输载体，具体地说是一种肿瘤靶向碳纳米管药物载体及其制备。在氧化碳纳米管上共价键合藻红蛋白标记的P-糖蛋白抗体，其可作为小分子药物的运输载体，药物载体通过吸附作用装载小分子药物。此药物载体制备简单，具有靶向给药、可控缓释和克服细胞多药耐药性的特性。

权利要求

1.一种肿瘤靶向碳纳米管药物载体，其特征在于：在氧化碳纳米管上共价键合有藻红蛋白标记的P-糖蛋白抗体，其可作为小分子药物的运输载体，此载体通过吸附作用装载小分子药物；

所述小分子药物是指100＜分子量＜10000的药物。

2.根据权利要求1所述药物载体，其特征在于：所述小分子药物是指100＜分子量＜10000的蒽醌类抗癌药物。

3.根据权利要求1所述药物载体，其特征在于：所述氧化碳纳米管为直径1-100nm的单壁或多壁碳纳米管，长度为50-500nm。

4.一种权利要求1所述药物载体的制备方法，其特征在于：

1)将氧化碳纳米管溶解在PH＝6.0-7.4的10-100mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液中，氧化碳纳米管与缓冲液的比例为1mg∶1-50ml；

2)向步骤1)体系中加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺，N-羟基硫代琥珀酰亚胺与氧化碳纳米管的重量比为5-10∶1，在快速搅动下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与氧化碳纳米管的重量比为1-2∶1，室温反应

0.5-2小时；

3)将步骤2)反应后的混合物用0.3-0.5um的膜过滤，收集固体，并用0.1-1M的氯化钠溶液洗涤，洗涤后将其重新用PH＝6.0-7.4的10-100mM2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液溶解，缓冲液与氧化碳纳米管的比例为1-50ml∶1mg；

4)在90-250rpm下，向步骤3)的缓冲体系中加入藻红蛋白标记的P-蛋白抗体Anti-P-gp-PE，Anti-P-gp-PE与氧化碳纳米管的重量比为0.05-2∶1，避光反应2-24h；

5)将步骤4)的反应产物过滤，并用0.1-1M的NaCl溶液洗涤后，将产物溶解在PH＝

6.0-7.4的10-100mM PBS缓冲液中，2-8℃避光保存。

说明书

一种肿瘤靶向碳纳米管药物载体及其制备

技术领域

[0001] 本发明涉及纳米药物运输载体，具体地说是一种肿瘤靶向碳纳米管药物载体及其制备，此药物载体以吸附的方式装载小分子药物，能够识别多药耐药细胞，并能够缓慢释放药物至多药耐药细胞。适用于在临床上由于P-糖蛋白(P-gp)高表达而用药效率低的患者。

背景技术

[0002] 化疗是目前用来治疗癌症的主要方法，但是在化疗过程中肿瘤细胞会产生多药耐药性(MDR)，这已经成为治愈癌症的一个巨大的障碍(文献1.Higgins C.F，Multiple molecular mechanisms for multidrug resistancetransporters，Nature 2007，446(7137)，749-757.)。多药耐药性是指在用一种细胞毒剂杀伤细胞的过程中，细胞会对其他结构与此细胞毒剂不相似的药剂也产生相关的耐药性。具体来说，在多药耐药细胞的细胞膜上转运蛋白过量表达，转运蛋白利用ATP水解产生的能量可以和进入细胞内的药物分子结合并且将其外排出细胞。转运蛋白种类很多，P-糖蛋白(P-gp)就是一种被广泛研究的转运蛋白(文献2.Deeley R.G.，C.Westlake，et al，Transmembranetransport of endo-and xenobiotics by mammadian ATP-binding cassettemultidrug resistance proteins，Physiological Reviews 2006，86(3)，849-899.)。此外越来越多的研究表明，脑毛细血管内皮细胞上的P-糖蛋白(P-gp)也过量表达。由于P-gp的外排功能，使得一些药物难以抵达脑部患处，因而产生了所谓的血脑屏障，不利于脑部用药。因此，越来越多的研究希望克服P-gp的外排功能，从而提高用药效率。

[0003] 目前已经发现生物大分子和表面活性剂可以将药物输送到多药耐药细胞从而有效抑制P-gp(文献3.Mazel M.，P.Clair，et al.，Doxorubicin-peptideconjugates overcome multidrug resistance，Anti-Cancer Drugs 2001，12(2)，107-116. 文 献4.Kabanov A.V.，E.V.Batrakova，et al.，Pluomic(R)blockcopolymers as novel polymer therapeutics for drug and gene delivery，Journal ofControlled Release 2002，
82(2-3)，189-212.)。但是，这类运输载体对正常细胞也会产生很大的毒副作用，不具有靶向给药的能力。

[0004] 纳米材料可以自由进入细胞，并且能够富集在肿瘤组织中，作为一种有效的运输载体，引起了广泛的关注。据报道，碳纳米管可以运输生物活性大分子进入细胞，且细胞毒性很小，是一种理想的药物运输载体(文献5.Worle-Knirsch J.M.，K.Pulskamp，et al.，Oops they did it again！Carbonnanotubes boax scientists in viability assays，Nano Letters 2006，6(6)，1261-1268. 文 献 6.Pantarotto D.，R.Singh，et al.，Functionalized carbonnanotubes for plasmid DNA gene delivery，Angewandte Chemie-InternationalEdition 2004，43(39)，5242-5246.)。相对用碳纳米管运输生物大分子的研究，对小分子药物运输的研究则比较少(文献7.Wu W.，S.Wieckowski，et al.，Targeted delivery of amphotericin B to cells by using functionalized carbonnanotubes，Angewandte Chemie-International Edition 2005，44(39)，6358-6362)，尤其是以吸附的方式和小分子药物结合后，靶向运输的研究则完全没有报道。

[0005] 罗丹明123作为P-gp的底物，没有明显的细胞毒性，可用于P-gp功能的研究。此外，它还具有和蒽醌类抗癌药物相似的离域∏键结构，能够和碳纳米管以吸附的方式结合。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种肿瘤靶向碳纳米管药物载体及其制备，碳纳米管药物运输载体以物理吸附的方式和小分子药物结合后，可高效输送药物至多药耐药细胞，并能实现靶向给药和可控缓释。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0008] 在氧化碳纳米管上共价键合有藻红蛋白标记的P-糖蛋白抗体，其可作为小分子药物的运输载体，药物载体通过吸附作用装载小分子药物。

[0009] 所述药物载体的制备过程为：

[0010] 1)将氧化碳纳米管溶解在PH＝6.0-7.4的10-100mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液中，氧化碳纳米管与缓冲液的比例为1mg∶1-50ml；

[0011] 2)向步骤1)体系中加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺，N-羟基硫代琥珀酰亚胺与氧化碳纳米管的重量比为5-10∶1，在快速搅动下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与氧化碳纳米管的重量比为1-2∶1，室温反应0.5-2小时；

[0012] 3)将步骤2)反应后的混合物用0.3-0.5um的膜过滤，收集固体，并用0.1-1M的氯化钠溶液洗涤，洗涤后将其重新用PH＝6.0-7.4的10-100mM2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液溶解，缓冲液与氧化碳纳米管的比例为1-50ml∶1mg；

[0013] 4)在90-250rpm下，向步骤3)的缓冲体系中加入藻红蛋白标记的P-蛋白抗体Anti-P-gp-PE，Anti-P-gp-PE与氧化碳纳米管的重量比为0.05-2∶1，避光反应2-24h；

[0014] 5)将步骤4)的反应产物过滤，并用0.1-1M的NaCl溶液洗涤后，将产物溶解在PH＝6.0-7.4的10-100mM PBS缓冲液中，2-8℃避光保存。

[0015] 本发明具有如下优点：

[0016] 1.药物载体制备简单。本发明是将直径为1-100nm的单壁和多壁碳纳米管经强酸氧化处理，长度为50-500nm，在碳纳米管表面形成羧基，并共价结合上藻红蛋白(PE)标记的P-糖蛋白抗体(Anti-P-gp)；整个过程只需要两步反应即可完成。

[0017] 2.药物载体毒性小。作为药物输送的载体，本身对细胞基本没有毒性，具有很好的生物学安全性，应用前景广阔。

[0018] 3.可实现药物分子的无损装载。碳纳米管药物运输载体和小分子药物通过两个∏键之间的相互作用，以吸附的方式结合。从而避免了以共价方式键合对药物分子结构的损伤。

[0019] 4.可实现药物分子的缓释。由于药物分子是以吸附的方式和药物载体结合，易于从药物载体上释放，并能保持缓慢的释放速率，有利于药效的长久发挥。

[0020] 5.药物载体可以克服P-gp的外排功能。由于纳米材料进入细胞的特殊机理，从而可以避免具有多药耐药性的肿瘤细胞对药物的外排作用，将药物分子成功输送至多药耐药细胞，为化疗过程中肿瘤细胞产生的多药耐药性提供了一种有效的解决途径。同时，也可用于克服血脑屏障实现脑部给药。

[0021] 6.可实现靶向给药。此药物载体对多药耐药的肿瘤细胞具有很高的识别能力，能够靶向输送药物至多药耐药细胞。因而，不仅提高了药物对耐药肿瘤细胞的杀伤力，而且减轻了药物的毒副作用。

[0022] 附图说明：下面结合附图和实施例对发明进一步说明。

[0023] 图1是碳纳米管药物运输载体的制备路线。

[0024] 图2是药物载体对多药耐药细胞识别能力的考察。

[0025] 图3是碳纳米管的生物学安全性评价。

[0026] 图4是碳纳米管吸附罗丹明123的原理图。

[0027] 图5是碳纳米管对罗丹明123的等温吸附曲线。

[0028] 图6是碳纳米管对罗丹明123的释放曲线。

[0029] 图7是对载体克服P-gp外排运输罗丹明123效果的评价。

具体实施方式

[0030] 本发明首先将氧化碳纳米管表面共价键合藻红蛋白标记的P-糖蛋白抗体(Anti-P-gp-PE)，然后药物载体通过吸附作用装载小分子药物。最后，用慢性白血病多药耐药细胞(K562A)和慢性白血病敏感细胞(K562S)验证了上述载体识别K562A细胞，运输和释放罗丹明123的能力。

[0031] 实施例

[0032] 1.碳纳米管药物运输载体的制备：用浓硝酸、浓硫酸处理碳纳米管，在其表面形成羧基，增加水溶性。藻红蛋白标记的P-糖蛋白抗体(Anti-P-gp-PE)共价键合在氧化碳纳米管表面。具体制备路线见图1。

[0033] 1)氧化碳纳米管(o-CNT)的制备(文献8.Pan CS，Zou HF，et.CarbonNanotubes as Adsorbent of Solid-Phase Extraction and Matrix for LaserDesorption/Ionization Mass Spectrometry J Am Soc Mass Spectrom 2005 16：883-892.)：120℃下原始的碳纳米管(CNT)与浓硝酸和浓硫酸(V/V＝1/3)在搅拌回流的条件下反应30min。氧化后的碳纳米管溶液用水稀释10倍，之后用0.45um的膜过滤并用水洗涤直至滤液呈中性。将沉淀物用水溶解后，在200W超声1h，8000g离心以去除水溶性不好的碳纳米管。将溶液冷冻干燥后收集黑色粉末状固体。

[0034] 从而制备得到了水溶性的氧化碳纳米管，在干燥的环境中储存此氧化碳纳米管用于后续实验。

[0035] 2)识别团的连接：2mg的氧化碳纳米管溶解在10ml的2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液中(50mM，PH＝6.0)。加入10mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)后，在快速搅动下加入1.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，室温反应30min。将反应后的混合物用0.45um的膜过滤，并用MES缓冲液洗涤多次后，将其重新用10ml的MES溶解，在100rpm下，加入藻红蛋白标记的P-糖蛋白抗体(Anti-P-gp-PE)，避光反应2h。将反应产物过滤并用0.1M的NaCl溶液洗涤后，将产物溶解在PBS缓冲液中，2-8℃避光保存。

[0036] 所得到的药物运输载体制备过程简单易行，具有识别能力的P-糖蛋白抗体和氧化碳纳米管以共价的方式键和，相对比较稳定。

[0037] 2.考察药物载体吸附和释放药物的能力：通过离域∏键之间的相互作用，罗丹明123和氧化碳纳米管以吸附的方式相互结合，原理如附图4。将一定量的罗丹明123和氧化碳纳米管混合后，用荧光分光光度计检测游离的罗丹明浓度，进而可以计算被药物载体吸附的罗丹明123的量。对于罗丹明123释放量的测量，是通过透析的方法，利用荧光分光光度计测量罗丹明123的释放量。吸附曲线和释放曲线分别见附图5，6。

[0038] 1)吸附量的测量：含有125ug氧化碳纳米管的水溶液加入到1罗丹明123的PBS溶液中，保证最终体积为5ml，罗丹明123的浓度从0.1ug/ml增加到1ug/ml。混合液在25℃，100rpm下搅动2小时后，用0.45um的膜过滤并立即用荧光分光光度计在488nm激发波长、525nm发射波长下测量滤液中罗丹明123的荧光信号的强度。

[0039] 2)释放曲线的测量：将2ml含有罗丹明123(100ng/ml)和氧化碳纳米管(140ug/ml)的PBS、FBS混合溶液(v/v＝1∶1)装入透析袋中(截留分子量是8000Da)，加入上述PBS、FBS混合溶液5ml，在37℃下振荡(180rpm)，每隔2h取出透析液，测量释放出的罗丹明的量，并加入新的PBS、FBS混合溶液5ml。

[0040] 可见，罗丹明123通过∏键之间的相互作用可以被药物载体吸附。从体外释放曲线可以看出被吸附的罗丹明123能够缓慢地释放。

[0041] 3.药物载体的生物学安全性考察：首先将细胞和氧化碳纳米管孵育一定时间，然后用检测细胞凋亡的试剂盒(Annexin v/PI)染色细胞，最后通过流式细胞仪测试细胞的存活率。测试结果见附图3。

[0042] 1)K562细胞的培养：人类白血病细胞系-K562细胞系，购自中国医学科学院血液研究所(天津，中国)。多药耐药性细胞K562A是在37℃和5％二氧化碳下，在外加10％新生小牛血清的RPMI-1640(GIBCO)中进行培养，阿霉素用以诱导细胞膜上Pgp的表达。除了没有用阿霉素诱导驯化外，K562S是在同样的条件下培养。

[0043] 2)碳纳米管的生物学安全性评价：在5个细胞数目为1×106的K562S细胞的培养孔中加入氧化碳纳米管，使其浓度分别是0，10，20，30，40ug/ml。细胞在培养2h后，离心洗涤，并用1ml的PBS重新悬浮。5个样每个取100ul后分别加入5ul Annexin v(FITC)和5ulPI。在避光条件下室温反应15min后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

[0044] 从实验结果可以看出，碳纳米管具有很好的生物学安全性。在碳纳米管对细胞的作用浓度达到40ug/mg时，仍然没有发现明显的细胞毒性。

[0045] 4.识别多药耐药细胞能力的评价：一定浓度的药物运输载体分别和K562A、K562S细胞孵育后，用流式细胞仪检测进入细胞的药物载体的荧光强度。通过对荧光强度的比较，可以评价细胞识别多药耐药细胞的能力，结果见附图2。

[0046] 具体过程：分别取1×106的K562A和K562S细胞加入20ug/ml的氧化碳纳米管药物运输载体。37℃孵育1h后将细胞离心洗涤后，测量进入两种细胞内的药物载体的量。

[0047] 比较进入两种细胞的药物载体的荧光强度可以发现，在耐药细胞内的药物载体的荧光强度是敏感细胞内的7倍。说明此药物载体具有很好的识别多药耐药细胞的能力。

[0048] 5.评价药物载体克服P-gp功能运输药物的能力：取两份相同细胞数的K562A细胞，一份仅仅和罗丹明123孵育，另外一份与氧化碳纳米管、罗丹明123的混合溶液孵育。将细胞离心、裂解、释放出被吸收的罗丹明123后，用毛细管电泳激光诱导荧光(CE-LIF)的方法检测释放出的罗丹明123的量。测量结果见附图7。

[0049] 具体过程：在两个培养孔内各加入1×106个K562A细胞。在其中一个孔内加入罗丹明123使其浓度为200ng/ml；另一个孔内加入氧化碳纳米管、罗丹明123的混合液，使其浓度分别为20ug/ml、200ng/ml。孵育30min后，离心洗涤3次，再各加入1ml含钙镁离子的PBS缓冲液，孵育1h。将细胞收集离心、洗涤、弃上清后，用500ul TBS(10mMTris-Boric acid，10mMSDS，PH＝7.4)缓冲液冻融裂解细胞。最后，通过胶束电动的分离模式用CE-LIF检测裂解液中罗丹明123的含量。

[0050] 从图7可以看出，利用药物载体运输罗丹明123后，耐药细胞内的罗丹明123的含量增加了7倍。说明所制备的碳纳米管药物载体能够克服P-gp的作用将罗丹明123运输至多药耐药细胞。