一类可在细胞/组织/活体中应用的可见光激发的锌离子荧光造影试剂的合成方法

摘要

本发明涉及一类可在细胞/组织/活体中应用的可见光激发的锌离子荧光造影试剂，其结构为荷移荧光团4-取代氨基-7-取代基-2，1，3-苯并噁二唑，其中：荷移荧光团的7-取代基R为拉电子取代基，所述的拉电子取代基为硝基-NO2，或磺酰胺基-SO2NH2，或磺酸酯基-SO2CH3，或磺酸基-SO3H；4-取代氨基是由具有金属离子螯合能力的TPEA所构成的取代氨基，所述的TPEA为N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)乙二胺。发明还包括了该类锌离子荧光造影试剂的合成及其在细胞/组织/活体中锌离子的荧光造影应用。

权利要求

1.一类可在细胞/组织/活体中应用的可见光激发的锌离子荧光造影试剂的合成方法，其特征在于：荷移荧光团前体为4-氯-7-取代基-2，1，3-苯并噁二唑或4-氟-7-取代基-2，1，3-苯并噁二唑，在碱性催化剂存在下，将荷移荧光团前体与金属离子螯合试剂TPEA在溶剂中反应即可合成目标产物，所述荷移荧光团前体的7-取代基R为拉电子取代基，拉电子取代基为硝基-NO2，或磺酰胺基-SO2NH2，或磺酸酯基-SO2CH3，或磺酸基-SO3H；所述的TPEA为N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)乙二胺；

其过程是：

a)在溶液中加入荷移荧光团前体、金属离子螯合试剂TPEA和催化剂，混合后室温搅拌过夜；

b)滤去固体获得滤液，并将固体用氯仿洗涤后获得氯仿洗涤液；

c)合并滤液和氯仿洗涤液，减压除去溶剂，获得残余物；

d)将残余物通过柱层析获得荧光造影试剂，柱层析中使用的淋洗液是由乙酸乙酯与甲醇的混合液。

2.根据权利要求1所述的一类可在细胞/组织/活体中应用的可见光激发的锌离子荧光造影试剂的合成方法，其特征在于：拉电子取代基为硝基-NO2的荧光造影试剂是N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’-(7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺；

拉电子取代基为磺酰胺基-SO2NH2的荧光造影试剂是N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’-(7-胺磺酰基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺；

拉电子取代基为磺酸酯基-SO2CH3的荧光造影试剂是N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’-(7-甲氧磺酰基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺；

拉电子取代基为磺酸基-SO3H的荧光造影试剂是N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’-(7-磺酸基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺。

3.根据权利要求1所述荧光造影试剂的合成方法，其特征在于：所述的溶剂为甲醇，或乙醇，或四氢呋喃，或二甲基甲酰胺，或二氧六环，或乙酸乙酯，或丙酮，或甲基异丁酮，或乙腈；所述的催化剂为有机碱或无机碱，其中有机碱为三乙胺，或吡啶，或二异丙基乙基胺，无机碱为碳酸钠，或碳酸钾，或氢氧化钠，或氢氧化钾；柱层析中使用的淋洗液中甲醇的体积百分比为0～80％。

4.根据权利要求3所述荧光造影试剂的合成方法，其特征在于：荷移荧光团前体与金属离子螯合试剂TPEA的摩尔比例为1∶0.5～3，荷移荧光团前体和催化剂之间的摩尔比为1∶0.5～3。

说明书

一类可在细胞/组织/活体中应用的可见光激发的锌离子

荧光造影试剂的合成方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一类锌离子荧光造影试剂的合成方法，尤其一类可在细胞/组织/活体中应用的可见光激发的锌离子荧光造影试剂的合成方法。

[0002] 背景技术

[0003] 锌离子是人体内含量仅次于铁的过渡金属元素，在神经信号传导，基因转录、细胞增殖和凋亡、信号转导以及蛋白的结构与功能调控等方面具有重要的作用。虽然大部分锌离子以结合态存在于生物体内，生物体内尤其是在神经系统内还存在不少的自由锌离子或可被结合的锌离子。锌离子的缺乏或代谢紊乱与儿童发育迟缓、智障以及神经退行性疾病如老年痴呆、帕金森症等密切相关。研究锌离子在生物体内的分布、转运和代谢，了解锌离子在生物体内的时空分布具有十分重要的意义。由于锌离子特定的3d104S0电子构型，常规光谱技术难以实现生物体内的锌离子检测。荧光探针技术利用锌离子与荧光探针结合后造成的荧光信号变化实现对锌离子的跟踪和检测，目前已在细胞和组织层次获得应用，取得了良好的效果。因此合成合适的锌离子荧光探针成为锌离子荧光成像技术的关键。为克服紫外光激发荧光探针造影中紫外光激发引起的细胞损伤，可见光激发的锌离子荧光探针成为研究的热点。目前的已知的可见光激发的锌离子荧光探针大部分由荧光素和罗丹明类的衍生物构成，造成激发光单一，难以满足越趋复杂的多色共染实验(如使用荧光素或罗丹明类探针的共染)以及不同显微镜配置的需要。因此寻找新的具有不同可见光激发能力的锌离子荧光 探针具有重要的意义。

[0004] N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)乙二胺(TPEA)是报道的金属离子螯合试剂，可以通过文献报道的方法来合成。[(a)Brinksma，J.，Rispens，M.T.，Hage，R.，Feringa，B.L.Inorg.Chim.Acta 2002，337，75-82；(b)Horner，O.，Girerd，J.J.，Philouze，C.，Tchertanov，L.Inorg.Chim.Acta 1999，290，139-144；(c)Kawabata，E.，Kikuchi，K.，Urano，Y.，Kojima，H.，Odani，A.，Nagano，T.，J.Am Chem.Soc.2005，127，818-819.]该结构可以与锌离子结合，并且有合适的结合常数，可以满足大多数生物体内锌离子测试的需要，但没有荧光信号，无法实现锌离子的荧光指示。4-氨基-7-取代-2，1，3-苯并噁二唑(7-取代基为拉电子取代基)是一种可见光激发的荷移荧光团，并已在细胞内其他化学物种的造影中获得应用。[I，Uchiyama，S.，Santa，T.，Fukushima，T.，Homma，H.，Imai，K.J.Chem.Soc.，Perkin Trans.2，1998，2165-2173；II，(a)Ghosh，P.B.，Whitehouse，M.W.Biochem.J.，1968，108，155-156.(b)Bellon，G.Malgras，A.，Randoux，A.，Borel，J.P.J.Chromatogr.A，1983，278，167.(c)Watanabe，Y.，Imai，K.Anal.Biochem.，1981，116，471-472.(d)Imai，K.，Uzu，S.，Kanda，S.Anal.Chim.Acta 1994，290，3-20.(e)The handbook：Aguide to fluorescent probes and labeling technologies，10th edition.Molecularprobes.Edited by Haugland，R.P.，p 1107；III(a)Pagano，R.E.，Sleight，R.G.Science 1985，
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[0005] 利用该类荷移荧光团与N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)乙二胺(TPEA)的结构特点构筑一类可可见光激发的锌离子荧光造影试剂(也称为为锌离子荧光探针)，并成功应用于对细胞/组织/活体模式动物中的锌离子的荧光造影，目前未见报道。发明内容：

[0006] 本发明的目的在于：针对目前的可见光激发的锌离子荧光探针大部分由荧光素和罗丹明类的衍生物构成，造成激发光单一，难以满足越趋复杂的多色共染实验(如使用荧光素或罗丹明类探针的共染)以及不同显微镜配置需要的实际问题，提供一类具有不同激发波长的可在细胞/活体中应用的可见光激发的锌离子荧光造影试剂及其合成方法和应用。

[0007] 本发明的目的是这样实现的：一类可在细胞/组织/活体中应用的可见光激发的锌离子荧光造影试剂，其特征在于：它的结构为荷移荧光团4-取代氨基-7-取代基-2，1，3-苯并噁二唑，其中：荷移荧光团的4-取代氨基是由具有金属离子螯合能力的TPEA所构成的取代氨基，7-取代基R为拉电子取代基，所述的TPEA为N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)乙二胺，所述的拉电子取代基为硝基-NO2，或磺酰胺基-SO2NH2，或磺酸酯基-SO2CH3，或磺酸基-SO3H；荧光造影试剂的结构为：

[0008]

[0009] 在本发明的技术方案中：

[0010] 拉电子取代基为硝基-NO2的荧光造影试剂是N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’-(7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺；

[0011] 拉电子取代基为磺酰胺基-SO2NH2的荧光造影试剂是N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’-(7-胺磺酰基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺；

[0012] 拉电子取代基为磺酸酯基-SO2CH3的荧光造影试剂是N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’(7-甲氧磺酰基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺；

[0013] 拉电子取代基为磺酸基-SO3H的荧光造影试剂是N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’-(7-磺酸基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺。

[0014] 一种上述荧光造影试剂的合成方法，其特征在于：荷移荧光团前体为4-氯-7-取代基-2，1，3-苯并噁二唑或4-氟-7-取代基-2，1，3-苯并噁二唑，在碱性催化剂存在下，将荷移荧光团前体与金属离子螯合试剂TPEA在溶剂中反应即可合成目标产物， [0015]

[0016] 其过程是：

[0017] a)在溶液中加入荷移荧光团前体、金属离子螯合试剂TPEA和催化剂，混合后室温搅拌过夜；

[0018] b)滤去固体获得滤液，并将固体用氯仿洗涤后获得氯仿洗涤液；

[0019] c)合并滤液和氯仿洗涤液，减压除去溶剂，获得残余物；

[0020] d)将残余物通过柱层析获得荧光造影试剂，柱层析中使用的淋洗液是由乙酸乙酯与甲醇以不同比例混合的混合液。

[0021] 在荧光造影试剂的合成方法中：所述的溶剂为甲醇，或乙醇，或四氢呋喃，或二甲基甲酰胺，或二氧六环，或乙酸乙酯，或丙酮，或甲基异丁酮，或乙腈；所述的催化剂为有机碱或无机碱，其中有机碱为三乙胺，或吡啶，或二异丙基乙基胺，无机碱为碳酸钠，或碳酸钾，或氢氧化钠，或氢氧化钾；柱层析中使用的淋洗液中甲醇的体积百分比为0～80％。 [0022] 在荧光造影试剂的合成方法中：荷移荧光团前体与金属离子螯合试剂TPEA的摩尔比例为1∶0.5～3，荷移荧光团前体和催化剂之间的摩尔比为1∶0.5～3。

[0023] 一种上述荧光造影试剂的应用，其特征在于：所述的荧光造影试剂作为锌离子荧光探针，应用于对细胞或组织或活体模式动物中的锌离子的荧光造影，实现对锌离子的定位和跟踪。

[0024] 在荧光造影试剂的应用中：所述的锌离子荧光探针在锌离子荧光造影中针对金属2+
离子Zn 的激发波长在440-480nm之间，属可见光激发。

[0025] 在荧光造影试剂的应用中：所述的锌离子荧光探针在激光共聚焦荧光显微镜造影过程中，在氩离子激光器458nm和488nm的两条可见光谱线分别激发下均能获得良好的细胞/组织内锌离子造影图像。

[0026] 在荧光造影试剂的应用中：所述的锌离子荧光探针可在具有透光性的活体模式动物中进行锌离子的荧光造影和激光共聚焦荧光造影。

[0027] 本发明的优点在于：作为金属离子螯合试剂TPEA的N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)乙二胺合成技术成熟，并且有合适的结合常数，可以满足大多数生物体内锌离子测试的需要，在合成该类可在细胞/组织/活体中使用的可见光激发的锌离子荧光造影试剂时，合成效率高，步骤短；作为锌离子荧光探针，可以应用于对细胞或活体模式动物中的荧光造影，与传统的紫外光激发荧光探针相比，细胞损伤小，自发荧光干扰小；与现有的荧光素和罗丹明类的可见光激发的锌离子荧光探针相比，该探针在pH7-9之间具有稳定的荧光，在生理条件下进行锌离子造影不会受到pH的干扰，而且在激光共聚焦荧光显微镜造影时，可分别选用458和488nm波长激发，便于共染实验的展开；在细胞中有特定分布，可对特定细胞器上锌离子的变化进行跟踪；不仅可用于活细胞中锌离子的造影和跟踪，还可用于透光性活体的锌离子造影，有利于活体中锌库的观察。

附图说明

[0028] 图1是5μM NBD-TPEA在含10％DMSO(v/v)的水溶液中不同pH下的荧光光谱； [0029] 图2是NBD-TPEA在HEPES缓冲溶液中利用锌离子滴定过程中的紫外光谱； [0030] 图3是5μM NBD-TPEA在HEPES缓冲溶液中利用锌离子滴定过程中的荧光光谱； [0031] 图4是5μM NBD-TPEA在HEPES缓冲溶液中(1∶9，DMSO/water，v/v；50mM HEPES，100mM KNO3；pH＝7.40)对不同金属离子的荧光响应；

[0032] 图5是利用5μM NBD-TPEA的1×PBS溶液室温染色20分钟后的HeLa细胞的激光共聚焦荧光造影图；

[0033] 图6是HeLa细胞以5μM NBD-TPEA的1×PBS溶液和50nMMitoTracker Red CMXRos(或1μM LysoTracker Red DND-99，或5μM BODIPY TR ceramide)共染后的激光共聚焦荧光造影图；

[0034] 图7是PC12细胞以5μM NBD-TPEA的1×PBS溶液染色后的激光共聚焦造影图； [0035] 图8.是利用5μM NBD-TPEA的1×PBS溶液染色的斑马鱼幼虫的荧光造影图； [0036] 图9.以Zn2+溶液孵育(5μM，28.5℃，12h)的4天龄斑马鱼在以5μM NBD-TPEA的1×PBS溶液染色后的激光共聚焦荧光造影图。

具体实施方式

[0037] 实施例1

[0038] 荧光造影试剂的合成：

[0039] 荷移荧光团前体：4-氯-7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑(4-ClNBD，907mg，4.59mmol)；

[0040] 金属离子螯合试剂TPEA：N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)乙二胺(1377mg，4.13mmol)，可通过文献合成步骤完成；

[0041] 溶剂：四氢呋喃THF(100ml)

[0042] 催化剂：碳酸钾K2CO3(571mg，4.13mmol)。

[0043] 制备方法：

[0044] 在所述的溶液中加入荷移荧光团前体、金属离子螯合试剂TPEA和催化剂，混合后室温搅拌过夜；然后滤去固体获得滤液，并将固体用氯仿洗涤后获得氯仿洗涤液与滤液合并。合并获得的溶液经减压除去溶剂后，获得残余物。残余物通过柱层析可以获得荧光造影试剂N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’-(7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺，柱层析中使用的淋洗液是由乙酸乙酯与甲醇按照体积比8∶1形成的混合液。为了便于后续描述，将N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’-(7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺定义为NBD-TPEA。

[0045] NBD-TPEA的摩尔收率63％。NBD-TPEA的相关化学结构表征如下： 1H NMR(Bruker DRX500，CD3OD，500MHz，δ，ppm)：8.49(d，1H，J＝4.0Hz)8.39(d，2H，J＝4.0Hz)8.35(d，1H，J＝9.0Hz)7.79(t，1H，J＝8.0Hz)7.70(t，2H，J＝7.0Hz)7.55(d，2H，J＝7.5Hz)7.34(m，2H)7.20(t，2H，J ＝ 6.0Hz)6.21(d 1H，J ＝ 9.0Hz)5.34(br，2H)4.20(br，2H)3.92(s，
13
4H)3.06(t，2H，J ＝ 6.0Hz). C NMR(Bruker DRX500，CD3OD，500MHz，δ，ppm)：160.97，
151.44，150.59，147.87，147.05，146.89，139.89，139.57，137.64，126.16，125.13，124.79，
124.25，123.84，123.82，104.85(aromatic C)，62.73，60.93，54.56，52.94(aliphatic C)。
对C26H24N8O3元素分析的计算结果为：C，62.89；H，4.87；N，22.57％，实测结果为：C，62.61；
+
H，5.19；N，22.30％.质谱(电喷雾质谱，正电荷模式，m/z)：497.2[M+H]。

[0046] 具体实施时，只要更换荷移荧光团的7-取代基R，就能获得不同的荧光造影试剂。当取代基R为磺酰胺基-SO2NH2，合成的荧光造影试剂为N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’-(7-胺磺酰基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺，为区别特定义为SBD-TPEA1；当取代基R为磺酸酯基-SO2CH3，合成的荧光造影试剂为N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’-(7-甲氧磺酰基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺，为区别特定义为SBD-TPEA2；当取代基R为磺酸基-SO3H，合成的荧光造影试剂为N，N，N’-三(吡啶-2-甲基)-N’-(7-磺酸基-2，1，3-苯并噁二唑-4-)乙二胺，为区别特定义为SBD-TPEA3。

[0047] 具体实施时，所述的反应溶剂可以择一选择甲醇、乙醇、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二氧六环、乙酸乙酯、丙酮、甲基异丁酮；所述的催化剂可以选择有机碱或无机碱，其中有机碱可以选择三乙胺或吡啶或二异丙基乙基胺，无机碱可以择一选择碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾。

[0048] 实施例2

[0049] HEPES缓冲溶液：1∶9，DMSO/水，v/v；50mM HEPES；100mM KNO3；pH＝7.40。 [0050] 锌离子荧光响应能力和光谱研究

[0051] 将实施例1获得的NBD-TPEA(5μM)溶于HEPES缓冲溶液，在AMINCO Bowman series 2上测定它的发射和激发光谱。结果表明，该化合物具有一定的水溶性，其在中性水溶液中具有较弱的荧光，并且激发波长为469nm，而发射波长为550nm。

[0052] 其荧光的pH依赖性在含DMSO的NBD-TPEA的水溶液(5μM，DMSO/水，1∶9v/v)中利用5M HNO3和5M NaOH调节溶液pH完成测定。pH荧光滴定结果表明，NBD-TPEA的在近中性条件下具有稳定的荧光，有利于其在近中性生理条件下的应用。图1中，λex＝469nm。相应pH值均标在光谱线上。插图为根据不同pH下F/FpH7.1在534nm下给出的荧光pH滴定曲线。

[0053] 对NBD-TPEA的锌离子响应能力测试分别由Zn2+紫外和荧光滴定来完成。 [0054] NBD-TPEA的锌离子紫外滴定通过向比色皿中3mL NBD-TPEA(40μM)HEPES缓冲溶液中滴加等分的10μl Zn(NO3)2(1.5mM)水溶液来完成。其紫外光谱在每次滴加混合充分完成之后测定。测定结果表示由图2给出。该图表明随着锌离子的加入，其紫外吸收峰逐渐从从496nm蓝移到478nm。图2中插图为根据496nm处的紫外吸收强度变化给出的锌离子滴定曲线，该曲线表明NBD-TPEA的锌离子结合比例为1∶1。

[0055] 其荧光滴定通过类似的操作完成，但NBD-TPEA和Zn(NO3)2溶液浓度分别为5μM和1.25mM。每次滴加的体积为2.5μl。激发波长为469nm锌离子荧光滴定实验结果显示在图3中该图表明，锌离子滴定导致NBD-TPEA的荧光明显增强。图3中的插图是根据544nm处滴加锌离子前后的荧光强度比F/F0给出的锌离子滴定曲线(F为滴加后的荧光强度，F0为滴加前的荧光强度)。该滴定曲线同样显示1∶1的锌离子结合比例。 该研究还表明锌离子结合可以导致NBD-TPEA荧光强度的明显提高，在1∶1时的增强倍数在14倍左右。 [0056] NBD-TPEA对不同金属离子的荧光响应能力通过测定3mlNBD-TPEA(5μM)HEPES缓冲溶液在分别加入12.5μl金属阳离子(1.2mM)溶液前后的荧光光谱变化来确定，测定的激发波长为469nm。图4中是根据544nm处荧光强度在加入不同金属离子后的增强倍数列出的比较结果。研究结果表明除了锌离子以外，仅有鎘离子也可导致NBD-TPEA的荧光增强。然而鎘离子导致的增强倍数较小，同时由于生命体中鎘离子的含量极低，不会影响其锌离子荧光响应。为确定细胞中具有较高浓度的钠、钾、钙和镁离子对NBD-TPEA锌离子响应2+ 2+ +
能力有无影响，实验中还测定了当有1000倍的Ca ，Mg 或Na 存在下的锌离子荧光响应行为。结果表明这些离子的存在不影响NBD-TPEA对锌离子的荧光响应能力。这再次表明NBD-TPEA很可能是一种有效的细胞锌离子造影试剂。

[0057] 实施例3

[0058] 探针的细胞锌离子造影能力：

[0059] 利用这些探针可以实现多种活细胞中的锌离子造影。

[0060] 1、将5mM NBD-TPEA的水性储备液利用1×PBS溶液稀释到5μM作为细胞染色溶液备用。

[0061] HeLa细胞中锌离子造影由如下步骤完成：去除培养基的细胞经1×PBS溶液洗涤三遍后，利用5μM NBD-TPEA溶液室温孵育20分钟。利用PBS溶液洗涤三次后利用激光共聚焦荧光显微镜进行造影(图5a和5d)。随后细胞进一步利用5μM ZnSO4/2-mercaptopyridine-N-oxide溶液孵育，以增加细胞内的锌离子浓度，随后再经NBD-TPEA染色后进行细胞造影(图5b和5e)。造影后，细胞进一步利用TPEN脱除细胞中的锌离子(TPEN为N，N，N’，N’-四(2-吡啶甲基)亚乙烯二胺，25μM，通过利用1×PBS 溶液稀释其DMSO储备液获得)随即继续以1×PBS溶液洗涤三遍后再次进行造影(图5c和5f)。造影是利用激光共聚焦荧光显微镜完成的，造影分别在458nm(图5a，5b和5c)和488nm(图5d，5e和5f)激光激发下进行结果发现，458和488nm两个激发波长均可实现HeLa细胞内锌离子的有效造影。细胞中引入外来锌离子增加锌离子浓度时，荧光明显增强(图
5b和5e)。在利用TPEN脱除锌离子后则荧光明显减弱，基本看不出荧光的存在(图5c和
5f)，表明此时细胞中的锌离子浓度非常低。而仅经过NBD-TPEA染色处理的HeLa细胞则显示较弱的荧光(图5a和5d)。A549，PC12，HepG2等细胞中的锌离子造影可在类似的条件下完成。这些实验结果表明NBD-TPEA具有良好的细胞内锌离子荧光造影能力，并且显示该探针可分别利用Ar离子激光器的458和488nm两个可见光激发波长来实现造影。

[0062] 2、NBD-TPEA探针在细胞内的分布方式

[0063] NBD-TPEA在细胞内存在明显的选择性分布。这已分别通过与溶酶体荧光探针LysoTracker Red DND-99，高尔基体探针BODIPY TR ceramide以及腺粒体探针MitoTracker Red CMXRos的共染实验的到了确认。共染实验使用的是活HeLa细胞，共染造影实验中对NBD-TPEA的激发波长是488nm，造影窗口500-600nm。对LysoTracker Red DND-99，MitoTracker RedCMXRos和BODIPY TR ceramide的激发波长是543nm，造影窗口是555-650nm。与线粒体探针的共染实验首先用50nM Red CMXRos溶液室温染色15分钟。在以1×PBS洗涤细胞两次后，再用NBD-TPEA以前述方法染色(图6a-6e)。其中图6a为由Red CMXRos红色荧光给出的荧光造影，图6b为由NBD-TPEA绿色荧光给出的荧光造影，图6c为细胞经进一步以5μM ZnSO4/pyrithione(1∶1)溶液孵育后给锌后给出的NBD-TPEA绿色荧光造影，图6d为图6a和6c造影的叠合图，图6e为图6c中细胞再经25μM TPEN处理脱锌后的绿色荧光造影。图6d表明线粒体造影与NBD-TPEA造影没有明显的共定位效果，因此该探针在线粒体上没有明显分布。

[0064] 对与溶酶体荧光探针LysoTracker Red DND-99的共染实验，细胞首先利用1μM Red DND-99室温孵育5分钟。在以1×PBS洗涤细胞两次后，再用NBD-TPEA以前述方法染色(图6f-6j)。图6f为由Red DND-99红色荧光给出的荧光造影，图6g为由NBD-TPEA绿色荧光给出的荧光造影，图6h为细胞经进一步以5μM ZnSO4/pyrithione(1∶1)溶液孵育给锌后给出的NBD-TPEA绿色荧光造影，图6i为图6f和6g造影的叠合，图6j为图6h中细胞再经25μM TPEN处理脱锌后的绿色荧光造影。实验表明溶酶体造影与NBD-TPEA造影存在明显的共定位效果，表明NBD-TPEA在溶酶体上有明显的选择性分布。

[0065] 与高尔基体探针的共染则是首先用5μM BODIPY TR ceramide溶液在4℃染色30分钟，再以1×PBS洗涤两次。在1×PBS孵育30分钟后用1×PBS洗涤细胞两次。最后用NBD-TPEA以前述方法染色(图6k-6o)。图6k为由BODIPY TR ceramide红色荧光给出的荧光造影，图6l是由NBD-TPEA绿色荧光给出的造影，图6m为细胞进一步以5μMZnSO4/pyrithione(1∶1)溶液孵育加锌后给出的NBD-TPEA绿色荧光造影，图6n为造影6k和
6m的叠合图，图6o则是图6m中细胞经进一步25μMTPEN处理脱锌后的绿色荧光造影。
NBD-TPEA绿色荧光造影激发为488nm，造影窗口为500-600nm.对Red CMXRos，Red DND-99 and BODIPYTR ceramide等的红色荧光造影，激发为543nm，窗口为555-650nm。图6n中明显的共定位效果表明NBD-TPEA也会有选择性地分布在高尔基上。

[0066] 3、NBD-TPEA探针锌离子造影的可逆性和锌离子跟踪应用

[0067] NBD-TPEA探针的锌离子造影能力具有良好的可逆性和锌离子跟踪性 能。这在高分化的PC12细胞中的锌离子检测中已得到证实。

[0068] 高分化PC12细胞以5μM NBD-TPEA溶液孵育5分钟，后进行成像。随后吸去染色液，直接加入5μM ZnSO4/2-mercaptopyridine-N-oxide溶液孵育给锌，同时立即进行细胞成像，造影过程维持5分钟(图7a-7e)。吸去锌离子培养溶液后，加入25μM TPEN(N，N，N’N’-4(2-吡啶甲基)乙烯二胺)溶液脱锌，同时立即开始造影进程并维持5分钟(图7f-7j)。造影均利用激光共聚焦荧光显微镜完成。标尺为10微米。实验表明NBD-TPEA对细胞内锌离子的变化过程有明显的跟踪能力，并且这种能力具有良好的可逆性。 [0069] 实施例4

[0070] 活体锌离子造影能力：

[0071] 1、探针的活体锌离子荧光造影能力

[0072] 该类探针可对透光性活体中的锌离子进行有效的荧光造影。

[0073] 斑马鱼胚胎培养在28.5度的MilliQ纯水中，在8小时后加入1-苯基-2-硫脲(PTU，最终浓度为0.003％)以减少色素的生成。在不同的发育阶段分别取出斑马鱼进行染色和锌离子造影(图8)。染色是在28.5度利用5μM NBD-TPEA溶液孵育20分钟而完成。在利用甲基纤维素对斑马鱼进行包埋后进行荧光造影。造影利用荧光显微镜完成。经GFP2滤光片后的汞灯光线作为激发光。曝光时间1秒钟。图8a为培养18小时后胚胎的荧光造影，图8b则为图8a相应的明场图，图8c为培养25小时后斑马鱼幼鱼的荧光造影。胚胎总长约为～1.9毫米。图8d则是图8c的相应明场图。图8e则为培养36小时后斑马鱼幼鱼的荧光造影，胚胎总长约～2.7毫米。图8f为培养54小时后的幼鱼荧光造影。幼虫总长约为～3.2毫米，图8g为图8f相应的明场图。图8h为5天龄的斑马鱼幼虫造影，幼虫总长约为～3.5毫米，图8i为7天龄幼虫的造影，幼虫总长约～4毫米。荧光 造影中发现斑马鱼胚胎或幼鱼在发育过程层中存在明显的发亮区域，这是锌离子富集区域。 [0074] 斑马鱼锌离子的脱除后造影同样是利用25μM TPEN溶液处理进行的。实验利用5天龄的斑马鱼幼虫在25μM TPEN溶液中28.5度下孵育，随后以1×PBS溶液洗涤三次。在NBD-TPEA染色后进行造影，造影前利用1×PBS洗涤(图8j)。造影同样利用荧光显微镜在相同条件下完成，并利用未经TPEN处理的斑马鱼幼虫进行对照造影。

[0075] 造影结果表明NBD-TPEA可以有效地的实现斑马鱼幼虫的活体锌离子荧光造影，并且发现了斑马鱼胚胎发育过程中存在于斑马鱼幼虫胸部的锌库。

[0076] 2、探针的活体锌离子激光共聚焦荧光造影能力

[0077] 斑马鱼幼虫体内锌离子的激光共聚焦造影是在4天龄的斑马鱼幼虫上进行的。实2+
验中斑马鱼幼虫先在5μM Zn 溶液中28.5℃下培养12小时。幼虫在以1×PBS洗涤三次后利用甲基纤维素包埋。再以NBD-TPEA以同样的方式染色。随后幼虫通过激光共聚焦荧光显微造影。图9中a为头部明场图和荧光造影图的共定位图(俯视图)，图9b为头部左侧明场放大图，图9c为头部左侧放大的明场和荧光造影的共定位图，图9d放大的头部左侧荧光造影图。造影发现在斑马鱼两眼之间出现对称的绿色荧光斑点(图9a和9d)。这些亮点与斑马鱼特定组织(可能是神经节)存在着明显的共定位效果(图9a-9c)。实验表明NBD-TPEA染色可以实现活体中锌离子的激光共聚焦荧光造影。相应的共定位实验有助于了解锌离子在活体中的分布区域和变化过程。

[0078] 以上各实施例仅以NBD-TPEA为例进行描述，它们不是对本发明的具体限制，用SBD-TPEA1、SBD-TPEA2、SBD-TPEA3在重复上述过程中，可以获得相同或类似的结果。