一株高产脂肪酶的解脂亚罗酵母突变株、培养方法及其酶应用

摘要

本发明提供一株经过紫外诱变方法得到的解脂亚罗酵母脂肪酶高产菌株LW1(CGMCC No.2707)，并提供该菌株的发酵培养方法、脂肪酶提纯、催化脂肪酸甲酯化的方法。解脂亚罗酵母CGMCCNo.2707在100L发酵罐上经过补料发酵培养97.5h，产酶水平为15500U/ml，所制得的脂肪酶酶粉活力为30000U/g。获得的脂肪酶酶粉或发酵液可直接应用于催化脂肪酸甲酯化反应。在脂肪酸与甲醇等摩尔比加入，体系中用酶量为每克脂肪酸1000-3000U时，30h转化率在90％以上。

权利要求

1.一种高产脂肪酶的解脂亚罗酵母突变株(Yarrowialipolytica)LW1，其保藏编号为CGMCC No.2707。

2.根据权利要求1所述的高产脂肪酶解脂亚罗酵母菌株LW1的培养方法，其特征在于该方法的步骤如下：A.PDA固体斜面培养基配制如下：200g马铃薯经洗净去皮切碎后，加水1000ml煮沸半个小时，用纱布过滤，其滤液再加20g葡萄糖，混匀后用去离子水补充液体体积至1000ml，在温度115℃下灭菌15分钟，得到PDA液体培养基，往该PDA液体培养基中加入15g琼脂，待琼脂溶解、凝固后得到PDA固体培养基；

B.发酵种子培养基配制如下：将以重量计豆粉4％-9％、豆油2％-6％、葡萄糖

1％-3％、(NH4)2SO4 0.1％-0.4％、KH2PO4 0.1％-0.4％、MgSO4·7H2O 0.05％-2％配制成pH6.0-pH 6.5的发酵种子培养基；

C.发酵培养基配制如下：将以重量计豆粉4％-15％、豆油4％-12％、

(NH4)2SO40.1％-0.4％、KH2PO4 0.1％-0.4％、MgSO4·7H2O0.05％-2％，CaCO31％-5％，消泡剂甘油聚醚1％-5％配制成pH6.0-pH 6.5的发酵培养基；

D.培养条件与方法

(i)斜面培养

将所述解脂亚罗酵母菌株菌株LW1取一接种环菌苔接种于PDA固体斜面，在初始pH6.0-pH7.0与温度28℃-30℃下恒温培养12-72小时；

(ii)摇瓶培养

将上述步骤i)斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入发酵种子培养基中，在初始pH6.0-pH7.0、温度28℃-30℃下、装液量1∶5-1∶4、摇床转速180-300转/分条件下进行培养，每4-24小时取样测定酶活，直至酶活下降。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于将所述方法步骤D(ii)的条件替换为：(iii)发酵罐培养

向1-2个茄子瓶斜面培养得到的菌种中分别加入30-100ml无菌水，刮下菌苔，接种于

100L发酵罐培养基中，温度28℃-30℃、初始pH 6.1-pH6.5、罐压0.5-1.0大气压与通空气

1∶1-1∶2(v/m)的发酵培养条件下培养90-140小时，得到所述菌株LW1发酵液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于将所述发酵罐转速由180转/分逐渐提高到300转/分，或调节通气量由1∶1(v/m)逐渐增大到1∶2(v/m)，或在发酵过程中补入以重量计1％-5％的豆油提高发酵酶活。

5.根据权利要求2-4中任一项权利要求所述的方法，其特征在于所述解脂亚罗酵母菌株LW1发酵液酶活是15500U/ml以上。

6.使用权利要求2所述方法得到的解脂亚罗酵母菌株LW1发酵液制备脂肪酶酶粉的方法，其特征在于该方法步骤如下：将根据权利要求2所述方法得到的高产脂肪酶解脂亚罗酵母菌株LW1发酵液在3000转/min下离心10min，取其上清液，向上清液中加入其体积3-4倍的95％、-18℃乙醇，加完全部乙醇后，在冰箱冷冻室于温度-18℃--20℃下冷却0.5-1小时，然后在2000转/分下离心2-10分钟，倾出上清液，得到的沉淀物用95％冷乙醇洗涤，其乙醇用量是所述上清液体积的1/4-1/2，再离心，重复洗涤操作2-3次，直到倾出的上清液成为浅黄色，然后用温度-18℃的丙酮洗涤，其丙酮用量是乙醇体积的1/2-1倍，再离心，重复洗涤操作2-3次，直至丙酮上清液基本无色，真空脱除丙酮，得到脂肪酶酶粉。

7.根据权利要求6所述方法得到的脂肪酶酶粉，其特征在于该脂肪酶酶粉的水解酶活是20000u/g-30000u/g。

8.使用权利要求2所述方法得到的解脂亚罗酵母菌株LW1发酵液在催化脂肪酸甲酯化反应中的用途，其特征在于将脂肪酸与甲醇按等摩尔比加入，其中甲醇每隔5h-10h加入一次，分3-6次加入，酯化体系中脂肪酶用量为每克脂肪酸1000-2000U，28-45℃，180-200转/分的空气浴摇床中进行反应15-40小时，得到的产物经气相色谱进行检测确认是脂肪酸甲酯，其酯化率70-95％。

9.根据权利要求6所述方法得到的脂肪酶酶粉在催化脂肪酸反应中的用途，其特征在于将脂肪酸与甲醇按等摩尔比加入，其中甲醇每隔2h-10h加入一次，分3-6次加入，酯化体系中脂肪酶用量为每克脂肪酸1000-3000U，28-45℃，180-200转/分的空气浴摇床中进行反应6-30小时，得到的产物经气相色谱进行检测确认是脂肪酸甲酯，其酯化率70％-95％。

10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于所述的脂肪酸选自C12-C18饱和或不饱和脂肪酸。

说明书

一株高产脂肪酶的解脂亚罗酵母突变株、培养方法及其酶

应用

【技术领域】

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及高产脂肪酶的解脂亚罗酵母菌株，发酵培养方法，及其发酵获得的脂肪酶或发酵液在催化脂肪酸甲酯化反应中的用途。 【背景技术】

[0002] 解脂亚罗酵母菌株又称解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，属半子囊酵母菌，是非常规酵母菌之一，已应用于生产脂肪酶、单细胞蛋白、柠檬酸、异丙基苹果酸等。它产生的脂肪酶广泛应用于工业、轻工业、食品、医药等领域。

[0003] 脂肪酶能够将脂肪酸甘油酯催化水解为游离脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯、甘油，此外还能催化醇或酯与甘油酯之间的转酯化反应，脂肪酸与醇之间的酯化反应，具有广泛的应用价值，已成为市场上的第三大工业用酶。但现有的产脂肪酶的解脂亚罗酵母菌株产酶单位偏低，工业化成本偏高。

[0004] 随着能源危机、环境污染的加剧，生物柴油作为替代能源是以可再生资源为原料，同时具有环境污染小的优点，成为研究开发的热点，并达到了一定规模的实际应用。脂肪酶催化生物柴油合成，具有方法简单、条件温和、能耗低、副产物价值高的优点。目前，应用于生物柴油生产的脂肪酶开发不多。NOVA公司垄断经营的脂肪酶成本高，不适合催化反应器进一步放大。因此，在我国乃至世界生物柴油生产的工业化过程中，急需获得酶活单位高，生产成本低廉的工业化脂肪酶生产菌株。

[0005] 本专利使用紫外照射方法对野生型Yarrowia lipolytica出发菌株进行诱变，并将常规筛选方法加以改进，得了高产脂肪酶的突变菌株 LW1。经本专利所述方法发酵得到的发酵液酶活最高达到15500u/ml。该菌株及其培养方法提高了脂肪酶的产生量，适合工业化生产，能催化脂肪酸甲酯化等酶法催化生产生物柴油领域。使用专利所述方法得到的高酶活的发酵液还可以制成不同酶活的脂肪酶制剂，可以作为产品向市场销售，因此具有较高的经济价值。【发明内容】

[0006] [要解决的技术问题]

[0007] 本发明的第一个目的是提供一种高产脂肪酶的解脂亚罗酵母菌株(Yarrowia lipolytica)LW1(CGMCC No.2707)，又称解脂耶氏酵母。

[0008] 本发明的另一个目的是提供所述高产脂肪酶的解脂亚罗酵母菌株LW1的发酵培养方法。

[0009] 本发明的另一目的是提供所述脂肪酶的制备方法。

[0010] 本发明的另一目的是提供所述脂肪酶与所述发酵液在其催化脂肪酸甲酯化方法中的用途。

[0011] [技术方案]

[0012] 本发明是通过下述技术方案实现的。

[0013] 本发明涉及紫外诱变选育得到解脂亚罗酵母菌株(Yarrowialipolytica)LW1。 [0014] 根据本发明，以从中国农业大学食堂周围环境中分离得到的解脂亚罗酵母野生型为试验菌株，通过紫外线诱变的方法，以改良的透明圈筛选方法进行初筛，摇瓶复筛得到了脂肪酶高产解脂亚罗酵母菌株(Yarrowia lipolytica)LW1。

[0015] 本发明的高产脂肪酶的解脂亚罗酵母菌株(Yarrowialipolytica)LW1，该菌菌株已于2008年10月14日，寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，编号CGMCC No.2707，它具有以下微生物学特性：

[0016] 1)、麦芽汁培养基：在28℃下生长48小时后，细胞呈长椭圆形假丝酵母状。 [0017] 2)、PDA固体培养基上的玻片培养物：良好的假菌丝体形成。

[0018] 3)、无孢子形成。

[0019] 4)、划线培养物：灰白，顶端凸起，表面构造有褶皱。

[0020] 5)、最适培养温度：28℃

[0021] 6)、能够利用的碳源：利用葡萄糖、甘油，不利用淀粉、蔗糖。 [0022] 7)、kNO3同化作用：无

[0023] 本发明还涉及所述高产脂肪酶解脂亚罗酵母菌株LW1的诱变选育方法，其特征在于该方法的步骤如下：

[0024] A、制备野生型出发菌株菌悬液

[0025] 以从中国农业大学食堂周围环境中分离得到的野生型解脂亚罗酵母为出发菌株，依次经PDA固体培养基在28℃下活化1次，PDA液体培养基在28℃下活化2次，然后按照以重量计5％接种量接种入PDA液体培养基，在温度28℃下培养12h，然后取1ml菌液加到10ml已灭菌的以重量计0.86％NaCl水溶液中，得到野生型菌株菌悬液。所述的PDA培养基与下述的PDA斜面培养基相同。

[0026] 所述野生型解脂亚罗酵母培养所使用的培养装置是本技术领域的技术人员熟知的培养装置。例如所述野生型解脂亚罗酵母固体培养装置是恒温培养箱；所述野生型解脂亚罗酵母液体培养装置例如是恒温振荡摇床。

[0027] 所述灭菌所使用的设备是本技术领域的技术人员熟知的设备，例如上海申安医疗器械厂商品名LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器。

[0028] B、紫外线诱变及高产菌株的选育

[0029] 采用本技术领域的技术人员熟知的方法，例如紫外诱变的方法，将在步骤A)所得6
到的野生型解脂亚罗酵母出发菌株菌悬液的活菌数调节到1.85×10 个/ml，将所述悬液置于玻璃片上，其悬液层厚度为 0.2cm，让其在距紫外灯25cm的20瓦紫外灯下照射90秒进行紫外线诱变；紫外线诱变结束后立即将菌液涂布于PDA固体培养基平板上，在温度28℃下培养90小时。

[0030] 所使用紫外灯的波长范围是250-265nm；在待紫外线诱变的悬液层表面上的光照2
度是1850uw/cm，所述的紫外灯例如是北京昌平长城空气净化设备工程公司以商品名超净工作台销售的产品。

[0031] 从诱变后培养的PDA固体培养基平板上挑选单菌落接种于初筛分离培养基A上，在温度28℃下培养48小时。

[0032] 本发明所述的改良透明圈筛选方法采取的初筛分离培养基A是在PDA固体培养基中添加三丁酸甘油酯至终浓度2％(以重量计)、琥珀酸钠至终浓度25mg/ml与制霉菌素至终浓度20U/ml。其中添加的制霉菌素是一种抗真菌剂，能与真菌细胞膜中的麦角固醇结合，引起细胞膜透性改变，增进菌体对营养物质的吸收，有利于胞外酶的分泌，因此利用制霉菌素来筛选高渗透性变异株可使胞外酶产量进一步提高；另外，在筛选时添加脂肪酶底物结构类似物——琥珀酸钠，能解除代谢产物的反馈抑制，以期通过筛选获得解除代谢产物反馈抑制作用的代谢调节变异株来提高酶产量(参见文献：宋欣，曲音波“耐碱性脂肪酶突变株的选育及其酶学性质的研究”，工业微生物1999(29)12；章文贤，蒋咏梅等，“抗性突变株筛选法选育脂肪酶高产菌”，工业微生物2001(31)6)。

[0033] 由于脂肪酶可分解培养基中的三丁酸甘油酯而产生透明圈，所以可以从上述初筛分离培养平板上挑选17个水解透明圈大的菌株，在以重量计5％接种量接入培养基B中，在温度28℃与200rpm条件下在摇床上进行摇瓶复筛，每4小时取样测定酶活，直至酶活下降，这样得到产酶水平最高的高产脂肪酶解脂亚罗酵母菌株LW1。

[0034] 所述的培养基B的成分及配比优选为：以重量计豆粉6％、豆油4％、葡萄糖1％、(NH4)2SO40.2％、KH2PO40.1％、MgSO4·7H2O 0.05 ％，pH 6.5。

[0035] 在本发明中，所述脂肪酶酶活的测定方法是橄榄油滴定法，该方法的步骤如下： [0036] 1)0.05M NaOH的配制：先用无CO2水配制5M NaOH储液；再准确稀释50倍后，称取100℃烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾0.38g，溶于80ml无CO2水中，采用酸碱滴定的方法标定出其准确浓度，再推算出储液浓度；现场使用无CO2水将所述的储液配制成0.05MNaOH溶液；

[0037] 2)以重量计2％PVA-1750水溶液的配制：准确称量PVA-1750，加到蒸馏水中，并用沸水浴加热使之溶解，然后用三层纱布过滤，并定容，在温度4℃下保存；PVA即聚乙烯醇。

[0038] 3)PVA-橄榄油乳化液底物的配制：将橄榄油与在上述步骤2)得到的以重量计2％PVA-1750以1∶3(v/v)比例混合，使用实验室高速剪切分散乳化机(上海贝尔特机电设备科技有限公司，B25型，220V，50Hz)10000rpm、乳化2-3分钟，得到PVA-橄榄油乳化液底物； [0039] 4)取5ml在上述步骤3)得到的乳化液底物与4ml 0.1M pH8.0磷酸钠缓冲液，把它们加到150ml三角瓶中，再把三角瓶置于恒温水浴摇床中，在温度37℃与130rpm下温育5min；

[0040] 5)取1ml适当稀释的在前面制备得到的酶液，加入到上述底物和缓冲液的混合物中，在温度37℃与130rpm条件下进行反应10min，然后加入15ml无水乙醇终止反应； [0041] 6)滴加4滴酚酞作指示剂，使用步骤1)的0.05M NaOH溶液滴定酶解产生的脂肪酸，至反应液变粉红色停止。

[0042] 空白操作如前面所述的方法相同，只是将发酵液与无水乙醇混合反应10min后加入到所述底物和缓冲液中。

[0043] 根据本发明，所述的酶活定义为在该橄榄油滴定法的测定条件 下，1min释放1μmol脂肪酸的酶量为一个酶活单位。

[0044] 本发明还涉及所述的解脂亚罗酵母菌株LW1的培养。所述高产脂肪酶解脂亚罗酵母菌株LW1的培养方法如下：

[0045] A、斜面培养

[0046] 将所述解脂亚罗酵母菌株菌株LW1取一接种环菌苔接种于PDA固体斜面，在初始pH6.0-pH7.0与温度28℃-30℃下恒温培养12-72小时。

[0047] 在PDA固体斜面培养时使用的PDA固体斜面培养基配制方法如下：200g马铃薯经洗净去皮切碎后，加水1000ml煮沸半个小时，用纱布过滤，其滤液再加20g葡萄糖，混匀后用去离子水补充液体体积至1000ml，在温度115℃下灭菌15分钟，得到PDA液体培养基，往该PDA液体培养基中加入15g琼脂，待琼脂溶解、凝固后得到PDA固体培养基。 [0048] 所述斜面培养时间根据菌种生长情况，选择生长曲线中处于对数增长期的菌种。 [0049] 所述斜面培养使用的仪器是本技术领域的技术人员熟知的仪器，如试管和茄子瓶。

[0050] B、摇瓶培养

[0051] 将上述步骤A)斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入发酵种子培养基中，在初始pH6.0-pH7.0、温度28℃-30℃下、装液量1∶5-1∶4、摇床转速180-300转/分的条件下进行培养，每4-24小时取样测定酶活，直至酶活下降。

[0052] 在摇瓶培养时使用的发酵种子培养基组成如下：以重量计豆粉4％-9％、豆油2％-6％、葡萄糖1％-3％、(NH4)2SO40.1％-0.4％、KH2PO40.1％-0.4％、MgSO4·7H2O0.05％-2％，pH6.0-pH 6.5。

[0053] C、发酵罐发酵培养

[0054] 向1-2个茄子瓶斜面培养得到的菌种中分别加入30-100ml无菌 水，刮下菌苔，接种于100L发酵罐培养基中，温度28℃-30℃、初始pH6.1-pH6.5、罐压0.5-1.0大气压与通空气1∶1-1∶2(v/m)的发酵培养条件下培养90-140小时；发酵过程中通过改变以下条件提高发酵酶活：将转速由180转/分逐渐提高到300转/分；调节通气量由1∶1(v/m)逐渐增大到1∶2(v/m)；根据发酵情况补入以重量计1％-5％的豆油。发酵到97.5小时，其酶活达到最高，产酶水平达到15500U/ml，其检测结果参见附图1。

[0055] 在发酵罐发酵培养时使用的发酵培养基组成如下：以重量计豆粉4％-15％、豆油4％-12％、(NH4)2SO40.1％-0.4％、KH2PO40.1％-0.4％、MgSO4·7H2O 0.05％-2％，CaCO31％-5％，消泡剂(甘油聚醚)1％-5％，pH6.0-pH 6.5。

[0056] 所述酶活测定方法是前面描述的橄榄油滴定法。

[0057] 所述的发酵罐是本技术领域中通常使用的发酵罐，例如镇江格瑞生物工程有限公司销售的发酵罐。

[0058] 根据本发明的一种优选实施方式，所述的发酵培养方法是根据产酶情况，逐步将转速由180rpm提升至240rpm提高产酶水平。

[0059] 根据本发明的一种优选实施方式，所述的发酵培养方法是根据产酶情况，通过分批流加碳源即分批补加以重量计1％-5％豆油的方式来提高产酶水平。

[0060] 本发明还涉及高产脂肪酶解脂亚罗酵母菌株LW1发酵液制备脂肪酶酶粉。所述的高产脂肪酶解脂亚罗酵母菌株LW1发酵液制备脂肪酶酶粉的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

[0061] 将上述方法2得到的高产脂肪酶解脂亚罗酵母菌株LW1发酵液在3000转/min下离心10min，取其上清液。向上清液中加入其体积3-4倍的95％、-18℃乙醇，加完全部乙醇后，在冰箱冷冻室于温度-18℃--20℃下冷却0.5-1小时，然后在2000转/分下离心2-10分钟，倾出上清液，得到的沉淀物用95％冷乙醇洗涤，其乙醇用量是所述上 清液体积的1/4-1/2，再离心，重复洗涤操作2-3次，直到倾出的上清液成为浅黄色，然后用温度-18℃的丙酮洗涤，其丙酮用量是乙醇体积的1/2-1倍，再离心，重复洗涤操作2-3次，直至丙酮上清液基本无色，真空脱除丙酮，得到脂肪酶酶粉，测得脂肪酶酶粉水解酶活在20000u/g-30000u/g。

[0062] 所述的离心机是本技术领域中通常使用的离心机，例如上海安亭科学仪器厂制造的飞鸽牌离心机。

[0063] 本发明涉及解脂亚罗酵母菌株LW1发酵液在催化脂肪酸反应中的用途。 [0064] 本发明还涉及所述的解脂亚罗酵母菌株LW1发酵液在催化脂肪酸反应中的用途，其特征在于将脂肪酸与甲醇按等摩尔比加入，其中甲醇每隔5h-10h加入一次，分3-6次加入，酯化体系中脂肪酶用量为每克脂肪酸1000-2000U，在温度28-45℃与180-200转/分的空气浴摇床中进行反应15-40小时，得到的产物经气相色谱进行检测确认是脂肪酸甲酯，酯化率70-95％。

[0065] 检测脂肪酶催化反应产物的气相色谱法是在下述条件下进行的： [0066] 岛津GC2010气相色谱仪，色谱柱，DB-1HT 30×0.25×0.1；氢火焰检测器；分流比30∶1，柱流量1.50ml/min，氮气吹扫流量10.0ml/min，进样口温度380℃，保留时间25min，柱箱温度365℃，采用程序升温：20℃/min，4min；15℃/min，3min；20℃/min，7min，保留时间30min。检测器温度是385℃。

[0067] 本发明还可以使用其它的气相色谱仪进行检测，但其检测条件可以根据该仪器的情况作适当调整。

[0068] 本发明还涉及由所述高产脂肪酶解脂亚罗酵母菌株LW1发酵液制备脂肪酶酶粉在催化脂肪酸反应中的用途。以所述方法得到的脂肪酶酶粉在催化脂肪酸甲酯化反应中的用途，其特征在于将脂肪酸与甲醇按等摩尔比加入，其中甲醇每隔2h—10h加入一次，分3—6次加入，酯化体系中用酶量为每克脂肪酸1000-3000U，28-45℃，180-200转/分的空气浴摇床中进行反应6-30小时，得到的产物经气相色谱进行检测确认是脂肪酸甲酯，酯化率70％-95％。

[0069] 所述甲醇流加时间根据反应中使用的发酵液或酶粉酶活情况具体调节。 [0070] 所述空气浴摇床是本技术领域熟知的设备，如江苏太仓市实验室设备厂生产的THZ-C恒温振荡器。

[0071] 所述的脂肪酸选自C12-C18饱和或不饱和脂肪酸。

[0072] 优选地，所述的脂肪酸选自C16-C18不饱和脂肪酸。

[0073] 更优选地，所述的脂肪酸选自油酸或棕榈油。

[0074] 采用本发明方法得到的脂肪酸甲酯可以广泛地用于工业、农业作为生物柴油使用。

[0075] [有益效果]

[0076] 本发明提供了脂肪酶高产解脂亚罗酵母菌株LW1及其培养方法，并将采用该方法获得的脂肪酶应用于催化化学反应。采用本发明所述的方法，100L发酵罐培养97.5小时，以橄榄油为底物，产酶水平为15500U/ml。使用该方法获得的脂肪酶发酵液以1500U/g脂肪酸用量，催化油酸甲醇酯化反应30小时转化率在75％以上，使用该菌株制得的脂肪酶酶粉以2500U/g脂肪酸用量，催化油酸甲醇酯化反应30小时转化率在90％以上。本发明为该酶的工业化应用奠定了基础。

[0077] 【附图说明】

[0078] 图1解脂亚罗酵母LW1发酵罐培养酶活及pH监测图。

[0079] 图2解脂亚罗酵母突变株脂肪酶发酵液催化油酸甲醇酯化反应气相检测图 [0080] 黑色线条为脂肪酸甲酯色谱图，粉色线条为对照的脂肪酸色谱图 [0081] 图3.解脂亚罗酵母突变株的脂肪酶酶粉催化脂肪酸甲酯化

[0082] A.对照的脂肪酸色谱图，B.酯化后的脂肪酸甲酯色谱图

[0083] 【具体实施方式】

[0084] 实施例1

[0085] 将从农大食堂周围环境中分离的野生型解脂亚罗酵母依次经PDA固体培养基在28℃下活化1次，PDA液体培养基在28℃下活化2次，然后按照以重量计5％接种量接入PDA液体培养基，在28℃下培养12h，然后取1ml菌液加到已灭菌的10ml的以重量计0.86％NaCl水溶液中，得到出发菌株的菌悬液。

[0086] 将上述所得到的出发菌株菌悬液的活菌数调节到1.85×106个/ml，将所述悬液置于玻璃片上，其悬液层厚度为0.2cm，让其在距紫外灯25cm的20瓦紫外灯下照射90秒进行紫外线诱变；紫外线诱变结束后立即将菌液涂布于PDA固体培养基平板上，在温度28℃下培养90小时。

[0087] 从诱变培养的PDA固体培养基平板上挑选单菌落接种于初筛分离培养基上，即在PDA固体培养基中添加三丁酸甘油酯至终浓度2％(以重量计)、琥珀酸钠至终浓度25mg/ml与制霉菌素至终浓度20U/ml。28℃，培养48小时。

[0088] 从上述初筛分离培养平板上挑选17个水解透明圈大的菌株，以单菌落接入摇瓶复筛培养基中(以重量计豆粉6％、豆油4％、葡萄糖1％、(NH4)2SO4 0.2％、KH2PO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.05％，pH 6.5。)28℃，200rpm进行摇瓶复筛。

[0089] 复筛时每隔4小时取一次样，检测脂肪酶酶活。17个初筛得到的菌株，分别培养至125小时，得一株产脂肪酶最高的突变株，命名为LW1，其最终酶活2850u/ml。所述酶活是采用本申请说明书中描述的橄榄油滴定法测定的。

[0090] 实施例2

[0091] 将解脂亚罗酵母突变株LW1在茄子瓶内培养24小时后，向其中加入50ml灭菌蒸馏水，洗下菌苔，直接接种于100L发酵罐中，在温度28℃、初始pH 6.5、罐压0.7个大气压与通空气1∶1(v/m)的发酵条件下培养。发酵到63小时，将发酵罐转速由180转/分提高到240转/分，此时罐压增加到1.0个大气压，通气量由1∶1(v/m)提高到 1∶2(v/m)，培养100小时，采用本申请说明书中描述的橄榄油滴定法测定的酶活达到8250u/ml。 [0092] 实施例3

[0093] 将解脂亚罗酵母突变株LW1在茄子瓶内培养24小时后，向其中加入50ml灭菌蒸馏水，洗下菌苔，直接接种于100L发酵罐中，28℃、初始pH 6.5、罐压0.6大气压与通空气1∶1(v/m)的发酵培养，发酵到55小时时酶活增长速度缓慢，补入以重量计2％的豆油，转速由180转/分提高到240转/分，培养到75小时时，又补入以重量计2％的豆油，此时罐压升高到1.0个大气压，培养到97.5小时，采用本申请说明书中描述的橄榄油滴定法测定的酶活达到15500u/ml。

[0094] 实施例4

[0095] 将实施例3得到的解脂亚罗酵母突变株LW1发酵液稀释为酶活4000u/ml的酶液。催化油酸甲醇酯化反应(反应体系：酶用量4000U，2.82g油酸，405μl甲醇，其中甲醇每间隔10h加入上述体积的三分之一即135μl，30℃，190rpm)30小时。反应产物采用下述条件进行气相色谱检测：

[0096] 岛津GC2010气相色谱仪，色谱柱，DB-1HT 30×0.25×0.1；氢火焰检测器；分流比30∶1，柱流量1.50ml/min，氮气吹扫流量10.0ml/min，进样口温度380℃，保留时间25min，柱箱温度365℃，采用程序升温：20℃/min，4min；15℃/min，3min；20℃/min，7min，保留时间30min。检测器温度是385℃。检测得到油酸甲酯含量75.17％。

[0097] 实施例5

[0098] 将实施例1诱变得到的解脂亚罗酵母突变株LW1在发酵罐上发酵，得到的发酵液酶活12000u/ml，在3000转/min下离心10min，取其上清液；往该上清液中加入其体积3倍的95％-18℃乙醇，加完全部乙醇后，在冰箱冷冻室于温度-20℃下冷却0.5小时，然后在2000转/分下离心4分钟，倾出上清液，得到的沉淀物用95％冷乙醇洗涤， 其乙醇用量是所述上清液体积的1/4，再离心，重复洗涤操作2次，直到倾出的上清液成为浅黄色，然后用温度-18℃的丙酮洗涤，其丙酮用量是乙醇体积的1/2，再离心，重复洗涤操作2次，直至丙酮上清液基本无色，真空脱除丙酮，得到脂肪酶酶粉。采用本申请说明书中描述的橄榄油滴定法测得酶粉水解酶活为24000u/g。

[0099] 取上述酶粉0.2g催化油酸甲醇反应体系(反应体系：酶用量5000U，2.82g油酸，405μl甲醇，其中甲醇每间隔10h加入上述体积的三分之一即135μl，30℃，190rpm)，30h后，将反应产物经气相色谱检测。

[0100] 检测方法如实施例4所述，检测得到油酸甲酯含量是89.18％。

[0101] 实施例6

[0102] 将实施例1诱变得到的解脂亚罗酵母突变株LW1以实施例3所述方法在发酵罐上发酵，得到的发酵液酶活15500u/ml。再以实施利5中所述的酶粉制备方法得到脂肪酶酶粉。测得酶粉水解酶活为30000u/g。

[0103] 取上述酶粉催化棕榈油甲醇反应体系，棕榈油与甲醇按等摩尔比加入，其中甲醇每隔6h加入一次，分4次加入，酶用量为每克脂肪酸3000U，30℃，180转/分的空气浴摇床中进行反应24小时，得到的产物经实施例4描述的气相色谱检测，脂肪酸甲酯含量是90.16％。