液相色谱法测定独一味药物制剂中木犀草素含量的方法

摘要

本发明提供一种液相色谱法测定独一味中木犀草素含量的方法，该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-四氢呋喃-0.5％磷酸为流动相，检测波长为350±2nm，柱温25～50℃，流速0.5～1.5ml/min，进样量5～20μl的色谱条件下，将制备的供试品溶液进行液相色谱分析，测定对照品溶液相应位置的色谱峰面积，按标准曲线计算相应的含量。本发明的测定方法精密度高、重现性好、回收率高、测量结果准确，提高了含独一味药材的药物制剂的质量标准，有利于产品稳定性和工业化生产的质量控制，并确保了人们用药的安全性和有效性。

权利要求

1.液相色谱法测定独一味药物制剂中木犀草素含量的方法，其特征在于：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-四氢呋喃-0.5％磷酸为流动相，检测波长为350±2nm，柱温40℃，流速1.0ml/min，进样量5～20μl的色谱条件下，将独一味药物制剂供试品溶液进行液相色谱分析，测定对照品溶液相应位置的色谱峰面积，按标准曲线计算相应的含量；

所述流动相中乙腈∶四氢呋喃∶0.5％磷酸的体积比为20∶6.4∶73.6；

所述独一味药物制剂供试品溶液的制备：将独一味药物制剂按1∶10～1∶25的体积比加入到浓度为1.5～4.0mol/L的盐酸甲醇溶液，于80～100℃，回流10～120分钟，冷却，摇匀，滤过，精密量取续滤液2～5体积份，用甲醇或所述流动相或乙醇稀释0～5倍，摇匀，用0.22～0.45μm的微孔滤膜滤过，即得独一味药物制剂供试品溶液；所述盐酸甲醇溶液中盐酸与甲醇的体积比1.35∶10～4.05∶10；

所述对照品溶液的制备：将经五氧化二磷干燥的木犀草素对照品，用甲醇制成浓度介-1

于5μg·ml 的梯度溶液。

2.如权利要求1所述液相色谱法测定独一味药物制剂中木犀草素含量的方法，其特征在于：所述独一味药物制剂为贴膏剂、气雾剂、软膏剂、喷雾剂、片剂、丸剂或巴布剂。

说明书

液相色谱法测定独一味药物制剂中木犀草素含量的方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药领域，涉及一种药品的检测方法，尤其涉及一种高效液相色谱法测定独一味药物制剂中木犀草素的含量的方法。

背景技术

[0002] 木犀草素(C15H10O6)属弱酸性四羟基黄酮化合物，为黄色晶体，属于黄酮。木犀草素熔点：328℃～330℃(一水合物)，微溶于水，溶于碱溶液(一水合物)。

[0003] 独一味为传统藏药，相关制剂被临床广泛应用于各种外科手术后的镇痛止血及口腔科、妇科、关节炎等方面的治疗。《中国药典》要求测定独一味及其制剂中总黄酮及木犀草素含量，并设定了质量标准。大量药理实验表明，木犀草素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌；解痉、祛痰、抑酶、利尿利胆作用，是独一味的活性物质基础。因此，建立独一味制剂中木犀草素含量的测定方法，能更好地保障独一味药材及其相关提取物、制剂的质量。

[0004] 目前，测定独一味药物中木犀草素的方法是采用高效液相色谱法(见《中国药典》2005年版一部附录VID)，其中流动相的选择主要有：甲醇-0.4％磷酸水溶液(45∶55)；甲醇-水-乙酸(50∶50∶1)；甲醇-0.025mol/L磷酸二氢钠溶液-磷酸(55∶45∶0.08)；
乙腈-0.5％磷酸水溶液(3∶7)；甲醇-四氢呋喃-0.5％醋酸(27∶4∶69)等。用以上系统溶液作流动相时，木犀草素峰和杂质峰分离度差，并有拖尾现象，使木犀草素的含量测定不够准确。

发明内容

[0005] 本发明的目的提供一种专属性强、能更准确测定独一味药物中木犀草素的含量的高效液相色谱检测方法。

[0006] 本发明液相色谱法测定独一味药物制剂中木犀草素含量的方法，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-四氢呋喃-0.5％磷酸为流动相，在检测波长350±2nm，柱温25～50℃，流速0.5～1.5ml/min，进样量5～20μl的色谱条件下，将独一味药物供试品溶液进行液相色谱分析，测定对照品溶液相应位置的色谱峰面积，按标准曲线计算相应的含量。

[0007] 所述流动相中，乙腈、四氢呋喃、0.5％磷酸的体积比为(10～40)∶(4.8～7.2)∶(55.2～82.8)。优选体积比为：(15～30)∶(5.6～6.8)∶(64.4～78.2)；最佳体积比为20∶6.4∶73.6。

[0008] 所述对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷干燥的木犀草素对照品，用甲醇-1或乙醇制成浓度介于3～40μg·ml 的梯度溶液。

[0009] 本发明的测定方法适用于独一味药物制剂，主要有贴膏剂、气雾剂、软膏剂、喷雾剂、片剂、丸剂、巴布剂等。

[0010] 所述独一味药物制剂供试品溶液的制备：将独一味药物制剂按1∶10～1∶25的体积比加入到浓度为1.5～4.0mol/L的盐酸甲醇溶液，于80～100℃，回流10～120分钟，冷却，摇匀，滤过，精密量取续滤液2～5体积份，用甲醇或所述流动相或乙醇稀释0～5倍，摇匀，用0.22～0.45μm的微孔滤膜滤过，即得独一味药物供试品溶液。所述盐酸甲醇溶液中盐酸与甲醇的体积比1.35∶10～4.05∶10。

[0011] 下面通过具体实验对本发明方法进行进一步说明。

[0012] (1)仪器与试剂

[0013] 仪器：Agilent-1100液相色谱仪；

[0014] 对照品：来源于中国药品生物制品鉴定所(供含量测定用，批号：111520-200201)；

[0015] 试剂：甲醇、乙腈、四氢呋喃为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

[0016] (2)色谱条件选择

[0017] 色谱柱：Zorbax-C18；流动相为乙腈-四氢呋喃-0.5％磷酸(体积比为20∶6.4∶73.6)；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂为250mm×4.6mm，5μm；柱温：40℃；检测波长为350nm；流速：1.0ml/min，进样量20μl；理论板数按木犀草素(C15H10O6)峰计算应不低于3000。

[0018] (3)标准曲线的绘制

[0019] 分别精密吸取浓度为3、6、12、18、24、30μg·ml-1的木犀草素对照品溶液各0.01ml，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，进行线性回归分析，结果表明木犀草素在3～30μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，结果见表1。

[0020] 表1

[0021]浓度(ug/ml) 3 6 12 18 24 30
峰面积 129.3 261.7 531.9 798.5 1099.8 1343.9

[0022] 回归方程为：y＝45.419x-9.0153，r＝0.9998。

[0023] (4)精密度试验

[0024] 精密吸取浓度为15μg·ml-1的木犀草素对照品溶液0.01ml，注入液相色谱仪，连续进样5次，测定峰面积，结果见表2。

[0025] 表2精密度试验

[0026]

[0027] 由表2可知，RSD为0.19％，表明精密度良好。

[0028] (5)稳定性试验

[0029] 取独一味药物制剂2g，精密称定重量，置平底烧瓶中，精密加入浓度为2.5mol/L的盐酸甲醇溶液25ml(盐酸与甲醇的体积比2.25∶10)，于96℃回流30分钟，放冷，再精密称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，用甲醇稀释至5ml，摇匀，用0.22～0.45μm的微孔滤膜滤过。

[0030] 取上述溶液，分别在0、2h、4h、8h、12h、24h后注入液相色谱仪，进样测定峰面积，结果见表3。

[0031] 表3稳定性试验

[0032]

[0033] 由表3可知，RSD为0.99％，表明样品在24小时之内检测稳定性良好。

[0034] (6)重现性试验

[0035] 依法制备供试品溶液6份，每份2g，分别精密称定，精密加入2.5mol/L的盐酸甲醇溶液25ml(盐酸与甲醇的体积比2.25∶10)，精密称定重量，加热到98℃，回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足其减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。注入液相色谱仪，分别测定，结果见表4。

[0036] 表4重现性试验

[0037]

[0038] 由表4可知，RSD为0.99％，表明样品的重现性良好。

[0039] (7)加样回收试验

[0040] 取已知含量的供试品(木犀草素含量：0.32mg/g)6份，每份1g，精密称定重量，-1同供试品制备方法，精密量取续滤液2ml，置量瓶中，再分别精密加入浓度为30μg·ml的木犀草素对照品溶液0.7ml、0.8ml、1.0ml，用乙腈∶四氢呋喃∶0.5％磷酸(体积比为
20∶6.4∶73.6)稀释至5ml，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过。注入液相色谱仪，分别测定，结果见表5。

[0041] 表5加样回收试验

[0042]

[0043] 由表5可知，RSD为0.99％，表明样品的回收率良好。

[0044] (8)样品测定

[0045] 取独一味药物制剂约2g，精密称定，精密加入2.5mol/L的盐酸甲醇溶液25ml(盐酸与甲醇的体积比2.25∶10)，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足其减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置量瓶中，用甲醇稀释至5ml，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过。注入液相色谱仪，分别测定，结果见表6。

[0046] 表6(n＝2)

[0047]

[0048] 通过对多批留样产品中的木犀草素检测可知，药物组合物制剂中每1g含独一味以木犀草素计在0.26mg～0.49mg的范围内，考虑到多批样品的批间差异，在最低限量的基础上下浮40％，作为最低限量标准0.15mg/g。因此暂定本品每1g含独一味以木犀草素(C15H10O6)计，应不得少于0.15mg。

[0049] (9)阴性样品测定

[0050] 取不含独一味的药物制剂约2g，精密称定，精密加入2.5mol/L的盐酸甲醇溶液25ml(盐酸与甲醇的体积比2.25∶10)，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足其减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置量瓶中，用甲醇稀释至5ml，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过。注入液相色谱仪，进行分析，结果对样品测定无干扰。

[0051] (10)供试品溶液的制备：取独一味药物制剂约2g，精密称定，精密加入2.5mol/L的盐酸甲醇溶液25ml(盐酸与甲醇的体积比2.25∶10)，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足其减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置量瓶中，用甲醇稀释至5ml，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

[0052] (11)样品中的含量测定

[0053] 精密吸取样品溶液20.0μl，以上述色谱条件，注入高效液相色谱仪中，测定与木犀草素标准品相同位置的色谱峰面积，根据标准曲线计算制剂中木犀草素的含量；结果见表7。

[0054] 表7样品含量测定(n＝2)

[0055]

[0056] 结果表明，独一味不同制剂中均可检测出木犀草素，但含量相差很大。

[0057] 本发明与现有技术相比的有益效果：

[0058] 1、本发明采用乙腈-四氢呋喃-0.5％磷酸为流动相，减少了杂质的影响，木犀草素峰与杂质峰得到了更好的分离，使木犀草素的含量测定更为准确。

[0059] 2、本发明得测定方法具有重现性、稳定性好、操作方法简便、精密度高、专属性强等优点；

[0060] 3、本发明可有效地控制产品的质量，使独一味药物制剂的质量达到稳定、可控、高效及安全。附图说明：

[0061] 图1为独一味中木犀草素对照品色谱图

[0062] 图2为独一味中木犀草素样品色谱图

[0063] 图3为独一味中木犀草素阴性色谱图

具体实施方式

[0064] 实施例一：含独一味药材的片剂中木犀草素含量测定

[0065] 照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。

[0066] (1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈-四氢呋喃-质量浓度0.5％磷酸(20∶6.4∶73.6)为流动相，柱温40℃；检测波长350nm；流速1.0ml/min；理论板数按木犀草素(C15H10O6)峰计算应不低于5000。

[0067] (2)对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷干燥的木犀草素对照品0.25mg，置量瓶中，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，即得。

[0068] (3)供试品溶液的制备：取本品约0.5g，精密称定，精密加入2.5mol/L的盐酸甲醇溶液15ml(盐酸与甲醇的体积比2.25∶10)，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足其减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置量瓶中，用甲醇稀释至5ml，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

[0069] (4)测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，本品每1g含独一味以木犀草素(C15H10O6)计，不得少于0.45mg。

[0070] 实施例二：含独一味药材的贴膏剂中木犀草素含量测定

[0071] 照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。

[0072] 步骤(1)、(2)与实施例1同。

[0073] (3)供试品溶液的制备：取本品约2g，精密称定，精密加入2.5mol/L的盐酸甲醇溶液25ml(盐酸与甲醇的体积比2.25∶10)，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇溶液补足其减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置量瓶中，用甲醇稀释至5ml，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

[0074] (4)测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，本品每1g含独一味以木犀草素(C15H10O6)计，不得少于0.27mg。

[0075] 实施例三：含独一味药材的丸剂中木犀草素含量测定

[0076] 照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。

[0077] 步骤(1)、(2)与实施例1同。

[0078] (3)供试品溶液的制备：取本品约5g，精密称定，精密加入3.0mol/L的盐酸甲醇溶液40ml(盐酸与甲醇的体积比2.7∶10)，称定重量，加热回流60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足其减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液4ml，置量瓶中，用乙醇稀释至5ml，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

[0079] (4)测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，本品每1g含独一味以木犀草素(C15H10O6)计，不得少于0.32mg。

[0080] 实施例四：含独一味药材的气雾剂中木犀草素含量测定

[0081] 照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。

[0082] 步骤(1)、(2)与实施例1同。

[0083] (3)供试品溶液的制备：精密量取本品10ml，置水浴锅上蒸干，残渣精密加入2.5mol/L的盐酸甲醇25ml(盐酸与甲醇的体积比2.25∶10)，称定重量，加热水解30分钟，放凉，再称定重量，用甲醇补足其减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

[0084] (4)测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，本品每1ml含独一味以木犀草素(C15H10O6)计，应不得少于30μg。

[0085] 实施例五：含独一味药材的软膏剂中木犀草素含量测定

[0086] 照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。

[0087] 步骤(1)、(2)与实施例1同。

[0088] (3)供试品溶液的制备：取本品约10g，精密称定，精密加入2.5mol/L的盐酸甲醇溶液50ml(盐酸与甲醇的体积比2.25∶10)，称定重量，加热回流60分钟，放冷，再称定重量，用盐酸甲醇溶液补足其减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液4ml，置量瓶中，用乙腈∶四氢呋喃∶0.5％磷酸(体积比为20∶6.4∶73.6)稀释至5ml，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

[0089] (4)测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，本品每1g含独一味以木犀草素(C15H10O6)计，不得少于0.20mg。

[0090] 实施例六：含独一味药材的喷雾剂中木犀草素含量测定

[0091] 照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。

[0092] 步骤(1)、(2)与实施例1同。

[0093] (3)供试品溶液的制备：精密量取本品5ml，置水浴锅上蒸干，残渣精密加入2.5mol/L的盐酸甲醇10ml(盐酸与甲醇的体积比2.25∶10)，称定重量，加热水解30分钟，放凉，再称定重量，用甲醇补足其减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

[0094] (4)测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，本品每1ml含独一味以木犀草素(C15H10O6)计，应不得少于25μg。

[0095] 实施例七：含独一味药材的巴布剂中木犀草素含量测定

[0096] 照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。

[0097] 步骤(1)、(2)与实施例1同。

[0098] (3)供试品溶液的制备：取本品约5g(30cm2)，剪成小块，除去盖衬，置平底烧瓶中，精密加入2.5mol/L的盐酸甲醇25ml(盐酸与甲醇的体积比2.25∶10)，精密称定重量，加热回流60分钟，放凉，用甲醇补足其减失的重量，精密量取续滤液2ml，置量瓶中，用甲醇至5ml，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

[0099] (4)测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，本品每1g含独一味以木犀草素(C15H10O6)计，应不得少于0.15mg。