CNS病症的治疗

摘要

本发明公开了通过鼻内施用一种组合物的方式治疗中枢神经系统(CNS)的病理病症的方法和组合物，所述组合物通过RNA干扰的方式调节涉及上述提及的病症的基因的表达和/或活性。

权利要求

1.引起RNA干扰和调节tau表达的siRNA在制备用于治疗中枢神经系统(CNS)疾病的药物中的应用，其中所述药物被配制用于鼻内施用，所述siRNA靶向选自SEQ ID NO：128、

129、159或160的核苷酸序列。

2.权利要求1的应用，其中所述疾病是痴呆、阿尔茨海默病和/或帕金森病，以及与CNS基因突变相关的先天性疾病。

3.权利要求1或权利要求2的应用，其中所述tau表达在细胞中得到调节。

4.权利要求3的应用，其中所述tau表达在CNS细胞中得到调节。

5.权利要求1或2的应用，其中所述siRNA包括修饰的寡核苷酸。

6.权利要求1的应用，其中所述siRNA在长度上是40个碱基对或更少。

7.权利要求1的应用，其中所述siRNA具有3’突出端。

8.权利要求7的应用，其中所述3’突出端是二核苷酸。

9.权利要求8的应用，其中所述二核苷酸突出端由胸腺嘧啶核苷酸组成。

10.权利要求1或2的应用，其中使用多种种类的siRNA。

11.权利要求10的应用，其中所述多种种类靶向相同的mRNA种类。

12.权利要求10的应用，其中所述多种种类靶向不同的mRNA种类。

13.一种配制成鼻内施用的药物组合物，其包括靶向选自SEQ IDNO：128、129、159和

160的核苷酸序列并且靶向在CNS中表达的tau基因的siRNA。

14.一种配制成鼻内施用的用于治疗CNS疾病的药物组合物，其包括靶向选自SEQ ID NO：128、129、159和160的核苷酸序列并且引起对在CNS中表达的tau基因的RNA干扰的siRNA。

说明书

CNS病症的治疗

发明领域

[0001] 本发明涉及通过鼻内施用一种组合物的方式治疗中枢神经系统(CNS)的病理病症的方法和组合物，所述组合物通过RNA干扰的方式调节涉及上述提及的病症的基因的表达和/或活性。本发明的组合物包括短干扰核酸分子(siNA)和相关的化合物，所述相关的化合物包括，但不限于，小干扰RNAs(siRNA)。在优选实施方案中，鼻内递送的靶向tau、亨廷顿蛋白、乙酰胆碱酯酶、以及CNS的这些或其它基因的突变的等位基因的siNA分子，有效用于制备用于治疗CNS疾病诸如痴呆、阿尔茨海默病、亨廷顿病和/或帕金森病的疾病以及其中与特别是CNS基因突变相关的先天性疾病的药物。

[0002] 发明背景

[0003] RNAi作为调节基因表达的工具

[0004] RNA干扰是指由双链RNA(dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。在20世纪90年代早期在植物中发现这种现象后，Andy Fire和Craig Mello证明在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中dsRNA以极其有效的方式特异性并且选择性地抑制基因表达(Fire等，1998)。第一链(有义RNA)的序列与目标信使RNA(mRNA)相对应区域的序列一致。第二链(反义RNA)与所述mRNA互补。这样得到的dsRNA证明比相对应的单链RNA分子(具体是反义RNA)更有效几个数量级。

[0005] 当酶切酶遇到dsRNA并且将其切成叫作小干扰RNAs或siRNA的片段时，RNAi过程开始。这种蛋白属于RNA酶III核酸酶家族。蛋白的复合物将这些RNA残余物聚集起来，并且利用它们的编码作为指导去寻找和破坏细胞中具有匹配序列的任何RNAs，如目标mRNA(参见，Bosher和Lahouesse，2000；和Akashi等，2001)。

[0006] 在应用RNAi进行基因击倒的尝试中，认识到哺乳动物细胞已经发展了多种抗病毒感染的保护机制，其可能妨碍这种方法的应用。的确，极低水平的病毒dsRNA的存在引发干扰素反应，导致对翻译的全面非特异性抑制，其又引发程序性细胞死亡(Williams，1997，Gil和Esteban，2000)。

[0007] 在2000年，据报道，dsRNA特异性抑制在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的三种基因。当胚胎继续发育时，没有观察到翻译停滞，以及由此引起的PKR反应(Wianny和Zernicka-Goetz，2000)。在Ribopharma AG(Kulmbach，德国)的研究证明了RNAi在哺乳动物细胞中的功能性，其使用短(20-24个碱基对)dsRNAs来切断人细胞中的基因，而不启动急性期反应。其他研究小组进行的类似的实验证实了这些结果(Elbashir等，2001；Caplen等，2001)。在许多正常和癌症的人和小鼠细胞系中检测，确定短发夹RNAs(shRNAs)可以与它们的siRNA负体一样有效地沉默基因(Paddison等，2002)。最近，另一组小RNAs(21-25个碱基对)表现出调控基因表达的下调。这些RNAs，小时序调节RNAs(stRNAs)，在秀丽隐杆线虫发育过程中调节基因表达的时间(关于综述参见Banerjee和Slack，2002以及Grosshans和Slack，2002)。

[0008] 科学家们已经在一些系统中使用了RNAi，所述系统包括秀丽隐杆线虫、果蝇(Drosophila)、锥虫和其它无脊椎动物。最近一些小组已经提出对不同哺乳动物细胞系(特别是HeLa细胞)中的蛋白质生物合成的特异性抑制，其证明RNAi是广泛适用的体外基因沉默的方法。基于这些结果，RNAi已经迅速地变成了确认(鉴定和分配)基因功能的公认的工具。使用短dsRNA寡核苷酸的RNAi将产生对只是部分测序的基因功能的理解。

[0009] 最近，Krutzfeldt和同事表明，一类叫作‘antagomirs’的特异性加工的化合物可以有效地沉默微小RNAs(miRNAs)的作用，所述微小RNAs是调节基因表达的非编码RNA片段(Krutzfeldt等，2005)。

[0010] siNA产物的鼻内递送

[0011] 已经描述了使用病毒载体、聚合物、表面活性剂、或赋形剂将核酸汽雾递送至肺部用来治疗肺病。已经提议用于鼻内递送的适当的核酸包括dsDNA、dsRNA、ssDNA、ssRNA、短干扰RNA、微小RNA、和反义RNA(参见US2005/0265927，和WO2005/115358)。

[0012] 用于诱导RNAi试剂进入肺部的优选的递送试剂包括阳离子聚合物、修饰的阳离子聚合物、脂质、和适用于引入的表面活性剂(参见US20050008617)。

[0013] 递送至CNS

[0014] 用于CNS疾病治疗的鼻内递送仅使用乙酰胆碱酯酶抑制剂诸如加兰他敏和加兰他敏的各种盐及衍生物获得(参见，例如，US2006003989，WO2004/002402，WO2005/102275)，而通过将小干扰RNA释放到CNS中的方式治疗神经变性疾病先前已经通过手术植入导管而获得(参见，例如，WO2005/116212)。WO02/086105描述了通过在鼻腔中起始的神经通路将寡核苷酸递送到CNS的方法。讨论了反义寡核苷酸的应用，但是没有做出关于RNA干扰的参考。此外，在这一公布中没有关于所递送的寡核苷酸的生理活性的内容。静脉内施用的siNA进一步表现出穿过血-视网膜屏障，并且调节眼中基因的表达(WO03/087367，US2005/0222061)。在细胞培养物中使用siNA以及通过包括下列各项的策略的方式在体内获得了参与阿尔茨海默病的某些基因如β-分泌酶(BACE)、淀粉状前体蛋白(APP)、PIN-1、早老蛋白1(PS-1)和/或早老蛋白2(PS-2)的表达的调节，以及参与亨廷顿病的基因如亨廷顿蛋白或共济失调蛋白1的表达的调节，所述策略包括鞘内和脑室内施用，植入导管和泵，通过化学或渗透性打开血脑屏障，或通过直接注射或输注到脑动脉系统中(即，进入纹状体、皮层中----参见，例如WO2005/003350，US2005/042646，和GB2415961)。

[0015] 通过RNAi的方式Tau靶向

[0016] Tau在遗传性和获得性形式的年龄相关的痴呆，包括阿尔茨海默病(AD)中具有重要的作用(Hardy和Selkoe，2002；Lee等，2001；Mullan等，1992；Poorkaj等，1998；Hutton等，1998)。AD特征在于两种主要的病理性特点：老年斑，其包含源自淀粉状前体蛋白(APP)裂解的β-淀粉状蛋白(AP)；和神经原纤维缠结，其包含细丝状tau蛋白。稀有的遗传形式的AD已经揭示了AP产生在所有形式的AD，即散发性和遗传性的AD发病机理中的主要作用(Hardy和Selkoe，2002)。在三种已知引起家族性AD的基因----编码APP、早老蛋白1和早老蛋白2的基因中的突变，主要作用增加神经毒性β-淀粉状蛋白的产生(Hardy和Selkoe，2002)。

[0017] Tau，神经原纤维缠结的主要成分，同样在AD发病机理中起重要作用(Lee等，2001)。Tau中的突变引起类似的显性遗传的神经变性疾病，连锁到染色体17上的具有帕金森神经功能障碍的额颞痴呆(FTDP-17)。在FTDP-17中，tau突变改变tau蛋白序列，或者导致异常的剪接(Lee等，2001；Lewis等，2001；Oddo等，2003)。Tau蛋白表达的异常还引起一些其它重要的神经变性疾病，包括发展性核上麻痹和皮质基底(corticobasal)神经节变性(Houlden等，2001)。因此，全面或以等位基因-特异性方式减少tau表达的努力可以证明在FTDP-17、AD或其它tau-相关疾病中是治疗有效性的。

[0018] 已经在细胞培养中实现Tau突变和/或相关的单核苷酸多态性(SNP)的通过RNAi方式的等位基因-特异性沉默(Miller等，2003，2004)。此外，目的siRNA通过注射到尾静脉中的方式成功地递送到小鼠模型中(US2004/0241854)。

[0019] 上述是对与RNAi相关的相关技术以及递送到CNS途径的讨论。所述讨论仅供理解后附的本发明，并不是承认所述的任何工作是所申请的发明的现有技术。存在常规方法的技术所不满足的需要，其中siNA分子可以被递送至CNS，并且其中这样的递送导致RNA干扰活性。我们已经开发了通过鼻内施用使siRNA分子靶向CNS的方式调节体内基因表达以治疗CNS疾病的技术。

[0020] 发明概述

[0021] 本发明提供通过鼻内施用引起RNA干扰的化合物的方式治疗中枢神经系统(CNS)的病理的方法和组合物。

[0022] 本发明的组合物包括短干扰核酸分子(siNA)和相关的化合物，其包括但不限于，小干扰RNA(siRNA)，双链RNA(dsRNA)，短发夹RNA(shRNA)，微小RNA(miRNA)，antagomirs，以及能够调节RNA干扰的分子。

[0023] 本发明的方法包括对需要其的患者施用有效量的一种或多种本发明的siNA，用于治疗CNS病理病症。在优选实施方案中，本发明的方法包括鼻内施用治疗性siNA。特别地，本发明的组合物可以用于制备用于治疗CNS病理以及与特别是与CNS基因的突变相关的先天性疾病的药物，所述CNS病理包括痴呆、阿尔茨海默病、亨廷顿病和/或帕金森病。可以按照本发明方法治疗的病理和疾病优选地包括影响海马、皮层和/或纹状体的那些。

[0024] 在一个实施方案中，本发明涉及siNA或类似化学合成的实体，其针对tau、亨廷顿蛋白或乙酰胆碱酯酶基因、以及这些或最终调节所产生的蛋白的量的其它CNS基因的突变等位基因的mRNA表达进行干扰。在优选实施方案中，鼻内施用本发明的组合物，以特异性靶向CNS内部目的基因的异常形式。

[0025] 附图简述

[0026] 本发明将通过参考下述附图的举例方式进行描述。

[0027] 图1.在对小鼠鼻内施用0.9％ NaCl(对照)，1nmol/ul siRNA-GFP(小鼠1)，2nmol/ul siRNA-GFP(小鼠2)，和2nmol/ul siRNA-GFP+TransIT-TKO(小鼠3)后的GFP表达水平。进行了CNS的皮层、海马、纹状体和球体的分析。

[0028] 图2.siRNA降低GFP蛋白的水平。在转基因GFP小鼠中鼻内施用针对GFP设计的siRNA。将动物在不同时间处死，并且通过蛋白质印迹分析所收集的组织。在小鼠CI，CII和CIII中施用盐水对照作为对照。值显示针对对照小鼠的GFP蛋白标准化的GFP蛋白表达水平。

[0029] 图3.siRNA降低GFP mRNA的水平。在转基因GFP小鼠中鼻内施用针对GFP设计的siRNA。将动物在不同时间处死，并且收集来自不同组织的mRNA。在该图中，纹状体和皮层的GFP mRNA的表达通过定量PCR进行分析。

[0030] 图4.siRNA降低具有不同突变的MAPT基因转录体的水平。设计成不同突变的siRNAs分析为Seq ID 159(P301L突变)和Seq ID 160(R406W突变)。从用该特异性siRNA处理48小时的细胞制备RNA。样品通过用MAPT的特异性引物进行定量PCR进行分析(在下文中描述)。值表示相对于作为对照的模拟转染的细胞针对18S标准化的不同的转录体的平均表达水平。

[0031] 图5.siRNA降低MAPT基因转录体的水平。从用不同siRNA处理24、48小时和72小时的MDA-MB-435细胞制备RNA。样品通过用特异性引物进行的实时PCR进行分析，其在下文中进行描述。值表示相对于模拟转染的对照针对18S标准化的不同转录体的平均表达水平。

[0032] 图6.针对R406W突变设计的siRNA Seq ID 160在体内降低MAPT蛋白水平。在转基因MAPT小鼠中鼻内施用siRNA Seq ID 160。在siRNA施用后7天时处死动物，并且通过蛋白质印迹分析海马组织。

[0033] 图7.MAPT突变和基因序列登记号的列表。

[0034] 图8.由本发明的siNA靶向的MAPT区域和靶向这些区域的siNA双链体的序列表。

[0035] 发明详述

[0036] 本发明涉及通过鼻内施用引起RNAi的化合物的方式治疗CNS病理的方法和组合物。本发明的组合物包括短干扰核酸分子(siNA)，其调节与CNS异常病症相关的目标基因的表达。

[0037] 本发明的方法包括对需要其的患者施用有效量的一种或多种本发明的siNA。

[0038] siRNA的设计

[0039] 根据本发明，例如当siNA选择性地降低或抑制一个基因或涉及病理病症的基因的等位基因的表达时，该基因被siNA“靶向”。备选地，当siNA在严格的条件下与基因的转录物杂交时，siNA靶向该基因。siNA可以在体外或体内检测其靶向基因的能力。

[0040] 在1999年，Tuschl等解译了siRNAs的沉默作用，显示出它们的效率是一个与二聚体的长度、3′末端突出端的长度以及这些突出端的序列有关的函数。

[0041] 在目标基因中选择正确的同源区域与精确的沉默具有很大的相关性。所述目标基因序列的短片段(例如，长度为19-40个核苷酸)被选择来作为本发明所述的siNA的序列。备选地，选择目的等位基因的可变区作为所述siNA化合物的靶点。在一个实施方案中，所述siNA是siRNA。在这样的实施方案中，目标基因序列的短片段是目标基因mRNA的片段。
在优选的实施方案中，从目标基因mRNA中选择序列片段作为候选siRNA分子的标准包括：
1)距离天然mRNA分子的5′或3′末端至少是50-100个核苷酸的来自目标基因mRNA的序列；2)G/C含量在30％和70％之间，最优为大约50％的来自目标基因mRNA的序列；3)不含重复序列(例如，AAA，CCC，GGG，TTT，AAAA，CCCC，GGGG，TTTT)的来自目标基因mRNA的序列；4)在mRNA中易接近的来自目标基因mRNA的序列；和5)对于该目标基因是唯一的来自目标基因mRNA的序列。来自目标基因mRNA的序列片段可以满足一种或几种上述提及的标准。在优选的实施方案中，siRNA具有低于60％的G/C含量和/或缺乏重复序列。

[0042] 实际上，目的基因作为核苷酸序列被引入一个预测程序，这个预测程序考虑了上文所描述的用于设计最佳寡核苷酸的所有变量。该程序扫描易于被siRNA靶向的区域中任意的mRNA核苷酸序列。这一分析的输出是可能的siRNA寡核苷酸的得分。最高的得分被用于设计典型地通过化学合成制备的双链RNA寡核苷酸(尽管其它长度也有可能，但典型的长度为21bp)。还可以进行一些化学修饰，所述化学修饰是本领域公知的，其以提高dsRNA寡核苷酸的稳定性或可用性为目的。

[0043] 候选寡核苷酸能够进一步地根据种间序列的保守性进行过滤，以促进从动物到人类临床研究的转变。

[0044] 除与目标区域完全互补的siNA之外，简并的siNA序列可以被用于靶向同源区域。WO2005/045037描述了靶向这样的同源序列的siNA分子的设计，例如通过掺入不规范碱基对，比如错配和/或摆动碱基对，其提供额外的目标序列。例如在错配被确定的情况中，不规范碱基对(如错配和/或摆动碱基)能够用于产生靶向多于一个基因序列的siNA分子。
在一个非限制性实例中，不规范碱基对，如UU和CC碱基对，被用于生成能够靶向享有序列同源性的不同靶的序列的siNA分子。同样地，利用本发明siNAs的一个优势是单个siNA能够被设计为包含与在同源基因中保守的核苷酸序列互补的核酸序列。通过这种方法，使用单个siNA，而不是使用靶向不同基因的多于一个siNA分子，就能够抑制多于一种基因的表达。

[0045] 序列的同一性可以通过本领域熟知的序列比较和比对运算法则(见Gribskov和Devereux，序列分析引物，Stockton出版社，1991，以及其中引用的参考文献)，以及通过例如在BESTFIT软件程序中用默认参数执行的Smith-Waterman运算法则来计算核苷酸序列之间的百分比差异(例如，威斯康辛大学遗传计算小组(University of Wisconsin GeneticComputing Group))而进行计算。优选的是在siNA和目标基因片段之间高于90％，95％，或99％的序列同一性。备选地，siNA和天然RNA分子间的互补性可以通过杂交被功能性地定义，也可以通过它降低或抑制目标基因表达的能力来功能性地定义。siNA影响基因表达的能力能够在体内或体外以经验来确定。

[0046] 本发明中优选的siNA分子是双链的。在一个实施方案中，双链siNA分子含有平头末端。在另一个实施方案中，双链siNA分子含有突出的核苷酸(例如，1-5个核苷酸的突出端，优选为2个核苷酸的突出端)。在一个具体的实施方案中，突出的核苷酸为3′突出端。在另一个具体的实施方案中，突出的核苷酸为5′突出端。任何类型的核苷酸可以成为突出端的一部分。在一个实施方案中，突出的一个或多个核苷酸是核糖核酸。在另一个实施方案中，突出的一个或多个核苷酸是脱氧核糖核酸。在优选的实施方案中，突出的一个或多个核苷酸是胸腺嘧啶核苷酸。在另一个实施方案中，突出的一个或多个核苷酸是修饰的或非经典型核苷酸。这些突出的一个或多个核苷酸可能含有非经典型核苷酸间键(例如，除磷酸二酯键以外的其它键)。

[0047] siNA双链体的合成

[0048] siNA能够通过本领域内已知的任何方法合成。RNAs优选地利用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪化学合成。另外，siRNA可以通过商业的RNA寡聚物合成供应商处获得，所述供应商包括但不限于Proligo(汉堡，德国)，Dharmacon Research(拉斐特，CO，美国)，GlenResearch(斯特林，VA，美国)，ChemGenes(阿什兰，MA，美国)，和Cruachem(格拉斯哥，英国)，Qiagen(德国)Ambion(美国)以及Invitrogen(苏格兰)。备选地，本发明的siNA分子能够通过用含有在启动子的控制下的反式互补siNA序列的载体对细胞转染来在细胞中进行表达。一旦被表达，siNA可以通过本领域中公知的技术从细胞中分离出来。

[0049] 当用单链RNA分子进行操作时，退火步骤是必要的。为了使所述RNA退火，将浓度为50μM的各种RNA寡聚物溶液各30μl混合于100mM的乙酸钾，30mM pH值为7.4的HEPES-KOH和2mM的乙酸镁中。然后，将此溶液在90℃培育1分钟，离心15秒，之后再在37℃温育1小时。

[0050] 在siRNA是短发夹RNA(shRNA)的实施方案中，siRNA分子的两条链可以由接头区域所连接(例如，核苷酸接头或非核苷酸接头)。

[0051] siNA的化学修饰

[0052] 本发明的siNA可能包含一个或多个被修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯键。在本领域中所公知的化学修饰具有提高siNA的稳定性、可用性和/或细胞获取的能力。技术人员应该意识到可能掺入RNA分子中的其它类型的化学修饰(关于这些修饰类型的综述参见国际公布WO03/070744和WO2005/045037)。

[0053] 在一个实施方案中，修饰能够被用于提供提高的抗降解能力或提高的吸收能力。这种修饰的实例包括核苷酸间的硫代磷酸酯键、2′-O-甲基核糖核苷酸(特别是在双链siRNA的有义链上)、2′-脱氧-氟基核糖核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、“通用碱基(universal base)”核苷酸、5-C-甲基核苷酸和反向脱氧脱碱基残基结合(通常见于GB2406568)。

[0054] 在另一个实施方案中，修饰可以用来增强siRNA的稳定性或提高靶向效率。修饰包括siRNA的两条互补链间的化学交联连接，siRNA一条链3′或5′末端的化学修饰，糖修饰，核碱修饰和/或骨架修饰，2′-氟基修饰的核糖核苷酸和2′-脱氧核糖核苷酸(通常见于国际公布WO2004/029212)。

[0055] 在另一个实施方案中，修饰可以用来增强或降低对目标mRNA中和/或互补siNA链中的互补核苷酸的亲和力(通常见于国际公布WO2005/044976)。例如，未修饰的嘧啶核苷酸可以被2-硫代，5-炔基，5-甲基，或5-丙炔基嘧啶取代。另外，未修饰的嘌呤能够被7-deza，7-烷基，或7-链烯基嘌呤所取代。

[0056] 在另一个实施方案中，当siNA是双链siRNA时，3′-末端核苷酸突出的核苷酸被脱氧核糖核苷酸所替代(通常见于Elbashir等，2001)。

[0057] 在一个实施方案中，本发明特征在于描述一种双链短干扰核酸(siNA)分子，该分子下调目标基因的表达，优选是在CNS中表达的基因的表达，更优选的是MAPT基因的表达，其中所述siNA分子是由两个独立的寡核苷酸片段组装的，其中一个片段包括有义区，第二个片段包括该siNA分子的反义区。在另一个实施方案中，该siNA分子的约19个核苷酸的每个片段与该siNA分子的另一片段的互补核苷酸碱基配对，并且其中该siNA分子的每个片段的至少两个3’末端核苷酸不与该siNA分子的另一片段的核苷酸碱基配对(即，该siNA分子在每条链上包括至少2个核苷酸的突出端)。在一个实施方案中，该siNA分子每条片段的2个3’端核苷酸中的每一个是2’-脱氧-嘧啶核苷酸，诸如2’-脱氧-胸腺嘧啶。在另一个实施方案中，该siNA分子的每条片段的所有21个核苷酸与该siNA分子的另一片段的互补核苷酸碱基配对。在另一个实施方案中，反义区的约19个核苷酸与由目标基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分序列碱基配对。在另一个实施方案中，反义区的约21个核苷酸与由目标基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分序列碱基配对。在上述实施方案中的任一个中，包括所述反义区的片段的5’末端可以任选地包括磷酸基团。

[0058] 在一个实施方案中，本发明特征在于描述siNA分子，其中有义或反义链的任一个或二者在所述有义或反义链中的任一个或二者的3’-端、5’-端或3’-端和5’-端二者包括一个或多个，例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或多个，优选地1-5个核苷酸间硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或多个)，优选地约1-5个，2’-脱氧，2’-O-甲基，2’-脱氧-2’-氟，和/或约一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，
8，9，10或多个)，优选地1-5个，通用碱基修饰的核苷酸，和任选地末端帽分子。在另一个实施方案中，所述有义和/或反义siNA链的一个或多个，例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或多个，优选地1-5个嘧啶核苷酸用2’-脱氧，2’-O-甲基和/或2’-脱氧-2’-氟核苷酸进行化学修饰，任选地用一个或多个，例如约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或多个，优选地1-5个核苷酸间硫代磷酸酯键和/或在3’-端、5’-端或3’-端和5’-端两端的末端帽分子进行化学修饰，其存在于相同的或不同的链中。

[0059] 在一个实施方案中，本发明特征描述一种化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其在所述siNA分子的每条链中具有约1-约5个或更多(特别地约1，2，3，4，5或更多个)核苷酸间硫代磷酸酯键。

[0060] 在另一个实施方案中，本发明特征描述包括2’-5’核苷酸间连接的siNA分子。所述2’-5’核苷酸间连接可以在一条或两条siNA序列链的3’-端、5’-端或3’-和5’-端两端。另外，所述2’-5’核苷酸间连接可以存在于一条或两条siNA序列链内的许多其它的位置，例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或多个包括在所述siNA分子的一条或两条链中嘧啶核苷酸的每个核苷酸间连接可以包括2’-5’核苷酸间连接，或约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或多个包括在所述siNA分子的一条或两条链中嘌呤核苷酸的每个核苷酸间连接可以包括2’-5’核苷酸间连接。

[0061] 在一个实施方案中，例如，在siNA分子的5’-端、3’-端、5’和3’-端两端，或它们的任意组合处，本发明的siNA分子包括一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或多个)锁定核酸(LNA)核苷酸。

[0062] 在另一个实施方案中，例如，在siNA分子的5’-端、3’-端、5’和3’-端两端，或它们的任意组合处，本发明的siNA分子包括一个或多个(例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或多个)无环核苷酸。

[0063] 在一个实施方案中，本发明特征描述本发明的一种化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中在有义或反义区中任一个或二者中都存在的任何(例如，一个或多个或全部)嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸，并且其中在有义或反义区中任一个或二者中都存在的任何(例如，一个或多个或全部)嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸。任选地，组成存在于所述有义或反义区的3’-末端核苷酸突出端的任何核苷酸是2’-脱氧核苷酸。

[0064] 在一个实施方案中，本发明特征描述本发明的一种化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子，其中在有义或反义区中任一个或二者中都存在的任何(例如，一个或多个或全部)嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸，并且其中在有义或反义区中任一个或二者中都存在的任何(例如，一个或多个或全部)嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸。任选地，组成存在于所述有义或反义区的3’-末端核苷酸突出端的任何核苷酸是2’-脱氧核苷酸。

[0065] 在一个实施方案中，本发明特征描述一种化学合成的双链RNA分子，其通过RNA干扰引导目标RNA，优选在CNS中表达的RNA，更优选MAPT RNA的裂解，其中所述RNA分子的每条链长度约21-约23个核苷酸；所述RNA分子的一条链包括与所述目标RNA具有充分的互补性的核苷酸序列，以使所述RNA分子通过RNA干扰引导所述目标RNA的裂解；并且其中所述RNA分子的至少一条链包括一个或多个本文所述的化学修饰的核苷酸，诸如脱氧核苷酸，2’-O-甲基核苷酸，2’-脱氧-2’-氟核苷酸，2’-O-甲氧基乙基核苷酸等。

[0066] 在一个实施方案中，本发明特征描述一种包括本发明的siNA分子的药物。

[0067] 在一个实施方案中，本发明特征描述一种包括本发明的siNA分子的活性成分。

[0068] 在一个实施方案中，本发明特征描述双链短干扰核酸(siNA)分子下调目标基因，优选在CNS中表达的基因，更优选MAPT基因的表达的应用，其中所述siNA分子包括一个或多个化学修饰，并且所述双链siNA的每条链长约18-约28个或更多(例如，约18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，或28个或更多)核苷酸。

[0069] 在一个实施方案中，本发明特征描述一种双链短干扰核酸(siNA)分子，其抑制目标基因，优选在CNS中表达的基因，更优选MAPT基因的表达，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，其包括与目标RNA或其片段的核苷酸序列互补的核苷酸序列，另一条链是有义链，其包括与所述反义链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且其中在所述双链siNA分子中存在的大部分嘧啶核苷酸包括糖修饰。优选地，所述目标RNA或其片段编码蛋白或其片段。任选地，所述反义链的5’端包括磷酸基团。所述反义链的核苷酸序列或其片段可以与所述目标RNA的不翻译区或其片段的核苷酸序列互补。

[0070] 在一个实施方案中，所述siNA分子的每条链包括约18-约29个或更多(例如，约18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，或29个或更多)核苷酸，其中每条链包括至少约18个与另一条链的核苷酸互补的核苷酸。在一个实施方案中，所述siNA分子由两条寡核苷酸片段组装而成，其中一条片段包括所述siNA分子的反义链的核苷酸序列，并且第二条片段包括所述siNA分子的有义区的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述有义链与所述反义链通过接头分子连接，所述接头分子诸如多核苷酸接头或非核苷酸接头。在另一个实施方案中，存在于有义链中的嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’氟嘧啶核苷酸，并且存在于有义区中的嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，存在于有义链的嘧啶核苷酸是
2’-脱氧-2’氟嘧啶核苷酸，并且存在于有义区的嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸。
在另一个实施方案中，存在于反义链中的嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸，并且存在于反义链中的任何嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，所述反义链包括一个或多个2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸和一个或多个2’-O-甲基嘌呤核苷酸。
在另一个实施方案中，存在于反义链中的嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸，并且存在于反义链中的任何嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，有义链包括3’-末端和5’-末端，其中末端帽部分(例如，反向脱盐脱碱部分或反向脱氧核苷酸部分诸如反向胸腺嘧啶核苷)存在于有义链的5’-末端、3’-末端、或5’和3’-末端两端。
在另一个实施方案中，反义链在反义链的3’-末端包括核苷酸间硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，反义链在3’末端包括甘油基修饰。在另一个实施方案中，反义链的5’-末端任选地包括磷酸基团。

[0071] 在任一个上述双链短干扰核酸(siNA)分子的实施方案中，所述双链短干扰核酸(siNA)分子抑制目标基因，优选在CNS中表达的基因，更优选MAPT基因的表达，其中存在于所述双链siNA分子中的大部分嘧啶核苷酸包括糖修饰，所述siNA分子的两条链中的任一条可以包括约21个核苷酸。在一个实施方案中，所述siNA分子的每一条链的约21个核苷酸与所述siNA分子的另一条链的互补核苷酸碱基配对。在另一个实施方案中，所述siNA分子的每一条链的约19个核苷酸与所述siNA分子的另一条链的互补核苷酸碱基配对，其中所述siNA分子的每一条链的至少两个3’末端核苷酸不与所述siNA分子的另一条链的核苷酸碱基配对。在另一个实施方案中，所述siNA分子的每条片段的两个3’末端核苷酸中的任一个是2’-脱氧-嘧啶，诸如2’-脱氧-胸腺嘧啶核苷。在一个实施方案中，所述siNA分子的每条链与所述siNA分子的另一条链的互补核苷酸碱基配对。在一个实施方案中，反义链的约19个核苷酸与目标RNA或其片段的核苷酸序列碱基配对。在一个实施方案中，反义链的约21个核苷酸与目标RNA或其片段的核苷酸序列碱基配对。

[0072] 在一个实施方案中，本发明特征描述一种在药用载体或稀释剂中包括本发明的siNA分子的组合物。

[0073] 在非限制性实例中，将化学修饰的核苷酸引入到核酸分子中提供了一种有力的工具，其克服外源递送的天然RNA分子固有的体内稳定性和生物利用度的潜在的局限。例如，由于化学修饰的核酸分子倾向于在血清中具有更长的半衰期，所以，化学修饰的核酸分子的应用可以使得更低剂量的特定的核酸分子用于给定的治疗效果。此外，某些化学修饰可以通过靶向特别的细胞或组织而提高核酸分子的生物利用度，和/或提高核酸分子的细胞摄入。因此，即使与天然核酸分子相比较，例如，当与全RNA核酸分子比较时，化学修饰的核酸分子的活性降低时，由于所述分子的提高的稳定性和/或递送，所修饰的核酸分子的整体活性可以大于天然分子的活性。不同于天然的未修饰的siNA，化学修饰的siNA还可以将在人类中激活干扰素活性的可能性减小到最小。

[0074] 在本文所述的任一个siNA分子的实施方案中，本发明的siNA分子的反义区在所述反义区的3’-末端可以包括核苷酸间硫代磷酸酯键。在本文所述的siNA分子的任一个实施方案中，所述反义区在所述反义区的5’-末端可以包括约1-约5个核苷酸间硫代磷酸酯键。在本文所述的siNA分子的任一个实施方案中，本发明的siNA分子的3’-末端核苷酸突出端可以包括在核酸糖、碱基或骨架上进行化学修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在本文所述的siNA分子的任一个实施方案中，3’-末端核苷酸突出端可以包括一个或多个通用碱基核糖核苷酸。在本文所述的siNA分子的任一个实施方案中，3’-末端核苷酸突出端可以包括一个或多个无环核苷酸。

[0075] 在其它实施方案中，siNA分子具有平端末端。

[0076] 在一个实施方案中，本发明包括siNA分子，其是40个核苷酸或更少，并且包括图8的SEQ ID NOS：1-160中任一项的核苷酸序列。在一个具体的实施方案中，所述siNA是
21-30个核苷酸长，并且包括图8的SEQ IDNOS：161-318中的任一项。

[0077] 在一个实施方案中，本发明特征描述在受试者或生物体内调节目标基因，优选在CNS中表达的基因，更优选MAPT基因的表达的方法，所述方法包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中一条siNA链包括与所述目标基因的RNA互补的序列；和(b)在适于调节受试者或生物体中的目标基因的表达的条件下，将所述siNA分子引入到受试者或生物体中。目标蛋白或RNA的水平可以利用本领域公知的许多方法确定。

[0078] 在另一个实施方案中，本发明特征描述在受试者或生物体中调节多于一种目标基因，优选在CNS中表达的基因，更优选包括至少一个MAPT基因的表达的方法，所述方法包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中一条siNA链包括与所述目标基因的RNA互补的序列；和(b)在适于调节受试者或生物体中的目标基因的表达的条件下，将所述siNA分子引入到受试者或生物体中。目标蛋白或RNA的水平可以如本领域公知那样确定。

[0079] 在一个实施方案中，本发明特征描述在细胞内调节目标基因、优选在CNS中表达的基因，更优选MAPT基因的表达的方法，所述方法包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA包括具有与所述目标基因的RNA的互补性的单链序列；和(b)在适于调节细胞内的目标基因的表达的条件下，将所述siNA分子引入到细胞中。

[0080] 在另一个实施方案中，本发明特征描述在细胞内调节多于一种目标基因、优选在CNS中表达的基因，更优选包括至少一个MAPT基因的表达的方法，所述方法包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA包括具有与所述目标基因的RNA的互补性的单链序列；和(b)在适于调节细胞内的目标基因的表达的条件下，用所述siNA分子在体外或体内接触所述细胞。

[0081] siRNA双链体的体外检测

[0082] 为了检测siRNA干扰作用的特异性，在表达目标基因的细胞培养物中进行了初步检测。

[0083] 基本地，将细胞与相对应的siRNA双链体温育，然后分析基因表达水平。为了将siRNA击倒与培养的细胞中的具体表型联系起来，需要证明目标蛋白的减少，或者至少证明目标mRNA的减少。目标基因的mRNA水平可以通过实时PCR(RT-PCR)来定量。此外，蛋白质水平可以利用本领域中公知的多种方法来确定，例如用针对不同靶的特异性抗体的蛋白质印迹分析法允许了对目标蛋白质的减少的直接监测。

[0084] 通过本领域中公知的任意转染技术将siRNA引入细胞中。例如利用阳离子脂质，如脂转染胺2000试剂(Invitrogen)，可以实施单一的siRNA双链体转染，随后在转染后24，48和72小时再进行沉默效率的测定。

[0085] 转染的效率可能依赖于细胞类型，但也可能依赖于传代次数和细胞的汇合。形成siRNA-脂质体复合物的时间和方式(例如倒置混合法对比旋涡混合法)也是至关重要的。低转染效率是沉默失败最为常见的原因。良好的转染不是微不足道的问题，并且对每一个新的待用的细胞品系需要进行仔细地检查。转染效率可以利用转染报道基因，例如CMV-驱动的EGFP表达质粒(例如来自Clontech)或B-Gal表达质粒，来测定，并在次日通过相差和/或荧光显微镜方法来估算。

[0086] 依赖于目标蛋白质的丰度和寿命(或周转更新)，在1-3天后或更晚时，击倒表型可能会变得明显起来。在没有观察到表型的情形中，可以通过免疫荧光检验法或蛋白质印迹法观察到蛋白质的消耗。

[0087] 药物制剂和给药途径

[0088] 本发明可以包括一个或多个种类的siNA分子的同时施用。这些种类可以被挑选出来去靶向一个或多个目标基因。

[0089] 在一个实施方案中，在本发明所述的治疗方法中施用了单一类型的siNA。在另一个实施方案中，本发明中的一种siNA与本发明中的另一种siNA，和/或一种或多种对CNS疾病病症具有治疗、预防或控制作用的非siNA治疗剂联合施用。短语“与……联合”并不限于多种治疗剂在精确的同一时刻施用，而是指本发明的siNAs和其他的试剂按照某种顺序并在一定的时间间隔内施用于患者，以使联合的益处高于用其他方法施用这些试剂的益处。例如，每种治疗剂可以同时或者按照任意的顺序在不同的时间点进行顺序施用；然而，如果不同时施用，它们的施用应该在时间上充分的接近，以提供理想的治疗效果。每种治疗剂都能够以任意的适当形式和合适的途径单独施用。

[0090] 本发明的siNA可以通过任何本领域已知的常规技术配制为药物组合物(参见例如，Alfonso，G.等，1995，在：药物科学和实践(The Science andPractice ofPharmacy)，Mack出版社，Easton PA，第19版)。在本发明所述方法中所用的含有一种或多种siNA的制剂可以具有多种形式，并可能依赖于对每名患者特异性的许多因素(例如，患者的疾病类型和严重性、施用的siNA的类型、年龄、体重、反应和过去的病史)，制剂中siNA的数量和类型，组合物的形式(例如，液态、半液态或固态形式)，和/或治疗方案(例如，治疗剂是随着时间缓慢输注给药；单一推注，一天一次，一天多次或几天一次给药)。

[0091] 本发明的siNA分子以及其制剂或组合物可以如本领域所公知那样直接或局部的施用。例如，siNA分子可以包括递送赋形剂，包括脂质体，用于施用于受试者。载体和稀释剂以及它们的盐可以存在于药用制剂中。核酸分子能够通过为本领域技术人员所知的许多方法施用到细胞中，这些方法包括，但不限于，脂质体的包封作用，离子电渗疗法或与其他赋形剂的结合，如与可生物降解的聚合物、水凝胶、环糊精聚(乳酸-共-乙醇酸共聚物)(PLGA)和PLCA微球体、可生物降解的纳米胶囊、以及生物粘合微球体的结合，或者通过蛋白载体进行。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子也能够与聚乙烯亚胺及其衍生物配制或复合，如与聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物配制或复合。

[0092] 本发明的siNA分子可以与膜破坏剂和/或阳离子脂质或辅助脂质分子复合。

[0093] 可以在本发明中使用的递送系统包括，例如，水性和非水性凝胶，乳膏，多种乳状液，微乳，脂质体，油膏，水性和非水性的溶液，洗液，气溶胶，碳氢化合物基质及粉末，而且还包括赋形剂，如增溶剂、渗透增强剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，和亲水性聚合物(例如，聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方案中，药用的载体是脂质体或透皮增强剂。

[0094] 本发明的药物制剂的形式是适合施用的，例如，系统或局部的施用，进入细胞或受试者，包括如人中。适合的形式部分地依赖于用途或进入的途径，例如口服、透皮或注射。本领域已知的其他因素还包括一些需要考虑的事项，如毒性以及阻止所述组合物或制剂发挥作用的形式。

[0095] 本发明还包括为储存或施用制备的组合物，该组合物在药用载体或稀释剂中包括药物有效量的所需化合物。用于治疗应用的可接受的载体或稀释剂在制药领域已被熟知。例如，防腐剂、稳定剂、染料和调味剂都能够被提供。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。另外，还能够使用抗氧化剂和悬浮剂。

[0096] 药物有效剂量是指预防、抑制发生、或治疗(在某种程度上减轻症状，优选消除所有的症状)疾病状态所需要的剂量。药物有效剂量依赖于疾病的种类，所用的组合物，给药途径，被治疗的哺乳动物的类型，考虑的具体的哺乳动物的生理特征，协同的药物治疗，以及医学领域中的技术人员应该认识到的其他因素。

[0097] 本发明的制剂能够以包含常规无毒性药用载体、佐剂和/或赋形剂的剂型制剂进行给药。用于口服的制剂还可以作为硬明胶胶囊存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，所述惰性固体稀释剂例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土；或者作为软明胶胶囊存在，其中活性成分与水或油介质混合，所述油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油。

[0098] 水性混悬液含有在混合物中的活性材料和适合于制备水性混悬液的赋形剂。这种赋形剂为悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯树胶；分散或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如磷脂酰胆碱，或烯化氧和脂肪酸的缩合产物，如聚氧乙烯硬脂酸酯，或者为氧化乙烯与长链脂族醇的缩合产物，如十七碳乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或者为氧化乙烯与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯类的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或者为氧化乙烯与源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯类的缩合产物，例如聚乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，以及一种或多种甜味剂，诸如蔗糖或糖精。

[0099] 油性混悬液可以通过将活性成分悬浮在以花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油为例的植物油中来配制，或者悬浮于矿物油中，如液体石蜡中来配制。油性混悬液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或十六烷醇。这些组合物可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸而进行保存。

[0100] 适用于通过添加水而制备水性混悬液的可分散性粉末和颗粒提供与分散剂或润湿剂，混悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。适合的分散剂或润湿剂或混悬剂已于上文中举例说明了。还可以存在其它的赋形剂，如甜味剂、调味剂和着色剂。

[0101] 本发明的药物组合物也能呈现为水包油型乳状液的形式。其中油相可为植物油或矿物油或它们的混合物。适合的乳化剂可为天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄芪胶，天然存在的磷脂，例如大豆、磷脂酰胆碱，以及源自脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯，例如去水山梨糖醇单油酸酯，以及上述偏酯和氧化乙烯的缩合产物，例如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。所述乳状液也能含有甜味剂和调味剂。

[0102] 这种混悬液可以根据已知技术利用上述提及的那些适合的分散剂或润湿剂以及混悬剂来制备。

[0103] 无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外(parentally)可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。在这些被使用的可接受的赋形剂和溶剂中包括水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发的油通常用作溶剂或悬浮介质。为达到这个目的，可以使用任何无刺激性的不挥发的油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸，如油酸，也用在可注射的制剂中。

[0104] 本发明的核酸分子还可以与其它治疗化合物组合施用到受试者中，以增加整体治疗效果。使用多种化合物治疗适应症可以提高有益效果同时减少副作用的存在。

[0105] 备选地，本发明的某些siNA分子能在细胞内从真核启动子表达。具有表达siNA分子能力的重组载体能够被递送并持久存在于靶细胞中。备选地，可以使用提供核酸分子的瞬间表达的载体。这样的载体能够根据需要重复施用。siNA分子一经表达就会与目标mRNA相互作用并产生RNAi反应。表达siNA分子的载体的递送可以是系统性的，例如，通过静脉内或肌内给药，通过对从受试者移植出来的靶细胞给药、接着再引入该受试者中，或者通过任何其它允许导入需要的靶细胞的方法。

[0106] siNA的鼻内施用

[0107] 在GFP C57BL/6-TG(ACTB-EGFP)小鼠中进行鼻内siNA递送研究。这种转基因小鼠种系购自“杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)”。由于对于这种转基因纯合的小鼠在出生后的前两周内死亡，所以使用转基因小鼠。在鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子的控制下具有“增强的”GFP(EGFP)cDNA的转基因小鼠种系使得所有的组织，除了红细胞和毛发之外，在激发光下呈现绿色。这种应变(strain)在C57BL/6小鼠中产生。编码增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的应变cDNA与鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子结合。在这种构建体中还包括牛珠蛋白聚腺苷酸信号。在PCR引物中包含的EcoRI位点用来将所扩增的EGFP cDNA引入到含有鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子、β-肌动蛋白内含子和牛珠蛋白聚腺苷酸信号的pCAGGS表达载体中。将具有所述启动子和编码序列的完整的插入物用Bam-HI和SalI剪切，并且进行凝胶纯化。

[0108] 用于下调EGFP mRNA表达的siRNA靶向EGEP mRNA(SEQ ID 319)中的下述序列：5’-GGC UAC GUC CAG GAG CGC ACC-3’。所述siRNA双链体的有义链是5’-P GGC UAC GUC CAG CGC ACC-3’，并且反义链是5’-P U GCG CUC CUG GAC GUA GCC UU-3’(SEQ ID 320)。
用于下述实验中的siRNA双链体具有2个胸腺嘧啶核苷酸的3’突出端。

[0109] 实验流程

[0110] 对于鼻内递送实验，使用C57BL/6-TG(ACTB-EGFP)雄性小鼠(8周龄)。将鼻内滴注稀释在0.9％ NaCl中的siRNA的小鼠与滴注赋形剂(0.9％NaCl)的对照小鼠进行比较。将动物用异氟烷麻醉，并且将20μl的每种溶液滴入每个鼻孔中。

[0111] 以20μl的终体积鼻内施用不同剂量的siRNA相对EGFP mRNA(-/+转染脂质)。对照动物用单独的赋形剂处理。在所有的情形中，将动物在施用药物后一定范围的天数里处死，以找到干扰的最佳时间。

[0112] 对于组织分析，将小鼠用CO2处死，并且迅速将脑切下放到冰冷的盘子上。一半处理用于蛋白质印迹，而另一半处理用于免疫组织化学。

[0113] 从不同脑区域收集样品组织，并且通过蛋白质印迹和实时PCR进行分析。在Adobe Photoshop程序的辅助下，测量不同处理条件下的GFP表达。在关于β-肌动蛋白基因标准化后获得抑制水平，所述β-肌动蛋白基因在不同组织中组成型地表达。

[0114] 实验条件如在表1中所述分布(条件以一式两份或一式三份分析)。用一剂量的530μg(40纳摩尔)的关于GFP的裸siRNA鼻内处理的小鼠命名为小鼠1，2和3，并且在接种siRNA后3和5天处死。由用两剂量的265μg(20纳摩尔)的稳定的siRNA处理的动物组成的另一个实验组(编号为4，5，6，7，8和9)在3、5和8天处死(表1)。

[0115] 通过两种方法收集样品组织：一种在蛋白缓冲裂解介质中，另一种在RNAlater(Ambion)中。后来，将小块组织包含在OCT中，以分析所述组织中的GFP蛋白的免疫荧光信号。在数据处理之前将所有样品保存在-80℃。

[0116]小鼠编号 鼻内治疗性处理
CI，CII，CIII 赋形剂对照剂量
1，2，3 单一剂量的530μg siRNA
4，5 单一剂量的265μg siRNA，在3天处死
6，7 单一剂量的265μg siRNA，在5天处死
8，9 单一剂量的265μg siRNA，在8天处死

[0117] 表1：鼻内siRNA递送的实验条件的示意性分布。siRNA的剂量显示在表格中。

[0118] 通过将脑区域在冰冷的提取缓冲液中匀浆而制备用于蛋白质印迹分析的提取物，所述提取缓冲液由pH 7.4的20mM HEPES，100mM NaCl，20mM NaF，1％ Triton X-100，1mM原钒酸钠，5mM EDTA，1μM冈田酸和蛋白酶抑制剂(2mM PMS F，10μg/ml牛胰蛋白酶抑制剂，10μg/ml亮抑酶肽，和10μg/ml抑胃酶肽)组成。将样品匀浆，并且在4℃以15,000X g离心20分钟。通过Bradford确定上清中含有的蛋白。通过10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离30微克的总蛋白，并且转移到硝基纤维素膜上。用于检测转基因的一抗是EGFP抗体(1/1000)(西格玛(Sigma))和抗β-肌动蛋白(1/2500)(西格玛(Sigma))。
在4℃，将所述膜在5％无脂干牛奶中与抗体温育过夜。二级山羊抗-小鼠抗体(1/1000；
Invitrogen，圣地亚哥，CA)和ECL检测试剂(安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences)，Arlington Heights，IL)用于免疫检测。通过密度计量学定量蛋白水平，并且GFP值关于肌动蛋白进行标准化，以校正在负载蛋白量中的任何偏差。

[0119] 将用于免疫组织化学的脑固定在在Sorensen’s缓冲液中的4％低聚甲醛中并且在30％的蔗糖溶液中冷冻保护。将脑在冷冻切片机(Leica，Nussloch，德国)上切成30微米的矢形切片并收集在由30％乙二醇、26％甘油和pH7.2的磷酸缓冲液组成的冷冻保护溶液中。然后，通过荧光显微镜分析脑切片。

[0120] 将分离在RNAlater中的组织保存在-80℃。由于其密度，在RNA提取之前去除RNAlater。用三唑试剂(Invitrogen)按照供应商的流程分离RNA。在通过定量PCR测量GFP表达之前进行DNA酶处理。

[0121] 进行siRNA应用，以确定到脑部的siRNA递送是否发生。由于目的是确定GFP基因转录体的下调，在siRNA应用后测量荧光水平。在实验流程过程中在动物中没有观察到次级作用。

[0122] 结果

[0123] 中枢神经系统体内递送模型

[0124] 实施例1

[0125] 进行siRNA应用，以确定在中枢神经系统(CNS)中的正确的鼻内siRNA递送。将用20μl NaCl(0.9％)(对照)，或用20μl浓度在1nmol/μl(小鼠1)、2nmol/μl(小鼠2)、或2nmol/μl的siRNA+转染脂质TransIT-TKO(小鼠3)处理的小鼠在处理后48小时处死。在实验流程过程中在动物中没有观察到次级作用。

[0126] 提取不同CNS区域(皮层、海马、纹状体或球体)以及不同组织(气管、肺、鼻上皮、食道)的样品，并且进一步通过用特异性识别GFP的抗体进行的蛋白质印迹和上述免疫荧光分析。作为负载对照，使用针对β-肌动蛋白的抗体。

[0127] 在关于β-肌动蛋白标准化后，将不同CNS区域中GFP-表达抑制水平的结果显示在图1中。可以看出，最高的抑制作用是使用2nmol/μl的剂量不用转染脂质获得的。此外，在CNS的许多组织中观察到抑制，包括皮层、海马、纹状体和球体。这一结果还通过实时PCR证实。

[0128] 实施例2

[0129] 在GFP小鼠模型中使用不同浓度和时间的鼻内siRNA施用。将用20μlNaCl(0.9％)(对照)，或用20μl浓度在40nmol或20nmol的siRNA处理的小鼠在处理后
3、5和8天处死。在实验流程过程中在动物中没有观察到次级作用。

[0130] 提取不同CNS区域(皮层、海马、纹状体、小脑、脑干或球体)的样品，并且通过用特异性识别GFP的抗体进行蛋白质印迹和免疫荧光的方式进一步分析。作为负载对照，使用针对β-肌动蛋白的抗体。

[0131] 在关于β-肌动蛋白标准化后，将不同CNS区域中GFP-表达抑制水平的结果显示在图2中。可以看出，抑制作用取决于脑区域。在皮层、海马、纹状体和球体中观察到最大的GFP沉默。蛋白质印迹实验的结果通过定量PCR证实(图3)。在图3中，分析皮层和纹状体中GFP mRNA水平的下调，并且在小鼠条件8和9中观察到这些水平的清楚的减少。

[0132] 实施例3.体外MAPT siRNA双链体的检测。

[0133] 为了检验所述siRNAs的特异性，在表达MAPT的细胞培养物中分析MAPT(微管相关蛋白tau)干扰。用于这些实验的细胞是人MDA-MB-435细胞。在与相对应的siRNA双链体温育后分析MAPT mRNA的水平。为了将siRNA击倒与所培养的细胞中的具体表型联系起来，需要证明靶蛋白的减少或者至少证明靶mRNA的减少。

[0134] 在细胞培养物中转染siRNA双链体

[0135] 用于siRNA转染的技术的一些实例是本领域公知的。siRNA双链体的转染由siRNA双链体的单一转染组成，转染使用阳离子脂质，诸如脂转染胺2000试剂(Invitrogen)，并且在转染后24、28和72小时关于沉默作用进行读数。

[0136] 典型的转染流程可以操作如下：在6孔平板的一个孔中，我们对人MDA-MB-435细胞使用最终浓度为100nM的siRNA来进行转染。按照脂转染胺2000试剂流程，在转染的前一天，我们在每个孔3ml适宜的含有DMEM、10％血清、抗生素和谷氨酰胺的生长培养基中5
接种2-4x10 个细胞，并在标准的生长条件(37℃和5％的CO2)下进行细胞培养。在转染的当天，细胞必须达到30-50％汇合。我们在250μl的DMEM中稀释12.5μl浓度为20μM的siRNA双链体(对应于最终浓度为100nM)或25μl浓度为20μM的siRNA双链体(对应于最终浓度为200nM)，并混合。此外，将6μl的脂转染胺2000也稀释于250μl的DMEM中，并混合。经过在室温下培养5分钟后，在20分钟的室温培养过程中，使稀释后的低聚物(siRNA双链体)和稀释后的脂转染胺结合以形成复合体。然后，我们将该复合体逐滴滴加到在2ml新鲜的低抗生素含量的生长培养基中的细胞上，并通过前后摇动平板轻轻地使之混合，以确保转染复合物的均匀分布。我们在它们的标准生长条件下培养细胞，在转染的后一天，去除这些复合物并添加新鲜和完全的生长培养基。为了监测基因沉默，在转染后24，
48和72小时收集细胞。

[0137] 转染的效率可能依赖于细胞类型，但也可能依赖于传代次数和细胞的汇合。形成siRNA-脂质体复合物的时间和方式(例如倒置混合法相对旋涡混合法)也至关重要。低转染效率是沉默失败最为常见的原因。良好的转染不是微不足道的问题，并且需要对每一个新的待用的细胞品系进行仔细地检查。转染效率可以利用转染报道基因，例如CMV-驱动的EGFP表达质粒(例如来自Clontech)或B-Gal表达质粒，来测定，并在次日通过相差和/或荧光显微镜方法来估算。

[0138] 依赖于目标蛋白质的丰度和寿命(或周转更新)，在1-3天后或更晚时，击倒表型可能会变得明显起来。在没有观察到表型的情形中，可以通过免疫荧光检验法或蛋白质印迹法观察到蛋白质的消耗。

[0139] 转染后，将从细胞中提取的总RNA片段用脱氧核糖核酸酶I预处理，并用于通过随机引物进行反转录。利用覆盖至少一个外显子-外显子连接区的特异性引物对进行PCR扩增，以用作扩增前mRNA的对照。也需要非靶mRNA的RT/PCR作为对照。mRNA有效的缺失而无法觉察的目标蛋白质的减少可以显示出在细胞中可能存在大储量的稳定的蛋白质。或者，可以利用实时PCR扩增以更精确的方式测定mRNA的减少或消失。定量PCR监测在每个PCR循环中在反应过程中发射的、作为扩增子生成的指示剂的荧光。这一信号与在反应中PCR产物的量成正比例增加。通过记录每个循环中荧光发射的量，有可能在指数生长期中监控PCR反应，在指数生长期中PCR产物的量的第一次显著增加与目标模板的初始量相关。

[0140] 为了校验差异表达的MAPT基因在细胞培养物中的干扰模式，按照供应商的流程(应用生物系统(Applied Biosystems))实施了qRT-PCR。对应用生物系统7300建立反应条件，并且实现一步RT-PCR反应。25μl的反应体积由2XSyBr green、MultiscribeTM反转录酶6.25U、RNA酶抑制剂和50nM的正向和反向引物混合100ng的模板RNA组成。设计针对MAPT的特异性引物，并且将18S作为管家基因进行分析。所述正向引物具有序列：AAGAGCCGCCTGCAGACA(SEQ ID NO 321)，而所述反向引物具有序列：
GAGCCGATCTTGGACTTGACA.(SEQ ID NO 322)。

[0141] 反转录以在48℃30秒的起始步骤实行。热循环参数为：95℃持续10分钟，40个循环的在95℃持续15秒和60℃持续1分钟。还分析解离曲线来检验扩增特异性。将每个样品的阈值循环(Ct)值与对照24小时样品比较，以确定在siRNA转染后每种基因下调的百分数。

[0142] 为了评估扩增的PCR产物的特异性，进行熔融曲线分析。获得的熔融曲线允许在引物-二聚体和特异性PCR产物之间的区分。

[0143] MAPT siRNAs的体外测定。

[0144] 为了确定使用RNAi技术对MAPT靶的抑制，第一步是在MDA-MB-435细胞培养物中进行实验。这些测定以两部分进行。首先，转染在图7中所述的针对MAPT突变设计的siRNAs。然后，设计针对MAPT野生型的siRNAs，并且分析转染后MAPT的下调。图4显示关于先前在图7中所述的MAPT突变的定量PCR实验的代表性结果。图8显示针对其设计siNA的MAPT中的目标序列(SEQ ID NO 1-160)。siNA双链体给作SEQ ID NO 161-318。

[0145] 分析了针对突变MAPT P301L(给作Seq ID 159的目标区域)和MAPTR406W(给作Seq 1D 160的目标区域)设计以下调MAPT mRNA水平的siRNAs。图4显示的值表示在与对照细胞标准化后对基因表达的siRNA干扰的百分数的平均值以及它们的标准误差。与对照细胞相比较，在siRNASeq ID 159处理(对MAPT P301L特异)后，在48小时MAPT转录体的水平减少20％。然而，在siRNA Seq ID 160(对MAPT R406W特异)转染后使MAPT相对对照水平的减少达到40％。

[0146] 在第二轮实验中，设计针对MAPT wt的不同的siRNAs。由于MAPT具有不同的同种型，进行序列比对，并且针对共有区域设计siRNAs。MAPT同种型的参照序列的登记号列为NM_005910，NM_016834，NM_016835和NM_016841。将针对MAPT wt的两个不同的siRNAs，其对应于Seq ID 128和Seq ID 139转染到MDA-MB-435细胞中。下图5显示定量PCR分析的代表性结果。值表示在与对照细胞标准化后对每种基因表达的siRNA干扰的百分数的平均值和它们的标准偏差。与对照细胞相比较，在特异性siRNA处理后，MAPT转录体在24、48或72小时的水平显著减小。对应于Seq ID 128的siRNA，将MAPT转录体减少70％，这种减少在48小时和72小时一直持续不变。与模拟转染的细胞相比较，siRNA Seq ID 129还达到约60％的非常好的MAPT下调水平。

[0147] 实施例4.在体内检测MAPT siRNA双链体。

[0148] 为了提供在病理模型中鼻内递送的概念的证据，在适当的MAPT转基因小鼠模型中下调涉及额颞痴呆症的MAPT。

[0149] 小鼠品系描述

[0150] 对于生成MAPT转基因小鼠，将编码具有两个N端外显子的人4-重复tau同种型的质粒pSGT42(Montejo de Garcini等，1994)用作模板，以使用Quikchange(Stratagene)方法单独引入FTDP-17突变G272V和P301L。然后，通过将限制性片段SacII/AseI(含有G272V突变)和AseI/HindIII(含有P301L突变)连接到先前用SacII/HindIII切割的质粒pSGTR406W(Perez，M.，Lim，F.，Arrasate，M.，和Avila，J.(2000)FTDP-17-连锁的突变R406W消除了磷酸化的tau与微管的相互作用(The FTDP-17-linked mutationR406W abolishes the interaction of phosphorylated tau with microtubules)，神经化学杂志(J.Neurochem.)74：2583-2589)中，以形成质粒pSGTVLW，而组装三联突变tau cDNA。将突变的tau开放阅读框从pSGTVLW上切下作为BamHI/BglII片段，并且以相对于CMV启动子正向方向连接到PBKCMV(Stratagene)的BamHI位点中，以产生pBKVLW。然后，将pBKVLW的SalI/XhoI片段以相对于thy1启动子正向方向连接到pTSC21k(Luthi等，1997)的XhoI位点中。通过对SacII-HindIII区域测序证实得到的质粒pTTVLW编码3个特异性氨基酸改变G272V，P301L，和R406W。通过NotI消化消除载体序列，并且凝胶纯化大片段，然后通过前核注射将其引入到单细胞CBA3C57BL/6胚胎中。通过PCR鉴定建立者小鼠，并且与野生型C57BL/6小鼠杂交。所有分析的转基因小鼠都是杂合体。将小鼠每笼养4只，笼子具有随意可获得的食物和水，并且保持在07：00小时开始光照的12/12小时光照-黑暗循环的控温环境中。使用寡核苷酸TT1，5’-CTC TGCCCTCTGTTCTCTGG-3’(SEQ ID 323，在小鼠thy1基因的外显子2中)；TT2，5’-CCTGTCCCCCAACCCGTACG-3’(SEQ ID 324；在人taucDNA序列的末端59处)；和THY，5’-CGCTGATGGCTGGGTTCATG-3’(SEQ ID 325；在鼠thy1基因的内含子2中)，对尾DNA进行PCR筛选。我们使用TT1和TT2从转基因而不是从内源鼠DNA特异性扩增470-bp的产物，同时作为DNA的内部对照，TT1和THY用来从鼠基因组DNA而不是从转基因特异性扩增450-bp的产物。所述转基因主要在海马和额颞皮层中表达。

[0151] 实验流程

[0152] 在转基因MAPT小鼠模型中使用不同浓度和时间的鼻内siRNA施用。将小鼠用20μl的NaCl(0.9％)(对照)或用20μl浓度为20nmol的siRNA处理。

[0153] 实验条件如表2所述那样分布(条件以一式三份进行分析)。将小鼠用一或二剂量的关于MAPT的siRNA(Seq ID 160)鼻内处理，并且在接种siRNA后不同时间处死。

[0154]小鼠编号 鼻内治疗性处理
CI，CII，CIII 赋形剂对照剂量
1，2，3 单一剂量的265μg siRNA，在3天处死
4，5，6 单一剂量的265μg siRNA，在5天处死
7，8，9 单一剂量的265μg siRNA，在7天处死
10，11 两剂量的132μg siRNA，在8天处死

[0155] 表2：鼻内siRNA递送的实验条件的示意性分布。siRNA的剂量显示在表格中。

[0156] 提取不同CNS区域(皮层、海马、纹状体、小脑、脑干或球体)的样品，并且进一步通过蛋白质印迹、免疫荧光和定量PCR分析。使用特异性识别突变的人MAPT的抗体。作为负载对照，使用针对β-肌动蛋白的抗体。在Adobe Photoshop程序的辅助下，测量在不同处理条件下的MAPT表达。在关于β-肌动蛋白基因标准化后，获得抑制水平，所述β-肌动蛋白基因在不同组织中组成型表达。

[0157] 在关于β-肌动蛋白标准化后，在不同CNS区域中的MAPT表达抑制水平的结果显示在图6中。可以看出，在海马中观察到对MAPT表达的抑制作用，在海马中转基因蛋白以高水平表达。其中基因表达的下调作用是最高的动物条件与在siRNA滴注后7天处死的动物相对应。蛋白质印迹实验的结果通过定量PCR得到证实。

[0158] 参考文献

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