一种嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A及其基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种产嗜酸β-甘露聚糖酶的菌株Bispora sp.MEY-1，和从该菌种中得到的嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A，其具有如SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列，编码上述β-甘露聚糖酶的基因man5A，其具有如SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列，以及包含该基因的重组载体和应用。本发明的β-甘露聚糖酶的具有以下性质：最适pH1.0～1.5，最适温度65℃，良好的pH稳定性和热稳定性、高比活；极好的蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。作为一种新型的酶制剂，可广泛用于动物饲料、食品、医药、酿酒、能源工业等。

权利要求

1.一种嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1，其保藏号为：CGMCC No.2500。

2.一种嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种嗜酸β-甘露聚糖酶基因man5A，其特征在于，编码权利要求2或3所述的β-甘露聚糖酶。

5.如权利要求4所述的β-甘露聚糖酶基因man5A，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

6.如权利要求4所述的β-甘露聚糖酶基因man5A，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

7.包含权利要求4所述β-甘露聚糖酶基因的重组载体。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-man5A，其中，通过将权利要求4所述的β-甘露聚糖酶基因man5A连接到表达载体pPIC9上的酶切位点SnaBI和NotI之间，获得所述重组载体pPIC9-man5A。

9.包含权利要求4所述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

10.一种制备嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求7所述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组β-甘露聚糖酶的表达；以及

3)回收并纯化所表达的β-甘露聚糖酶MAN5A。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型汉逊酵母细胞。

12.权利要求2或3所述的嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A在饲料、食品、医药添加剂中的应用。

说明书

一种嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A及其基因和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种产嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A的菌株Bispora sp.MEY-1，和从该菌种中得到的嗜酸β-甘露聚糖酶及其基因man5A、包含该基因的重组载体和应用。

背景技术

[0002] β- 甘 露 聚 糖 酶 (β-mannanase endo-1，4-β-D-mannanmannohydr-oase EC3.2.1.78)是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶，存在于微生物，动植物中。植物半纤维素的数量仅次于纤维素，甘露聚糖是植物半纤维素的主要成份，是以1，4-β-D-吡喃甘露糖苷键连接而成的线性多糖。在β-甘露聚糖外切酶和甘露糖苷内切酶的作用下，甘露聚糖可被分解为甘露糖。

[0003] 在许多微生物，植物(瓜儿豆等豆类植物的种子，西红柿的种子和果实)和一些低等动物(蓝贻贝Mytilus deulis，海洋软体动物Littorina brevicula)中都存在β-甘露聚糖酶(Millward-Sadler，et al Microbiol.Lett.141，183-188)。微生物则是产β-甘露聚糖酶的重要来源，已报道的有芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌等。真菌中有曲霉、链霉菌、里氏木酶等。微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点，已在实际生产和基础研究中得到应用(McCleary，B.V.Carbohydr.Res.119，191-219.)。 [0004] 近年来，随着甘露寡糖生理功能的发现，绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，对β-甘露聚糖酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。β-甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。目前，国内外对β-甘露聚糖酶的研究和开发集中在细菌产生的碱性和中性酶方面。对于酸性甘露聚糖酶的报道较少。而在饲料中应用的甘露聚糖酶，需要在酸性条件下具有高活性。酸性β-甘露聚糖酶主要来源于真菌，如：曲霉属和木霉属的菌。它们作用的最适pH值在2.4～5.0。但天然菌株所产的甘露聚糖酶产量低，不能满足工业化生产的需要。随着分子生物学的发展，部分酸性甘露聚糖酶的基因已经克隆并在不同的宿主中进行了表达。但仍没有工业化生产嗜酸甘露聚糖酶。在我国，对嗜酸甘露聚糖酶的研究很少，仅克隆了少数酸性甘露聚糖酶基因，运用基因工程手段来产业化生产嗜酸甘露聚糖酶产 品还未见报道。

[0005] 本研究得到了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有强嗜酸性，作用pH范围广，较好的耐热性和极好的抗蛋白酶能力，可作应用于饲料、食品、医药等工业。 发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种产嗜酸β-甘露聚糖酶的菌株Bispora sp.MEY-1。 [0007] 本发明再一目的是提供来源于上述菌株的嗜酸β-甘露聚糖酶。

[0008] 本发明的再一目的是提供上述β-甘露聚糖酶的基因。

[0009] 本发明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶的重组载体。

[0010] 本发明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

[0011] 本发明的再一目的是提供一种制备嗜酸β-甘露聚糖酶的方法。

[0012] 本发明的再一目的是提供上述嗜酸β-甘露聚糖酶的应用。

[0013] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、酿酒以及能源工业中应用新的β-甘露聚糖酶。本发明人筛选到一种天然菌株，它所产生的β-甘露聚糖酶适合于在饲料、食品、酿酒以及能源工业中使用。该嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1，于2008年5月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.2500。

[0014] 从上述菌株中获得了一种嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1：

[0015] MLFQVGTVLL LAWLSPTTDA APGWGWRTVT VTETVTPSST AAGTCSASSP

[0016] STSGIISSST 60

[0017] SSSTATISSA SATSYPSTTY PTTPAYPICT SRAPFASIDD VHPRLFNYNG

[0018] TGAKYFAGTN 120

[0019] AWWTSYLMID SDVNLVFSEI KNTQLQVVRI WGFGSVNTDP GPGTVFFQLL

[0020] NSTGSYINYA 180

[0021] ANGIPRLDAV VSYAERNGVK IVLNFVNNWS ALGGIASYNA AFGGNATSWY

[0022] TDAESQKVYK 240

[0023] DYIKLLVNRY KCSPAIFAWE LANEPRCQGC DTSVIYNWAT EVSQYIKSLD

[0024] PRHMVALGDE 300

[0025] GWFAPADGIG DGSYAYSGDQ GVDFVKNLGI KTLDYGTFHL YPSSWGYNES

[0026] WGSTWILQHN 360

[0027] EVGAAHNKAV VLEEYGGPPT PNNHTAVEEP WQATVLKDTK LAMDQFWQFG

[0028] TVLSTGLSDY 420

[0029] DNFTIWYNSQ EYVPLARDHA AAMLEKPV 448

[0030] 其中，该酶全长448个氨基酸，N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列“MLFQVGTVLL LAWLSPTTDA”。

[0031] 因此，成熟的嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A的理论分子量为46.8kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

[0032] APGWGWRTVT VTETVTPSST AAGTCSASSP STSGIISSST SSSTATISSA

[0033] SATSYPSTTY 60

[0034] PTTPAYPICT SRAPFASIDD VHPRLFNYNG TGAKYFAGTN AWWTSYLMID

[0035] SDVNLVFSEI 120

[0036] KNTQLQVVRI WGFGSVNTDP GPGTVFFQLL NSTGSYINYA ANGIPRLDAV

[0037] VSYAERNGVK 180

[0038] IVLNFVNNWS ALGGIASYNA AFGGNATSWY TDAESQKVYK DYIKLLVNRY

[0039] KCSPAIFAWE 240

[0040] LANEPRCQGC DTSVIYNWAT EVSQYIKSLD PRHMVALGDE GWFAPADGIG

[0041] DGSYAYSGDQ 300

[0042] GVDFVKNLGI KTLDYGTFHL YPSSWGYNES WGSTWILQHN EVGAAHNKAV

[0043] VLEEYGGPPT 360

[0044] PNNHTAVEEP WQATVLKDTK LAMDQFWQFG TVLSTGLSDY DNFTIWYNSQ

[0045] EYVPLARDHA 420

[0046] AAMLEKPV 428

[0047] 该β-甘露聚糖酶MAN5A同时具有好的热稳定性而在常温下又必须具备高活性、在酸性和中性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本发明筛选到的嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1所产生的β-甘露聚糖酶，其最适pH值为1.O～1.5，在pH1.0～5.0的范围内维持70％以上的酶活性；最适温度为65℃，在70℃下处理20分钟，剩余酶活性为50％，在80℃下处理2分钟，剩余酶活性为46％；具有极好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶处理能力。这种性质的β-甘露聚糖酶还未曾有过报道。

[0048] 本发明还提供了编码上述嗜酸β-甘露聚糖酶的基因。

[0049] 该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

[0050] atgctttttc aagtgggaac agtgctttta ttggcctggc tgtctcccac gacagacgcg 60 [0051] gctcctggtt ggggttggag gacagtcact gtgaccgaaa ccgtgactcc ctcttccaca 120 [0052] gccgctggaa cttgttcagc tagtagccca agcacgagtg gcatcatttc atcttcaaca 180 [0053] tcatcttcga cggcaaccat ctcctcggca tcagccacaa gctatcctag cacgacatac 240 [0054] cccacaacgc cagcgtatcc catctgtact tcgcgtgcgc cttttgcgag tatcgatgat 300 [0055] gttcaccctc ggctcttcaa ttacaatggt actggtgcca agtatttcgc tggcaccaac 360 [0056] gcctggtgga caagttacct tatgatcgac tccgatgtga accttgtgtt ctctgagatt 420 [0057] aagaacaccc agcttcaagt ggtcaggatc tggggattcg gaagcgtcaa tacagatcct 480 [0058] gggcctggga cggtcttctt ccagctcttg aattcgacag gaagctacat caactatgcg 540 [0059] gcgaacggca taccaagact cgatgctgtg gtcagctatg ccgaaaggaa tggcgttaag 600 [0060] atcgtcctga actttgtaaa caattggagc gcacttggcg gaattgcctc gtataacgcc 660 [0061] gcttttggag ggaatgctac atcttggtac accgatgccg agagccaaaa agtgtataaa 720 [0062] gactacatca aactgctggt gaataggtac aagtgttcgc ctgcaatctt cgcatgggaa 780 [0063] ctggcgaacg aagtaagaca ccccgcttct attgtgcttc ctgcactggc tcaccgcatt 840 [0064] ccatgtacag cctagatgtc aagggtgcga taccagtgtg atatacaatt gggcaactga 900 [0065] ggtctctcag tacatcaaaa gccttgaccc ccggcatatg gtggcactcg gggatgaagg 960 [0066] ctggtttgcc cccgccgatg gcattggaga cggttcatat gcgtacagtg gagaccaggg 1020 [0067] gtacgtagtg gaatgcgctt ggcctgcctg ccgtttgctg ataacagtgc caaagcgttg 1080 [0068] acttcgtcaa aaacctagga attaagacat tggattatgt gagtgtgctt accgtccgtg 1140 [0069] tgacgcgtcg agcgcatgta ctgacaggac gataggggac cttccatctc tatccatcat 1200 [0070] cttggggata taatgaatcc tggggctcga cgtggatact gcagcacaac gaagtgggag 1260 [0071] cagcacacaa caaagctgtc gtcctcgagg agtatggcgg tccgcccacg cctaacaatc 1320 [0072] acacggcggt cgaggaaccc tggcaggcaa cggtgttgaa agacaccaag ctggccatgg 1380 [0073] atcagttttg gcagttcggc accgtcttga gcaccggact ctccgactac gacaacttca 1440 [0074] cgatctggta taactctcag gaatatgttc ccctggcgag agatcatgcc gcggcaatgc 1500 [0075] tggagaagcc tgtgtaa 1517 [0076] 本发明通过PCR的方法分离克隆了这一β-甘露聚糖酶基因man5A，DNA全序列分析结果表明，β-甘露聚糖酶MAN5A结构基因man5A全长1517bp，含有3个内含子，+792～+849bp，+1021～1075bp，+1120～1176bp为其内含子序列，cDNA长1347bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示。

[0077] atgctttttc aagtgggaac agtgctttta ttggcctggc tgtctcccac gacagacgcg 60 [0078] gctcctggtt ggggttggag gacagtcact gtgaccgaaa ccgtgactcc ctcttccaca 120 [0079] gccgctggaa cttgttcagc tagtagccca agcacgagtg gcatcatttc atcttcaaca 180 [0080] tcatcttcga cggcaaccat ctcctcggca tcagccacaa gctatcctag cacgacatac 240 [0081] cccacaacgc cagcgtatcc catctgtact tcgcgtgcgc cttttgcgag tatcgatgat 300 [0082] gttcaccctc ggctcttcaa ttacaatggt actggtgcca agtatttcgc tggcaccaac 360 [0083] gcctggtgga caagttacct tatgatcgac tccgatgtga accttgtgtt ctctgagatt 420 [0084] aagaacaccc agcttcaagt ggtcaggatc tggggattcg gaagcgtcaa tacagatcct 480 [0085] gggcctggga cggtcttctt ccagctcttg aattcgacag gaagctacat caactatgcg 540 [0086] gcgaacggca taccaagact cgatgctgtg gtcagctatg ccgaaaggaa tggcgttaag 600 [0087] atcgtcctga actttgtaaa caattggagc gcacttggcg gaattgcctc gtataacgcc 660 [0088] gcttttggag ggaatgctac atcttggtac accgatgccg agagccaaaa agtgtataaa 720 [0089] gactacatca aactgctggt gaataggtac aagtgttcgc ctgcaatctt cgcatgggaa 780 [0090] ctggcgaacg agcctagatg tcaagggtgc gataccagtg tgatatacaa ttgggcaact 840 [0091] gaggtctctc agtacatcaa aagccttgac ccccggcata tggtggcact cggggatgaa 900 [0092] ggctggtttg cccccgccga tggcattgga gacggttcat atgcgtacag tggagaccag 960 [0093] ggcgttgact tcgtcaaaaa cctaggaatt aagacattgg attatgggac cttccatctc 1020 [0094] tatccatcat cttggggata taatgaatcc tggggctcga cgtggatact gcagcacaac 1080 [0095] gaagtgggag cagcacacaa caaagctgtc gtcctcgagg agtatggcgg tccgcccacg 1140 [0096] cctaacaatc acacggcggt cgaggaaccc tggcaggcaa cggtgttgaa agacaccaag 1200 [0097] ctggccatgg atcagttttg gcagttcggc accgtcttga gcaccggact ctccgactac 1260 [0098] gacaacttca cgatctggta taactctcag gaatatgttc ccctggcgag agatcatgcc 1320 [0099] gcggcaatgc tggagaagcc tgtgtaa 1347 [0100] 其中，信号肽的碱基序列为：ATGCTTTTTC AAGTGGGAAC AGTGCTTTTATTGGCCTGGC TGTCTCCCAC GACAGACGCG。

[0101] 成熟蛋白理论分子量为46.8kDa，该酶属于糖基水解酶第5家族。将β-甘露聚糖酶基因man5A cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，该基因与来源于Emericella nidulans的甘露聚糖酶序列一致性最高，核苷酸序列一致性为45.4％，氨基酸序列一致性为47.1％。说明MAN5A是一种新的甘露聚糖酶。并为此基因的改造和在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。

[0102] 本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组载体，优选为pPIC9-man5A。将本发明的β-甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将β-甘露聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的SnaB I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-man5A。 [0103] 本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/man5A。

[0104] 本发明还提供了一种制备嗜酸β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤： [0105] 1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

[0106] 2)培养重组菌株，诱导重组β-甘露聚糖酶的表达；以及

[0107] 3)回收并纯化所表达的β-甘露聚糖酶。

[0108] 其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型汉逊酵母(Hansenula Polymorpha Yeast)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/man5A。

[0109] 本发明还提供了上述嗜酸β-甘露聚糖酶的应用。

[0110] 运用基因工程手段来产业化生产嗜酸甘露聚糖酶产品还未见报道。

[0111] 本发明提供了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有强嗜酸性，作用pH范围广，较好的耐热性和抗蛋白酶能力，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产嗜酸甘露聚糖酶。

[0112] 附图说明

[0113] 本发明得到的嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1，于2008年5月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.2500。

[0114] 图1man5A在毕赤酵母中表达的β-甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析，1，分子量标准；2，发酵培养上清；3，纯化的重组β-甘露聚糖酶。

[0115] 图2本发明重组β-甘露聚糖酶的最适pH值。

[0116] 图3本发明β-甘露聚糖酶的pH稳定性。

[0117] 图4本发明β-甘露聚糖酶最适反应温度。

[0118] 图5本发明β-甘露聚糖酶热稳定性。

[0119] 图6蛋白酶处理本发明β-甘露聚糖酶后的酶活曲线。

[0120] 图7蛋白酶处理本发明β-甘露聚糖酶后的SDS-PAGE分析，

[0121] 1，分子量标准；2，β-甘露聚糖酶MAN5A；3，胰蛋白酶处理后的MAN5A；4、5，胃蛋白酶处理后的MAN5A；；6，胰蛋白酶；7，胃蛋白酶。

具体实施方式

[0122] 试验材料和试剂

[0123] 1、菌株及载体：Bispora sp.MEY-1由本发明人分离获得，毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

[0124] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。 [0125] 3、培养基：

[0126] (1)Bispora sp.MEY-1培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH2.5。

[0127] (2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl，pH7.0)。 [0128] (3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ YNB，0.00004％ Biotin，1％甘油(V/V)。

[0129] (4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。 [0130] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

[0131] 实施例1筛选嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1

[0132] 将来源于江西某矿的铀矿废水样品经富集培养后(富集培养基：(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，CaCl2 0.2g/L，魔芋粉0.5％，pH2.5)，按常规稀释后涂布于产酶培养基(同富集培养基，另加1.5％琼脂糖，pH 2.5)平板上，30℃培养5～6d，挑取产生透明圈菌落在产酶培养基平板划线分 离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法筛选到该分泌甘露聚糖酶的菌株。

[0133] 本菌株在PDA上30℃下培养7d菌落直径2～3cm，灰黑色或灰褐色，呈圆形放射状，表面有绒状皱褶且不易于挑起。分生孢子梗直立，(6～9)μm×(10～13)μm。顶端产生链生孢子，分生孢子有隔，0～1隔，椭圆形至纺锤形，无分枝，棕色至深棕色，(5～8.25)μm×(10～19)μm。其最适生长pH为2.5～3.0，最适温度30℃。

[0134] 该嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1，于2008年5月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.2500。

[0135] 实施例2嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1β-甘露聚糖酶编码基因man5A的克隆 [0136] 提取嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1基因组DNA：

[0137] 将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在
4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

[0138] 根据已发表的甘露聚糖酶基因保守序列设计合成了兼并引物P1，P2。以Bisporasp.MEY-1总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃变性5min后冷却至4℃；然后94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，32个循环后72℃保温8min。
得到一约150bp片段，将该片段回收后送三博生物技术有限公司测序。

[0139] 根据测序得到的核甘酸序列设计TAIL-PCR引物usp1，usp2，usp3；dsp1，dsp2，dsp3(见表1)。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收 [0140] 后送三博生物技术有限公司测序。测序正确的片断经拼接后获得全长基因。 [0141] 表1.甘露聚糖酶基因克隆的简并引物及TAIL-PCR特异性引物

[0142]

[0143] 实施例3β-甘露聚糖酶基因的RT-PCR分析

[0144] 提取Bispora sp.MEY-1的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计恰当的引物(MAN5A F：5′-ATGCTTTTTCAAGTGGGAACAGTGCTTTTATTGGCC-3′，MAN5A R：5′-TTACACAGGCTTCTCCAGCATTGCCGC-3′)扩增该单链cDNA，获得甘露聚糖酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

[0145] 通过比较甘露聚糖酶酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因有3个内含子，cDNA长1275bp，编码424个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列，所测出的基因man5A的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的甘露聚糖酶基因序列进行同源比较，氨基酸序列最高一致性为47.1％，核苷酸序列一致性为45.4％，证明从Bispora sp.MEY-1中分离克隆得到的编码甘露聚糖酶的基因为新基因。

[0146] 实施例4重组β-甘露聚糖酶的制备。

[0147] 将表达载体pPIC9进行双酶切(SnaBI+NotI)，同时将编码甘露聚糖酶的基因man5A双酶切(SnaBI+NotI)，切出编码成熟甘露聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Bispora sp.MEY-1甘露聚糖酶基因man5A的重组质粒pPIC-man5A并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/man5A。

[0148] 取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定甘露聚糖酶的活力。重组甘露聚糖酶的表达量为64U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组甘露聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。所表达的甘露聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上(图1)。

[0149] 实施例5重组β-甘露聚糖酶的活性分析

[0150] 采用DNS法对本发明的甘露聚糖酶进行活性分析。具体方法如下：在pH1.5，65℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。

[0151] 甘露聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解甘露聚糖生成1μmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(IU)。

[0152] 实施例6甘露聚糖酶MAN5A的最适pH及pH稳定性

[0153] 经纯化的甘露聚糖酶MAN5A在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 0.5～2.2KCl-HCl缓冲液，pH 2.2～8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液及pH 8.0～10.0Tris-HCl系列缓冲液。纯化的甘露聚糖酶MAN5A在不同pH的缓冲体系，65℃下测定的pH适性结果(图2)表明：MAN5A的最适pH为1.0～1.5，在pH1.0～5.0范围内，酶活性维持在75％以上，而在pH8.0以上，基本检测不到酶活性。

[0154] 将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，在pH1.0～12.0之间保持最适pH下酶活的95％以上，这说明此酶具有较好的耐酸耐碱性。

[0155] 实施例7甘露聚糖酶MAN5A酶反应最适温度及热稳定性。

[0156] 最适温度的测定在pH1.5缓冲体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为甘露聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在65℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，其最适温度为65℃。酶的热稳定性试验表明(图5)，MAN5A在60℃下保温60min，剩余酶活性为70％，70℃下保温20min，剩余酶活性为50％，80℃下保温2min，剩余酶活性为46％。这表明MAN5A具有较好的热稳定性。

[0157] 实施例8不同化学试剂甘露聚糖酶MAN5A酶活性的影响。

[0158] 在酶促反应体系中加入不同的化学试剂(终浓度分别为1mmol/L，5mmol/L和+ 2+ 2+ 3+10mmol/L)，研究不同化学试剂对酶活性的影响。结果表明：低浓度的Li、Ca 、Co 、Cr 、
2+ 2+ + 2+
Cu 、Mn 和Ag 对酶活有明显的激活作用。Hg 和SDS对MAN5A有极强的抑制作用，其余金
2+ 3+
属离子在低浓度时对MAN5A的酶促反应无显著影响。高浓度的Ni 、Fe 和β-巯基乙醇对+ 2+ 3+ 2+
酶活有明显的激活作用。高浓度Li、Cu 和Pb 对酶活有一定的抑制。而Hg 和SDS对酶活有极强的抑制作用。高浓度的其它离子对酶活影响不大。(表2)。

[0159] 表2各种化学试剂对甘露聚糖酶MAN5A活力的影响

[0160]

[0161] 注：“-”代表无法检测。

[0162] 实施例9甘露聚糖酶MAN5A的抗胰蛋白酶和胃蛋白酶能力。

[0163] 用pH2.0KCl-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH2.0KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶/甘露聚糖酶(w/w)≈0.1，37℃保温，0、2、5、8、10、20、30和60min取样，在pH1.5及65℃条件下测定酶活性。实验结果表明β-甘露聚糖酶MAN5A用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理60min后，酶活性均没有降低。相反，用胰蛋白酶处理后酶活有10％的提高。说明β-甘露聚糖酶MAN5A具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力(图6)。胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后的β-甘露聚糖酶MAN5A经SDS-PAGE分析表明：胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后的β-甘露聚糖酶MAN5A的分子量均略有降低(图7)。但并没有降低其活性。

[0164] 实施例10甘露聚糖酶降解角豆胶和魔芋粉的产物。

[0165] 在500μL 0.5％的角豆胶和魔芋粉中分别加入100μL纯化的酶液，pH1.5，65℃ 下保温3～4h。用无水乙醇将酶蛋白沉淀，上清液用2500色谱仪，利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培(HPAEC-PAD)检测方法，进行产物中糖种类的分析。分析结果表明：甘露聚糖酶MAN5A降解角豆胶的产物主要是甘露糖，甘露二糖，甘露三糖，和其它寡聚糖。产物中甘露糖含量为13.38％，甘露二糖含量为5.21％，甘露三糖含量为28.91％，其它寡聚糖的含量为52.49％。MAN5A降解魔芋粉的产物主要是甘露糖，甘露二糖，甘露三糖，甘露四糖和其它寡聚糖。产物中甘露糖含量为27.03％，甘露二糖含量为6.29％，甘露三糖含量为16.24％，甘露四糖的含量为1.21％，其它寡聚糖的含量为49.25％。

[0166] 序列表

[0167] <110>中国农业科学院饲料研究所

[0168] <120>一种嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A及其基因和应用

[0169] <160>4

[0170] <210>1

[0171] <211>448

[0172] <212>PRT

[0173] <213>真菌(Bispora sp.MEY-1)

[0174] <400>1

[0175] MLFQVGTVLL LAWLSPTTDA APGWGWRTVT VTETVTPSST AAGTCSASSP

[0176] STSGIISSST 60

[0177] SSSTATISSA SATSYPSTTY PTTPAYPICT SRAPFASIDD VHPRLFNYNG

[0178] TGAKYFAGTN 120

[0179] AWWTSYLMID SDVNLVFSEI KNTQLQVVRI WGFGSVNTDP GPGTVFFQLL

[0180] NSTGSYINYA 180

[0181] ANGIPRLDAV VSYAERNGVK IVLNFVNNWS ALGGIASYNA AFGGNATSWY

[0182] TDAESQKVYK 240

[0183] DYIKLLVNRY KCSPAIFAWE LANEPRCQGC DTSVIYNWAT EVSQYIKSLD

[0184] PRHMVALGDE 300

[0185] GWFAPADGIG DGSYAYSGDQ GVDFVKNLGI KTLDYGTFHL YPSSWGYNES

[0186] WGSTWILQHN 360

[0187] EVGAAHNKAV VLEEYGGPPT PNNHTAVEEP WQATVLKDTK LAMDQFWQFG

[0188] TVLSTGLSDY 420

[0189] DNFTIWYNSQ EYVPLARDHA AAMLEKPV 448

[0190] <210>2

[0191] <211>428

[0192] <212>PRT

[0193] <213>真菌(Bispora sp.MEY-1)

[0194] <400>2

[0195] APGWGWRTVT VTETVTPSST AAGTCSASSP STSGIISSST SSSTATISSA

[0196] SATSYPSTTY 60

[0197] PTTPAYPICT SRAPFASIDD VHPRLFNYNG TGAKYFAGTN AWWTSYLMID

[0198] SDVNLVFSEI 120

[0199] KNTQLQVVRI WGFGSVNTDP GPGTVFFQLL NSTGSYINYA ANGIPRLDAV

[0200] VSYAERNGVK 180

[0201] IVLNFVNNWS ALGGIASYNA AFGGNATSWY TDAESQKVYK DYIKLLVNRY

[0202] KCSPAIFAWE 240

[0203] LANEPRCQGC DTSVIYNWAT EVSQYIKSLD PRHMVALGDE GWFAPADGIG

[0204] DGSYAYSGDQ 300

[0205] GVDFVKNLGI KTLDYGTFHL YPSSWGYNES WGSTWILQHN EVGAAHNKAV

[0206] VLEEYGGPPT 360

[0207] PNNHTAVEEP WQATVLKDTK LAMDQFWQFG TVLSTGLSDY DNFTIWYNSQ

[0208] EYVPLARDHA 420

[0209] AAMLEKPV 428

[0210] <210>3

[0211] <211>1517

[0212] <212>DNA

[0213] <213>真菌(Bispora sp.MEY-1)

[0214] <400>3：

[0215] atgctttttc aagtgggaac agtgctttta ttggcctggc tgtctcccac gacagacgcg 60 [0216] gctcctggtt ggggttggag gacagtcact gtgaccgaaa ccgtgactcc ctcttccaca 120 [0217] gccgctggaa cttgttcagc tagtagccca agcacgagtg gcatcatttc atcttcaaca 180 [0218] tcatcttcga cggcaaccat ctcctcggca tcagccacaa gctatcctag cacgacatac 240 [0219] cccacaacgc cagcgtatcc catctgtact tcgcgtgcgc cttttgcgag tatcgatgat 300 [0220] gttcaccctc ggctcttcaa ttacaatggt actggtgcca agtatttcgc tggcaccaac 360 [0221] gcctggtgga caagttacct tatgatcgac tccgatgtga accttgtgtt ctctgagatt 420 [0222] aagaacaccc agcttcaagt ggtcaggatc tggggattcg gaagcgtcaa tacagatcct 480 [0223] gggcctggga cggtcttctt ccagctcttg aattcgacag gaagctacat caactatgcg 540 [0224] gcgaacggca taccaagact cgatgctgtg gtcagctatg ccgaaaggaa tggcgttaag 600 [0225] atcgtcctga actttgtaaa caattggagc gcacttggcg gaattgcctc gtataacgcc 660 [0226] gcttttggag ggaatgctac atcttggtac accgatgccg agagccaaaa agtgtataaa 720 [0227] gactacatca aactgctggt gaataggtac aagtgttcgc ctgcaatctt cgcatgggaa 780 [0228] ctggcgaacg aagtaagaca ccccgcttct attgtgcttc ctgcactggc tcaccgcatt 840 [0229] ccatgtacag cctagatgtc aagggtgcga taccagtgtg atatacaatt gggcaactga 900 [0230] ggtctctcag tacatcaaaa gccttgaccc ccggcatatg gtggcactcg gggatgaagg 960 [0231] ctggtttgcc cccgccgatg gcattggaga cggttcatat gcgtacagtg gagaccaggg 1020 [0232] gtacgtagtg gaatgcgctt ggcctgcctg ccgtttgctg ataacagtgc caaagcgttg 1080 [0233] acttcgtcaa aaacctagga attaagacat tggattatgt gagtgtgctt accgtccgtg 1140 [0234] tgacgcgtcg agcgcatgta ctgacaggac gataggggac cttccatctc tatccatcat 1200 [0235] cttggggata taatgaatcc tggggctcga cgtggatact gcagcacaac gaagtgggag 1260 [0236] cagcacacaa caaagctgtc gtcctcgagg agtatggcgg tccgcccacg cctaacaatc 1320 [0237] acacggcggt cgaggaaccc tggcaggcaa cggtgttgaa agacaccaag ctggccatgg 1380 [0238] atcagttttg gcagttcggc accgtcttga gcaccggact ctccgactac gacaacttca 1440 [0239] cgatctggta taactctcag gaatatgttc ccctggcgag agatcatgcc gcggcaatgc 1500 [0240] tggagaagcc tgtgtaa 1517 [0241] <210>4

[0242] <211>1347

[0243] <212>DNA

[0244] <213>真菌(Bispora sp.MEY-1)

[0245] <400>4：

[0246] atgctttttc aagtgggaac agtgctttta ttggcctggc tgtctcccac gacagacgcg 60 [0247] gctcctggtt ggggttggag gacagtcact gtgaccgaaa ccgtgactcc ctcttccaca 120 [0248] gccgctggaa cttgttcagc tagtagccca agcacgagtg gcatcatttc atcttcaaca 180 [0249] tcatcttcga cggcaaccat ctcctcggca tcagccacaa gctatcctag cacgacatac 240 [0250] cccacaacgc cagcgtatcc catctgtact tcgcgtgcgc cttttgcgag tatcgatgat 300 [0251] gttcaccctc ggctcttcaa ttacaatggt actggtgcca agtatttcgc tggcaccaac 360 [0252] gcctggtgga caagttacct tatgatcgac tccgatgtga accttgtgtt ctctgagatt 420 [0253] aagaacaccc agcttcaagt ggtcaggatc tggggattcg gaagcgtcaa tacagatcct 480 [0254] gggcctggga cggtcttctt ccagctcttg aattcgacag gaagctacat caactatgcg 540 [0255] gcgaacggca taccaagact cgatgctgtg gtcagctatg ccgaaaggaa tggcgttaag 600 [0256] atcgtcctga actttgtaaa caattggagc gcacttggcg gaattgcctc gtataacgcc 660 [0257] gcttttggag ggaatgctac atcttggtac accgatgccg agagccaaaa agtgtataaa 720 [0258] gactacatca aactgctggt gaataggtac aagtgttcgc ctgcaatctt cgcatgggaa 780 [0259] ctggcgaacg agcctagatg tcaagggtgc gataccagtg tgatatacaa ttgggcaact 840 [0260] gaggtctctc agtacatcaa aagccttgac ccccggcata tggtggcact cggggatgaa 900 [0261] ggctggtttg cccccgccga tggcattgga gacggttcat atgcgtacag tggagaccag 960 [0262] ggcgttgact tcgtcaaaaa cctaggaatt aagacattgg attatgggac cttccatctc 1020 [0263] tatccatcat cttggggata taatgaatcc tggggctcga cgtggatact gcagcacaac 1080 [0264] gaagtgggag cagcacacaa caaagctgtc gtcctcgagg agtatggcgg tccgcccacg 1140 [0265] cctaacaatc acacggcggt cgaggaaccc tggcaggcaa cggtgttgaa agacaccaag 1200 [0266] ctggccatgg atcagttttg gcagttcggc accgtcttga gcaccggact ctccgactac 1260 [0267] gacaacttca cgatctggta taactctcag gaatatgttc ccctggcgag agatcatgcc 1320 [0268] gcggcaatgc tggagaagcc tgtgtaa 1347