一种抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶Aga-F75及其基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明提供了一种新的赤霉菌Gibberela.sp.F75，其保藏号为CGMCC No.2499，并从该菌株中得到一种抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶Aga-F75，进而得到其基因、包含该基因的重组载体。所述α-半乳糖苷酶Aga-F75的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该酶具有适宜的作用pH值，较强的蛋白酶抗性和较好的水解各种底物的能力，可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。

权利要求

1.一种赤霉菌，其特征在于，该菌株为赤霉菌(Gibberela.sp.)F75，其保藏号为CGMCC No.2499。

2.一种抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶Aga-F75，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶基因aga-F75，其特征在于，编码权利要求2所述的α-半乳糖苷酶Aga-F75。

4.如权利要求3所述的α-半乳糖苷酶基因aga-F75，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

5.如权利要求3所述的α-半乳糖苷酶基因aga-F75，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

6.包含权利要求3、4或5所述α-半乳糖苷酶基因aga-F75的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pET22b(+)/aga-F75，其中，通过将所述的α-半乳糖苷酶基因aga-F75连接到表达载体pET22b(+)获得所述重组载体pET22b(+)/aga-F75。

7.包含权利要求3、4或5所述α-半乳糖苷酶基因aga-F75的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌。

8.一种制备抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶Aga-F75的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求6的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株，所述菌株为大肠杆菌；

2)培养重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶Aga-F75。

9.权利要求2所述抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶Aga-F75的应用。

说明书

一种抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶Aga-F75及其基因和

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶Aga-F75及其基因、包含该基因的重组载体和应用。

背景技术

[0002] α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC3.2.1.22)即蜜二糖酶，属于外切糖苷酶类，能够专一性催化糖链非还原末端α-半乳糖苷键的水解，它不仅能够水解含α-半乳糖苷键的寡糖，而且还能够催化含该键的多糖。棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖是豆类植物中广泛存在的低聚寡糖，在α-半乳糖苷酶的作用下，这些寡糖可以被分解为D-半乳糖和其他相应的单糖和寡糖。

[0003] 豆粕是非常优秀的植物性蛋白质饲料原料，一般在日粮中的用量为25～30％。但在豆粕中含有5～6％的单胃动物不能消化的α-半乳糖苷类的低聚寡糖，如棉子糖、水苏糖等，这些寡糖一方面会引起动物的肠胃胀气疾病，另一方面会增加食糜的粘度，从而降低了动物对营养物质的消化与吸收。而在豆科饲料中添加α-半乳糖苷酶能够增加饲料中低聚寡糖的消化，减少此类低聚寡糖的抗营养作用，减轻或消除单胃动物的消化紊乱，从而提高饲料中营养物质的利用率和代谢能(Ghazi S，et al.BritishPoultry Science.44(3)：410-418)。

[0004] 在制糖工业中，由于甜菜中棉子糖的存在，造成糖蜜粘度增加而阻碍蔗糖结晶析出，以致产生大量的废糖蜜，使糖产量降低。应用α-半乳糖苷酶处理废糖蜜能将阻碍蔗糖结晶的棉子糖清除，在分解一分子棉子糖的同时，还产生一分子的蔗糖，因而提高蔗糖的得率(Ganter C.，et al.Journal of Biotechnology.8(4)：301-310)。同时酶法制糖可使蔗糖的粒状结晶的均匀性、色泽和纯度得到改善。

[0005] 在大豆及其制品中，含有1％的棉子糖、4％的水苏糖和微量的毛蕊花糖。这些寡糖阻碍人类对豆类的消化吸收，能够产生胀气等疾病，而人胃肠道不分泌α-半乳糖苷酶，因此在豆制品中加入α-半乳糖苷酶，可以分解这些寡糖，增加人类对豆类营养的吸收(Prashanth S J and Mulimani V H.，Process Biochemistry.40：1199-1205)。

[0006] α-半乳糖苷酶广泛存在于微生物、植物、动物和人体内。在微生物中，细菌、放线菌、丝状真菌、酵母等都能合成α-半乳糖苷酶。目前，已分离筛选出许多产α-半乳糖苷酶的微生物，如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、青霉、红曲霉、米曲霉、黑曲霉、焦曲霉、泡盛曲霉、葡酒色被包霉、毛霉、根霉、黄曲霉、啤酒酵母等等。微生物α-半乳糖苷酶有较高的产量，特别是丝状真菌，每升培养基可以分泌30g蛋白质，它们产生的α-半乳糖苷酶可以分泌到胞外、具有合适的酸碱度和良好的稳定性从而最有利于技术应用(den Herder I.F.，et al.Mol.Gen.Genet.233，404-410)。因此产α-半乳糖苷酶的真菌受到越来越广泛的关注。由于动物或人体内存在大量的蛋白酶，α-半乳糖苷酶在食品及饲料工业或某些医药领域的应用中，需要具备蛋白酶抗性以防止被降解并加强其应用效果。且在应用过程中，该酶常与包括蛋白酶在内的各种酶混合使用，酶的蛋白酶抗性尤显重要。但目前很少有抗蛋白酶的α-半乳糖苷酶的报道。含有α-半乳糖苷键的寡糖和多聚糖包括多种，而以前报道的α-半乳糖苷酶其底物特异性不能水解多种底物，在应用上各具有其局限性。

[0007] 本发明公开了一个新的α-半乳糖苷酶基因，其编码的α-半乳糖苷酶具有适宜的作用pH值，较强的蛋白酶抗性和较好的水解各种底物的能力，可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。

发明内容

[0008] 本发明的目的之一是提供一种赤霉菌。

[0009] 本发明的目的之一是提供一种抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶Aga-F75。

[0010] 本发明的再一目的是提供编码上述α-半乳糖苷酶Aga-F75的基因。

[0011] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

[0012] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

[0013] 本发明的另一目的是提供一种制备上述α-半乳糖苷酶Aga-F75的基因工程方法。

[0014] 本发明的另一目的提供上述α-半乳糖苷酶Aga-F75的应用。

[0015] 本发明提供了一种赤霉菌Gibberela.sp.F75，于2008年5月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No.2499。

[0016] 本发明提供了一种α-半乳糖苷酶Aga-F75，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0017] MVLVTLRGIT TTAVLFCQAI SALAESSDPI HVDGTSFALN GDNVSYRFHV

[0018] DNTTGDLIND 60[0019] HYGGPVAEDG ITAEIGPIQG WVNLIGRVRR EFPDHGRGDF RIPAFQLQQA

[0020] SGTTVTDFRY 120[0021] KSHEVVEGKP GLPGLPSTFG EADDVSTLVV RMYDNYSSIA VDLSYSIFPK

[0022] YDAVVRSVNI 180[0023] TNRGNATVNL KRVSSWSVDL QQDNLDLIEI RGDWAREGMR VRRKVDFGTQ

[0024] GFQSSTGYSS 240[0025] HLHNPFLALV ASTTTETQGE AWGFSLVYTG SFAVDVEKSS QGLTRAILGV

[0026] NSLDFSWPLK 300[0027] PGQTFTTPEV VSVFSNKGVG GMSRQFHRLY RKHLMKSKYA EETRPVLLNS

[0028] WEGLGFEINE 360[0029] TAIEKIAKQS ADLGIKLFVM DDGWFGNKYP RVNDSAGLGD WQPNKERFPD

[0030] GLTPLVENIT 420[0031] ELRIANASDD LKFGIWFEPE MVNPKSDLYD KHPDWAIHAG SYPRTETRNQ

[0032] LVLNVALPEV 480[0033] QEFIIDSVSK ILRESPISYV KWDNNRGIHE TPDPTLNYKY MLGLYHVFET

[0034] LTSRFPDVLW 540[0035] EGCASGGGRF DPGVLQWFPQ IWTSDDTDAV ERIAIQFGTS LAYPPSAMGA

[0036] HLSHVPNGNT 600[0037] QRITSVKFRA HVAMMGGSFG VELDPSDLEP EEREQIPGLI ELSEKINPIV

[0038] ITGDFYRLAL 660[0039] PEETNYPAGQ FISEDGKKVV LFAFQTRATI NNSWPWFRLQ GLDASAKYRV

[0040] DNNQTVSGST 720[0041] LMNMGIQLTF EGDYDSHVLM IEKQ 744。

[0042] 本发明提供了编码上述α-半乳糖苷酶Aga-F75的基因。其全基因序列如SEQ IDNO.2所示。

[0043] gtcagtttct attgcgcgga tatactcacg tcataccagt tatgtcagcg gtctcatctg 60[0044] ggatctgtgc tgatctcgac aacgatgacg atctgctcaa aggtatcttc gcagtcacat 120[0045] catcagtcac tctcccacaa ctcatccaga tcgccgagtc gagatcatca cgagcgctac 180[0046] atatgggatc tcgaatttcc tgtgactttg aactttgaac tgatgatctt ctctggggat 240[0047] ttataaacat gtcggctccc gcggattaaa cccctcggat ttgactttcg tttaaacaac 300[0048] ttttgctagg gtcaagatgg tgcttgttac attgaggggc attacgacga cggcagttct 360[0049] gttctgccag gccatttcgg ctctcgcgga gagctcagat cgtaagtctt catcttcatt 420[0050] attctcatac tgaacaatat taacatgtct gcagcaattc acgtcgacgg cacctctttc 480[0051] gccctcaacg gcgataacgt ctcataccgg ttccacgtcg acaacaccac tggagacctt 540[0052] atcaacgacc actacggcgg ccccgttgcc gaagatggaa tcaccgctga gatcggcccc 600[0053] atccaaggct gggtcaactt gatcggccgt gtccgacgcg aattccccga ccacggcaga 660[0054] ggagacttcc gcatcccagc gttccagctc caacaagcca gcggcacgac cgtcacagac 720[0055] tttcgctaca agtctcacga ggttgtagaa ggaaaacctg gattacctgg tcttccgtcg 780[0056] acgtttggcg aggctgatga tgtgtcgact ttggtggtgc gtatgtacga caattatagc 840[0057] tctattgctg ttgatctgtc gtattcgatc tttccgaaat atgatgctgt tgtgcggagt 900[0058] gtgaacatca cgaatcgtgg gaatgcgacg gtgaatttga aaagggtttc gagttggagt 960[0059] gttgatttac agcaggataa tctggacctt attgagatca ggggtgattg ggctcgtgag 1020[0060] ggcatgcgcg tgcgtcgaaa ggttgacttt ggaactcaag ggtgagcatc atttcggtga 1080[0061] agcaattaca cagactgcta acggcattgt agattccaaa gctctactgg ttattcgtct 1140[0062] catcttcaca acccgttcct cgctctcgtt gcatcaacga ctaccgaaac gcaaggcgaa 1200[0063] gcatggggct tctccctggt gtacaccggc tccttcgccg ttgacgtcga gaagagctca 1260[0064] cagggactca cccgcgccat tctcggtgtc aattctctcg acttctcgtg gccactgaaa 1320[0065] cctggacaaa ccttcaccac tcccgaggtc gtctccgtct tctcaaacaa aggtgtcggc 1380[0066] ggcatgtcca gacaatttca ccgcttgtac agaaagcatt tgatgaagag taaatatgca 1440[0067] gaagagacac gtcctgttct tctcaacagc tgggagggct tgggtttcga aatcaacgag 1500[0068] actgctattg aaaagatcgc caaacaatct gcagacctcg gtatcaagct gttcgtcatg 1560[0069] gatgatggct ggttcggtaa caagtacccg cgagttaacg attcagcggg tcttggagat 1620[0070] tggcagccta acaaggaacg cttccctgat gggttgactc ctctggtcga aaatatcacg 1680[0071] gaattgagaa ttgctaatgc ttccgatgat ctcaagttcg gtatctggtt cgagcccgaa 1740[0072] atggtgaacc ccaaatcaga cttgtatgac aaacaccccg actgggcgat ccacgcaggc 1800[0073] tcgtatcccc gaaccgagac acgtaatcaa ttggttctca atgtagctct gcccgaggtc 1860[0074] caagagttca tcatcgactc cgtctccaag attctccgcg aatcaccgat ttcctacgtc 1920[0075] aagtgggata acaaccgtgg aatccacgag acgcctgatc ctactctcaa ctacaagtat 1980[0076] atgcttggtc tttatcacgt ctttgagact ttgacgagtc gcttccctga tgttctgtgg 2040[0077] gaaggctgtg cttctggcgg tggtcggttt gatcccggtg ttcttcagtg gttccctcag 2100[0078] atttggacgt cggatgatac agatgcggtt gagcgtattg ctatccagtt cggcacgtca 2160[0079] cttgcgtacc ctccatctgc catgggagcc catctatcgc atgtgcctaa tggaaatacc 2220[0080] cagagaataa catccgtcaa gttcagagcc catgttgcaa tgatgggcgg ctcctttggc 2280[0081] gtcgaacttg acccaagcga tcttgagcct gaagagaggg aacagattcc tggtctcatt 2340[0082] gaactttctg aaaagattaa ccccatcgtc atcaccggcg acttttatag acttgcattg 2400[0083] cctgaggaaa ctaactaccc agctgggcag ttcatttctg aggatggcaa gaaagttgtc 2460[0084] ctttttgcgt tccagacgag ggcgactatc aataattctt ggccttggtt ccgacttcaa 2520[0085] ggtttggatg caagtgccaa gtacagggtg gacaataacc agacggtttc tggttcgacg 2580[0086] ctgatgaaca tgggtatcca attgacgttt gagggggatt atgatagcca tgtcttgatg 2640[0087] attgagaagc aatagttcgg gtggctaagc tatggatgac atactgtaaa tagcgcttca 2700[0088] aatacaagat tcgctcagat ctcaacgtcg acgcaagaca taaataactc gaactgttca 2760[0089] tccaacgcgt caaaacacac aagcaagctt tcaccaagat aattcatcga tcaccgacaa 2820[0090] ccttgcatcg tcaccctcca acgtccgcac ga 2852[0091] 其cDNA序列如SEQ ID NO.3所示。

[0092] atggtgcttg ttacattgag gggcattacg acgacggcag ttctgttctg ccaggccatt 60[0093] tcggctctcg cggagagctc agatccaatt cacgtcgacg gcacctcttt cgccctcaac 120[0094] ggcgataacg tctcataccg gttccacgtc gacaacacca ctggagacct tatcaacgac 180[0095] cactacggcg gccccgttgc cgaagatgga atcaccgctg agatcggccc catccaaggc 240[0096] tgggtcaact tgatcggccg tgtccgacgc gaattccccg accacggcag aggagacttc 300[0097] cgcatcccag cgttccagct ccaacaagcc agcggcacga ccgtcacaga ctttcgctac 360[0098] aagtctcacg aggttgtaga aggaaaacct ggattacctg gtcttccgtc gacgtttggc 420[0099] gaggctgatg atgtgtcgac tttggtggtg cgtatgtacg acaattatag ctctattgct 480[0100] gttgatctgt cgtattcgat ctttccgaaa tatgatgctg ttgtgcggag tgtgaacatc 540[0101] acgaatcgtg ggaatgcgac ggtgaatttg aaaagggttt cgagttggag tgttgattta 600[0102] cagcaggata atctggacct tattgagatc aggggtgatt gggctcgtga gggcatgcgc 660[0103] gtgcgtcgaa aggttgactt tggaactcaa gggttccaaa gctctactgg ttattcgtct 720[0104] catcttcaca acccgttcct cgctctcgtt gcatcaacga ctaccgaaac gcaaggcgaa 780[0105] gcatggggct tctccctggt gtacaccggc tccttcgccg ttgacgtcga gaagagctca 840[0106] cagggactca cccgcgccat tctcggtgtc aattctctcg acttctcgtg gccactgaaa 900[0107] cctggacaaa ccttcaccac tcccgaggtc gtctccgtct tctcaaacaa aggtgtcggc 960[0108] ggcatgtcca gacaatttca ccgcttgtac agaaagcatt tgatgaagag taaatatgca 1020[0109] gaagagacac gtcctgttct tctcaacagc tgggagggct tgggtttcga aatcaacgag 1080[0110] actgctattg aaaagatcgc caaacaatct gcagacctcg gtatcaagct gttcgtcatg 1140[0111] gatgatggct ggttcggtaa caagtacccg cgagttaacg attcagcggg tcttggagat 1200[0112] tggcagccta acaaggaacg cttccctgat gggttgactc ctctggtcga aaatatcacg 1260[0113] gaattgagaa ttgctaatgc ttccgatgat ctcaagttcg gtatctggtt cgagcccgaa 1320[0114] atggtgaacc ccaaatcaga cttgtatgac aaacaccccg actgggcgat ccacgcaggc 1380[0115] tcgtatcccc gaaccgagac acgtaatcaa ttggttctca atgtagctct gcccgaggtc 1440[0116] caagagttca tcatcgactc cgtctccaag attctccgcg aatcaccgat ttcctacgtc 1500[0117] aagtgggata acaaccgtgg aatccacgag acgcctgatc ctactctcaa ctacaagtat 1560[0118] atgcttggtc tttatcacgt ctttgagact ttgacgagtc gcttccctga tgttctgtgg 1620[0119] gaaggctgtg cttctggcgg tggtcggttt gatcccggtg ttcttcagtg gttccctcag 1680[0120] atttggacgt cggatgatac agatgcggtt gagcgtattg ctatccagtt cggcacgtca 1740[0121] cttgcgtacc ctccatctgc catgggagcc catctatcgc atgtgcctaa tggaaatacc 1800[0122] cagagaataa catccgtcaa gttcagagcc catgttgcaa tgatgggcgg ctcctttggc 1860[0123] gtcgaacttg acccaagcga tcttgagcct gaagagaggg aacagattcc tggtctcatt 1920[0124] gaactttctg aaaagattaa ccccatcgtc atcaccggcg acttttatag acttgcattg 1980[0125] cctgaggaaa ctaactaccc agctgggcag ttcatttctg aggatggcaa gaaagttgtc 2040[0126] ctttttgcgt tccagacgag ggcgactatc aataattctt ggccttggtt ccgacttcaa 2100[0127] ggtttggatg caagtgccaa gtacagggtg gacaataacc agacggtttc tggttcgacg 2160[0128] ctgatgaaca tgggtatcca attgacgttt gagggggatt atgatagcca tgtcttgatg 2220[0129] attgagaagc aatag 2235[0130] 本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因aga-F75的重组载体。

[0131] 本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因aga-F75的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

[0132] 本发明还提供了一种制备抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶Aga-F75的方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0133] 1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

[0134] 2)培养重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶表达；以及

[0135] 3)回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶Aga-F75。

[0136] 本发明还提供了α-半乳糖苷酶Aga-F75的应用。

[0137] 相较于目前报道或用于生产的α-半乳糖苷酶，该酶具有适宜的作用pH值，较强的蛋白酶抗性和优良的水解各种底物的能力，可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。

附图说明

[0138] 赤霉菌Gibberela.sp.F75，于2008年5月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No.2499。

[0139] 图1重组α-半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析，M：低分子量蛋白质Marker；1：未诱导对照，对照空载体pET-22b(+)转化E.coli BL21诱导后的CTP；2：载体pET-22b(+)/aga-F75转化E.coli BL21诱导后的CTP；3：纯化的α-半乳糖苷酶Aga-F75。

[0140] 图2α-半乳糖苷酶的最适pH。

[0141] 图3α-半乳糖苷酶pH稳定性。

[0142] 图4α-半乳糖苷酶作用的最适温度。

[0143] 图5α-半乳糖苷酶的热稳定性。

[0144] 图6α-半乳糖苷酶Aga-F75的蛋白酶抗性分析。

具体实施方式

[0145] 实验条件：

[0146] 1、菌株及载体：赤霉F75(Gibberela.sp.F75)由发明人筛选，宿主大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，载体pET-22b(+)均购自于Invitrogen公司。

[0147] 2、酶类及其他生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。胰蛋白酶(Trypsin)、α-糜蛋白酶(α-Chymotrypsin)、蛋白酶K(Proteinase K)、枯草杆菌蛋白酶A(Subtilisin A)、胶原蛋白酶(Collagenase)为Sigma(USA)产品；蛋白酶proleather为Amano Enzyme Inc.(Japan)产品，碱性蛋白酶(Alkalineprotease)来源于Bacillus pumilus SMJ-P；IPTG为Promega公司产品；蜜二糖、棉子糖、水苏糖、角豆胶和牛血清白蛋白为Sigma(USA)产品；其它都为国产试剂。

[0148] 3、培养基：青霉培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂。

[0149] 诱导产酶培养基(0.4％K2HPO4，0.28％(wt/vol)(NH4)2SO4，0.12％(wt/vol)CaCl2，0.12％(wt/vol)尿素，0.12％(wt/vol)MgSO4，0.02％(wt/vol)甘露糖，0.02％(wt/vol)酵母提取物和3％(wt/vol)豆粕)。

[0150] 大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

[0151] 说明：本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，1994)。

[0152] 实施例1分离赤霉菌Gibberela.sp.F75及其产酶特性

[0153] 菌株Gibberela.sp.F75在PDA培养基上生长3-5天后，菌丝为白色，根部红色。根据丝状真菌18S rDNA的保守序列设计的引物对菌株的18S rDNA进行PCR扩增，测序结果与Genbank数据库中的核苷酸序列比对，发现F75的18S rDNA核苷酸序列与Gibberella fujikuroi(Genbank accession No.AB237662)据有最高的相似性为99％。结合形态观察，可证明该菌株为根霉，命名为Gibberella.sp.F75。将豆粕作为诱导物和碳源加入产酶培养基中(4％K2HPO4，0.28％(NH4)2SO4，0.12％CaCl2，0.12％Urea，0.12％MgSO4，0.02％Mannanose，0.02％Yeast extract，3％的豆粕为碳源)，30℃、250rpm摇振培养5天后，将菌液离心，取上清测酶活。结果108h(约4-5d)后出现出较高的α-半乳糖苷酶活性，约0.3U/mL(以pNPG为底物)。

[0154] 实施例2赤霉菌α-半乳糖苷酶编码基因aga-F75的克隆

[0155] 提取赤霉菌(Gibberela.sp.F75)基因组DNA：取30℃培养7天后的赤霉菌液6000rpm离心10min。取100mg菌丝体加500μL无菌水清洗，离心取沉淀。沉淀重悬于
500μL提取液混合液，于37℃温育60min，10000rpm离心10min去沉淀。上清液用等体积酚、酚∶氯仿、氯仿依次抽提。取上层溶液加0.6-1倍体积的异丙醇常温沉淀10min。
12000rpm离心15min。沉淀用70％乙醇清洗，稍离心，将沉淀烘干后用30μL无菌水溶解，备用。

[0156] 根据发表的α-半乳糖苷酶的保守序列设计合成了简并引物P1，5′-GAYGAYGGNTGGTTYGGN-3′和P2，5′-GACCATYTCNGGYTCNAMCC-3′，以赤霉菌F75总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性3min后冷却至4℃；然后94℃变性
30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，32个循环后72℃保温10min。得到一片段测序。根据测序得到的核甘酸序列设计Tail-PCR引物，进行PCR扩增。获得片段上下游序列后进行测序，拼接得到全长基因序列。

[0157] 进一步进行α-半乳糖苷酶基因的RT-PCR分析。提取菌丝体的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计并利用引物F75up1，5’-AAGATGGTGCTTGTTACATTGAGGG-3，F75AG4，5’-GAACTATTGCTTCTCAATCATCAAG-3’，扩增该单链cDNA，获得α-半乳糖苷酶的完整cDNA序列。结果表明，该基因为一个长2235bp的基因片段，编码744个氨基酸和一个终止密码子。其与已发现的红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的α-半乳糖苷酶(Genbank accession No.CAA93245)存在最高的相似性为69％，与阿维氏链霉菌(Penicillium sp.F63)的α-半乳糖苷酶(Genbank accession No.ABC70181)的相似性为63％，为一个新基因。

[0158] 实施例3α-半乳糖苷酶的活性分析。

[0159] 酶活性测定方法采用pNPG法。将pNPG溶于0.1mol/L McIlvaine缓冲液中，使其终浓度为2mmol/L。将20μL酶液，230μL的McIlvaine缓冲液和250μL 2mM的pNPG混合，摇匀。37℃温育5min后，反应液中加入1.5mL 1M的Na2CO3溶液来终止反应。在405nm处测其OD值，以对硝基酚(pNP)的生成量表示酶活力。对照管加酶液和缓冲液后，先加Na2CO3溶液再加pNPG溶液。

[0160] 酶活(U/mL)单位定义：在37℃下每分钟分解pNPG释放1μmol pNP需的酶量被定义为一个酶活单位。

[0161] 实施例4制备含有α-半乳糖苷酶编码基因aga-F75的重组酶

[0162] 根据的测序结果设计引物：

[0163] F75AG-ES(5’CTAGGATCCGATGGTGCTTGTTACATTGAG-3’)、F75AG-YA(5’CTAGCGGCCGCCTATTGCTTCTCAATCATC-3’)，在引物的末端分别引入内切酶BamH I和Not I酶切位点，进行PCR扩增。质粒pET22b(+)和基因片断进行双酶切后连接形成载体pET22b(+)/aga-F75，制备BL21(DH3)感受态细胞，将重组质粒pET22b(+)/aga-F75电击转化宿主菌。鉴定阳性重组子，并诱导检测酶活。取含有重组体质粒的BL21(DE3)菌株和含有pET-22b(+)-lic空质粒的BL21(DE3)菌株(作对照)，分别接种于3mL LB(加有100μg/mL的氨苄青霉素)培养液中，37℃快速振荡培养过夜。分别取100μL过夜培养液加入含100μg/mL氨苄青霉素的10mL LB培养液(1％接种量)中，37℃振荡培养约2-3h(OD600达到0.6-0.8)后加入终浓度
1mol/L的诱导剂IPTG，18℃ 180rpm震荡培养12h。培养液12,000rpm离心5min，分别收集培养基上清和沉淀，细胞沉淀用pH4.8的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液重悬，超声破碎后
12,000rpm离心10min，收集上清为细胞总蛋白(CTP)。按上述酶活测定方法分别检测培养基上清和CTP酶活。结果重组酶主要在大肠杆菌胞内表达，CTP中酶活性为1.42U/ml。经SDS-PAGE电泳检测，可以看见一条明显的特异性条带(图1，LANE2)。

[0164] 大肠杆菌诱导产生的α-半乳糖苷酶Aga-F75经一步NTA柱纯化(NEB)，比活提高至20.29U/mg。纯化Aga-F75经SDS-PAGE得到电泳纯的单一条带，分子量约为80kDa与预测分子量相近(图1，LANE 3)。

[0165] 实施例5α-半乳糖苷酶Aga-F75的酶学性质

[0166] 经纯化的α-半乳糖苷酶Aga-F75在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 2.0～8.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液和pH 9.0～11.0的0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。纯化的α-半乳糖苷酶Aga-F75在不同pH的缓冲体系，37℃下测定的pH适性结果(图2)表明：Aga-F75的最适作用pH为4.0，在pH3.0-5.0保持80％以上的相对酶活性，pH低于2或高于8.0几乎丧失所有酶活。

[0167] 将酶液在不同pH值的缓冲液中于常温下处理12h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，Aga-F75在pH范围为3.0-12.0间都很稳定，保持80％以上的酶活。

[0168] 最适温度的测定在pH4.8的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液体系及不同的温度(0～70℃)下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，Aga-F75的最适作用温度60℃，温度高于70℃时仍有10％左右的酶活。

[0169] 测定α-半乳糖苷酶在不同的温度(50，60℃)下分别保温2、5、10、15、20、30时的相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。结果在50℃下处理30min后酶活没有下降，60℃处理30min后仍有5％的酶活，耐热性较好(图5)。

[0170] 实施例6α-半乳糖苷酶Aga-F75对蛋白酶的抗性

[0171] 将蛋白酶分别用下列溶液配制成1mg/mL的溶液：用pH 7.00.1mol/L Tris-HCl将胰蛋白酶、α-糜蛋白酶配成1mg/mL的溶液；用pH7.50.1mol/L Tris-HCl将蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶A、胶原蛋白酶配成1mg/mL的溶液；用pH10.00.1mol/L甘氨酸-NaOH将proleather、碱性蛋白酶配成1mg/mL的溶液。将纯化的α-半乳糖苷酶与蛋白酶按10∶1(w/w)在该蛋白酶缓冲液中处理30min后，按标准方法检测处理酶的剩余酶活。结果表明，用不同蛋白酶处理后Aga-F75的剩余酶活分别为103.26％(胰蛋白酶)，99.50％(α-糜蛋白酶)，78.72％(蛋白酶K)，98.30％(枯草芽孢杆菌蛋白酶A)，100.53％(胶原蛋白酶)，80.95％(proleather)和53.75％(碱性蛋白酶)，Aga-F75对各种蛋白酶的抗性较强(图6)。

[0172] 实施例7α-半乳糖苷酶Aga-F75的底物特异性

[0173] 将蜜二糖、棉子糖、水苏糖溶解于0.1mol/L，pH4.0的McIlvaine缓冲液中，浓度各1mg/mL，用1U/mL和3U/mL的α-半乳糖苷酶分别与这些底物在37℃下作用24h。半乳糖的释放用离子交换色谱仪CARBOPAC PA10(Dionex Corporation，USA)进行测定。结果表明(表1)，Aga-F75分解天然底物的能力为棉子糖＞水苏糖＞密二糖。并且3个单位的酶要比1个单位的酶分解能力更强一些。

[0174] 表1Aga-F75对不同底物的降解能力

[0175]

[0176]

[0177] 序列表

[0178] <110>中国农业科学院饲料研究所

[0179] <120>一种抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶Aga-F75及其基因和应用

[0180] <160>3

[0181] <210>1

[0182] <211>744

[0183] <212>PRT

[0184] <213>赤霉菌(Gibberela.sp.F75)

[0185] <400>1

[0186] MVLVTLRGIT TTAVLFCQAI SALAESSDPI HVDGTSFALN GDNVSYRFHV

[0187] DNTTGDLIND 60[0188] HYGGPVAEDG ITAEIGPIQG WVNLIGRVRR EFPDHGRGDF RIPAFQLQQA

[0189] SGTTVTDFRY 120[0190] KSHEVVEGKP GLPGLPSTFG EADDVSTLVV RMYDNYSSIA VDLSYSIFPK

[0191] YDAVVRSVNI 180[0192] TNRGNATVNL KRVSSWSVDL QQDNLDLIEI RGDWAREGMR VRRKVDFGTQ

[0193] GFQSSTGYSS 240[0194] HLHNPFLALV ASTTTETQGE AWGFSLVYTG SFAVDVEKSS QGLTRAILGV

[0195] NSLDFSWPLK 300[0196] PGQTFTTPEV VSVFSNKGVG GMSRQFHRLY RKHLMKSKYA EETRPVLLNS

[0197] WEGLGFEINE 360[0198] TAIEKIAKQS ADLGIKLFVM DDGWFGNKYP RVNDSAGLGD WQPNKERFPD

[0199] GLTPLVENIT 420[0200] ELRIANASDD LKFGIWFEPE MVNPKSDLYD KHPDWAIHAG SYPRTETRNQ

[0201] LVLNVALPEV 480[0202] QEFIIDSVSK ILRESPISYV KWDNNRGIHE TPDPTLNYKY MLGLYHVFET

[0203] LTSRFPDVLW 540[0204] EGCASGGGRF DPGVLQWFPQ IWTSDDTDAV ERIAIQFGTS LAYPPSAMGA

[0205] HLSHVPNGNT 600[0206] QRITSVKFRA HVAMMGGSFG VELDPSDLEP EEREQIPGLI ELSEKINPIV

[0207] ITGDFYRLAL 660[0208] PEETNYPAGQ FISEDGKKVV LFAFQTRATI NNSWPWFRLQ GLDASAKYRV

[0209] DNNQTVSGST 720[0210] LMNMGIQLTF EGDYDSHVLM IEKQ 744

[0211] <210>2

[0212] <211>2852

[0213] <212>DNA

[0214] <213>赤霉菌(Gibberela.sp.F75)

[0215] <400>2

[0216] gtcagtttct attgcgcgga tatactcacg tcataccagt tatgtcagcg gtctcatctg 60[0217] ggatctgtgc tgatctcgac aacgatgacg atctgctcaa aggtatcttc gcagtcacat 120[0218] catcagtcac tctcccacaa ctcatccaga tcgccgagtc gagatcatca cgagcgctac 180[0219] atatgggatc tcgaatttcc tgtgactttg aactttgaac tgatgatctt ctctggggat 240[0220] ttataaacat gtcggctccc gcggattaaa cccctcggat ttgactttcg tttaaacaac 300[0221] ttttgctagg gtcaagatgg tgcttgttac attgaggggc attacgacga cggcagttct 360[0222] gttctgccag gccatttcgg ctctcgcgga gagctcagat cgtaagtctt catcttcatt 420[0223] attctcatac tgaacaatat taacatgtct gcagcaattc acgtcgacgg cacctctttc 480[0224] gccctcaacg gcgataacgt ctcataccgg ttccacgtcg acaacaccac tggagacctt 540[0225] atcaacgacc actacggcgg ccccgttgcc gaagatggaa tcaccgctga gatcggcccc 600[0226] atccaaggct gggtcaactt gatcggccgt gtccgacgcg aattccccga ccacggcaga 660[0227] ggagacttcc gcatcccagc gttccagctc caacaagcca gcggcacgac cgtcacagac 720[0228] tttcgctaca agtctcacga ggttgtagaa ggaaaacctg gattacctgg tcttccgtcg 780[0229] acgtttggcg aggctgatga tgtgtcgact ttggtggtgc gtatgtacga caattatagc 840[0230] tctattgctg ttgatctgtc gtattcgatc tttccgaaat atgatgctgt tgtgcggagt 900[0231] gtgaacatca cgaatcgtgg gaatgcgacg gtgaatttga aaagggtttc gagttggagt 960[0232] gttgatttac agcaggataa tctggacctt attgagatca ggggtgattg ggctcgtgag 1020[0233] ggcatgcgcg tgcgtcgaaa ggttgacttt ggaactcaag ggtgagcatc atttcggtga 1080[0234] agcaattaca cagactgcta acggcattgt agattccaaa gctctactgg ttattcgtct 1140[0235] catcttcaca acccgttcct cgctctcgtt gcatcaacga ctaccgaaac gcaaggcgaa 1200[0236] gcatggggct tctccctggt gtacaccggc tccttcgccg ttgacgtcga gaagagctca 1260[0237] cagggactca cccgcgccat tctcggtgtc aattctctcg acttctcgtg gccactgaaa 1320[0238] cctggacaaa ccttcaccac tcccgaggtc gtctccgtct tctcaaacaa aggtgtcggc 1380[0239] ggcatgtcca gacaatttca ccgcttgtac agaaagcatt tgatgaagag taaatatgca 1440[0240] gaagagacac gtcctgttct tctcaacagc tgggagggct tgggtttcga aatcaacgag 1500[0241] actgctattg aaaagatcgc caaacaatct gcagacctcg gtatcaagct gttcgtcatg 1560[0242] gatgatggct ggttcggtaa caagtacccg cgagttaacg attcagcggg tcttggagat 1620[0243] tggcagccta acaaggaacg cttccctgat gggttgactc ctctggtcga aaatatcacg 1680[0244] gaattgagaa ttgctaatgc ttccgatgat ctcaagttcg gtatctggtt cgagcccgaa 1740[0245] atggtgaacc ccaaatcaga cttgtatgac aaacaccccg actgggcgat ccacgcaggc 1800[0246] tcgtatcccc gaaccgagac acgtaatcaa ttggttctca atgtagctct gcccgaggtc 1860[0247] caagagttca tcatcgactc cgtctccaag attctccgcg aatcaccgat ttcctacgtc 1920[0248] aagtgggata acaaccgtgg aatccacgag acgcctgatc ctactctcaa ctacaagtat 1980[0249] atgcttggtc tttatcacgt ctttgagact ttgacgagtc gcttccctga tgttctgtgg 2040[0250] gaaggctgtg cttctggcgg tggtcggttt gatcccggtg ttcttcagtg gttccctcag 2100[0251] atttggacgt cggatgatac agatgcggtt gagcgtattg ctatccagtt cggcacgtca 2160[0252] cttgcgtacc ctccatctgc catgggagcc catctatcgc atgtgcctaa tggaaatacc 2220[0253] cagagaataa catccgtcaa gttcagagcc catgttgcaa tgatgggcgg ctcctttggc 2280[0254] gtcgaacttg acccaagcga tcttgagcct gaagagaggg aacagattcc tggtctcatt 2340[0255] gaactttctg aaaagattaa ccccatcgtc atcaccggcg acttttatag acttgcattg 2400[0256] cctgaggaaa ctaactaccc agctgggcag ttcatttctg aggatggcaa gaaagttgtc 2460[0257] ctttttgcgt tccagacgag ggcgactatc aataattctt ggccttggtt ccgacttcaa 2520[0258] ggtttggatg caagtgccaa gtacagggtg gacaataacc agacggtttc tggttcgacg 2580[0259] ctgatgaaca tgggtatcca attgacgttt gagggggatt atgatagcca tgtcttgatg 2640[0260] attgagaagc aatagttcgg gtggctaagc tatggatgac atactgtaaa tagcgcttca 2700[0261] aatacaagat tcgctcagat ctcaacgtcg acgcaagaca taaataactc gaactgttca 2760[0262] tccaacgcgt caaaacacac aagcaagctt tcaccaagat aattcatcga tcaccgacaa 2820[0263] ccttgcatcg tcaccctcca acgtccgcac ga 2852[0264] <210>3

[0265] <211>2235

[0266] <212>DNA

[0267] <213>赤霉菌(Gibberela.sp.F75)

[0268] <400>3：

[0269] atggtgcttg ttacattgag gggcattacg acgacggcag ttctgttctg ccaggccatt 60[0270] tcggctctcg cggagagctc agatccaatt cacgtcgacg gcacctcttt cgccctcaac 120[0271] ggcgataacg tctcataccg gttccacgtc gacaacacca ctggagacct tatcaacgac 180[0272] cactacggcg gccccgttgc cgaagatgga atcaccgctg agatcggccc catccaaggc 240[0273] tgggtcaact tgatcggccg tgtccgacgc gaattccccg accacggcag aggagacttc 300[0274] cgcatcccag cgttccagct ccaacaagcc agcggcacga ccgtcacaga ctttcgctac 360[0275] aagtctcacg aggttgtaga aggaaaacct ggattacctg gtcttccgtc gacgtttggc 420[0276] gaggctgatg atgtgtcgac tttggtggtg cgtatgtacg acaattatag ctctattgct 480[0277] gttgatctgt cgtattcgat ctttccgaaa tatgatgctg ttgtgcggag tgtgaacatc 540[0278] acgaatcgtg ggaatgcgac ggtgaatttg aaaagggttt cgagttggag tgttgattta 600[0279] cagcaggata atctggacct tattgagatc aggggtgatt gggctcgtga gggcatgcgc 660[0280] gtgcgtcgaa aggttgactt tggaactcaa gggttccaaa gctctactgg ttattcgtct 720[0281] catcttcaca acccgttcct cgctctcgtt gcatcaacga ctaccgaaac gcaaggcgaa 780[0282] gcatggggct tctccctggt gtacaccggc tccttcgccg ttgacgtcga gaagagctca 840[0283] cagggactca cccgcgccat tctcggtgtc aattctctcg acttctcgtg gccactgaaa 900[0284] cctggacaaa ccttcaccac tcccgaggtc gtctccgtct tctcaaacaa aggtgtcggc 960[0285] ggcatgtcca gacaatttca ccgcttgtac agaaagcatt tgatgaagag taaatatgca 1020[0286] gaagagacac gtcctgttct tctcaacagc tgggagggct tgggtttcga aatcaacgag 1080[0287] actgctattg aaaagatcgc caaacaatct gcagacctcg gtatcaagct gttcgtcatg 1140[0288] gatgatggct ggttcggtaa caagtacccg cgagttaacg attcagcggg tcttggagat 1200[0289] tggcagccta acaaggaacg cttccctgat gggttgactc ctctggtcga aaatatcacg 1260[0290] gaattgagaa ttgctaatgc ttccgatgat ctcaagttcg gtatctggtt cgagcccgaa 1320[0291] atggtgaacc ccaaatcaga cttgtatgac aaacaccccg actgggcgat ccacgcaggc 1380[0292] tcgtatcccc gaaccgagac acgtaatcaa ttggttctca atgtagctct gcccgaggtc 1440[0293] caagagttca tcatcgactc cgtctccaag attctccgcg aatcaccgat ttcctacgtc 1500[0294] aagtgggata acaaccgtgg aatccacgag acgcctgatc ctactctcaa ctacaagtat 1560[0295] atgcttggtc tttatcacgt ctttgagact ttgacgagtc gcttccctga tgttctgtgg 1620[0296] gaaggctgtg cttctggcgg tggtcggttt gatcccggtg ttcttcagtg gttccctcag 1680[0297] atttggacgt cggatgatac agatgcggtt gagcgtattg ctatccagtt cggcacgtca 1740[0298] cttgcgtacc ctccatctgc catgggagcc catctatcgc atgtgcctaa tggaaatacc 1800[0299] cagagaataa catccgtcaa gttcagagcc catgttgcaa tgatgggcgg ctcctttggc 1860[0300] gtcgaacttg acccaagcga tcttgagcct gaagagaggg aacagattcc tggtctcatt 1920[0301] gaactttctg aaaagattaa ccccatcgtc atcaccggcg acttttatag acttgcattg 1980[0302] cctgaggaaa ctaactaccc agctgggcag ttcatttctg aggatggcaa gaaagttgtc 2040[0303] ctttttgcgt tccagacgag ggcgactatc aataattctt ggccttggtt ccgacttcaa 2100[0304] ggtttggatg caagtgccaa gtacagggtg gacaataacc agacggtttc tggttcgacg 2160[0305] ctgatgaaca tgggtatcca attgacgttt gagggggatt atgatagcca tgtcttgatg 2220[0306] attgagaagc aatag 2235