培养双孢蘑菇菌丝体的方法和用于培养其的培养基

摘要

本发明提供培养双孢蘑菇菌丝体的方法和用于培养双孢蘑菇菌丝体的培养基，所述方法包括在包含甘蔗提取物的液体培养基中培养双孢蘑菇菌丝体或其孢子。

权利要求

1.培养双孢蘑菇(Agaricus bisporus)菌丝体的方法，所述方法包括在包含10-30g/l的甘蔗提取物、1-10g/l的硝酸钠和1-10g/l的酵母提取物的液体培养基中培养双孢蘑菇菌丝体或其孢子，其中所述培养双孢蘑菇菌丝体是在初始pH 6.0-6.5，培养温度25-28℃，同时以150-250rpm的搅动速率搅动下进行的，其中所述培养双孢蘑菇菌丝体在完成前进行3-6天。

2.权利要求1的方法，其中利用搅拌器分散所述双孢蘑菇菌丝体。

3.权利要求1的方法，所述方法还包括通过在液体培养基中预培养双孢蘑菇菌丝体或其孢子制备蘑菇种子培养物，所述液体培养基包括15-25g/l的马铃薯葡萄糖液体培养基、

1-10g/l的酵母提取物、2-5g/l的麦芽提取物、和2-5g/l的大豆胨。

4.权利要求3的方法，其中所述预培养双孢蘑菇菌丝体或其孢子是在初始pH

6.0-6.5，培养温度25-28℃，同时以150-250rpm的搅动速率搅动下进行的。

5.权利要求4的方法，所述方法还包括利用搅拌器分散预培养的蘑菇菌丝体。

说明书

培养双孢蘑菇菌丝体的方法和用于培养其的培养基

技术领域

[0001] 本发明涉及液体培养双孢蘑菇(Agaricus bisporus)菌丝体的方法。技术背景

[0002] 双孢蘑菇是一种属于蘑菇目蘑菇科(Agaricales Agaricaceae)的蘑菇。作为培养双孢蘑菇菌丝体的常规方法，已知固体培养方法和液体培养方法。固体培养方法具有这样的缺点，即培养时间长，污染可能性高，且难于在培养结束后自动化仅重获菌丝体的操作。

[0003] 与固体培养方法相比，双孢蘑菇的液体培养方法具有低污染可能性、和在相对紧凑的空间内短期大规模培养的优点。Hunfeid等写的论文(真菌学(Mycology)44：605-611，1952)公开了在摇动和供氧条件下液体培养双孢蘑菇菌丝体的方法。另外，Fraser等写的论文(蘑菇科学(MushroomSci.)3：190-200，1956)描述了酵母提取物和酪蛋白促进双孢蘑菇菌丝体的生长。而且，韩国专利公布号1997-0027295公开了利用选自由糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽提取物和淀粉糖浆组成的组中的至少一种作为碳源液体培养担子菌纲(Basidiomycetes)的方法。然而，该液体培养方法具有这样的缺点，即培养时间相对长，且由于使用单糖和二糖，所以成本高，且由此不适合于大规模培养。

发明内容

[0004] 技术问题

[0005] 如在上述现有技术中所见，仍存在对开发利用这样的培养基成分培养双孢蘑菇菌丝体方法的需要，所述培养基成分是便宜的，以适合于大规模培养，并且支持菌丝体的高度生长，从而减少培养时间和由此减少污染可能性。

[0006] 技术方案

[0007] 本发明提供有效培养双孢蘑菇菌丝体的方法。

[0008] 本发明还提供用于培养双孢蘑菇菌丝体的培养基。

[0009] 按照本发明的方面，提供了培养双孢蘑菇菌丝体的方法，其包括在包含甘蔗提取物的液体培养基中培养双孢蘑菇菌丝体或其孢子。

[0010] 甘蔗提取物可以具有10-30g/l的浓度。当甘蔗提取物的浓度低于10g/l时，双孢蘑菇菌丝体不能充分生长。当甘蔗提取物的浓度高于30g/l时，渗透压高并且过程不是成本经济型的。因此，浓度优选地在10-30g/l的范围内。甘蔗提取物主要用作碳源和生长因子来源。术语“甘蔗提取物”指通过提取甘蔗汁和再浓缩和结晶所述汁而制备的非精制的糖提取物。能够直接制备或商购甘蔗提取物。

[0011] 除甘蔗提取物外，所述培养基还可以包括营养物，诸如氮源、磷酸、痕量元素等。氮源可以是有机氮或无机氮，优选地是大豆胨(soytone)和硝酸钠，并且更优选地是硝酸钠。硝酸钠可以在培养基中具有1-10g/l的浓度。硝酸钠显示出被双孢蘑菇菌丝体的高吸收效率，很便宜，并维持培养基的pH恒定，而当使用其他基于铵的氮源时，培养基的pH改变。
当硝酸钠的浓度低于1g/l时，双孢蘑菇菌丝体生长所需的氮源不足。当硝酸钠的浓度高于10g/l时，没有很大地影响双孢蘑菇菌丝体的生长。因此，优选地，在培养基中使用1g/l-10g/l的硝酸钠。

[0012] 所述培养基可以包括浓度为1-10g/l的酵母提取物。

[0013] 培养双孢蘑菇菌丝体可以在培养基初始pH6.0-6.5，培养温度25-28℃，同时以150-250rpm的搅动速率搅动下进行。

[0014] 可以在接种前利用搅拌器分散双孢蘑菇菌丝体。当培养接种物时，随着菌丝体的生长形成大的团块，由此难于供氧。因此，为了防止氧气供应的限制，接种前需要将菌丝体分散为小粒子。

[0015] 双孢蘑菇菌丝体培养可以进行到直到获得需要量的菌丝体。例如，培养期通常可以是3-10天，和优选地是3-6天。按照本发明的实施方案，需要3-6天的培养期，从而获得双孢蘑菇菌丝体的理想最大产量。因此，与现有技术中获得双孢蘑菇菌丝体理想最大产量需要14-15天的培养期相比，按照本发明的双孢蘑菇菌丝体的培养期能够缩短许多。

[0016] 培养双孢蘑菇菌丝体还可以包括在液体培养基中预培养双孢蘑菇菌丝体或其孢子，所述液体培养基包括15-25g/了的马铃薯葡萄糖液体培养基、1-10g/l的酵母提取物、2-5g/l麦芽提取物、和2-5g/l的大豆胨。

[0017] 预培养指在进行双孢蘑菇菌丝体的主培养前为了从原始菌株获得蘑菇种子培养物的初步培养。原始菌株指从中起源种子培养物的菌株。种子培养物指理想菌株，即原始菌株的纯培养，且接种物指为了增殖被接种到培养基中的种子培养物。

[0018] 预培养可以在初始pH6.0-6.5，培养温度25-28℃，并且同时以150-250rpm的搅动速率搅动下进行。获得的菌丝体能够利用搅拌器分散。在预培养过程中，由于菌丝体的生长可以形成大团块，并由此限制氧气的供应。因此，为了防止氧气供应的限制，需要将菌丝体分散为小粒子。预培养能够进行到直到获得增殖所需的种子培养物的量，并且预培养通常需要3-4天。

[0019] 本发明还提供用于培养双孢蘑菇菌丝体的培养基。所述培养基包括甘蔗提取物，并且可以优选地包括浓度为10-30g/l的甘蔗提取物。所述培养基还可以包括硝酸钠作为氮源。优选地，所述培养基可以包括浓度为1-10g/l的硝酸钠。另外，所述培养基还可以包括浓度为1-10g/l的酵母提取物。该培养基可以具有6.0-6.5的初始pH值。

[0020] 按照本发明实施方案的培养基可以优选地包括浓度为15-25g/l的甘蔗提取物和浓度为5-10g/l硝酸钠，并且更优选地，还包括浓度为5-10g/l的酵母提取物。

[0021] 本发明还提供用于预培养双孢蘑菇菌丝体或其孢子的培养基，所述培养基包括15-25g/l的马铃薯葡萄糖液体培养基、1-10g/l的酵母提取物、2-5g/l的麦芽提取物、和
2-5g/l的大豆胨。

[0022] 附图简述

[0023] 通过参考附图详细描述本发明的示范性实施方案，本发明的以上和其他特征和优点将变得更加清楚，在所述附图中：

[0024] 图1是按照本发明实施方案的双孢蘑菇菌丝体电子显微镜图像；

[0025] 图2显示按照本发明的实施方案，与培养温度相关的双孢蘑菇菌丝体生长；

[0026] 图3显示按照本发明的实施方案，与初始pH相关的双孢蘑菇菌丝体生长；

[0027] 图4显示按照本发明的实施方案，与培养期相关的双孢蘑菇菌丝体生长；

[0028] 图5显示按照本发明的实施方案，与培养基中碳源类型相关的双孢蘑菇菌丝体生长；

[0029] 图6显示按照本发明的实施方案，与作为碳源使用的甘蔗提取物浓度相关的双孢蘑菇菌丝体生长；

[0030] 图7显示按照本发明的实施方案，与培养基中氮源类型相关的双孢蘑菇菌丝体生长；

[0031] 图8显示按照本发明的实施方案，与作为氮源使用的硝酸钠浓度相关的双孢蘑菇菌丝体生长；

[0032] 图9显示按照本发明的实施方案，与生物反应器搅动速率相关的双孢蘑菇菌丝体生长。

[0033] 最佳实施方式

[0034] 在下文中，将参考下列实施例更明确地描述本发明。下列实施例是为了举例说明的目的，而非意欲限制本发明的范围。

[0035] 实施例1：分离菌株和制备接种物

[0036] 通过组织培养获得双孢蘑菇菌株，并且将获得的菌株在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上在25℃培养3周，并且然后将获得双孢蘑菇菌丝体保存在4℃。

[0037] 图1是按照本发明实施方案的双孢蘑菇菌丝体电子显微镜图像。

[0038] 为了利用固体培养制备接种物，从保存在冰箱中的PDA平板培养基的中心部分分离菌丝体，并接种在固体培养基中，并然后在温度为25℃的恒温箱中培养，从而获得接种物。当通过液体培养从双孢蘑菇菌丝体制备接种物时，在121℃，高压灭菌在500ml锥形瓶中的100ml PDBYMS培养基15分钟，所述PDBYMS培养基包括20g/l马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)、10g/l酵母提取物、5g/l麦芽提取物和5g/l大豆胨，并且然后将菌丝体接种到PDBYMS培养基中，并在200rpm搅动速率下培养。在下列实施例中，除特别指明的成分以外，培养基的剩余部分是蒸馏水。

[0039] 实施例2：种子预培养

[0040] 为了检查种子预培养的最适条件，制备了具有下表1中所示成分的培养基。将100ml各种制备的培养基加入的500ml锥形瓶中，然后在121℃高压灭菌15分钟。然后将1％(v/v)在无菌条件下搅匀的接种物接种到其中，并在温度为25℃的恒温箱中，以200rpm摇动下，培养4天。为了测量菌丝体的生长，利用纱布过滤培养基，并利用超速离心机，以1500rpm，分离10分钟，然后在温度为60℃的干燥箱中干燥24小时，从而测量菌丝体的干重。

[0041] 表1

[0042]实验组 PDB 酵母提 麦芽提 大豆胨 重量 干重
(g/l) 取物 取物 (g/l) (g/100ml) (g/100ml)
(g/l) (g/l)
P1 0 10 5 5 6.49 0.46
P2 5 10 5 5 7.50 0.65
P3 10 10 5 5 8.35 0.93
P4 15 10 5 5 7.65 1.01

[0043] 如表1中所示，当使用包括24g/l PDB、10g/l酵母提取物、2-5g/l麦芽提取物和2-5g/l大豆胨的培养基时，菌丝体的生长最高。

[0044] 因此，使用包括24g/l PDB、10g/l酵母提取物、5g/l麦芽提取物和5g/l大豆胨的培养基作为预培养种子培养物的培养基。另外，作为用于设置最适培养条件的基础培养基，使用了包括24g/l PDB、10g/l酵母提取物、5g/l麦芽提取物、和5g/l大豆胨的PDBYMS培养基。

[0045] 在主培养前，利用搅拌器分散在预培养中随着双孢蘑菇菌丝体的生长而形成的团块。所述搅拌器是韩国专利公布号1998-0072112中公开的小搅拌机类型。

[0046] 实施例3：设定主培养的最适条件

[0047] 1.最适温度

[0048] 为了检查生长双孢蘑菇菌丝体的最适培养温度，将100ml基础培养基加入到500ml锥形瓶中，并且然后在121℃高压灭菌15分钟。然后，将1％(v/v)在无菌条件下搅匀的接种物接种到其中，并且在以200rpm摇动的同时，在温度为25℃的恒温箱中培养4天，从而检查菌丝体的生长。除了使用28℃和然后30℃的温度以外，在相同条件下重复该过程。

[0049] 图2显示按照本发明的实施方案，与培养温度相关的双孢蘑菇菌丝体生长[0050] 参考图2，菌丝体在28℃和30℃生长极好，并且特别地，在28℃显示出最高值。

[0051] 2.最适pH

[0052] 为了检查生长菌丝体的最适初始pH，将100ml初始pH4.0的基础培养基加入到500ml锥形瓶中。然后，在121℃高压灭菌该培养基15分钟，并将1％(v/v)在无菌条件下搅匀的接种物接种到其中，并然后在以25℃和200rpm摇动的同时培养4天，从而检查菌丝体的生长。除了利用磷酸和50％NaOH以0.5的增量将pH调节到4.5-9.0范围内以外，在相同条件下重复该过程。

[0053] 图3显示按照本发明的实施方案，与初始pH相关的双孢蘑菇菌丝体生长。参考图3，在pH6.0时，观察到菌丝体的生长达到最高。

[0054] 3.培养期

[0055] 为了检查培养期怎样影响双孢蘑菇菌丝体生长，将100ml基础培养基加入到500ml锥形瓶中，并然后将初始pH调节到6.0-6.5范围内。然后，在121℃高压灭菌该培养基15分钟，将1％(v/v)在无菌条件下搅匀的接种物接种到其中，并然后在以25℃和
200rpm摇动的同时培养10天，从而检查菌丝体的生长。

[0056] 图4显示按照本发明的实施方案，与培养期相关的双孢蘑菇菌丝体生长。参考图4，菌丝体的生长缓慢增长直到培养期2天时，并从第三天起快速增长，显示出典型的指数生长期。菌丝体的最大量是在第九天的2.43g/100ml，并且菌丝体的生长在其后下降。由图
4中所示的结果，确定了6天培养期作为最适培养期，该6天培养期显示出与9天培养期时菌丝体量的微小差别。

[0057] 4.选择碳源及其最适浓度

[0058] 为了选择用于本培养的最适培养基，改良基础培养基，从而检查其对菌丝体生长的影响。

[0059] 即，将作为碳源的20g/l PDB与10g/l酵母提取物、5g/l麦芽提取物和5g/l大豆胨混合。再将培养基的pH调节为6.0-6.5，并且然后将100ml该培养基加入到500ml锥形瓶中，并在121℃高压灭菌15分钟，从而制备试验培养基。然后，将1％(v/v)在无菌条件下搅匀的接种物接种到其中，并在以200rpm摇动的同时，在25℃培养4天，从而检查菌丝体的生长。除了使用葡萄糖和甘蔗提取物(CJ公司(CJ Corporation))作为碳源以外，在相同条件下重复该过程。

[0060] 图5显示按照本发明的实施方案，与培养基中碳源类型相关的双孢蘑菇菌丝体生长。参考图5，当使用甘蔗提取物作为碳来源时，菌丝体的生长最有效。

[0061] 其次，为了选择碳源的最适浓度，制备了与10g/l酵母提取物、5g/l麦芽提取物和5g/l大豆胨相混合的分别包括1g/l、5g/l、10g/l、15g/l和20g/l甘蔗提取物的培养基。然后将每种培养基的pH调节为6.0-6.5，并将100ml所述培养基加入到500ml锥形瓶中，并且然后在121℃高压灭菌15分钟，从而制备具有不同的碳源浓度的一系列培养基。然后，以与选择碳源试验中相同的方式检查菌丝体的生长。

[0062] 图6显示按照本发明的实施方案，与作为碳源使用的甘蔗提取物浓度相关的双孢蘑菇菌丝体生长。参考图6，当甘蔗提取物的浓度是10-20g/l时，菌丝体生长极好。

[0063] 5.选择氮源及其最适浓度

[0064] 为了检查对于双孢蘑菇菌丝体生长最适的氮来源和浓度，将20g/l甘蔗提取物，即最适碳源添加到PDBYMS培养基中。然后向其中加入10g/l硝酸钠作为氮源。将培养基的pH调节到6.0-6.5，将100ml该培养基加入到500ml锥形瓶中，并在121℃高压灭菌15分钟，从而制备培养基。除了使用硝酸铵、氯化铵、硫酸铵和然后大豆胨作为氮源以外，在相同条件下重复该过程。然后，以与选择碳源试验中相同的方式检查菌丝体的生长。

[0065] 图7显示按照本发明的实施方案，与培养基中氮源类型相关的双孢蘑菇菌丝体生长。参考图7，当使用大豆胨作为氮来源时，菌丝体的生长最高，其次是硝酸钠。当考虑经济因素和生长效果时，硝酸钠作为氮源可以是最优选的。

[0066] 其次，为了选择氮来源的最适浓度，除使用1g/l、3g/l、5g/l、7g/l和10g/l的硝酸钠外，以与选择氮源试验中相同的方式检查菌丝体的生长。

[0067] 图8显示按照本发明的实施方案，与作为氮源使用的硝酸钠浓度相关的双孢蘑菇菌丝体生长。参考图8，当硝酸钠的浓度是10g/l时，菌丝体的生长最高。另外的试验显示，当培养基包括10g/l硝酸钠作为氮源、和5g/l酵母提取物时，菌丝体的生长达到最高。

[0068] 实施例4：在生物反应器中液体培养双孢蘑菇菌丝体----最适叶轮转数[0069] 为了大规模培养双孢蘑菇菌丝体，在生物反应器中搅动的同时培养菌丝体。

[0070] 使用BIOFLO IIc批/连续发酵器(BIOFLO IIc Batch/ContinuousFermentor)(New Brunsdwick Scientific.)用作生物反应器。使用在蒸馏水中包含20g/l甘蔗提取物、10g/l硝酸钠和5g/l酵母提取物的培养基作为培养基，并将1％(v/v)在无菌条件下搅匀的接种物接种到21所述培养基中。然后，利用0.25v/v/m的空气供应，在生物反应器叶轮转速150rpm下，培养接种物4天，从而测量湿重。除了分别使用叶轮转速200rpm、250rpm和300rpm以外，在相同条件下重复该过程。

[0071] 图9显示按照本发明的实施方案，与生物反应器叶轮转速相关的双孢蘑菇菌丝体生长。参考图9，当叶轮转速是200rpm时，获得最大量的菌丝体。

[0072] 工业适用性

[0073] 按照本发明的培养双孢蘑菇菌丝体的方法，能够在短期内有效地培养大量的双孢蘑菇菌丝体。