一种羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种纳米级羟基喜树碱晶体冻干粉制剂的制备方法。其主要原料组成为：活性原料羟基喜树碱，磷脂，表面活性剂泊洛沙姆188或聚乙二醇硬脂酸酯-15和冻干辅料赋形剂。其制备方法为：羟基喜树碱溶加入碱溶液溶解后，水浴超声加磷脂，磁力搅拌加入泊洛沙姆188或聚乙二醇硬脂酸酯-15溶解；冰醋酸调节pH值至4.0～6.0，析出羟基喜树碱结晶；然后高压匀质，得到羟基喜树碱纳米结晶悬浮液，再加入冻干辅料赋形剂，冻干得到羟基喜树碱纳米晶体冻干粉制剂。该方法简单易操作。该纳米结晶冻干粉具有分散度高，稳定性好等优点。平均晶体大小为355.6nm，样品中羟基喜树碱平均含量为标示量的98.5％，该制剂抑制和杀灭肝癌和胃癌细胞作用显著强于羟基喜树碱注射液。

权利要求

1.一种羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的制备方法，其特征在于：它是按下述步骤进行的：(1)将1～6重量份的羟基喜树碱溶分散于蒸馏水中，用氢氧化钠调节溶液pH值为9～

12；

(2)将2～12重量份的磷脂加入到步骤(1)得到的溶液中，水浴超声分散；

(3)将0～10重量份的泊洛沙姆188或聚乙二醇硬脂酸酯-15添加到步骤(2)得到的溶液中，在33～38℃水浴下搅拌溶解；

(4)用酸调节步骤(3)得到的溶液的pH值至4.0～6.0，析出羟基喜树碱结晶；

(5)将步骤(4)得到的悬浮液在3000～18000PSI的压力下，匀质2～20次，得到羟基喜树碱纳米晶体悬浮液，羟基喜树碱结晶大小为200～600nm。

(6)将0.5～10重量份的冻干辅料赋形剂加入步骤5得到的羟基喜树碱纳米晶体悬浮液中，搅拌溶解；

(7)将步骤(6)得到的羟基喜树碱纳米晶体悬浮液进行冷冻干燥，得到羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂。

2.根据权利要求1所述的制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的方法，其特征在于：在所述步骤2中，水浴超声时间为1～10分钟，温度为25～40℃。

3.如权利要求1或2所述的制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，析出羟基喜树碱结晶大小为600～1500nm。

4.根据权利要求2所述羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的制备方法，其特征在于：在所述步骤(7)中，冷冻干燥是在-60～-70℃，0.5～0.1Pa条件下进行真空冷冻干燥。

5.根据权利要求3所述羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的制备方法，其特征是：在所述步骤(7)中，冷冻干燥是在-60～-70℃，0.5～0.1Pa条件下进行真空冷冻干燥。

说明书

一种羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抗癌药物，具体涉及一种羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂，本发明还涉及该制剂的制备方法。

[0002] 背景技术

[0003] 羟基喜树碱是上世纪60-70年代从中国喜树中提取的同类抗肿瘤单体中抗癌作用最强的微量生物碱，属于细胞周期特异性药物，主要作用于DNA合成期(S-期)。HCPT为拓扑异构酶I(Topo I)特异性抑制剂，通过抑制DNA超螺旋结构松弛过程中的再连接步骤，导致单链和双链DNA断裂，触发细胞死亡。临床主要用于原发性肝癌、胃癌、头颈部癌、腺原性上皮癌、白血病、膀胱癌等恶性肿瘤的放化疗；毒性反应主要表现在泌尿系统、消化系统及造血功能的抑制等，但其毒性明显低于喜树碱，特别是泌尿系统反应少，临床上易被接受。目前，羟基喜树碱主要以注射液在临床上的应用，注射液在临床应用上存在的主要问题有：(1)半衰期短(静脉注射分布半衰期(t1/2a)为4.5min，消除半衰期(t1/2β)为29min)，需反复给药或延长疗程，导致剂量限制性毒性-骨髓抑制和消化道毒性也随之增加。(2)静脉给药后主要分布于胆囊，而癌症常发组织器官如肝、肺、胃等组织的分布并不理想。(3)羟基喜树碱脂溶性水溶性都不好，制成水溶性钠盐的抗癌活性降低90％，毒副作用增大；稳定性差，药物的内酯环对光、pH敏感，抗肿瘤生物学功能较强的闭环内脂结构转化为功能较弱的开环羧酸盐结构，药理活性大大下降。由于上述原因，阻碍了羟基喜树碱充分发挥抗肿瘤作用，限制了其临床应用。

[0004] 目前国内外已有采用溶剂挥发法制备羟基喜树碱豆磷脂纳米冻干制剂的方法，该方法制备的羟基喜树碱豆磷脂纳米冻干制剂虽在一定程度上能够克服现有注射液的不足，但是该方法需用大量的低沸点的有机溶剂，对环境保护不利，且易导致有机溶剂在制剂中残留，影响药物的治疗效果。

[0005] 发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂，制剂中羟基喜树碱以纳米晶体状态存在，制剂重分散性好，稳定性高。 [0007] 本发明的目的还在于提供一种制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的方法，该方法在制备过程中采用碱溶解药物，不使有机溶剂，避免了环境污染和制剂中残留有机溶剂对药物疗效的影响。

[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

[0009] 本发明的羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂，它主要有下述重量份的原料制成： [0010] 羟基喜树碱1～6重量份

[0011] 磷脂2～12重量份

[0012] 泊洛沙姆188或聚乙二醇硬脂酸酯-150～10重量份

[0013] 冻干辅料赋形剂0.5～10重量份。

[0014] 本发明中所述磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂中的一种。所述的冻干辅料赋形剂为甘露醇或注射用葡萄糖或注射用乳糖中的一种。

[0015] 本发明的羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的制备方法，它是按下述步骤进行的：

[0016] (1)将1～6重量份的羟基喜树碱溶分散于蒸馏水中，用氢氧化钠调节溶液pH值为9～12；

[0017] (2)将2～12重量份的磷脂加入到步骤(1)得到的溶液中，水浴超声分散； [0018] (3)将0～10重量份的泊洛沙姆188或聚乙二醇硬脂酸酯-15添加到步骤(2)得到的溶液中，在33～38℃水浴下搅拌溶解；

[0019] (4)用酸调节步骤(3)得到的溶液的pH值至4.0～6.0，析出羟基喜树碱结晶； [0020] (5)将步骤(4)得到的悬浮液在3000～18000PSI的压力下，匀质2～20次，得到羟基喜树碱纳米晶体悬浮液，羟基喜树碱结晶大小为200～600nm。

[0021] (6)将0.5～10重量份的冻干辅料赋形剂加入步骤5得到的羟基喜树碱纳米晶体悬浮液中，搅拌溶解；

[0022] (7)将步骤(6)得到的羟基喜树碱纳米晶体悬浮液进行冷冻干燥，得到羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂。

[0023] 在所述步骤(2)中，水浴超声时间为1～10分钟，温度为25～40℃。 [0024] 在所述步骤(4)中，析出羟基喜树碱结晶大小为600～1500nm。 [0025] 在所述步骤(7)中，冷冻干燥是在-60～-70℃，0.5～0.1Pa条件下进行真空冷冻干燥。

[0026] 本发明的羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂中羟基喜树碱以纳米晶体状态存在，见附图1，该状态能保持羟基喜树碱结构中的内脂环为闭环状态，使治疗药物成分羟基喜树碱稳定，降低由于内脂环结构降解而产生的副反应，从而提高疗效。该制剂重分散性好，稳定性高。静脉注射给药后，对肝脏和肺有较高的选择性，而在其他器官中分布量较少，从而达到提高羟基喜树碱对肝癌和肺癌的治疗效果，减少对其他正常组织细胞的影响，最终实现提高抗肿瘤药物治疗的顺应性，提高患者的生存质量，延长生存时间的效果。 [0027] 本发明提供的制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的方法，该方法在制备过程中采用碱溶解药物，不使用有机溶剂，避免了环境污染和制剂中残留有机溶剂对药物治疗的影响。本制备方法简单，易实现，不会产生有机溶剂残留，药物含量高。 附图说明

[0028] 图1是羟基喜树碱纳米晶体透射电镜图。

[0029] 图2是羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂制备方法流程图。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例对本发明作详细说明

[0031] 实施例1

[0032] (1)制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的主要原料：

[0033] 羟基喜树碱1重量份，

[0034] 大豆卵磷脂2重量份，

[0035] 表面活性剂泊洛沙姆1881重量份，

[0036] 甘露醇0.5重量份。

[0037] (2)制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的方法：

[0038] 将1重量份的羟基喜树碱溶置于100ml容器中配制水溶液90ml，加入氢氧化钠调节pH值为9，用玻棒搅拌溶解后，再加入大豆卵磷脂2重量份，25℃水浴超声10分钟溶解；35℃水浴磁力搅拌加入1重量份的表面活性剂泊洛沙姆188溶解；用冰醋酸调节pH值为
4.0；高压匀质压力为3000PSI，匀质20次，加入甘露醇水溶液至100ml，分装于西林瓶中，每瓶2ml，冻干得到成品。

[0039] 实施例2

[0040] (1)制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的主要原料：

[0041] 羟基喜树碱2重量份，

[0042] 蛋黄卵磷脂4重量份，

[0043] 表面活性剂聚乙二醇硬脂酸酯-15 5重量份，

[0044] 甘露醇1重量份。

[0045] (2)制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的方法：

[0046] 将2重量份的羟基喜树碱溶置于100ml容器中配制水溶液90ml，加入氢氧化钠调节pH值为12，用玻棒搅拌溶解后，再加入大豆卵磷脂4重量份，40℃水浴超声1分钟溶解；33℃水浴磁力搅拌加入5重量份的表面活性剂泊洛沙姆188溶解；用冰醋酸调节pH值为
6.0；高压匀质压力为18000PSI，匀质2次，加入甘露醇水溶液至100ml，分装于西林瓶中，每瓶2ml，冻干得到成品。

[0047] 实施例3

[0048] (1)制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的主要原料：

[0049] 羟基喜树碱3重量份，

[0050] 大豆卵磷脂6重量份，

[0051] 聚乙二醇硬脂酸酯-15 6重量份，

[0052] 注射用葡萄糖5重量份。

[0053] (2)制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的方法：

[0054] 将3重量份的羟基喜树碱溶置于100ml容器中配制水溶液90ml，加入氢氧化钠调节pH值为10，用玻棒搅拌溶解后，再加入大豆卵磷脂6重量份，30℃水浴超声5分钟溶解；34℃水浴磁力搅拌加入6重量份的表面活性剂泊洛沙姆188溶解；用冰醋酸调节pH值为
5.0；高压匀质压力为6000PSI，匀质10次，加入注射用葡萄糖水溶液至100ml，分装于西林瓶中，每瓶2ml，冻干得到成品。

[0055] 实施例4

[0056] (1)制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的主要原料：

[0057] 羟基喜树碱6重量份，

[0058] 大豆卵磷脂12重量份，

[0059] 表面活性剂泊洛沙姆188 10重量份，

[0060] 注射用葡萄糖10重量份。

[0061] (2)制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的方法：

[0062] 将6重量份的羟基喜树碱溶置于100ml容器中配制水溶液90ml，加入氢氧化钠调节pH值为11，用玻棒搅拌溶解后，再加入大豆卵磷脂12重量份，35℃水浴超声8分钟溶解；36℃水浴磁力搅拌加入10重量份的表面活性剂泊洛沙姆 188溶解；用冰醋酸调节pH值为
5.5；高压匀质压力为10000PSI，匀质15次，加入注射用葡萄糖水溶液至100ml，分装于西林瓶中，每瓶2ml，冻干得到成品。

[0063] 实施例5

[0064] (1)制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的主要原料：

[0065] 羟基喜树碱5.5重量份，

[0066] 大豆卵磷脂11重量份，

[0067] 注射用葡萄糖1.5重量份。

[0068] (2)制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的方法：

[0069] 将5.5重量份的羟基喜树碱溶置于100ml容器中配制水溶液90ml，加入氢氧化钠调节pH值为11，用玻棒搅拌溶解后，再加入大豆卵磷脂12重量份，37℃水浴超声8分钟溶解；用冰醋酸调节pH值为5.5；高压匀质压力为12000PSI，匀质12次，加入注射用葡萄糖水溶液至100ml，分装于西林瓶中，每瓶2ml，冻干得到成品。

[0070] 实施例6

[0071] (1)制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的主要原料：

[0072] 羟基喜树碱4重量份，

[0073] 蛋黄卵磷脂10重量份，

[0074] 聚乙二醇硬脂酸酯-15 8重量份，

[0075] 注射用乳糖8重量份。

[0076] (2)制备羟基喜树碱纳米晶体冻干粉针制剂的方法：

[0077] 将6重量份的羟基喜树碱溶置于100ml容器中配制水溶液90ml，加入氢氧化钠调节pH值为11，用玻棒搅拌溶解后，再加入大豆卵磷脂12重量份，35℃水浴超声8分钟溶解；38℃水浴磁力搅拌加入10重量份的表面活性剂泊洛沙姆188溶解；用冰醋酸调节pH值为
5.5；高压匀质压力为8000PSI，匀质15次，加入注射用乳糖水溶液至100ml，分装于西林瓶中，每瓶2ml，冻干得到成品。

[0078] 对上述工艺制备的药品做质量检测：

[0079] 羟基喜树碱纳米结晶大小、PDI和zeta电位的测定：取样品加水适当稀释或将冻干粉重新分散到水中，采用纳米粒度和zeta电位测定仪测定羟基喜树碱纳米结晶大小、PDI和zeta电位，结果见表1～3。

[0080] 表1羟基喜树碱纳米结晶大小(nm)

[0081]

[0082] 表2羟基喜树碱纳米结晶的PDI

[0083]

[0084] 表3羟基喜树碱纳米结晶的zeta电位(mV)

[0085]

[0086] 含量测定：取羟基喜树碱纳米晶体冻干粉，用流动相(乙腈∶0.1％三乙胺-磷酸缓冲液＝75∶25)溶解并定容至100ml，脱气，进样20μ1，记录色谱图，以对照品溶液作为外标，按外标法，以峰面积计算，得样品中羟基喜树碱的含量为标示量的98.7％、97.6％、99.2％、98.2％、99.3％和98.5％。

[0087] 体外药效学实验：

[0088] 羟基喜树碱纳米晶体冻干粉对肝癌和胃癌细胞抑制作用的研究 [0089] 肝癌细胞SMMC-7721和胃癌细胞SGC-7901细胞生长于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中。细胞培养条件均为：37℃，5％CO2、饱和湿度、每2-3天用0.25％胰5
酶消化传代。取指数生长期细胞供实验。以0.5×10/ml细胞接种于96孔培养板，每孔
100μL，在37℃，5％CO2条件下培养。用RPMI-1640培养液分别稀释羟基喜树碱纳米晶体冻干粉和羟基喜树碱注射液至实验所需浓度， 于细胞接种24h后，加入96孔板，每孔100μl。
调零组和对照组加相应体积的培养液，每组设4个平行孔。培养72h后，每孔加5mg/mL MTT
20μL(调零组除外)，再培养4h，倾去培养液，加DMSO 150mL/孔，待沉淀完全溶解后，用酶标仪在波长490nm处调零后读取吸光度(A)。以不加药的肿瘤细胞组为对照，计算IC50值。 [0090] 以MTT法测定羟基喜树碱纳米晶体冻干粉对SMMC-7721和SGC-7901两种肿瘤细胞生长的抑制。羟基喜树碱纳米晶体冻干粉对SMMC-7721和SGC-7901肿瘤细胞生长有明显的抑制和杀伤作用。随着羟基喜树碱纳米晶体冻干粉量的增高，其抑制程度增强，与对照制剂羟基喜树碱注射液相比，有显著的差异(p＜0.001)。羟基喜树碱纳米晶体冻干粉作用于SMMC-7721和SGC-7901两种肿瘤细胞的IC50值分别比羟基喜树碱注射液小7.61和6.73倍，结果见表4。结果表明，羟基喜树碱纳米晶体冻干粉对SMMC-7721和SGC-7901两种肿瘤细胞的抑制作用明显优于羟基喜树碱注射液。

[0091] 表4羟基喜树碱纳米晶体冻干粉和注射液对两种肿瘤细胞的IC50值(ng/ml) [0092]