美人鱼发光杆菌疫苗及其制备方法和应用

摘要

本发明公开一种美人鱼发光杆菌疫苗及其制备方法和应用，该疫苗是由美人鱼发光杆菌脂多糖和佐剂组成。本发明先灭活美人鱼发光杆菌，然后从中提取美人鱼发光杆菌脂多糖，再将该脂多糖与佐剂混合从而得到美人鱼发光杆菌疫苗。本发明的疫苗可用于鱼类，尤其是海水鱼类的疾病防治。本发明的疫苗安全高效，且制备方法简单，成本低廉，有利于大规模推广。

权利要求

1.一种美人鱼发光杆菌疫苗，由美人鱼发光杆菌脂多糖和佐剂混合制成；每1ml疫苗含有美人鱼发光杆菌脂多糖0.25～1mg；所述佐剂为弗氏不完全佐剂。

2.根据权利要求1所述美人鱼发光杆菌疫苗，其特征在于所述疫苗中，每1ml疫苗含有美人鱼发光杆菌脂多糖0.5mg。

3.一种制备权利要求1所述美人鱼发光杆菌疫苗的方法，其特征在于该方法是先灭活美人鱼发光杆菌，然后从中提取美人鱼发光杆菌脂多糖，再将该脂多糖与佐剂混合得到美人鱼发光杆菌疫苗。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于所述美人鱼发光杆菌脂多糖的提取方法为酚水法。

5.权利要求1所述美人鱼发光杆菌疫苗在制备防治鱼类疾病药物中的应用。

说明书

美人鱼发光杆菌疫苗及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及鱼类疾病防治领域，具体涉及一种美人鱼发光杆菌疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae subsp.damselae)是一种革兰氏阴性，可以发光的，嗜盐条件性致病菌，它最初是1981年，从在温暖海水中生长的鲱鱼的溃疡伤口中分离到的，并分类到弧菌属，称为美人鱼弧菌，广泛分布于海洋、近海岸及海水生物中。它能引起的人畜病症与弧菌属相似，均能引起人类肠胃炎、伤口感染和人畜败血病(CURRENT MICROBIOLOGY Vo1.48(2004)，pp.167-174Cloning and Characterization of the Gene Encoding forOMP-PD Porin：The Major Photobacterium damsela Outer Membrane Protein)。

[0003] 美人鱼发光杆菌是一种具极端破坏性的引起组织坏死传染病的细菌，国外许多学者称之为“人鱼共患病原菌”，它不仅会引起假结核病和鱼出血性败血症，导致渔产养殖损失50％以上，还能通过人的伤口或者是食用未熟海产品而使人致病，如它能导致健康人类的伤口感染，原发性败血症，甚至还能引起致命坏死性筋膜炎等，在日本就发生过多起渔民感染了美人鱼发光杆菌而严重致病的事件。更可怕的是，越来越多的报道表明美人鱼发光杆菌具有强致死性，能同时以有免疫缺陷或者是健康人为宿主，并诱发快速的，爆发性的传染(Fraser SL，Purcell BK，Delgado B Jr，Baker AE，Whelen AC.Rapidly fatal infection due to Photobacterium(Vibrio)damela.Clin Infect Dis 1997；25：935-936.)。

[0004] 目前的研究证实美人鱼发光杆菌的致病因子有细胞外溶血素、美人鱼细胞溶解素、外膜蛋白和神经氨酸酶等。有学者对中国某海域海水进行了细菌普调查，美人鱼发光杆菌检出率高居第三位，占6.9％，为海洋优势菌，并对此进行了毒力实验及伤口感染实验，结果表明其具有组织侵入力，同时对动物还有较强的感染力。作为致病菌，其可引起卵形鲳鲹、小热带鱼、浅海鳖鱼、金头鲷、尖吻鲈、大菱鲆、鳗鲡等多种海水鱼类的创伤感染、出血性败血病，甚至死亡，带来巨大的经济损失。

[0005] 虽然传统的抗生素在治疗和防治海水鱼类细菌性疾病中发挥了重要作用，但长期用抗生素会引起细菌的耐药性，使用药的剂量越来越大，药物残留严重，影响水产品的质量，甚至威胁人类的健康。可见研制疫苗十分有必要。

[0006] 现在针对细菌的大多是采用灭活全菌苗，但灭活全菌苗在制备过程中常常会产生复杂的微生物代谢产物，从而出现副作用，使得免疫效果并不理想。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种能够有效的预防美人鱼发光杆菌致病，且使用安全、免疫保护效果明显的美人鱼发光杆菌疫苗。

[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种制备上述美人鱼发光杆菌疫苗的方法，该制备方法操作简单，成本低廉。

[0009] 本发明的另一个目的在于提供上述美人鱼发光杆菌疫苗在制备防治鱼类尤其是海水鱼类疾病的药物中的应用。

[0010] 本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

[0011] 本发明针对美人鱼发光杆菌的保护性抗原进行探索，通过比较发现此菌外膜的脂多糖(LPS)具有较好的保护性抗原特性，可以制成疫苗来抵抗美人鱼发光杆菌的侵袭。

[0012] 一种美人鱼发光杆菌疫苗，该疫苗是将美人鱼发光杆菌脂多糖与佐剂混合后制备而得。所述佐剂可以选择任何一种制备疫苗常用的，如弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂及氢氧化铝佐剂等。

[0013] 上述美人鱼发光杆菌疫苗中，每1ml疫苗含有美人鱼发光杆菌脂多糖0.25～1mg，优选每1ml疫苗含有美人鱼发光杆菌脂多糖0.5mg。

[0014] 上述美人鱼发光杆菌疫苗中，佐剂的用量并不用做特别限定，实际操作时可选择疫苗中美人鱼发光杆菌脂多糖与佐剂的质量比为2∶3～3∶2，优选两者质量比为1∶1。

[0015] 本发明美人鱼发光杆菌疫苗的制备方法，是先培养美人鱼发光杆菌并且将其灭活后，从已灭活的菌体中提取美人鱼发光杆菌脂多糖，然后将该脂多糖与佐剂混合得到美人鱼发光杆菌疫苗。

[0016] 上述制备方法中，美人鱼发光杆菌的培养采用斜面培养、液体培养等常规培养方法。

[0017] 上述制备方法中，美人鱼发光杆菌的灭活也采用本领域的常规方法，如可用福尔马林灭活、甲醛等。

[0018] 上述制备方法中，美人鱼发光杆菌脂多糖的提取采用本领域的常规提取方法，如热酚水法等。

[0019] 本发明的美人鱼发光杆菌疫苗，经毒性试验以及鱼类体内试验，证明该疫苗不但对鱼体毒性小，且在多种鱼类(如鲳鲹等)身上的免疫防治效果均很显著，因此可用于鱼类，尤其是南方海水鱼类的疾病防治。

[0020] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0021] 1.本发明的美人鱼发光杆菌疫苗使用安全，免疫防治效果好，能够有效预防美人鱼发光杆菌致病；

[0022] 2.本发明的疫苗其制备方法操作简单，成本低廉，且疫苗可用于鱼类尤其是海水鱼类的疾病防治，具有很高的商业价值。

具体实施方式

[0023] 以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何形势限制本发明。

[0024] 实施例1美人鱼发光杆菌的培养及灭活

[0025] 本发明人采用常规的分离方法从发病鱼体中分离出供试的美人鱼发光杆菌，并将其接种于Zobell 2216E斜面培养基，28℃培养24h，转接于Zobell 2216E液体培养基，28℃、180rpm摇床培养18h，加入0.25体积％福尔马林灭活细菌，4℃中过夜。7000rpm离心
15min，弃上清，加入灭菌生理盐水洗涤菌体，5000rpm离心15min，沉淀菌体，用灭菌生理盐水再洗涤两次，收集菌体。

[0026] 本实施例中Zobell 2216E斜面培养及以及Zobell 2216E液体培养基的配制均采用通用方法，为本领域技术人员所共知。

[0027] 实施例2美人鱼发光杆菌脂多糖(LPS)的提取

[0028] 本实施例的美人鱼发光杆菌脂多糖的提取采用酚水法，其步骤如下：

[0029] (1)取实施例1制备所得的菌体约20克，悬于200ml双蒸水中，再加入等体积预热的90％苯酚，取水相保存。

[0030] (2)向上述酚相中加入预热的蒸馏水使总体系恢复原体积(约400ml)，再65℃水浴中剧烈搅拌30min，用自来水冲淋玻璃容器外壁，使内容物迅速冷却至室温，10000rpm离心20min，取水相保存；

[0031] (3)重复步骤(2)2～3次，合并各次抽提所得水相，置透析袋中用自来水流动透析24h，再用蒸馏水透析48h，其间更换蒸馏水3～4次，然后，PEG20000反透析使透析袋内的溶液浓缩至50ml左右，将该浓缩液于30000g离心5h，取上清液，冷冻干燥，得到较纯的脂多糖(LPS)粉末。

[0032] 实施例3美人鱼发光杆菌疫苗的制备

[0033] 将实施例2制备所得的脂多糖(LPS)粉末稀释后与弗氏不完全佐剂充分混匀即得到美人鱼发光杆菌疫苗。

[0034] 本实施例一共制备5份美人鱼发光杆菌疫苗，其每份疫苗中美人鱼发光杆菌脂多糖的浓度分别为1ml疫苗中含有美人鱼发光杆菌脂多糖0.25mg、0.5mg、1mg、2mg和4mg。

[0035] 实施例4美人鱼发光杆菌脂多糖疫苗的毒性实验

[0036] 为了确保本发明疫苗的安全性，对实施例3制备的5份疫苗进行毒性实验。

[0037] 将健康的卵形鲳鲹120尾，平均体重约45g，随机分为6组，每组20尾。

[0038] 将健康的军曹鱼120尾，平均体重约60g，随机分为6组，每组20尾。

[0039] 将实施例3制备所得的5份疫苗和一个PBS对照，按0.1mg/尾的量分别注射入鱼体腹腔中，实验结果见表1、2。

[0040] 表1美人鱼发光杆菌疫苗对卵形鲳鲹毒性实验结果

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[0042] 表2美人鱼发光杆菌疫苗对军曹鱼毒性实验结果

[0043]

[0044] 由表1、2可以看出，当美人鱼发光杆菌脂多糖在所制备疫苗中的浓度为0.25mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml时，疫苗的毒性都较弱，从对鱼体毒性和经济角度考虑，美人鱼发光杆菌疫苗优选美人鱼发光杆菌脂多糖的浓度为0.5mg/ml。

[0045] 实施例5美人鱼发光杆菌疫苗对卵形鲳鲹生长的影响

[0046] 为了弄清本发明美人鱼发光杆菌脂多糖疫苗对鱼体生长的影响，采用实施例3制备所得美人鱼发光杆菌脂多糖浓度为0.5mg/ml的疫苗对鱼体进行生长状况的测试。

[0047] 将健康的卵形鲳鲹90尾，平均体重50.5g，军曹鱼90尾，平均体重63.2g，各随机8
分为3组，分别为疫苗免疫组(0.5mg/ml)、灭活全菌苗(1.8×10cfu/ml)免疫组和对照组(PBS)，每组30尾。腹腔注射0.1mg/尾，实验结果见表3、4。

[0048] 表3美人鱼发光杆菌疫苗对卵形鲳鲹生长的影响

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[0050] 表4美人鱼发光杆菌疫苗对军曹鱼生长的影响

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[0052] 由表3、4可以看出，在饲养的4周时间内，注射美人鱼发光杆菌疫苗后，鱼的日均增重量略高于对照组和灭活全菌苗，这说明本发明的疫苗并不会影响鱼体的生长。