负载重组人HSP70多肽复合物的树突状细胞疫苗、制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种负载重组人热休克蛋白70多肽复合物的树突状细胞疫苗、制备方法与应用。该疫苗通过设计、合成抗原多肽，将抗原多肽与重组人热休克蛋白70(rhHSP70)形成复合物，制备树突状细胞，再将复合物负载于树突状细胞(DC)而得到。该疫苗具有多靶点、双佐剂、高功效优势，可用于抗肿瘤及感染性疾病等的治疗。该制备工艺简单、快速、成本低。

权利要求

1.一种激活特异性CD8T克隆的组合物，所述组合物由序列为AAGIGILTV的MART1多肽、rhHSP70和DC细胞制备而来：(1)黑色素瘤抗原多肽与rhHSP70蛋白的准备

人工合成HLA-A201限制性黑色素瘤抗原多肽片段MART1：AAGIGILTV，以DMSO充分溶解，多肽浓度为5mg/mL；rhHSP70以PBS溶解，浓度为0.1mg/mL；

(2)rhHSP70-多肽复合物制备

取5μg MART1多肽与10μg rhHSP70多肽于1.5mL EP管内，加入400μl含10nM ATP、

1mM KCl、2mM MgCl2的PBS缓冲液中，混匀后于20℃共育40分钟，加入100nM ADP后继续于20℃孵育40分钟，将溶液移至0.5mL内含14kD分子量超滤膜的微型透析管内，过夜，除去未结合多肽，制备出rhHSP70-MART1复合物；

(3)体外诱导树突状细胞

+ +

采集新鲜肝素抗凝的HLA-A201 黑色素瘤患者外周血或HLA-A201 正常健康人外周血，经Ficoll密度梯度离心法后获得外周单个核细胞(PBMCs)，将PBMCs悬浮于含2％(v/v)6

灭活混合人AB血清的RPMI1640培养基中，浓度为2～3×10 个细胞/ml；按每孔3ml接种细胞于6孔细胞培养板内，于5％(v/v)CO2、37℃细胞培养箱内放置90min使单核细胞贴壁，用PBS缓冲液轻轻洗涤培养孔以除去未贴壁细胞；于每孔加入3ml DC诱导培养基I，所述的DC诱导培养基I是含5％(v/v)灭活人AB血清、100ng/ml rhGM-CSF和300ng/ml IFNα的RPMI1640培养基；于诱导第3天，每孔轻轻吸去1mL培养上清，加入1ml新鲜的DC诱导6

培养基I继续诱导；于第5天收获DCs，用PBS进行洗涤并悬浮于PBS溶液中，浓度为2×10个细胞/ml；

(4)HSP70-多肽复合物负载DCs

取250μl上述已制备的rhHSP70-MART1多肽复合物，加入至1mL诱导的DCs中，混匀后于27℃-30℃培育4-6小时；

(5)收集上述细胞，用PBS洗涤二次后悬浮于含2％(g/100ml)人白蛋白的生理盐水6

中，浓度为2×10 个细胞/ml，即制得所述的组合物。

2.权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物刺激CD8T克隆增殖。

3.权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物增强CD8T克隆杀伤靶细胞的能力。

说明书

负载重组人HSP70多肽复合物的树突状细胞疫苗、制备方

法与应用

技术领域：

[0001] 本发明属于生物制药领域，更具体涉及到将抗原多肽与重组人热休克蛋白70(rhHSP70)形成复合物，再将复合物负载于树突状细胞(DC)制备出树突状细胞多肽疫苗，用于肿瘤及感染性疾病的治疗。
背景技术：

[0002] 1.恶性肿瘤与感染性疾病发病及治疗现状

[0003] (1)肿瘤发病与治疗进展

[0004] 肿瘤与传染性疾病为全球公认的严重威胁人类生命与健康的重大疾病。在第18届国际抗癌症联盟大会上，世界卫生组织发表的一项研究报告表明，全球癌症状况将日益严重，今后20年新患者人数将由目前的每年1000万增加到1500万，因癌症而死亡的人数也将由每年600万增至1000万。我国流行病学调查表明，2003年我国城市居民恶性肿瘤致死率为94.71/10万，癌症成为第一位致死疾病；农村居民恶性肿瘤患者病死率更高，为104.01/10万，居全部死亡疾病之首。

[0005] 肿瘤已成为人类的第一号“杀手”。现行治疗肿瘤的常规方法(手术、放疗与化疗)虽在一定程度上缓解症状，但近80％的肿瘤患者在经受手术、放疗与化疗的痛苦之后仍因肿瘤的复发与转移而死亡。因此，开发新型抗肿瘤方法与药物必须而且紧迫。

[0006] 现在认为肿瘤的发生、发展与宿主免疫状态有着密切关系。因此，以通过提高肿瘤组织对宿主的免疫原性和增强机体对肿瘤细胞免疫应答能力的方式来抑制或消除肿瘤的免疫治疗是抗肿瘤治疗的重要方法。以免疫治疗为主体的肿瘤生物治疗已被公认为继手术、放疗和化疗后肿瘤治疗的“第四模式”，其疗效已在多种肿瘤的治疗中得到验证。基于机体细胞免疫机制的抗肿瘤细胞免疫治疗与治疗性疫苗的研发(如DC疫苗)已成为研究与开发热点。

[0007] (2)重大传染病发病与治疗现状

[0008] 近年来随着预防性疫苗的使用与普及，常见多发传染病得到有效控制，发病率大幅度下降，但部分重大传染性疾病的危害仍很严重。

[0009] 结核病(Tuberculosis，TB)一直是人们关注的一个全球性健康问题，尽管大多数人(约90％)在感染结核杆菌(MTB)后体内启动了保护性的有效的细胞免疫反应来阻止其发展成为活动性结核病，但伴随近年来耐药结核杆菌的流行，以及结核杆菌与人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIVs)的双重感染，导致TB的发病率与死亡率大幅度上升，TB已成为传染病中的头号杀手。

[0010] WHO最新统计表明全球人口的1/3(约20亿)感染过MTB，每年超过200万人死于结核病。我国每年新发生的耐药结核病患者数约占全世界的1/4，2002年报告新发肺结核患者58多万例，80％在农村。由于经济和管理等方面原因，导致治疗不彻底或服药不规律，造成耐药结核病患者逐年增多。卡介苗(Bacillus CalmetteGuerin，BCG)是目前唯一获准用于预防结核病的疫苗，主要用于预防儿童结核的发病，对成人结核发病预防作用从0-80％不等。鉴于BCG自身的不足(BCG变异、BCG制备过程中丢失部分与免疫记忆及保护性相关蛋白等)以及耐药MTB的流行，研制新型疫苗是控制结核病的重要途径。

[0011] 乙型肝炎病毒(HBV)感染则是又一种全球重大的公共卫生问题。预计全世界有3亿慢性HBV携带者，我国约占1.3亿。其中50-75％为有活动性病毒复制的慢性HBV携带者，他们中30％可能发展为肝硬化，5-10％可能发展为肝细胞癌。估计全球每年死于与HBV感染有关的慢性肝病人数约100万人。

[0012] 尽管a-干扰素与拉米夫定等新药使得慢性乙型肝炎的治疗得到改善，但由于HBV在肝内复制过程的复杂性，对复制过程中形成的cccDNA至今尚未找到有效的抗病毒药加以清除。大量研究表明：慢性HBV感染者免疫应答水平低下或缺失，病毒特异性T细胞数量和功能都降低，HBV特异性的CTL和Th细胞介导的免疫反应微弱，甚至检测不到针对HBV的特异性CTL反应，这种免疫耐受状态是导致HBV慢性持续感染的根源。因此，打破免疫耐受，重建慢性HBV感染病人特异性细胞免疫应答可能是慢性HBV感染得到根治的最新方法。

[0013] 2.特异性T细胞免疫反应在抗肿瘤、抗感染性疾病中的重要作用[0014] (1)人体免疫系统的作用机制

[0015] 人体免疫系统的主要功能之一是识别并清除异已(抗原)，如体内变异细胞(如肿瘤细胞)，感染病原体的宿主细胞(如感染HBV的肝细胞等)，及外来入侵的细菌(如TB)、病毒与寄生虫等。

[0016] 人体免疫系统能够识别这些异已抗原，激活机体天然免疫与特异性免疫反应(B淋巴细胞介导的体液免疫与T淋巴细胞介导的细胞免疫)，共同清除这些抗原，后者可同时产生免疫记忆，对人体进行长期保护。清除肿瘤、胞内感染病毒(如HBV)或胞内细菌(如TB)主要通过特异性T细胞免疫反应。

[0017] 特异性T细胞免疫反应大致由四个阶段组成：(1)抗原识别：人体抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cell，APC)通过表面受体识别并吞噬异已细胞；(2)抗原递呈：内吞的细胞被APC消化、裂解成多肽，后者与APC胞内丰富的MHC-I类或II类分子结合分别形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽复合物，并被转运至APC表面；(3)T细胞激活：携带MHC-多肽复合物的APC迁移至淋巴结与T细胞相遇，T细胞通过表面受体(T Cell Receptor，TCRs与APC表面的MHC-多肽复合物相互识别后被激活，成为有抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)；(4)特异杀伤：被激活的CTL循环至抗原所在部位，通过CTL表面的TCR特异识别抗原表达细胞后进行杀伤；可见，正是依靠人体自身强大的免疫防御系统，体内变异的细胞、外部入侵的细菌、病毒等才得以不断清除，保持机体自身稳定与平衡。APC作为特异性免疫应答的启动者发挥重要作用。

[0018] (2)DCs在特异性T细胞免疫反应中的重要地位

[0019] 树突状细胞(Dendritic Cell，DC)是至今为止发现的体内功能最为强大的专职性抗原递呈细胞(APC)，表达丰富的抗原捕获分子(如MMR，DEC205，FcRs，TLRs)、抗原递呈分子(如MHC-I，MHC-II，CD1)及免疫共刺激分子(如CD40，CD54，CD80，CD83，CD86等)；捕获抗原的DCs迁移至淋巴结，将加工、处理后的抗原信息递呈给T淋巴细胞(提供T淋巴细胞激活的第一信号)，其表达的免疫共刺激分子提供激活T淋巴细胞的第二信号，T细胞经激活分化为具有特异性杀伤功能的CTL。同时，经抗原刺激的DC分泌产生大量炎性因子(如IL-2，TNFα，IL-12，IFNγ等)增强机体天然免疫应答，故DC又有“天然免疫佐剂”的美称。

[0020] 鉴于DC强大的抗原捕获、加工、递呈与激活T细胞的功能，基于DC开发抗肿瘤、抗感染性疾病治疗性疫苗的研究成为全球热点。体外用抗原负载DC，将携带抗原信号的DC回输体内，激发机体主动特异性T细胞免疫应答，清除抗原表达细胞，同时在体内诱异免疫记忆。这种携带特定抗原信号，启动/激发机体特异性细胞免疫反应的功能性树突状细胞统称为“DC疫苗”(DC Vaccine)，该免疫治疗方法被认为是当今最先进、最有希望的细胞免疫治疗手段之一。

[0021] 3.DC疫苗在抗肿瘤领域的应用进展

[0022] 用人工合成的已知抗原多肽、重组抗原蛋白、编码抗原RNA/DNA质粒、细胞裂解液、细胞提取物、凋亡细胞等不同形式的抗原体外负载DC的研究与应用均有大量报道。美国Dendreon公司用前列腺酸性磷酸酶(PAP)与GM-CSF融合蛋白作为抗原负载DC治疗性TMDC疫苗产品Provenge (APC8015)已于2007年完成III期临床研究，并通过FDA专家评审(Journal of Clinical Oncology，2006，24(19)：3089-3094)。Barrou等用重组人PSA蛋白(前列腺癌相关抗原)体外冲击自体DC，对24例前列腺癌患者进行回输治疗，6例循环前列腺癌细胞阳性的患者在治疗6个月后转阴，12个月后检测仍为阴性；11例患者PSA水平下降，18例患者出现针对PSA的免疫反应(Barrou B，Benoit G.Cancer Immunol Immunother，
2004，53：453-460)。

[0023] Nesselhut T等用乳腺癌患者自体肿瘤细胞裂解物或合成多肽(Her2-neu)负载自体DC，经皮内注射或静脉回输给患者。结果显示：143例患者中37％产生了临床效应。其中7人完全缓解，14人部分缓解，33人病情稳定，3人综合应答，总生存期延长(Nesselhut T，Matthes C，Marx D，et al.2005 ASCO Annual Meeting)。

[0024] 4.DC疫苗在抗感染性疾病中的应用进展

[0025] 抗传染性病原体的理想疫苗不仅能产生持久性免疫，而且能产生合适的免疫应答以清除感染。结核杆菌为胞内寄生菌，欲达此目的主要依靠细胞介导免疫应答，而不是抗体应答。Dillon SM等研究发现小鼠单次接种结核杆菌纯蛋白衍生物(PPD)致敏的DC能诱发强烈的T细胞免疫应答并产生IFNγ。结核杆菌H37Rv株Hsp65具有免疫优势抗原的特性，能诱导和增强机体的抗结核免疫应答，并可激活γδT细胞。同时Hsp65具有载体分子效应和分子伴侣的特性，能辅助与其融合的蛋白片段，在MΦ或DC中以MHC2I类分子的途径呈递，并可活化DC使之成为初始型CTL的有效刺激剂。武汉大学医学院魏雅稚等用hsp65与pEGFP2C1融合基因载体转染DC，体外实验表明其能诱导未致敏的脾细胞增殖，证实转染的融合基因能在DC中表达目的蛋白，并能被DC有效地呈递。

[0026] Fazle Akbar等用重组HBsAg负载自体DC后回输给5名HBsAg阴性的健康志愿者，2名志愿者回输后第二周出现抗-HBsAg抗体；6名志愿者在第一次回输后检测无免疫应答者给予第二次回输，一个月内相继出现抗-HBsAg抗体(J Hepatology，2007，47(1)：60-66)。Chen等以HBsAg冲击的DC经皮下免疫19例CHB患者，观察到11/19例患者出现临床应答，其中10例患者HBeAg转阴，5例出现HBeAg血清学转换(World J Gastroenterol，
2005，11(12)：1806-1808)。解放军302医院王福生教授利用HBsAg和HBcAg两种抗原联合负载DC，该疫苗能诱导针对s181-193表位及c18-27表位的多克隆CTL(发明专利号：
200610078028.2)；

[0027] 5.热休克蛋白在免疫应答中的作用

[0028] (1)热休克蛋白(HSPs)的生物学活性

[0029] 热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是一组在生物进化过程中高度保守的蛋白质分子家族，该家族成员根据分子量大小可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP28等几大类。HSPs作为分子伴侣(Chaperons)在蛋白质合成后的折叠、转运，变性蛋白质的复性等过程中发挥重要作用。

[0030] HSP70是分子量在70KD左右的热休克蛋白，是热休克蛋白家族中最重要的一员，被称为主要热休克蛋白。HSP70蛋白由两部分组成，即ATP酶区(ATPase domain)和底物识别区或叫多肽结合区(Peptide-binding domain)。HSP70的ATP酶活性区是位于HSP70蛋白氨基端385个氨基酸残基；分离这一约44KD的氨基端片段，可以得到一个非多肽依赖性的ATP酶。多肽与HSP70分子结合和释放是一个依赖ATP的过程。HSP70蛋白的多肽结合区是羧基端的约27KD的氨基酸片段，能结合细胞内5-25mer的多肽(包括肿瘤或病毒特异性抗原多肽)形成HSP-多肽复合物，参与多肽在胞浆网膜系统内的转运。

[0031] 热休克蛋白被称为是连接天然免疫与特异免疫反应的桥梁。研究发现HSPs通过与DC表面HSP受体如CD91，CD40，LOX1，TLR2/4等结合刺激DC上调表达多种免疫共刺激分子(CD83，CD80，MHC-I)和免疫活性因子(MIP，TNFα，IL-12与IP-10等)，继而活化自然杀伤细胞(NK)，NKT细胞等增强机体非特异性免疫应答，故HSPs有“天然免疫佐剂”的作用(Srivastava PK.Curr Oncol Rep.2005Mar；7(2)：104-8)。

[0032] Srivastava发现：HSPs能够介导外源性抗原多肽向MHC-I类与MHC-II类分子的递呈。从肿瘤细胞或病毒感染细胞中提取的HSP-抗原多肽复合物免疫动物后能引起针对该肿瘤或病毒的特异性T淋巴细胞免疫应答，而仅免疫多肽或仅免疫HSP则不能诱导特异性免疫应答(Binder RJ，Vatner R，Srivastava P.Tissue Antigens.2004Oct；64(4)：442-51.)。

[0033] 基于这一发现，美国Antigenics公司(WWW.antigenics.com)将从患者肿瘤组织或肿瘤细胞中提取的gp96及HSP70-多肽复合物免疫肿瘤患者，相应产品( 和AG-858)已获FDA批准进入I-II期临床试验。

[0034] 我国曹雪涛院士等提取热处理后肿瘤细胞的外排体体外冲击树突状细胞，实验结果显示能激活树突状细胞和T淋巴细胞，有效诱导抗原特异性和非特异性的免疫反应，增强机体免疫功能(专利申请号：02145022.6，名称：一种新型高效非细胞性疫苗的制备及其用途)。

[0035] 6.现行DC疫苗的不足

[0036] 在DC疫苗设计中抗原的抗原性(Antigenicity)、免疫原性(Immunogenicity)、抗原负载体系(Antigen Delivery System)及佐剂(Adjuvents)是影响疫苗功效的重要参数。上述单纯抗原多肽负载DC的疫苗，或单纯HSP70抗原多肽复合物疫苗均存在不足。前者多肽自身的稳定性、多肽与DC表面MHC分子结合的亲和力及稳定性等是影响DC多肽疫苗的重要因素；后者免疫机体后需要通过体内APC(如DC)对结合于HSP70的抗原多肽进行重新递呈，方能启动特异性免疫应答，而肿瘤组织常分泌多种免疫抑制因子如IL-10，TGFβ等抑制DC的功能，从而影响特异性免疫应答的激发。发明内容：

[0037] 本发明的一个目的是为了克服上述多肽DC疫苗的缺陷，提高多肽DC疫苗的功效，提供一种流程简捷、高效的负载重组人HSP70抗原多肽复合物的DC疫苗。

[0038] 本发明的另一个目的是提供负载重组人HSP70抗原多肽复合物的DC疫苗的制备方法。

[0039] 本发明还有一个目的是提供负载重组人HSP70抗原多肽复合物的DC疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用；

[0040] 本发明还有一个目的是提供负载重组人HSP70抗原多肽复合物的DC疫苗在制备抗感染性疾病药物中的应用。

[0041] 本发明技术方案的理论基础：

[0042] (1)HSP70具有结合多肽的天然生物学特性(称之为分子伴侣)，使多肽不易降解，从而能保持多肽的稳定性(抗原的稳定)；

[0043] (2)HSP70具有协助多肽在细胞内浆网转运的功能，已证明HSP70能将其结合的多肽转运至MHC-I类分子，形成MHC-I-多肽复合物(T细胞激活的第一信号)，激发特异性T细胞免疫应答；

[0044] (3)DC是公认的功能最强的专职抗原递呈细胞，既作为抗原负载，抗原递呈的载体，同时因其表达丰富的免疫共刺激分子(T细胞激活的第二信号)，又具有“天然免疫佐剂”的作用；

[0045] (4)DC表达HSP70受体，HSP70多肽复合物可通过HSP受体介导的高效内吞机制，快速进入DC胞内，将抗原多肽递呈至MHC-I类分子，从而提高抗原递呈效率；

[0046] (5)HSP70在发挥分子伴侣作用的同时，具有促进DC免疫共刺激分子(如CD80，CD83，CD86等)的上调表达与细胞因子(IL-12，TNFα等)分泌的功能，从而提高DC疫苗的激发能力，具有“天然免疫佐剂”功效；

[0047] 本发明的目的是通过下列措施实现的：

[0048] 一种负载重组人HSP70多肽复合物的树突状细胞疫苗，其中包括下列步骤：

[0049] 1)重组人HSP70蛋白(rhHSP70)，如来源于加拿大Stressgen公司，产品目录号：ESP-555，纯度>90％；

[0050] 2)抗原多肽的设计与合成，纯度>90％，吉尔生化上海有限公司合成；

[0051] 3)重组人HSP70抗原多肽复合物的制备；

[0052] 4)体外诱导树突状细胞；

[0053] 5)抗原负载：将按上述方法制备的重组人HSP70抗原多肽复合物与树突状细胞混合，共同培育一定时间，制备成树突状细胞疫苗；

[0054] (6)树突状细胞疫苗的质量检测；

[0055] 所述的树突状细胞疫苗，其中重组人HSP70蛋白来源于加拿大Stressgen公司，产品目录号：ESP-555，纯度>90％；

[0056] 所述的树突状细胞疫苗，其中抗原多肽的设计依据已知的具有免疫原性的肿瘤特异抗原(TSA)、肿瘤相关抗原(TAA)或病原体抗原(如HBV或TB)表位进行人工合成，抗原多肽的长度为9至15个氨基酸序列或更长些如9-25个氨基酸序列，纯度为90％以上。其中所述的肿瘤抗原为黑色素瘤抗原MART1、肝癌相关抗原AFP、前列腺癌相关抗原PSA、胃癌相关抗原CEA或乳腺癌相关抗原Her2-neu，包括但不局限于上述肿瘤抗原。其中所述的病原体抗原为乙型肝炎病毒HBV、丙型肝炎病毒HCV、艾滋病毒HIV抗原或TB抗原，包括但不局限于上述病原体。

[0057] 所述的树突状细胞疫苗，其中重组人HSP70抗原多肽复合物是将一定量(10-100μM)HSP70蛋白与一定量(50-300nM)抗原多肽，在20℃-25℃温度下与含ATP、KCl、MgCl2的PBS缓冲液中共同反应40min，再加入ADP共同反应40min后，透析法除去游离多肽后制备而成；

[0058] 所述的树突状细胞疫苗，其中体外诱导树突状细胞是通过获取单个核细胞培养一定时间后，洗去未贴壁细胞，加入含GM-CSF和IL-4的细胞因子组合、GM-CSF和IL-15的细胞因子组合、GM-CSF和IFNα的细胞因子组合、或者GM-CSF和TNFα的细胞因子组合的培养基诱导成单核细胞来源的树突状细胞；或取CD34+前体造血干细胞，加入含GM-CSF，TNFα和Flt3-L细胞因子的培养基诱导成CD34-DCs。

[0059] 所述的树突状细胞疫苗，其中HSP70多肽复合物与树突状细胞共育的用量基准是6
10μM HSP70多肽复合物与10 个树突状细胞共育，共育温度为27℃-30℃；共育时间为4-6小时，收获并洗涤除去未结合的HSP70及HSP70多肽复合物，制备成树突状细胞疫苗。

[0060] 所述的树突状细胞疫苗，其中细胞纯度(CD11c+HLADR+)大于80％且细胞存活率大于90％；疫苗制剂内毒素含量小于5IU/ml；革兰氏菌检测阴性；支原体检测阴性；无菌检测合格；树突状细胞表面共刺激分子表达水平要求：CD80大于80％，CD83大于50％，CD86大于80％，CD40大于90％，CCR7大于50％；

[0061] 本发明的有益效果

[0062] 1.与利用生物化学法从组织中提取HSP70多肽复合物作为免疫原方法、或与通过构建目的抗原与HSP70融合蛋白表达质粒转染DC法比较，利用重组人HSP70蛋白与抗原多肽在体外形成复合物负载DC作为免疫原，具有抗原明确、设计灵活、抗原来源方便、安全性与疫苗活性高等诸多优点：

[0063] 1)可根据已知肿瘤相关抗原或已知感染的病原体有针对性地设计并合成抗原多肽(9-25氨基酸)，氨基酸序列明确，合成工艺简捷。如前列腺相关抗原多肽(PSA：CLAAGITYV)；肝癌相关抗原多肽(AFP：GVALQTMKQ)；黑色素瘤抗原多肽(MAGE3：FLWGPRALV)；乳腺癌相关抗原多肽(Her2-neu：KIFGSLAFL)；HBV抗原多肽(HBsAg：
FLLTRILTI；HBcAg：FLPSDFFPSV)等。生物化学法从组织中提取HSP70多肽复合物作为免疫原，操作过程相对复杂，复合物中HSP70结合的多肽序列不明确等缺陷；

[0064] 2)用生化法提取的HSP70多肽复合物作为免疫原，免疫后仍需通过人体APC(如DC)摄取、抗原多肽递呈等复杂过程，方能激发特异性T细胞免疫应答，此过程中APC的数量与质量将是影响免疫效果的关键因素之一。而用HSP70多肽复合物负载的树突状细胞作为免疫原，则利用树突状细胞专职且功能强大抗原摄取与递呈功能，在体外模拟并完成抗原负载与递呈过程，同时树突状细胞又具有“天然免疫佐剂”的功能，将明显提高疫苗的功效；

[0065] 3)重组人HSP70蛋白容易获取(如加拿大Stressgen公司，美国Sigma公司等)，HSP70多肽复合物在体外可批量制备。而生物化学法易受组织来源、数量与质量的多因素影响，通常不能批量制备；

[0066] 4)HSP70具有结合多肽的生物特性，可制备出多种多肽与HSP70的复合物，根据需要有机组合后同时负载DC，免疫后激发识别多种抗原表位的T细胞克隆，产生多效价、稳固的免疫应答。如黑色素瘤表达多种肿瘤抗原(GP100，MART1，MAGE3)，可用HSP70分别与这三种抗原肽(GP100：IMDQVPFSV，MART1：AAGIGILTV；MAGE3：FLWGPRALV)形成复合物，再负载树突状细胞；

[0067] 5)重组质粒转染DC法易受转染效率、目的蛋白表达效率、融合蛋白表达后在DC胞浆内抗原的递呈效率等诸多环节的影响，且外源性质粒载体的安全性至今仍难以控制。

[0068] 2.HSP70-多肽复合物负载的DC免疫学活性明显提高

[0069] 1)HSP70-多肽复合物负载的DC激活特异性CD8T克隆的能力明显提高[0070] 体外以GM-CSF与IL-4，IFNαa，IL-15，或TNFa因子组合诱导HLA-A201+健康志愿者外周单核细胞为树突状细胞。分别用10μg MART1多肽(AAGIGILTV)，10μgMART1多肽负载的DC，10μg HSP70-MART1(MART1多肽与HSP70形成的复合物)反复刺激自体CD8T淋巴细胞二次，每周一次。收集刺激的T淋巴细胞(CTL)，用流式细胞术检测特异识别MART1多肽的CD8T克隆的频率(Tetramer染色法)。实验结果来自三个独立健康志愿者，结果见图一所示。

[0071] CTL1为单独MART1多肽致敏的CD8T细胞，CTL2为MART1多肽负载DC致敏的CD8T细胞，CTL3为HSP70-MART1多肽复合物负载DC致敏的CD8T细胞；

[0072] 结果表明：以HSP70-多肽负载DC刺激HLA-A201+MART1+CD8T克隆增殖的能力最强，平均分别是单独MART1多肽、MART1多肽负载DC的107倍和10倍。

[0073] 2)HSP70多肽复合物负载的DC致敏的CTL具有较强杀伤靶细胞的能力[0074] DC诱导、抗原多肽负载与CD8T细胞致敏实验步骤同上，二次刺激后收集刺激的T51
淋巴细胞(CTL)，用经典的4小时 Cr释放试验检测CTL杀伤活性，靶细胞为负载MART1多+
肽的HLA-A201 的T2细胞株。CTL1为MART1多肽直接刺激的CD8T淋巴细胞，CTL2为用负载MART1多肽树突状细胞所刺激的CD8T淋巴细胞，CTL3为用负载HSP70-MART1复合物树突状细胞所刺激的CD8T淋巴细胞。实验结果来自三个独立健康志愿者，以均值+/-标准差表示，结果见图二。

[0075] 结果表明：以HSP70-多肽负载DC刺激的CTL特异杀伤靶细胞的能力最强(CTL3)，与CTL2和CTL1相比，均有显著统计学差异(P值分别为0.05与0.07)；

[0076] 3.HSP70-多肽复合物负载的DC疫苗设计中含有双重“天然免疫佐剂”，将会明显提高疫苗功效。

[0077] HSP70的一个作用是稳定多肽；第二个作用是通过DC表面HSP70受体介导HSP70多肽复合物的高效捕获；第三个作用是将其结合的多肽转运至MHC-I分子；第四个作用是促进DC表面免疫共刺激分子的上调表达及细胞因子的分泌；HSP70是连接天然免疫与特异性免疫的桥梁，且不存在个体多肽性(Polymorphism)，是公认的天然免疫佐剂；

[0078] 树突状细胞表达丰富的免疫共刺激分子是T细胞活化不可或缺的刺激信号，亦有“天然免疫佐剂”的美称。以活细胞作为抗原载体，能保持其共刺激分子的天然结构，易于T细胞受体(TCR)识别与激活。双佐剂的共同作用既可增加疫苗的抗原性，又能提高疫苗的免疫原性，综合提高DC疫苗的功效。

[0079] 4.HSP70能上调树突状细胞免疫共刺激分子的表达

[0080] 于DC诱导第五天分别加入0.1μg/mL，1.0μg/mL，10μg/mL rhHSP70或100ng/mL LPS共同培育48小时，收获DC，进行表面标志物检测(CD80，CD83，CD86)；图三为一例健康志愿者DC流式细胞检测结果。

[0081] 结果显示：HSP70可上调DC CD83、CD80、CD86的表达水平，从而提高DC疫苗的免疫活性。

[0082] 5.制备简便、安全、无毒：在本疫苗制备体系中，无外源质粒、载体、化学佐剂的掺入与污染；HSP70蛋白与DC细胞对个体自身均不具有抗原性，发生自身免疫疾病的可能性极小。

附图说明

[0083] 图一是MART1抗原多肽以三种不同负载形式刺激特异性CD8T克隆增殖的比较[0084] 图二是MART1抗原多肽以三种不同负载形式所致敏的CD8T淋巴细胞杀伤试验[0085] 体外以GM-CSF与IFNα因子组合诱导HLA-A201+健康志愿者外周单核细胞为树突状细胞；同时从外周血中纯化出自体CD8T淋巴细胞(试剂盒由德国MiltenyiBiotech公司提供，操作步骤按说明书进行)。用流式细胞术检测CD8T纯度，达95％以上；分别用10μg MART1多肽(AAGIGILTV)，10μg MART1多肽与HSP70复合物(HSP70-MART1)负载树突状细胞作为致敏原；分别用10μg MART1多肽，10μgMART1多肽负载的DC，10μg HSP70-MART1多肽负载的DC反复刺激自体CD8T淋巴细胞二次，每周一次。收集刺激后的T51
淋巴细胞(CTL)，用经典的4小时 Cr释放试验检测CTL杀伤活性，靶细胞为负载MART1多+
肽的HLA-A201 的T2细胞株。CTL1为MART1多肽直接刺激的CD8T淋巴细胞，CTL2为用负载MART1多肽树突状细胞所刺激的CD8T淋巴细胞，CTL3为用负载HSP70-MART1复合物树突状细胞所刺激的CD8T淋巴细胞。实验结果来自三个独立健康志愿者，以均值+/-标准差表示。

[0086] 图三不同浓度rhHSP70对树突状细胞表面共刺激分子表达水平的影响具体实施方式

[0087] 以下通过实施例对本发明作进一步阐述：

[0088] 实施例1：负载四种HSP70-黑色素瘤抗原多肽复合物的树突状细胞疫苗[0089] 1.黑色素瘤抗原多肽与rhHSP70蛋白的准备

[0090] 人工合成已知的HLA-A201限制性黑色素瘤抗原多肽片段，名称与序列为GP100：IMDQVPFSV；MART1：AAGIGILTV；MAGE3：FLWGPRALV和Try：YMDGTMSQV。以DMSO充分溶解，多肽浓度为5mg/mL；rhHSP70以PBS溶解，浓度为0.1μg/mL。

[0091] 2.rhHSP70-多肽复合物制备

[0092] 分别取5μg(5μl)多肽与10μg(100μl)rhHSP70多肽于1.5mL EP管内，加入400μl含10nM ATP，1mM KCl，2mM MgCl2的PBS缓冲液中，混匀后于20℃共育40分钟，加入100nM ADP后继续于20℃孵育40分钟。将溶液移至0.5mL微型透析管内(内含14kD分子量超滤膜)过夜，除去未结合多肽，分别制备出rhHSP70-GP100，rhHSP70-MART1，rhHSP70-MAGE3和rhHSP70-Tyr复合物；

[0093] 3.体外诱导树突状细胞

[0094] 采集新鲜肝素抗凝的黑色素瘤患者(HLA-A201+)外周血或HLA-A201+正常健康人外周血，经Ficoll密度梯度离心法后获得外周单个核细胞(PBMCs)，将PBMCs悬浮于含2％6
(v/v)灭活混合人AB血清的RPMI1640培养基中，浓度为2～3×10 个细胞/ml；按每孔
3ml接种细胞于6孔细胞培养板内，于5％(v/v)CO2，37℃细胞培养箱内放置90min使单核细胞贴壁，用PBS缓冲液轻轻洗涤培养孔以除去未贴壁细胞；于每孔加入3ml含5％(v/v)灭活人AB血清，100ng/ml rhGM-CSF和300ng/ml IFNα的RPMI1640培养基(DC诱导培养基I)。于诱导第3天，每孔轻轻吸去1mL培养上清，加入1ml新鲜的DC诱导培养基I继续
6
诱导；于第5天收获DCs，用PBS进行洗涤并悬浮于PBS溶液中，浓度为2x10 个细胞/ml；

[0095] 4.HSP70-多肽复合物负载DCs

[0096] 分别取250μl上述已制备的四种rhHSP70-多肽复合物，加入至1mL诱导的DCs中，混匀后于27℃-30℃培育4-6小时。

[0097] 5.DC疫苗收获：收集上述细胞，用PBS洗涤二次后悬浮于含2％(g/100ml)人白蛋6
白(HA)的生理盐水中，浓度为2x10 个细胞/ml，即为黑色素瘤树突状细胞多肽疫苗。

[0098] 6.疫苗质量控制标准与检测方法

[0099] (1)内毒素检测：小于5IU/ml；按照《中国药典》三部附录XII E细菌内毒素检查法检测；

[0100] (2)革兰氏菌检测：阴性；革兰氏染色法：

[0101] (3)无菌检测：合格；按照《中国药典》三部附录XII A无菌检查法检测；

[0102] (4)支原体检测：阴性；PCR扩增法；

[0103] (5)树突状细胞纯度：CD11c+HLA-DR+细胞>80％；流式细胞术；

[0104] (6)树突状细胞存活率：>90％；苔盼蓝染色法；

[0105] (7)树突状细胞表面标记检测：CD80>80％，CD83>50％，CD86>80％，CD40>90％，CCR7>50％；流式细胞术；

[0106] 实施例2：负载二种HSP70-肝癌抗原多肽复合物的肝癌树突状细胞疫苗[0107] 1.抗原多肽合成：大多数原发性肝癌患者高表达甲胎蛋白(AFP)，合并HBV慢性持续感染，针对这一类肝癌患者可以AFP与HBV作为靶抗原如AFP：GVALQTMKQ；HBsAg：FLLTRILTI；多肽溶解与浓度同实施例1；

[0108] 2.rhHSP70-多肽复合物制备：操作步骤同实施1，制备成HSP70-AFP和HSP70-HBsAg二种复合物；

[0109] 3.体外诱导树突状细胞

[0110] 采集新鲜肝素抗凝的原发性肝癌患者(HLA-A201+)外周血或HLA-A201+正常健康人员外周血，经Ficoll密度梯度离心法后获得外周单个核细胞(PBMCs)，将PBMCs悬浮于含6
2％(v/v)灭活混合人AB血清的RPMI1640培养基中，浓度为2-3×10 个细胞/ml；按每孔
3ml接种细胞于6孔细胞培养板内，于5％(v/v)CO2，37℃细胞培养箱内放置90分钟使单核细胞贴壁，用PBS缓冲液轻轻洗涤培养孔以除去未贴壁细胞；于每孔加入3ml含5％(v/v)灭活人AB血清，100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml IL-4的RPMI1640培养基(DC诱导培养基II)。于诱导第3天，每孔轻轻吸去1ml培养上清，加入1ml新鲜的DC诱导培养基II继续
6
诱导；于第5天收获DCs，用PBS进行洗涤并悬浮于PBS溶液中，细胞浓度为2x10 个细胞/ml；

[0111] 4.HSP70-多肽复合物负载DCs

[0112] 分别取250μl上述已制备的二种rhHSP70-多肽复合物，加入至1ml诱导的DCs中，混匀后于27℃-30℃培育4-6小时；

[0113] 5.DC疫苗收获：收集上述细胞，用PBS洗涤二次后悬浮于含2％(g/100ml)人白蛋6
白(HA)的生理盐水中，浓度为2x10 个细胞/ml，即为肝癌树突状细胞多肽疫苗。

[0114] 6.疫苗质量控制标准与检测方法：同实施例1。

[0115] 实施例3：负载二种HSP70-乳腺癌抗原多肽复合物的树突状细胞疫苗[0116] 1.抗原多肽合成：大多数乳腺癌患者高表达MUC1和Her2-neu相关抗原；针对这一类乳腺癌患者可以此作为靶抗原合成多肽，如MUC1：SLADPAHGV：Her2-neu：KIFGSLAFL；多肽溶解与浓度同实施例1；

[0117] 2.rhHSP70-多肽复合物制备：操作步骤同实施1，制备成HSP70-MUC1和HSP70-Her2-neu二种复合物；

[0118] 3.体外诱导CD34-DCs

[0119] HLA-201+乳腺癌患者经GM-CSF造血动员，用细胞采集仪采集单个核细胞(PBMCs)，加入CD34单抗磁珠分离纯化得到CD34+造血前体细胞(纯度>90％)，将其悬浮于含5％(v/v)混合人AB灭活血清的X-VIVO培养基中。于培养基中加入GM-CSF(50ng/ml)、TNFα(10ng/ml)和Flt3-L(100ng/ml)。培养第5天补充新鲜培养基与细胞因子，观察并及时调整细胞密度。收集诱导第9天的CD34-DCs，用PBS进行洗涤并悬浮于PBS溶液中，浓度6
为2x10 个细胞/ml；

[0120] 4.HSP70-多肽复合物负载DCs

[0121] 分别取250μl上述已制备的二种rhHSP70-多肽复合物，加入至1ml诱导的DCs中，混匀后于27℃-30℃培育4-6小时；

[0122] 5.DC疫苗收获：收集上述细胞，用PBS洗涤二次后悬浮于含2％(g/100ml)人白蛋6
白(HA)的生理盐水中，浓度为2x10 个细胞/ml，即为乳腺癌树突状细胞多肽疫苗。

[0123] 6.疫苗质量检测参数：同实施例1。

[0124] 实施例4：负载二种HSP70-HBV抗原多肽复合物的乙肝树突状细胞多肽疫苗[0125] 1.HBV抗原多肽合成：以HBV表面抗原多肽(HBsAg：FLLTRILTI)和HBV核心抗原多肽(HBcAg：FLPSDFFPSV)为靶抗原；多肽溶解与浓度同实施例1；

[0126] 2.rhHSP70-多肽复合物制备：操作步骤同实施1，制备成HSP70-HBsAg和HSP70-HBcAg二种复合物；

[0127] 3.体外诱导树突状细胞

[0128] 采集新鲜肝素抗凝的慢性乙型肝炎患者(HLA-A201+)外周血或HLA-A201+正常健康人员外周血，经Ficoll密度梯度离心法后获得外周单个核细胞(PBMCs)，将PBMCs悬浮6
于含2％(v/v)灭活混合人AB血清的RPMI1640培养基中，浓度为2-3×10 个细胞/ml；按每孔3ml接种细胞于6孔细胞培养板内，于5％(v/v)CO2，37℃细胞培养箱内放置90分钟使单核细胞贴壁，用PBS缓冲液轻轻洗涤培养孔以除去未贴壁细胞；于每孔加入3ml含5％(v/v)灭活人AB血清，150ng/ml rhGM-CSF和100ng/mlIL-15的RPMI1640培养基(DC诱导培养基III)。于诱导第3天，每孔轻轻吸去1ml培养上清，加入1ml新鲜的DC诱导培养基
6
III继续诱导；于第5天收获DCs，用PBS进行洗涤并悬浮于PBS溶液中，浓度为2x10 个细胞/ml；

[0129] 4.HSP70-多肽复合物负载DCs

[0130] 分别取250μl上述已制备的二种rhHSP70-多肽复合物，加入至1ml诱导的DCs中，混匀后于27℃-30℃培育4-6小时；

[0131] 5.DC疫苗收获：收集上述细胞，用PBS洗涤二次后悬浮于含2％(g/100ml)人白蛋6
白(HA)的生理盐水中，浓度为2x10 个细胞/ml，即为乙肝树突状细胞多肽疫苗。

[0132] 6.疫苗质量检测参数：同实施例1。