一株木糖氧化无色杆菌及其在降解异噁草酮中的应用

摘要

本发明公开了一株木糖氧化无色杆菌及其在降解异噁草酮中的应用。该木糖氧化无色杆菌为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)CGMCC №.2773。该菌株可以在高浓度异噁草酮环境下生长，并且可以高校降解异噁草酮，为微生物降解长残留除草剂异噁草酮的研究提供了重要的基础，可用于受异噁草酮污染的水体、土壤的生物净化。

权利要求

1.木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC №.2773。

2.木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC №.2773在降解异噁草酮中的应用。

3.木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC №.2773在生物净化受异噁草酮污染水体或土壤中的应用。

说明书

一株木糖氧化无色杆菌及其在降解异噁草酮中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株木糖氧化无色杆菌及其在降解异嗯草酮中的应用。

背景技术

[0002] 异噁草酮最先用于防除大豆田杂草，之后因其具有用量少、活性高等突出特点，被广泛推广用于多种作物田。因其对大豆高度安全，杀草谱广，尤其是对鸭跖草等恶性杂草有特效，所以在黑龙江省用量很大，每年用量在300吨以上，并且有上升的趋势。但是该除草剂持效期长，造成在土壤中的生物活性长达6个月以上，施用异嗯草酮的当年秋天或次年春天，都不宜种植小麦、大麦、燕麦、黑麦、谷子、水稻、甜菜、油菜等，使用后的次年可才种植水稻、玉米、棉花、花生、向日葵等作物，严重地影响了大豆产区种植业结构的调整(王险峰.进口农药应用手册.北京.中国农业出版社.2000：429-435)。因此，异嗯草酮的残留问题对后茬作物的危害需亟待解决。

[0003] 影响异嗯草酮降解的因素主要是土壤温度、湿度以及微生物活动，异嗯草酮一般不易发生光化学降解或热分解，其降解主要时依靠微生物。国外研究者通过温度、土壤湿14
度对C 标记的异嗯草酮的降解研究发现，在灭菌土和接种微生物土壤中，异嗯草酮的降解主要依赖于微生物作用。温度升高，异嗯草酮挥发量增加，但在低温条件下矿化速度最快，随着土壤湿度增加异嗯草酮的矿化速度也加快(Merrosh T.L，Sims G.K.，Stoller E.W.1995.Clomazone fate in soil as affected by microbial activity，temperature，and soil moisture.Agric.Food Chem.43(2)：537-543)。

[0004] 李莲芳对异嗯草酮在几种水稻土中的迁移降解研究中发现，温度越高，土壤湿度越大，微生物呼吸作用和矿化作用越强，降解作用也越强(李莲芳，李国学，杨仁斌等.2004.水稻土中广灭灵残留动态及降解影响因子的研究.中国生态农业学报，12(3)：112-115)。二者的差别可能是由于高温时异嗯草酮发生光化学降解或热分解，而低温时发生生物降解，而生物降解在整个过程中占主导地位，所以温度过高或过低均会抑制异嗯草酮的降解。研究还发现土壤性质对异嗯草酮降解有较大的影响，土壤有机质含量低则异嗯草酮降解能力较强，反之则降解能力较差。提高土壤含水量及适当增加土壤pH值有利于异嗯草酮的降解，但异嗯草酮是一种中性物质，过高的pH不利于其降解。另外异嗯草酮在灭菌水稻土中降解速率远小于未灭菌水稻土，说明土著微生物在其降解过程中发挥了一定的作用。

[0005] 目前解决长残留除草剂危害的途径主要有：开发除草剂新品种以代替现有长残留性除草剂，但由于对靶标酶的了解程度不够，加之开发一个农药新品种要投入资金数亿美元，所以难度很大；抗除草剂转基因作物品种的选育，需要投入大量的研究经费和人力，要经历较长的研究过程，距离实际应用还很遥远；利用一些化学物质即除草剂的解毒剂(保护剂)解除除草剂对作物产生的药害，但涉及到另外一种化学物质的投放于环境中，会造成二次污染的问题；利用源于土壤的微生物降解，才是真正能消除长残留除草剂污染的有效途径。

发明内容

[0006] 本发明的目的是一株木糖氧化无色杆菌及其在降解异嗯草酮中的应用。

[0007] 本 发 明 所 提 供 的 木 糖 氧 化 无 色 杆 菌 为 木 糖 氧 化 无 色 杆 菌(Achromobacterxylosoxidans)LYW CGMCC №.2773。

[0008] 所述木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC №.2773为革兰氏阴性菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，30℃条件下生长的菌落表面光滑、湿润、凸起，边缘微锯齿状，平面生长，不透明，培养基暗黄色，菌株细胞呈杆状。

[0009] 所述木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC №.2773，已于2008年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.2773。

[0010] 本发明的木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC №.2773来源于采自黑龙江省哈尔滨市长期施用长残留性除草剂异嗯草酮的土壤，可以在高浓度异嗯草酮环境下生长，并且可以高效降解异嗯草酮，为微生物降解长残留除草剂异嗯草酮的研究提供了重要的基础，可用于受异嗯草酮污染的水体、土壤的生物净化。

附图说明

[0011] 图1为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW在不同温度下对异嗯草酮的降解效果

[0012] 图2为在不同温度下木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW降解异嗯草酮的半衰期

[0013] 图3为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW对200μg·kg-1异嗯草酮的降解效果

[0014] 图4为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW降解200μg·kg-1异嗯草酮的半衰期

[0015] 图5为木糖氧化无色杆菌(Achromobac ter xylosoxidans)LYW对500μg·kg-1异嗯草酮的降解效果

[0016] 图6为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW降解500μg·kg-1异噁草酮的半衰期

具体实施方式

[0017] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

[0018] 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

[0019] 实施例1、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC№.2773的分离、纯化及其鉴定

[0020] 1、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC №.2773的分离及纯化

[0021] 1)采集样品

[0022] 土样采自黑龙江省哈尔滨市东北农业大学实验实习基地内长期施用长残留性除草剂异嗯草酮的土壤。

[0023] 2)菌体的富集和分离

[0024] 将长期施用长残留性除草剂的土壤样品混合均匀，称取10g加入到含有200mg·L-1-1异嗯草酮的50mL富集培养液中，置于30℃，120r·min 的摇床培养。以后每周添加10ml-1 -1
新鲜富集培养液，每次增加异嗯草酮的浓度，使其浓度分别为200mg·L 、400mg·L 、-1 -1 -1 -1 -1 -1
800mg·L 、1600mg·L 、2000mg·L 、3000mg·L 、4000mg·L 、5000mg·L ，富集培养时间-1
分别为2个月，培养液中异嗯草酮浓度达到5000mg·L 后，适应性培养一周，用平板稀释法-1
将其涂布在含有200mg·L 异嗯草酮的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，挑取单菌落，划线纯化，将纯化后的单菌落保存。

[0025] 所述的富集培养液组分及配比为：牛肉膏，3g/L；蛋白胨，5g/L；NaCl，5g/L；K2HPO4，5g/L；PH7.0-7.2。

[0026] 所述的无机盐培养基组分及配比为：KH2PO4，1.70g/L；K2HPO4，5.17g/L；(NH4)2SO4，2.6g/L；盐溶液，10mL/L；PH7.0-7.2。其中盐溶液为含MgSO4，19.5g/L；MnSO4，5g/L；FeSO4，
5g/L；CaCl2，0.3g/L的溶液。

[0027] 所述的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基组分及配比为：牛肉膏，3g/L；蛋白胨，5g/L；琼脂，18g/L，PH7.0-7.2。

[0028] 结果得到一株可在高浓度异嗯草酮环境下生长的菌株，其在上述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，30℃条件下生长的菌落表面光滑、湿润、凸起，边缘微锯齿状，平面生长，不透明，培养基暗黄色，菌株细胞呈杆状。

[0029] 2、将上述得到的菌株进行生理生化鉴定，结果其生理生化特征如表1所示。

[0030] 表1 LYW菌株的生理生化特征

[0031]项目 结果 项目 结果
革兰氏染色 阴性 甲酸 +
细胞形状 杆状 D-半乳糖酸内酯 +
接触酶 + D-半乳糖醛酸 -
氧化酶 - 丙二酸 +W
a-环糊精 - 丙酸 +
糊精 - 丁二酸 +
糖原 +W 溴代丁二酸 +
Tween40 + 琥珀酰胺酸 +
Tween80 + D-丙氨酸 +
N-乙酰半乳糖胺 - L-天冬氨酸 +
N-乙酰葡萄糖胺 - L-谷氨酸 +
核糖醇 - 甘氨酰天冬氨酸 +
L-阿拉伯糖 + 甘氨酰谷氨酸 +
D-阿糖醇 - L-组氨酸 +
D-纤维二糖 - 羟基脯氨酸 -
i-赤藓醇 - L-亮氨酸 +
D-果糖 - L-鸟氨酸 +
L-果糖 - L-苯丙氨酸 +
D-半乳糖 - L-脯氨酸 +
龙胆二糖 - D-丝氨酸 -
a-D-葡萄糖 + L-丝氨酸 +
麦芽糖 - L-苏氨酸 +W
甲基葡糖苷 - 肌苷 -
D-棉子糖 - 脲苷 -
D-鼠李糖 - 胸苷 -
D-山梨醇 - 苯基乙胺 +
蔗糖 - 腐胺 -
木糖醇 - 2-氨基乙醇 -
丙酮酸甲酯 + 2，3-丁二醇 -W
丁二酸一甲酯 + 甘油 -
乙酸 + D-葡糖-1-磷酸 -
柠檬酸 + D-葡糖-6-磷酸 -

[0032] 注：“+”表示生长或反应阳性；“-”表示不生长或反应阴性经上述鉴定表明该菌株为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)，将其命名为LYW。该木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW，已于2008年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №.2773。

[0033] 实施例2、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW对土壤中异嗯草酮的降解

[0034] 1、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW在不同温度下对含量为-1750μg·kg 的土壤中异噁草酮的降解效果

[0035] 将木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC №.2773用牛肉膏蛋白胨培养液(含牛肉膏，3g/L；蛋白胨，5g/L；PH7.0-7.2的培养液)在30℃的条件下进行增值培养，用于下述效果检测实验。

[0036] 在黑土(有机质含量3.557％，田间最大持水量37.5％，全氮0.195％，pH值7.12)-1 9中加入终浓度为750μg·kg 的异嗯草酮，分成6份每份32kg，其中三份分别按照10cfu/kg黑土的量接种木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYWCGMCC №.2773，将该菌株与土壤混匀，调节土壤含水量为田间最大持水量的60％，然后分别置于15℃、
20℃、28℃恒温培养箱中放置作为三个实验组，分别记为15℃处理、20℃处理、28℃处理；
另外三份土壤不接种任何菌，调节土壤含水量为田间最大持水量的60％，分别置于15℃、
20℃、28℃恒温培养箱中放置作为三个空白对照组，分别记为15℃ CK、20℃ CK、28℃ CK。
各组分别在培养后的第5、13、21、29、37、45、53、60天后，测定土壤中各处理异嗯草酮的残留量，计算各组处理异嗯草酮的半衰期。

[0037] 各处理土壤中异嗯草酮的残留量测量结果如图1所示，当温度为15℃、20℃、28℃时，三个空白对照组于第60天测定各对照土壤中异嗯草酮的残留量(图1中15℃ CK、20℃ -1CK、28℃ CK)，分别为673.38，642.52和622.67μg·kg ，而添加LYW菌后的三个处理组(图-1
1中15℃处理、20℃处理、28℃处理)残留量分别为133.45，74.86和52.38μg·kg ，残留率分别为17.79％、9.98％、6.98％，说明木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC №.2773对黑土中异嗯草酮具有很强的降解能力，并且温度为20℃～28℃的范围内降解效果好。

[0038] 各组处理异嗯草酮的半衰期结果如图2所示，结果表明在15℃、20℃、28℃条件下，异嗯草酮在黑土中自然降解的半衰期(图2中CK)分别为433.22天，256.72天和247.55天，而在LYW菌的作用下(图2中处理)，其降解半衰期分别为20.33天、15.83天和
14.09天。结果表明木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC №.2773能大幅度降低土壤中异嗯草酮的半衰期，使土壤中异嗯草酮快速降解。

[0039] 2、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW对含量为200μg·kg-1的土壤中异嗯草酮的降解效果

[0040] 在黑土(有机质含量3.557％，田间最大持水量37.5％，全氮0.195％，pH值7.12)-1 9中加入终浓度为200μg·kg 的异嗯草酮，分成4份每份28kg，其中两份分别按照10cfu/kg土壤的量接种木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYWCGMCC №.2773，将该菌株与土壤混匀，分别调节土壤含水量为田间最大持水量的60％和田间最大持水量的
40％，然后分别置于25℃恒温培养箱中放置作为2个菌处理组；另外2份黑土中不接种任何菌，分别调节土壤含水量为田间最大持水量的60％和田间最大持水量的40％，分别置于
25℃恒温培养箱中放置作为2个空白对照组，分别在持续定期测定土壤中各处理异嗯草酮的残留量，并计算计算各组处理异嗯草酮的半衰期。

[0041] 各处理土壤中异嗯草酮的残留量测量结果如图3所示，结果表明于第65天测定含水量为田间最大持水量的40％的空白对照组土壤(图3中40％CK)和含水量为田间最大持水量的60％的空白对照组土壤(图3中60％CK)中异嗯草酮
-1 -1
的残留量，分别为172.79μg·kg 和169.77μg·kg ，而添加木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)LYW CGMCC №.2773后含水量为田间最大持水量的40％的菌处理组土壤(图3中40％处理)和含水量为田间最大持水量的60％的菌处理组土-1
壤(图3中60％处理)中异嗯草酮的残留量，分别为残留量分别为14.84μg·kg 和-1
9.88μg·kg 。

[0042] 各组处理异噁草酮的半衰期结果如图4所示，结果表明异嗯草酮在黑土中自然降解的半衰期(图2中CK)分别为266.60天和223.60天，而添加木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC №.2773的含水量为田间最大持水量的40％的菌处理组土壤和含水量为田间最大持水量的60％的菌处理组土壤(图4中处理)中异噁草酮的降解效果明显好于未加菌处理(空白对照组)，其降解半衰期分别为15.44和13.13天，比空白对照(图4中CK)相应含水量的土壤中异噁草酮的降解半衰期分别提前了
251.16天和210.47天。

[0043] 3、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW对500μg·kg-1异嗯草酮的降解效果

[0044] 在黑土(有机质含量3.557％，田间最大持水量37.5％，全氮0.195％，pH值7.12)-1 9中加入终浓度为500μg·kg 的异嗯草酮，分成4份每份28kg，其中两份分别按照10cfu/kg土壤的量接种木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYWCGMCC №.2773，将该菌株与土壤混匀，分别调节土壤含水量为田间最大持水量的60％和田间最大持水量的
40％，然后分别置于25℃恒温培养箱中放置作为2个菌处理组；另外2份黑土中不接种任何菌，分别调节土壤含水量为田间最大持水量的60％和田间最大持水量的40％，分别置于
25℃恒温培养箱中放置作为2个空白对照组，分别在持续定期测定各处理土壤中异嗯草酮的残留量，并计算各组处理异嗯草酮的半衰期。

[0045] 各处理土壤中异嗯草酮的残留量测量结果如图5所示，结果表明于第65天测定含水量为田间最大持水量的40％的空白对照组土壤(图5中40％CK)和含水量为田间最大持水量的60％的空白对照组土壤(图5中60％CK)中异嗯草酮
-1 -1
的残留量，分别为456.12μg·kg 和453.33μg·kg ，而添加木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)LYW CGMCC №.2773后含水量为田间最大持水量的40％的菌处理组土壤(图3中40％处理)和含水量为田间最大持水量的60％的菌处理组土壤(图-1 -1
3中60％处理)中异嗯草酮的残留量，分别为残留量分别为46.82μg·kg ，32.34μg·kg 。

[0046] 各组处理异嗯草酮的半衰期结果如图6所示，结果表明异嗯草酮在黑土中自然降解的半衰期(图2中CK)分别为462.10天和407.73天，而添加木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)LYW CGMCC №.2773的含水量为田间最大持水量的40％的菌处理组土壤和含水量为田间最大持水量的60％的菌处理组土壤(图6中处理)中异噁草酮的降解效果明显好于未加菌处理(空白对照组)，其降解半衰期分别为16.82天和14.20天，比空白对照(图6中CK)相应含水量的土壤中异噁草酮的降解半衰期分别提前了445.27天和393.53天，说明LYW菌对土壤中高浓度的异嗯草酮也可以起到快速降解的作用。