一种蛋白质分子印迹整体柱的制备方法

摘要

本发明涉及一种蛋白质分子印迹整体聚合物的制备方法。将适当配比的功能单体、交联剂和蛋白质模板分子在0～4℃下静置2～5分钟，随后依次加入一定量的引发剂和增速剂。将上述混合物迅速注入液相色谱柱管后，放置于-5～-20℃环境中在1～12小时内完成聚合反应。用重量浓度为10％的十二烷基磺酸钠与体积浓度为10％的乙酸溶液洗脱模板蛋白质分子，即可制备大孔蛋白质分子印迹整体柱。本发明的优点为制备方法简单、可靠，获得的蛋白质分子印迹整体柱具有较强的模扳分子识别特性。该技术为发展蛋白质分子印迹整体柱提供了一种新型制备方法。

权利要求

1.一种蛋白质分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于：

以丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺为功能单体，功能单体与交联剂溶于10mM的pH4.5～

7.5的磷酸盐缓冲溶液中；缓冲溶液中功能单体的重量浓度为3.0～6.5％，交联剂的重量浓度0.35～0.7％；通入氮气除氧后加入模板分子，模板分子于缓冲溶液中的重量浓度为

0.15～0.55％，并在0～4℃下静置2～5分钟；随后加入引发剂过硫酸铵和增速剂N，N，N`，N`-四甲基乙二胺，缓冲溶液中引发剂的重量浓度为0.08～0.2％，增速剂的重量浓度为0.1～0.15％；混合均匀后迅速注入液相色谱柱管中，放入-5～-20℃环境中聚合1～

12小时；以上各物质的重量浓度均为它们在缓冲溶液中的终浓度；聚合反应结束后，用含有重量浓度9-11％十二烷基磺酸钠的体积浓度为9-11％乙酸混合液洗脱聚合物上的模板分子，获得大孔蛋白质分子印迹整体柱；最后，用pH4.5～7.5磷酸盐缓冲液冲洗柱子至色谱基线平衡即可使用；

所述模板分子为牛血清白蛋白、溶菌酶或细胞色素C；

所述功能单体除丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺外，其中还含有重量浓度为0.10.4％的甲基丙烯酸。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述交联剂为N，N`-亚甲基双丙烯酰胺或哌嗪二丙烯酰胺。

说明书

一种蛋白质分子印迹整体柱的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及液相色谱柱的制备，具体地说是一种新型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法。

背景技术

[0002] 分子印迹(molecular imprinting)是近年来基于分子识别机理发展起来的一种对特定分子(模板分子或印迹分子)具有选择性的聚合物合成技术。通常被描述为制造识别“分子钥匙”的人工“锁”的技术。例如在非共价型分子印迹中通常以目标分子为模板，通过氢键、静电作用、疏水作用等作用，将该分子与可聚合的功能单体进行组装，并于交联剂发生聚合反应。反应结束后除去印迹分子，即可在聚合物中形成功能基团精确排布的孔穴。该孔穴与印迹分子的形状、大小、电荷分布具有互补性。因此，制备的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)对印迹分子具有良好的选择性。目前，以小分子为印迹分子制备的MIP已广泛应用于色谱填料、人工受体、模拟酶、催化剂以及传感器等领域。

[0003] 然而，由于该方法本身的局限性，MIP面临的主要挑战之一是以蛋白质为模板制备蛋白质分子印迹整体柱。这是由于蛋白质体积大，将其包裹在聚合物网络中后难以洗脱出来。此外，在反应过程中还必须保持蛋白质的构象。

[0004] 目前，蛋白质分子印迹聚合物的制备方法主要有包埋法、表面印迹法和抗原决定基法。包埋法也称本体聚合法，是将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按照一定比例溶解在适当的溶剂中后，通过脱气、除氧，经引发聚合制备印迹聚合物。Liao等以血红蛋白、生长激素、红细胞色素、肌红蛋白和核糖核酸酶为模板分子，以丙烯酰胺为功能单体合成了低交联度的丙烯酰胺凝胶。然而制备的聚合物交联度低，机械强度差。部分模板分子由于被包埋在颗粒内洗脱困难。此外，吸附所需的平衡时间也较长(Liao，J.L.，Wang，Y.，Hjertén，S.，Chromatographia 1996，42，259-262；Hjertén，S.，Liao，J.L.，Nakazato，K.，Wang，Y.et al.，Chromatographia 1997，44，227-234)。采用表面印迹技术可将模扳分子的识别位点置于颗粒表面，能克服本体聚合的弊端。通常是在微球或聚合物涂层上进行印迹。Glud将转铁蛋白在溶液中与硼酸酯硅烷发生作用，然后在多孔硅胶颗粒上进行聚合。由于硼酸酯基团能与转铁蛋白上的硅酸铝发生不可逆反应，因此硼酸酯硅烷与转铁蛋白的预结合使得硼酸酯基团能正确排列，确保了与转铁蛋白的特异性相互作用(Glad M，Norrl w O，Sellergren B，Siegbahn N，Mosbach K。J.Chromatogr.1985，347，11-23.)。但是这种方法制备的印迹聚合物吸附容量比较低，制备过程繁琐。Shi等先将蛋白质吸附在云母表面，再将二糖分子薄层覆盖在吸附的蛋白质上。随后将含氟聚合物薄膜通过射频发光放电等离子体与糖分子交联。去除云母并洗脱蛋白质分子后即可在聚合物薄膜表面形成多糖覆盖的蛋白质印迹纳米孔穴。该材料对二元蛋白质溶液中的模板蛋白质具有一定的选择性吸附。但由于聚合物的表面积所限，此项技术只能用于蛋白质的检测，不适于对蛋白质进行识别分离(Shi H.，Tsai W.B.，Garrison M.D.，Ferrari S.，Ratner B.D.，Nature 1999，398，
593-597.)。抗原决定基法的原理是抗体在识别抗原时，只与抗原的决定基作用。因此具有相同决定基的抗原可以被同一种抗体识别。以代表蛋白质或多肽结构的小部分裸露片断的短肽作为模板，形成与之匹配的空间孔穴，即可识别多种具有该肽段的分子(Rachkov A.，Minoura N.；Biochimica et Biophysica Acta1544(2001)255-266)。该方法的缺点是选择性较差。印迹聚合物不仅可以识别模板分子，而且可以识别与模板具有相同氨基酸序列的多肽或蛋白质。

[0005] 综上所述，目前已有的蛋白质印迹技术仅限于合成聚合物颗粒。其蛋白质模板分子包埋严重，选择性差，无法对蛋白质进行识别分离。因此均不适于制备蛋白质印迹整体柱。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种蛋白质印迹整体柱的制备方法，以期解决在制备蛋白质印迹三维聚合物时难以将蛋白质模板从聚合物内部洗脱的关键问题。该发明以常温缓冲溶液为溶剂，溶解模板蛋白质、功能单体、交联剂以及引发剂；在低温聚合时水逐渐形成冰粒，成为聚合反应的致孔剂。同时单体在溶液中的浓度增大，聚合速度加快。当聚合反应完成后，温度升至常温，冰粒融化，聚合物内部即可形成多孔网状结构。这些孔道不仅具有很高的比表面，而且内表面上印迹的蛋白质非常易于从孔道中洗脱。通过该方法即可获得具有较大吸附容量的蛋白质印迹聚合物，从而实现蛋白质在色谱固定相上的识别分离。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0008] 一种蛋白质分子印迹整体柱的制备方法，

[0009] 以丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺为功能单体，功能单体与交联剂溶于10mM的pH4.5～7.5的磷酸盐缓冲溶液中；缓冲溶液中功能单体的重量浓度为3.0～6.5％，交联剂的重量浓度0.35～0.7％；通入氮气除氧后加入模板分子，模板分子于缓冲溶液中的重量浓度为0.15～0.55％，并在0～4℃下静置2～5分钟；随后加入引发剂过硫酸铵和增速剂N，N，N`，N`-四甲基乙二胺，缓冲溶液中引发剂的重量浓度为0.08～0.2％，增速剂的重量浓度为0.1～0.15％；混合均匀后迅速注入液相色谱柱管中，放入-5～-20℃环境中聚合1～12小时；聚合反应结束后，用含有重量浓度9-11％十二烷基磺酸钠的体积浓度为9-11％乙酸混合液洗脱聚合物上的模板蛋白，获得大孔蛋白质分子印迹整体柱；最后，用pH4.5～7.5磷酸盐缓冲液冲洗柱子至色谱基线平衡即可使用；

[0010] 所述模板分子为牛血清白蛋白、溶菌酶或细胞色素C。

[0011] 所述功能单体除丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺外，其中还含有重量浓度为0.1～0.4％的甲基丙烯酸；所述交联剂为N，N`-亚甲基双丙烯酰胺或哌嗪二丙烯酰胺。

[0012] 本发明的优越性：(1)采用低温时水结冰形成的冰粒为聚合反应的致孔剂，不需要加入其它致孔剂；(2)制备的蛋白质印迹聚合物具有大孔结构；(3)蛋白质模板分子从聚合物中的洗脱非常容易；(4)制备的蛋白质印迹整体聚合物具有较快的传质速率和较强的分子识别特性；(5)制备过程简单，合成成本低。

附图说明

[0013] 图1.牛血清白蛋白印迹整体柱对牛血清白蛋白的识别效果；图中Hb指血红蛋白；SA指牛血清白蛋白；

[0014] 图2.溶菌酶印迹整体柱对溶菌酶的识别效果；图中，1为指碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制剂，2为溶菌酶。

具体实施方式

[0015] 实施例

[0016] 选用重量浓度为3.0～6.5％的丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺与0.1～0.4％的甲基丙烯酸为功能单体，与重量浓度为0.35～0.7％的交联剂N，N`-亚甲基双丙烯酰胺或哌嗪二丙烯酰胺共同溶于10mM的磷酸盐缓冲溶液(pH4.5～7.5)中。通入氮气除去其中溶解的氧气后加入重量浓度为0.15～0.55％的模板蛋白质分子溶菌酶、细胞色素C或牛血清白蛋白。在0～4℃放置2～5分钟，加入重量浓度为0.08～0.2％的引发剂过硫酸铵和重量浓度0.1～0.15％的增速剂N，N，N`，N`-四甲基乙二胺。混合均匀后迅速注入液相色谱柱中，并放置在-5～-20℃下反应1～12小时。

[0017] 以上各物质的重量浓度均为它们在缓冲溶液中的终浓度。

[0018] 空白对照物，非分子印迹聚合物(NIP)的制备，除不加模板蛋白质分子外，其他步骤同上。

[0019] 整体印迹柱的合成条件如下表所示：

[0020]

[0021]

[0022] 按照上表中的用量制备整体柱后，用重量浓度10％十二烷基磺酸钠和体积浓度10％乙酸混合溶液洗脱聚合物上的模板蛋白，可得大孔的整体印迹柱；接着用水、pH4.5～
7.5磷酸盐缓冲液冲洗柱子至基线平衡即可使用。

[0023] 图1为以牛血清白蛋白作为模板分子制备的分子印迹整体柱在液相色谱模式下，对血红蛋白和牛血清白蛋白混合物中牛血清白蛋白的选择性识别。从图中可以看出虽然两种蛋白的性质相似，但该印迹整体柱对模板蛋白质表现出较强的保留。这说明通过本发明方法制备的分子印迹整体柱具有较好的蛋白质印迹效果。

[0024] 图2为以溶菌酶作为模板分子制备的分子印迹整体柱在液相色谱模式下，对指碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制剂和溶菌酶混合物中溶菌酶的选择性识别。从图中可以看出该印迹整体柱对模板蛋白质表现出较强的保留。这说明通过本发明方法制备的分子印迹整体柱具有较好的蛋白质印迹效果。