经修饰的软骨素合酶多肽及其晶体

摘要

公开了：(A)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的多肽；或(B)包含SEQ ID NO：2中具有一个或几个氨基酸的缺失、替代或添加的氨基酸序列并且具有软骨素合酶活性的多肽；编码所述多肽的核酸；生产所述多肽的方法，其包括至少如下步骤：(1)表达所述核酸以生产多肽；和(2)收集步骤(1)中生产的多肽；以及所述多肽的晶体。所述晶体可以是单斜晶体或四方晶体。

权利要求

1.由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽。

2.编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽的核酸。

3.由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成的DNA。

4.生产根据权利要求1的多肽的方法，其包括至少下面的步骤(1)和(2)：(1)从至少一种根据权利要求2和3的核酸表达多肽的步骤；和(2)收集步骤(1)中表达的多肽的步骤。

5.根据权利要求1的多肽的晶体，其是片状晶体，且显示出下面的晶体数据：晶系：单斜晶系

布喇菲晶格：简单单斜晶格空间群：P21

晶格常数：

a＝83.5

b＝232.0

c＝86.0

β＝105.5°。

6.根据权利要求1的多肽的晶体，其是八面体晶体，且显示出下面的晶体数据：晶系：四方晶系

布喇菲晶格：简单四方晶格空间群：P4

晶格常数：

a＝336

b＝336

c＝100

7.生产软骨素的方法，其包括在根据权利要求1的多肽存在下将软骨素、D-葡糖醛酸供体、和N-乙酰-D-半乳糖胺供体反应。

说明书

经修饰的软骨素合酶多肽及其晶体

技术领域

[0001] 本发明涉及经修饰的软骨素合酶多肽、编码该多肽的核酸、生产该多肽的方法、该多肽的晶体，等等。

[0002] 背景技术

[0003] 本文中所用缩写及其含义如下：

[0004] K4CP：来自大肠杆菌(Escherichia coli)K4菌株(血清型O5：K4(L)：H4，ATCC23502)的软骨素合酶

[0005] GalNAc：N-乙酰-D-半乳糖胺

[0006] GlcUA：D-葡糖醛酸

[0007] SDS：十二烷基硫酸钠

[0008] SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

[0009] UDP：尿苷5′-二磷酸

[0010] 专利文件1公开了来自大肠杆菌(Escherichia coli)K4菌株的软骨素合酶和编码该合酶的DNA。专利文件2公开了在K4CP的某个区域具有一个或几个氨基酸替代的经修饰的酶。

[0011] 然而，两个文件都没有公开和暗示本发明的多肽、编码该多肽的核酸、本发明多肽的晶体，等等。此外，这些文件的任一个都没有公开和暗示修饰K4CP以增加从它的DNA的表达水平、增强酶活性和促进结晶的想法。

[0012] 专利文件3公开了来自普通变形菌(Proteus vulgaris)的新的硫酸软骨素裂合酶及其晶体。然而，对K4CP没有公开或暗示。

[0013] 专利文件1：JP 2003-199583A

[0014] 专利文件2：JP 2005-65565A

[0015] 专利文件3：JP 10-262660A

[0016] 发明内容

[0017] 本发明的目的是提供：软骨素合酶多肽，其可以以高水平从核酸表达，具有高酶促活性，并且可以被结晶；编码该多肽的核酸；生产该多 肽的方法；该多肽的晶体；等等。 [0018] 本发明的发明人已经进行了广泛研究，且结果，他们已得到了在K4CP的特定区域具有缺失的多肽和编码该多肽的核酸。本发明人已惊奇地发现使用该多肽作为软骨素合酶可以显著增从它的核酸表达的效率并且可以显著增强酶促活性，并且由于该多肽分子是稳定的，其可以被容易地结晶，从而完成了本发明。

[0019] 即，本发明提供了下面的(A)或(B)代表的多肽(下文中称作“本发明的多肽”)： [0020] (A)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽；或

[0021] (B)由包括一个或几个氨基酸的缺失、替代或添加的SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成并且具有软骨素合酶活性的多肽。

[0022] 此外，本发明提供了编码下面的(A)或(B)代表的多肽的核酸(下文中称作“本发明的核酸”)：

[0023] (A)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽；或

[0024] (B)由包括一个或几个氨基酸的缺失、替代或添加的SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成并且具有软骨素合酶活性的多肽。

[0025] 作为本发明的核酸，在下面(a)或(b)中描述的核酸可以作为示例： [0026] (a)由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成的DNA；或

[0027] (b)DNA，其在严格条件下与由与DNA(a)互补的核苷酸序列组成的DNA杂交并且具有软骨素合酶活性。

[0028] 此外，本发明提供了生产本发明的多肽的方法，其包括至少下面的步骤(1)和(2)(下文中称作“本发明的生产方法”)：

[0029] (1)从至少一种本发明的核酸表达多肽的步骤；和

[0030] (2)收集步骤(1)中表达的多肽的步骤。

[0031] 此外，本发明提供了本发明的多肽的晶体(下文中称作“本发明的晶体”)。 [0032] 作为本发明的晶体，示例可以为片状晶体(下文中称作“本发明的晶体1”)。具体地，示例可以为显示出下面的晶体数据的晶体：

[0033] 晶系：单斜晶系

[0034] 布喇菲晶格：简单单斜晶格

[0035] 空间群：P21

[0036] 晶格常数：

[0037]

[0038]

[0039]

[0040] β＝105.5°

[0041] 此外，作为本发明的晶体，示例也可以为八面体晶体(下文中称作“本发明的晶体2”)。更具体地，示例可以为显示出下面的晶体数据的晶体：

[0042] 晶系：四方晶系

[0043] 布喇菲晶格：简单四方晶格

[0044] 空间群：P4

[0045] 晶格常数：

[0046]

[0047]

[0048]

[0049] 此外，本发明提供了生产软骨素的方法，其包括在本发明的多肽存在下，将糖受体底物、D-葡糖醛酸供体和N-乙酰-D-半乳糖胺供体反应。

[0050] 附图简述

[0051] 图1是显示用胰蛋白酶处理的K4CP的SDS-PAGE的图(照片)。

[0052] 图2是显示ΔN57K4CP的凝胶过滤层析级分的SDS-PAGE的图(照片)。 [0053] 图3是显示本发明的晶体1的光学显微镜图像的图(照片)。

[0054] 图4是显示本发明的晶体2的光学显微镜图像的图(照片)。

[0055] 图5是显示用ΔN57K4CP合成的软骨素的洗脱模式的曲线图。

[0056] 实施本发明的最佳方式

[0057] 下文中，通过参考实施本发明的最佳方式详细描述本发明。

[0058] <1>本发明的多肽

[0059] 本发明的多肽是通过下面(A)或(B)代表的多肽：

[0060] (A)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽；或

[0061] (B)由包括一个或几个氨基酸的缺失、替代或添加的SEQ ID NO：2 的氨基酸序列组成并且具有软骨素合酶活性的多肽。

[0062] 下文中，按顺序进行解释。

[0063] 多肽(A)

[0064] 多肽(A)是K4CP多肽，其中来自N-末端的57个氨基酸被缺失，并且该多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中显示。生产该多肽的方法不被具体限制，只要可以得到具有该序列的多肽。例如，通过肽合成技术，或者通过用蛋白酶如胰蛋白酶从N-末端除去57个氨基酸残基，或者使用编码该多肽的核酸通过基因工程技术，可以生产所述多肽。更具体的实例在下面的实施例1和2中显示。

[0065] 所述多肽具有高软骨素合酶活性并且可以如下述容易地结晶。

[0066] 多肽(B)

[0067] 多肽(B)是由包括一个或几个氨基酸的缺失、替代或添加的SEQ IDNO：2的氨基酸序列组成并且具有软骨素合酶活性的多肽。

[0068] 在多肽中，可以出现编码多肽的核酸的多态性或突变，且由于细胞中和纯化中生产的多肽的修饰，在它的氨基酸序列中也可以出现突变，其引起氨基酸的缺失、替代或添加。尽管如此，已知某种肽显示出与没有突变的多肽基本相等的生理/生物学活性。多肽(B)包括具有与多肽(A)稍微不同的结构但在功能中没有显著不同的多肽。 [0069] 添加的实例包括向SEQ ID NO：2的氨基末端添加选自甲硫氨酸、丙氨酸和甘氨酸的一个或两个或更多个氨基酸残基和向SEQ ID NO：2的氨基末端或羧基末端添加如下述的用于纯化的肽序列或者间隔序列。

[0070] 注意到(B)中“包括一个或几个氨基酸的添加的SEQ ID NO：2的氨基酸序列”不包括在SEQ ID NO：2的氨基末端添加来自K4CP的N-末端的57个氨基酸残基或其部分的序列，其导致丧失本发明的多肽特有的表达效率和结晶性质。

[0071] 如本文所用的术语“几个氨基酸”指可以被突变的氨基酸残基的数目，只要不损害软骨素合酶活性。具体地，该数目为例如2到40的整数，优选2到30的整数，更优选2到20的整数，还更优选2到15的整数，还更优选2到10的整数，还更优选2到8的整数，且还更优选2到6的整数。

[0072] 本发明的多肽可以具有这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：2有不小于90％，优选不小于95％，更优选不小于98％的同源性，只要该肽 不包括来自K4CP的N-末端的57个氨基酸残基，并且该肽具有软骨素合酶活性。可以基于Karlin和Altschul的算法，BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)) 或 FASTA(Methods Enzymol.，183，63(1990))确定氨基酸序列的同源性。

[0073] 本发明的多肽具有软骨素合酶活性。可以根据下面实施例3中描述的方法证实该肽是否具有软骨素合酶活性。

[0074] 生产该多肽的方法不受到具体限制，并且通过肽合成技术基于包括一个或几个氨基酸的缺失、替代或添加的SEQ ID NO：2的氨基酸序列(具有软骨素合酶活性)或者通过基因工程技术使用通过下述方法在其中导入突变的核酸，可以生产所述肽。 [0075] 本发明的多肽可以用于软骨素合成(软骨素糖链的延长反应)，其通过将所述多肽与糖供体底物(UDP-GalAc和UDP-GluUA)和糖受体底物(软骨素寡糖)接触用于所述合成来实现。此外，本发明的多肽可以用作生产如下述的本发明的晶体的材料。细节在下面的实施例中显示。

[0076] <2>本发明的核酸

[0077] 本发明的核酸是编码下面的多肽(A)或(B)的核酸：

[0078] (A)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽；或

[0079] (B)由包括一个或几个氨基酸的缺失、替代或添加的SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成并且具有软骨素合酶活性的多肽。

[0080] 多肽(A)和(B)如上面“<1>本发明的多肽”中所述。

[0081] 如本文所用的术语“核酸”包括DNA和RNA。因此，本发明的核酸类型可以是DNA或RNA，只要该核酸编码上述多肽，且具体地，该核酸优选是DNA。

[0082] 本领域技术人员将容易理解本发明的核酸包括由于遗传密码简并性而具有不同的核苷酸序列的核酸。

[0083] 作为本发明的核酸，在下面(a)或(b)中描述的核酸可以为示例： [0084] (a)由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成的DNA；或

[0085] (b)DNA，其在严格条件下与具有与DNA(a)互补的核苷酸序列的DNA杂交并且具有软骨素合酶活性。

[0086] 如本文所用的术语“严格条件”指其中形成所谓的特异杂交体(hybrid)并且不形成非特异性杂交体的条件(见Sambrook，J.等人，MolecularCloning A Laboratory Manual，second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，等)。“严格条件”的特定实例包括在42℃下在含有50％甲酰胺，4×SSC，50mM HEPES(pH7.0)，10×Denhardt氏溶液，100μg/ml鲑精DNA的溶液中杂交并在室温下用2×SSC，0.1％SDS溶液洗涤和在50℃下用0.1×SSC，0.1％SDS溶液洗涤的条件。可以根据下面实施例3中描述的方法证实多肽是否具有软骨素合酶活性。

[0087] 本发明的核酸已经基于最初分离自大肠杆菌K4菌株的核酸得到但是包括通过核酸合成、基因工程技术等等生产的核酸。如上述，尽管生产本发明的核酸的方法不被具体限制，但是通过下面实施例中描述的方法可以生产核酸。

[0088] 在本发明的核酸中，可以如下所述生产编码多肽(B)的核酸和DNA(b)。 [0089] 向编码多肽(A)的核酸或DNA(a)中引入核苷酸的缺失、替代或添加以引起氨基酸残基的缺失、替代或添加，其不相当大地损害此种核酸编码的多肽的软骨素合酶活性。可以如下所述向核酸中引入核苷酸的缺失、替代或添加：合成序列，该序列在两端具有限制酶可切割的位点并且含有所突变位置的两侧部分，并用合成的序列替换非突变核酸中所含的对应的核苷酸序列。备选地，也可以按照诸如位点特异性诱变方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.in Enzymol.，154，350(1987)；Kunkel，T.A. 等 人，Meth.in Enzymol.，154，367(1987))的方法向核酸中引入缺失、替代或添加。如果从具有如上述引入的缺失、替代或添加的核酸表达的多肽具有软骨素合酶活性，那么可以确定该核酸是目的核酸。可以根据下面实施例3中描述的方法证实表达的多肽是否具有软骨素合酶活性。

[0090] 如果编码本发明的多肽的本发明的核酸被表达，那么可以生产本发明的多肽。细节在下面实施例中显示。

[0091] <3>本发明的生产方法

[0092] 本发明的生产方法是生产本发明多肽的方法，其包括至少下面的步骤(1)和(2)： [0093] (1)从至少一种本发明的核酸表达多肽的步骤；和

[0094] (2)收集步骤(1)中表达的多肽的步骤。

[0095] 下文中，按顺序进行解释：

[0096] 步骤(1)是从本发明的核酸表达多肽的步骤。本发明的核酸如上面的“<2>本发明的核酸”中描述。

[0097] 从本发明的核酸表达多肽的方法不受到具体限制，只要本发明的核酸编码的多肽从该核酸生产。例如，可以如下所述从本发明的核酸表达多肽：将本发明的核酸插入到合适表达载体中；将该载体导入合适的宿主中以制备转化体，并生长转化体。表达载体和宿主不受到具体限制并且可以合适地选自本领域技术人员已知的载体和宿主。其特定实例在下面的实施例中显示。如本文所用的术语“生长”不仅包括增殖用作转化体的细胞或微生物，而且包括已经整合入了作为转化体的细胞的动物、昆虫等等的生长。本领域技术人员可依赖于待用的宿主类型适当选择生长条件。

[0098] 该步骤中表达的多肽是本发明的多肽。

[0099] 步骤(2)是收集在步骤(1)中表达的多肽(本发明的多肽)的步骤。 [0100] 本领域技术人员可依赖于步骤(1)中多肽的表达方法适当选择收集所述多肽的方法。

[0101] 例如，当通过将本发明的核酸插入表达载体，将载体导入宿主如大肠杆菌并培养宿主，使得本发明的多肽被表达并分泌于培养基(培养液体培养基的上清液)中时，可以收获培养基并不经进一步处理而用作本发明的多肽。

[0102] 此外，当多肽作为在细胞质中分泌的可溶形式或作为不溶(膜结合的)形式表达时，可以通过处理程序提取表达的多肽，如：使用氮空化装置的方法；通过细胞裂解提取，如匀浆，玻璃珠磨方法，超声破裂方法，和渗透压震扰方法，或者冻融方法；表面活性剂提取；或者其组合。备选地，可以收获提取物并不经进一步处理而用作本发明的多肽。 [0103] 本发明的生产方法可以还包括另一步骤，只要该方法包括步骤(1)和步骤(2)。 [0104] 例如，可以在步骤(2)后进行纯化本发明的多肽的步骤。纯化可以是部分纯化或完全纯化，并且本领域技术人员依赖于本发明的多肽的目的等等可以适当选择所述方法。 [0105] 纯化方法的特定实例包括处理程序，如用硫酸铵、硫酸钠等等盐析、离心、透析、超滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析、亲和层析、电泳和其组合。

[0106] 本发明的多肽可以作为与其他蛋白或肽如谷胱甘肽S-转移酶(GST) 或聚组氨酸的融合蛋白表达，以使用所述蛋白或肽的亲和柱纯化该肽。此种融合蛋白也可以被包括在本发明的多肽中。

[0107] 通过分析所得多肽的氨基酸序列、功能等等可以证实是否生产了本发明的多肽。 [0108] <4>本发明的晶体

[0109] 本发明的晶体是本发明的多肽的晶体。即，晶体包括上面多肽(A)和(B)两者的晶体。晶体优选为多肽(A)的晶体。

[0110] 本发明的晶体不受到具体限制，只要该晶体是本发明的多肽的结晶产物。此外，生产晶体的方法可以适当地选自本领域技术人员已知的用于多肽结晶的技术。本发明的晶体的实例包括单斜和四方晶体。

[0111] 本发明的晶体的特定实例包括本发明的晶体1和2。

[0112] 本发明的晶体1优选为片状晶体。显示出下面的晶体数据的晶体是更优选的： [0113] 晶系：单斜晶系

[0114] 布喇菲晶格：简单单斜晶格

[0115] 空间群：P21

[0116] 晶格常数：

[0117]

[0118]

[0119]

[0120] β＝105.5°

[0121] 通过向含有本发明的多肽的溶液中加入终浓度为约15％的聚乙二醇并让溶液在室温静置可以生产本发明的晶体1。更具体的生产方法在下面实施例4中显示。 [0122] 本发明的晶体2优选是八面体晶体。显示出下面的晶体数据的晶体是更优选的： [0123] 晶系：四方晶系

[0124] 布喇菲晶格：简单四方晶格

[0125] 空间群：P4

[0126] 晶格常数：

[0127]

[0128]

[0129]

[0130] 通过向含有本发明的多肽的溶液中加入终浓度为约4M的甲酸钠并让溶液在室温静置可以生产本发明的晶体2。更具体的生产方法在下面实施例5中显示。 [0131] 本发明的晶体可以以极高纯度提供本发明的多肽。例如，可以将本发明的晶体再溶解在水性溶剂中并用作本发明的多肽用于软骨素合成等等。

[0132] <5>生产本发明的软骨素的方法

[0133] 生产本发明的软骨素的方法包括将糖受体底物、D-葡糖醛酸供体(GlcUA)及N-乙酰-D-半乳糖胺供体(GalNAc)在本发明多肽存在下反应的步骤。

[0134] GlcUA供体优选为核苷二磷酸-GlcUA，且尤其优选UDP-GlcUA。另一方面，GalNAc供体优选为核苷二磷酸-GalNAc，尤其优选UDP-GalNAc。

[0135] 糖受体底物优选为软骨素，且尤其优选软骨素寡糖，如软骨素四糖和软骨素六糖。例如，通过上述反应生产软骨素并通过柱层析纯化所得的软骨素可以得到纯化的软骨素。 [0136] 生产本发明的软骨素的方法不受到所得软骨素分子量的限制，并且可以如下面实施例所述生产具有高达数十万或更高分子量的软骨素。

[0137] 下文中，通过参考实施例详细描述本发明。

[0138] 实施例1

[0139] 通过野生型K4CP的胰蛋白酶处理生产本发明的多肽(ΔN57K4CP)

[0140] 将具有SEQ ID NO：3(编码野生型K4CP)的核苷酸序列的DNA插入到作为表达载体的pGEX4T3(Amersham Biosciences生产；核苷酸序列在SEQ ID NO：5中显示)中的BamHI位点(SEQ ID NO：5中的核苷酸编号930-935)和EcoRI位点(SEQ ID NO：5的核苷酸编号938-943)之间。通过专利文件1中描述的方法制备具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的DNA(专利文件1的实施例2中“插入片段”对应于具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的DNA)。

[0141] 以与专利文件1的实施例2中所述相同的方法将该DNA用于转化大肠杆菌Top10F’(Invitrogen)，并且表达多肽。

[0142] pGEX4T3表达的多肽作为与GST(谷胱甘肽S-转移酶)的融合蛋白得到，并且使用谷胱甘肽琼脂糖(Sepharose)4B(GE HealthcareBiosciences)将表达的多肽进行亲和纯化。

[0143] 用凝血酶处理纯化的多肽以除去GST。通过向13μg多肽加入1单位凝血酶并在4℃过夜温育混合物进行凝血酶处理。

[0144] 凝血酶处理后，进行凝胶过滤(Sephacryl-S200；AmershamBiosciences生产)，以从而得到不含GST的K4CP(具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列)。

[0145] 用终浓度10ng/ml的胰蛋白酶在20℃下处理所得的产物15分钟。将未处理的和处理的溶液进行SDS-PAGE(12.5％凝胶)；并用考马斯亮蓝对凝胶染色。结果在图1中显示。在图1中，“M”、“-”和“+”分别代表分子量标记、胰蛋白酶未处理的溶液、和胰蛋白处理的溶液。

[0146] 如图1所示，在胰蛋白酶处理的溶液的情况中，检测到由胰蛋白酶处理生产的具有稍小的分子量的带(图1中实心三角形标记)。作为分析具有较小分子量的带的N-末端氨基酸序列的结果，发现该带对应于K4CP分子，其中来自N-末端的57个氨基酸残基已经被缺失。因此，发现该带是具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。下文中，将该多肽称作“ΔN57K4CP”。

[0147] 实施例2

[0148] 通过基因工程技术生产本发明的多肽(ΔN57K4CP)

[0149] 将具有SEQ ID NO：1(编码ΔN57K4CP)的核苷酸序列的DNA插入到上述表达载体pGEX4T3中的BamHI位点(SEQ ID NO：5中的核苷酸编号930到935)和EcoRI位点(SEQ ID NO：5中的核苷酸编号938到943)之间。通过PCR(聚合酶链反应)制备具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA。

[0150] 将DNA导入大肠杆菌Top10F’(Invitrogen)中，并在30℃下在补加了终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素钠的2×YT培养基中培养细菌。当培养基中的细菌细胞的浓度(OD600；600nm下的吸光度)达到0.6到1时，向培养基中加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D(-)-硫代吡喃型半乳糖苷)，接着在30℃过夜培养。培养完成后，用谷胱甘肽琼脂糖(Sepharose)4B(GE Healthcare Biosciences)将细胞匀浆的上清液进行 亲和层析。 [0151] 用凝血酶处理纯化的多肽以除去GST。以与实施例1相同的方法用凝血酶处理。 [0152] 凝血酶处理后，以与实施例1相同的方法进行凝胶过滤，以从而得到不含有GST的ΔN57K4CP(具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列)。将凝胶过滤得到的洗脱的级分(7个级分)以与实施例中相同的方法进行SDS-PAGE，且用考马斯亮蓝染色凝胶。结果在图2中显示。
在图2中，“M”代表分子量标记。

[0153] 图2表明通过基因工程技术可以生产ΔN57K4CP。发现在该实施例中表达的ΔN57K4CP的表达水平为实施例1中表达的K4CP的表达水平的约10倍。

[0154] 实施例3

[0155] 酶促活性的测量

[0156] 测量在实施例2中生产的ΔN57K4CP和通过专利文件1的实施例2中描述的方法生产的K4CP(通过将含有His-标记的肽与具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的N-末端结构域融合得到)的软骨素合酶活性。测量方法如下。

[0157] 将反应溶液(50μl)在30℃温育30分钟，该反应溶液含有要测量其酶促活性的多肽(2.0μg)，50mM Tris-HCl(pH7.2)，20mM MnCl2，0.15M NaCl，软骨素己糖(0.1 nmol；3
Seikagaku Corporation)，UDP-[H]GalNAc(0.1μCi，3nmol)，和UDP-GlcUA(3nmol)。温育后，在100℃加热反应溶液1分钟以终止酶促反应。之后，将溶液应用到Superdex Peptide HR10/30柱(GE Healthcare Biosciences)，并使用0.2MNaCl作为洗脱剂进行凝胶过滤层析。收集含有软骨素己糖或者更大分子的级分，并使用闪烁计数器测量酶促反应掺入的
3
[H]GalNAc的放射性。

[0158] 发现ΔN57K4CP的软骨素合酶活性为K4CP的2.06倍。

[0159] 实施例4

[0160] 本发明的晶体1的生产

[0161] 制备含有浓度为20mg/ml(溶剂组成：50mM Tris-HCl(pH8.0)，500mM NaCl，10mM UDP和5mM MnCl2)的实施例2中得到的ΔN57K4CP 的溶液，并向该溶液中加入终浓度分别为15％和0.2M的聚乙二醇(PEG3350；Hampton Research)和NaCl，并让整个溶液在室温静置。结果，生产了ΔN57K4CP的晶体。该晶体的光学显微镜图像在图3中显示。如图3所示，晶体是片状晶体。为该晶体进行X射线晶体学分析以获得下述晶体数据。 [0162] 晶系：单斜晶系

[0163] 布喇菲晶格：简单单斜晶格

[0164] 空间群：P21

[0165] 晶格常数：

[0166]

[0167]

[0168]

[0169] β＝105.5°

[0170] 实施例5

[0171] 本发明的晶体2的生产

[0172] 制备含有浓度为20mg/ml(溶剂组成：50mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM NaCl，10mM UDP和5mM MnCl2)的实施例2中得到的ΔN57K4CP的溶液，并向该溶液中加入终浓度分别为4M和20mM的甲酸钠和二硫苏糖醇，并让整个溶液在室温静置。结果，生产了ΔN57K4CP的晶体。该晶体的光学显微镜图像在图4中显示。如图4所示，晶体是八面体晶体。为该晶体进行X射线晶体学分析以得到下面的晶体数据。

[0173] 晶系：四方晶系

[0174] 布喇菲晶格：简单四方晶格

[0175] 空间群：P4

[0176] 晶格常数：

[0177]

[0178]

[0179]

[0180] 尽管通过各种方法尝试了SEQ ID NO：4(其中没有从N-末端除去57个氨基酸残基)的K4CP的结晶，但是没有得到K4CP晶体。

[0181] 实施例6

[0182] 将实施例2中生产的ΔN57K4CP(20μg)在反应溶液(50mMTris-HCl，pH7.2，0.2mM MnCl2，0.15M NaCl，100μl)中于30℃下温育72小时，该反应溶液含有UDP-[3H]GalNAc(0.1μCi，30nmol)，UDP-GlcUA(30nmol)，和软骨素己糖([A]1nmol，[B]0.1nmol，[C]0.01nmol)。加热反应溶液并使用串联连接的Sephacryl S500 HR10/30柱和Superose
6HR10/30柱(GE Healthcare Biosciences)以0.5ml/分钟的流速进行凝胶过滤层析。测量洗脱的级分的[3H]放射性以分析所合成的软骨素的洗脱模式(图5)。

[0183] 用透明质酸参照标准品产生分子量的校准曲线，并基于校准曲线计算洗脱的合成软骨素的平均分子量。结果，发现[A]、[B]和[C]的平均分子量分别为约16kDa、约216kDa和约685kDa。

[0184] 实施例7

[0185] 在如 实 施例 6中 所用 的 反应 溶 液(100μl)中 温育 实 施例 2中 生产的ΔN57K4CP(200μg)以进行 酶促反应，该反应溶 液含有没 有放射性的UDP-GalNAc(300nmol)，UDP-GlcUA(300nmol)和 软 骨 素 己 糖 ([A]10nmol，[B]1nmol，[C]0.1nmol)。加热反应溶液并应用到快速脱盐柱(GEHealthcare Biosciences)，且较高分子量的洗脱的级分穿过C18Sep-Pak(Waters)，接着冻干。使用多角度激光散射检测器(Wyatt TechnologyCorporation)测量所得的合成软骨素的平均分子量，且结果，发现[A]、[B]和[C]的分子量分别为34.7kDa、157kDa和344kDa(表1)。

[0186] 表1：通过光散射检测器对rCH分子量的测量

[0187]

[0188] 在该表中，“D/A”代表糖-核苷酸供体底物与软骨素己糖的摩尔浓度比。反应在30℃下进行72小时。

[0189] 从实施例6和7的结果发现通过使用ΔN57K4CP可以有效生产具有较高分子量的软骨素。

[0190] 工业实用性

[0191] 本发明的多肽可以用作有效和廉价地生产软骨素的工具等等。它是非常有用的，因为与野生型K4CP相比，所述多肽可以非常有效地从核酸表达，并且它具有高于野生型K4CP的酶促活性，并且可以被容易地结晶。此外，通过使用本发明的多肽可以有效生产具有较高分子量的软骨素。本发明的核酸是非常有用的，因为该核酸可以用作有效和廉价地生产本发明的多肽的工具。本发明的生产方法是非常有用的，因为该方法可以用于有效生产本发明的多肽。本发明的晶体是非常有用的，因为该晶体可以以极高纯度提供本发明的多肽。