检测类/抗甲状腺激素化合物的双杂交酵母及检测方法

摘要

本发明提供一种用于检测样品中类/抗甲状腺激素化合物的双杂交酵母细胞及其制备方法，其中该酵母中含有pGBT9-TR酵母表达质粒和pGAD424-GRIP1酵母表达质粒，其中pGBT9-TR酵母表达质粒包含甲状腺激素受体基因，pGAD424-GRIP1酵母表达质粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的甲状腺激素受体共激活因子基因片段。本发明提供还提供了一种检测样品中类/抗甲状腺激素化合物的生物测试方法。采用本发明酵母及生物测试方法，大大提高检测类/抗甲状腺激素的灵敏度。构建的酵母性状稳定，易于培养、筛选，整个类/抗甲状腺激素效应的筛选过程操作简单，所需样品量少，成本低廉。

权利要求

1.一种用于检测样品中类/抗甲状腺激素化合物和/或天然甲状腺激素化合物的双杂交酵母，其特征在于，该酵母中含有pGBT9-TR酵母表达质粒和pGAD424-GRIP1酵母表达质粒，其中所述pGBT9-TR酵母表达质粒包含甲状腺激素受体基因，并且所述的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒包含序列为SEQ ID No.2的甲状腺激素受体共激活因子基因片段，所用酵母为酿酒酵母Y187。

2.根据权利要求1所述的双杂交酵母，其特征在于，所述甲状腺激素受体基因为人甲状腺激素受体基因或序列为SEQ ID No.1的人甲状腺激素受体基因片段。

3.根据权利要求1或2所述的双杂交酵母，其特征在于，所述的双杂交酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TR-GRIP1菌株，其保藏编号为：CGMCC No.2306。

4.根据权利要求1或2所述的双杂交酵母，其特征在于，所述类甲状腺激素化合物选自多氯联苯类类甲状腺激素化合物、多溴阻燃剂类类甲状腺激素化合物、二恶英类类甲状腺激素化合物、酚类类甲状腺激素化合物、邻苯二甲酸酯类类甲状腺激素化合物和有机氯农药类类甲状腺激素化合物中的一种或几种，所述的抗甲状腺激素化合物选自多氯联苯类抗甲状腺激素化合物、多溴阻燃剂类抗甲状腺激素化合物、二恶英类抗甲状腺激素化合物、酚类抗甲状腺激素化合物、邻苯二甲酸酯类抗甲状腺激素化合物和有机氯农药类抗甲状腺激素化合物中的一种或几种。

5.一种制备权利要求1-4中任一项所述的双杂交酵母的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)纯化包含甲状腺激素受体基因的pGBT9-TR酵母表达质粒；

(2)纯化包含甲状腺激素受体共激活因子基因的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒；

(3)用所述的PGBT9-TR酵母表达质粒和所述的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒转化进入酵母细胞中，构建双杂交酵母TR-GRIP1。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于在所述的步骤(3)之后还筛选所述的双杂交酵母TR-GRIP1。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用营养缺陷型筛选和菌落转移滤膜分析相结合的方法筛选所述的双杂交酵母TR-GRIP1。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的菌落转移滤膜分析是采用添加甲状腺激素的X-gal缓冲液的菌落转移滤膜分析。

9.根 据 权 利 要 求8 所 述 的 方 法，其 特 征 在 于，所 述X-gal缓 冲 液 为-1

20mg·mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基甲酰胺溶液并且所述甲状腺激素为三碘甲状腺原氨酸。

10.根据权利要求7、8或9所述的方法，其特征在于，所述营养缺陷型筛选中采用的培养基为不添加亮氨酸和色氨酸的SD培养基，该培养基由20mg/L腺嘌呤半硫酸盐、20mg/L盐酸精氨酸、20mg/L一水合盐酸组氨酸、30mg/L异亮氨酸、30mg/L盐酸赖氨酸、20mg/L甲硫氨酸、50mg/L苯丙氨酸、200mg/L苏氨酸、30mg/L酪氨酸、20mg/L尿嘧啶、150mg/L缬氨酸、

6.7g/L无氨基酸酵母氮源组成。

11.权利要求1-4中任一项所述的双杂交酵母用于检测类甲状腺激素化合物的生物测试方法，该方法包括如下步骤：(1)首先将双杂交酵母细胞接种于已知系列浓度的甲状腺激素培养液，形成菌液，培养

2-4小时；

(2)培养结束后，向菌液中加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应

30-60分钟，检测上清液在420nm处的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶活性的参数；

(3)根据所述的系列浓度的甲状腺激素相对于它所对应的β-半乳糖苷酶活性的参数绘制β-半乳糖苷酶活性的诱导剂量-效应关系标准曲线；

(4)将所述双杂交酵母细胞与待测样品共培养，加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应，终止反应后检测反应上清液在420nm处的吸光度值，对照所述β-半乳糖苷酶活性的诱导剂量-效应关系标准曲线计算出待测样品中类甲状腺激素化合物的含量。

12.根据权利要求11所述的生物测试方法，其特征在于所述的待测样品为环境样品中-9 -7的有机溶剂提取液，其中类甲状腺激素化合物的浓度为10 ～10 mol/L。

13.权利要求1-4中任一项所述的双杂交酵母用于检测抗甲状腺激素化合物的生物测试方法，该方法包括如下步骤：(1)首先将双杂交酵母细胞接种于已知系列浓度的抗甲状腺激素化合物培养液，形成菌液，向菌液中添加甲状腺激素，培养2-4小时；

(2)培养结束后，向菌液中加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应

30-60分钟，检测上清液在420nm处的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶活性的参数；

(3)根据所述的系列浓度的抗甲状腺激素化合物相对于它所对应的双杂交酵母细胞的β-半乳糖苷酶活性参数绘制β-半乳糖苷酶活性的诱导剂量-效应关系标准曲线；

(4)将所述双杂交酵母细胞与待测样品共培养，加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应，终止反应后检测反应上清液在420nm处的吸光度值，对照所述的β-半乳糖苷酶活性的诱导剂量-效应关系标准曲线计算出待测样品中抗甲状腺激素化合物的含量。

14.根据权利要求13所述的生物测试方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的-7 -6甲状腺激素为浓度1×10 ～5×10 mol/L的三碘甲状腺原氨酸。

15.根据权利要求11或13所述的生物测试方法，其特征在于，当待测样品为液态样品时，在步骤(4)之前所述的待测样品还通过以下方法进行前处理：a.采用玻璃纤维滤膜过滤采集的液态样品；

b.将所述的液态样品通过固相萃取柱萃取，再向固相萃取柱中加入有机溶剂洗脱后得到具有类/抗甲状腺激素活性的化合物；

c.将所述的具有类/抗甲状腺激素活性的化合物的溶剂置换成二甲基亚砜，得到待测样品。

16.根据权利要求13所述的生物测试方法，其特征在于，所述的待测样品为环境样品-8 -5的有机溶剂提取液，其中抗甲状腺激素化合物的浓度为10 ～10 mol/L。

说明书

检测类/抗甲状腺激素化合物的双杂交酵母及检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于检测类/抗甲状腺激素化合物的双杂交酵母以及这种酵母的构建方法和它的检测方法，具体的说是涉及一种利用酵母双杂交技术获得的包含重组甲状腺激素受体基因的双杂交酵母，以及利用该酵母来检测类/抗甲状腺激素化合物的生物测试方法。

背景技术

[0002] 环境中的内分泌干扰物，亦被称为环境激素，是指人类在生产、生活过程中释放到环境中的某些有毒化学物质，它们与人体和动物体内的激素具有类似的化学结构，并能够产生类似激素的作用。它们进入体内，扰乱了激素的正常分泌，使人和动物的生理过程发生紊乱，导致生殖、免疫等功能发生障碍。环境中的内分泌干扰物的干扰效应包括：雌激素干扰效应、雄激素干扰效应、甲状腺激素干扰效应等，特别是甲状腺激素干扰效应能够对生物及人类生长发育、神经系统功能造成严重影响。尽管具有甲状腺激素干扰活性的化合物在环境中浓度极小，但是其一旦进入人体和动物体内，可以与特定的甲状腺激素受体结合形成复合物，该复合物进一步结合到细胞核中的甲状腺激素反应元件(TRE)，启动/抑制下游基因的表达，干扰内分泌系统的正常功能。90年代对甲状腺激素受体作用机制的研究进一步发现了甲状腺激素受体的共激活因子(coactor)，并建立了新的受体作用理论(参见Hong，H.，Kohlit，K.，Trivedit，A.，Deborah，L.，Johnson，D.L.和Stallcup，M.R.，1996，Natl.Acad.Sci.USA.93：4948-4952)。该理论认为，甲状腺激素(或者环境中类/抗甲状腺激素物质)与相应甲状腺激素受体的配体结合区(LBD)结合后引起构象改变，进一步结合共激活因子，促进转录。

[0003] 对环境中甲状腺激素干扰效应的研究刚刚起步，目前报道应用较多的为化学分析和生物测试方法。化学分析需要高分辨色谱/高分辨质谱，除了分析费用高外，对仪器设备条件和人员素质有相当严格的要求。另外一种采用的是利用富含甲状腺受体的鼠垂体瘤细胞株GH3(rat pituitary tumourcell line，GH3)进行测试，这种测试的原理是GH3细胞增殖依赖甲状腺激素或类甲状腺激素物质，因此通过测定细胞密度的变化反映化合物的类/抗甲状腺激素活性。但是，GH3细胞方法并不能考察甲状腺激素受体与化合物的直接作用。而且，该细胞培养复杂、对于实验室的无菌要求严格，并且测试时间长、费用较高，难于在环境样品中的推广应用。

[0004] 利用双杂交酵母技术将甲状腺激素受体基因或基因片段以及共激活因子基因片段同时导入酵母细胞构建双杂交甲状腺激素受体基因酵母则可以克服GH3细胞的缺点，并与新的受体作用理论相一致。而且，通过实验室直接构建酵母菌株，能够有效的控制回复突变的影响，测定环境化合物的甲状腺激素干扰效应时能够得到更好的质量控制。

[0005] 目前，通常采用报道基因的方法指示外界干扰、如化合物暴露等对基因转录的影响。其中，LacZ就是一种常用的编码β-半乳糖苷酶的报道基因，其产物β-半乳糖苷酶具有强的酶催化活性，能够与特定底物反应生成新的有色化合物，易于检测。因此，通过简单测定β-半乳糖苷酶的活性，就能够表征对基因转录的影响。

[0006] 除了甲状腺激素干扰效应的检测方法，环境样品的富集、净化的前处理方法也是检测环境样品甲状腺激素干扰效应的关键技术。文献报道具有甲状腺激素干扰效应的化合物种类繁多，包括多氯联苯(PCBs)；多溴阻燃剂；二恶英(Dioxins)以及酚类和一些酯类化合物等(参见，Boas，M.，Feldt-Rasmussen U，2006，European Journal of Endocrinology.154：599-611)。这些物质的物理、化学性质差别较大，且在水中通常浓度极低难于富集、净化；目前对于检测样品甲状腺激素干扰效应的样品前处理方法也未见报道，因此，急需建立甲状腺激素干扰效应检测的富集、净化方法，特别是环境样品中的类/抗甲状腺激素的检测方法。

发明内容

[0007] 本发明的一个目的在于提供一种用于检测样品中类/抗甲状腺激素化合物的双杂交酵母，本发明的另一个目的是提供制备该杂交酵母的方法，本发明的再一个目的提供了检测类甲状腺激素化合物的生物检测方法，本发明还提供了检测抗甲状腺激素化合物的生物检测方法。

[0008] 本发明的一个方面提供一种用于检测类甲状腺激素化合物的双杂交酵母，特别是环境中的类甲状腺激素化合物的双杂交酵母，其中，该酵母中含有pGBT9-TR酵母表达质粒和pGAD424-GRIP1酵母表达质粒，其中所述pGBT9-TR酵母表达质粒包含甲状腺激素受体基因，并且所述的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的甲状腺激素受体共激活因子基因片段。

[0009] 优选地，所述甲状腺激素受体基因为人甲状腺激素受体基因或具有如SEQ ID No.1所示序列的人甲状腺激素受体基因片段。

[0010] 所述的双杂交酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TR-GRIP1菌株，其保藏编号为：CGMCC No.2306。该酵母已于2007年12月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)进行了生物材料保藏。

[0011] 优选地，所述类甲状腺激素化合物选自天然甲状腺激素化合物、多氯联苯、多溴阻燃剂、二恶英、酚类化合物、酚类化合物代谢后具有酚类结构的化合物、邻苯二甲酸酯类化合物和有机氯农药类化合物中的一种或几种，所述的抗甲状腺激素化合物选自多氯联苯、多溴阻燃剂类化合物、二恶英、酚类化合物、酚类化合物代谢后具有酚类结构的化合物、邻苯二甲酸酯类化合物和有机氯农药类化合物中的一种或几种。

[0012] 本发明的另一个方面还提供了一种制备所述的双杂交酵母的方法，其中，该方法包括以下步骤：

[0013] (1)纯化包含甲状腺激素受体基因的pGBT9-TR酵母表达质粒；

[0014] (2)纯化包含甲状腺激素受体共激活因子基因的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒；

[0015] (3)用所述的PGBT9-TR酵母表达质粒和所述的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒转化进入酵母细胞中，构建双杂交酵母TR-GRIP1。

[0016] 具体而言，在所述方法中，构建双杂交酵母TR-GRIP1时，同时加入pGBT9-TR质粒和pGAD424-GRIP1质粒混合均匀，并加入感受态Y187酿酒酵母细胞孵育，得到双杂交酵母TR-GRIP1。

[0017] 具体而言，在制备双杂交酵母中，纯化pGBT9-TR酵母表达质粒时，用pGBT9-TR(美国加州大学Stallcup教授惠赠，参见Darimont，B.D.，Wagner，R.L.，Apriletti，J.W.1998.Genes Dev12：3343-3356。)转化感受态大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的培养基中筛选阳性克隆，提取质粒并纯化。

[0018] 同时，在制备双杂交酵母细胞中，纯化pGAD424-GRIP1酵母表达质粒时，用pGAD424-GRIP1(美国加州大学Stallcup教授惠赠，参见Li，H.W.，Kim，J.H.，Koh，S.S.，Stallcup，M.R.2003.J.Biol.Chem.Biol.279(6)：4212-4220。)转化感受态大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的培养基中筛选阳性克隆，提取质粒并纯化。

[0019] 优选地，在所述的步骤(3)之后还筛选所述的双杂交酵母TR-GRIP1。

[0020] 优选地，采用营养缺陷型筛选和菌落转移滤膜分析相结合的方法筛选所述的双杂交酵母TR-GRIP1。具体而言，在上述方法中，筛选双杂交酵母TR-GRIP1时，采用营养缺陷型筛选和菌落转移滤膜分析相结合的方法筛选双杂交酵母细胞，双杂交酵母细胞通过营养缺陷型培养基粗筛出阳性菌落，该培养基为不添加亮氨酸和色氨酸的SD培养基。进一步使用菌落转移滤膜分析方法，将菌落影印到无菌的1#干燥滤膜上，液氮反复冻融，破碎细胞；将1#滤膜置于含甲状腺激素的X-gal缓冲液的2#滤膜上，30℃孵育至出现明显蓝色菌落，将显色菌落继续培养备用。

[0021] 所述的菌落转移滤膜分析优选是采用添加甲状腺激素的X-gal缓冲液的菌落转-1移滤膜分析，所述X-gal缓冲液优选为20mg·mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基甲酰胺溶液并且所述甲状腺激素优选为三碘甲状腺原氨酸。

[0022] 优选地，所述营养缺陷型筛选中采用的培养基为不添加亮氨酸和色氨酸的SD培养基(即：SD/-Trp/-Leu)，其中包含20mg/L腺嘌呤半硫酸盐、20mg/L盐酸精氨酸、20mg/L一水合盐酸组氨酸、30mg/L异亮氨酸、30mg/L盐酸赖氨酸、20mg/L甲硫氨酸、50mg/L苯丙氨酸、200mg/L苏氨酸、30mg/L酪氨酸、20mg/L尿嘧啶、150mg/L缬氨酸、6.7g/L无氨基酸酵母氮源。

[0023] 本发明的再一个方面还提供了利用所述的双杂交酵母检测类甲状腺激素化合物的生物测试方法，该方法包括如下步骤：

[0024] (1)首先将双杂交酵母细胞接种于已知系列浓度的甲状腺激素培养液，形成菌液，培养2-4小时；

[0025] (2)培养结束后，向菌液中加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应30-60分钟，检测上清液在420nm处的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶活性的参数；

[0026] (3)根据所述的系列浓度的甲状腺激素相对于它所对应的β-半乳糖苷酶活性的参数绘制β-半乳糖苷酶活性的诱导剂量-效应关系标准曲线；

[0027] (4)将所述双杂交酵母细胞与待测样品共培养，加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应，终止反应后检测反应上清液在420nm处的吸光度值，对照所述β-半乳糖苷酶活性的诱导剂量-效应关系标准曲线计算出待测样品中类甲状腺激素化合物的含量。优选地，在步骤(1)中，将所述的双杂交酵母细胞接种前调节菌液600nm处的吸光度值为0.1～0.2，培养24小时后调整菌液600nm处的吸光度值为0.7～0.8。

[0028] 具体而言，在上述检测环境中类甲状腺激素化合物的生物测试方法中，双杂交酵母TR-GRIP1的培养方法为：将上述重组基因酵母TR-GRIP1的细胞接种到SD/-Trp/-Leu液体培养基中，检测菌液600nm处的吸光度值为0.1～0.2，30℃培养24小时后调整酵母菌液600nm处的吸光度值为0.7～0.8。绘制诱导标准曲线具体步骤为：将甲状腺激素溶解到二甲基亚砜(DMSO)中，此处甲状腺激素优选三碘甲腺原氨酸，制备一系列的三碘甲腺原-7 -1氨酸标准浓度反应液(浓度范围2×10 ～2×10 mol/L)，按照0.5％的比例添加三碘甲腺原氨酸标准浓度反应液到双杂交酵母细胞TR-GRIP1菌液中，制备暴露液；将暴露液接种至
96孔板中(200μL/孔)；30℃培养2小时后检测600nm处的吸光度值；再将含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液加入到96孔板中；30℃下充分反应30-60分钟后，添加
1mol/L的碳酸钠溶液终止反应；在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制三碘甲腺原氨酸(即T3)对重组基因酵母TR-GRIP1细胞的β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线。

[0029] β-半乳糖苷酶活性u的计算公式如下：u＝(AS-AB)/t·V·D·ODS，式中，u为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间(min)；V为测试体积(mL)；D为稀释因子；ODS为测试样品在595nm处的吸光度值；AS为测试样品在420nm处的吸光度值OD420；AB为空白对照在420nm处的吸光度。

[0030] 上述检测样品的具体步骤为：按照0.5％的比例添加二甲基亚砜(DMSO)溶解的待测样品到TR-GRIP1酵母菌液中，制备暴露液；暴露液接种至96孔板中(200μL/孔)；30℃培养2h后检测600nm处的吸光度值；再将含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应-1液加入到96孔板中；30℃下充分反应后，添加1mol·L 的碳酸钠溶液终止反应；在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，来检测待测化合物是否具有甲状腺激素受体诱导活性，即将测得的结果与上述标准曲线比较，进而可以计算出环境样品中类甲状腺激素化合物的含量，从而评价环境中类甲状腺激素化合物的毒性效应。

[0031] 所述的待测样品优选为环境样品中的有机溶剂提取液，其中类甲状腺激素化合物-9 -7的浓度为10 ～10 mol/L。

[0032] 本发明的再一个方面还提供了一种利用所述的双杂交酵母检测抗甲状腺激素化合物的生物测试方法，该方法包括如下步骤：

[0033] (1)首先将双杂交酵母细胞接种于已知系列浓度的抗甲状腺激素化合物培养液，形成菌液，向菌液中添加甲状腺激素，培养2-4小时；

[0034] (2)培养结束后，向菌液中加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应30-60分钟，检测上清液在420nm处的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶活性的参数；

[0035] (3)根据所述的系列浓度的抗甲状腺激素化合物相对于它所对应的双杂交酵母细胞的β-半乳糖苷酶活性参数绘制β-半乳糖苷酶活性的诱导剂量-效应关系标准曲线；

[0036] (4)将所述双杂交酵母细胞与待测样品共培养，加入邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液进行反应，终止反应后检测反应上清液在420nm处的吸光度值，对照所述的β-半乳糖苷酶活性的诱导剂量-效应关系标准曲线计算出待测样品中抗甲状腺激素化合物的含量。

[0037] 优选地，所述的甲状腺激素为浓度1×10-7～5×10-6mol/L的三碘甲状腺原氨酸。

[0038] 优选地，在步骤(1)中，将所述的双杂交酵母细胞接种前调节菌液600nm处的吸光度值为0.1～0.2，培养后调整菌液600nm处的吸光度值为0.7～0.8。

[0039] 绘制诱导标准曲线具体步骤为：将甲状腺激素溶解到二甲基亚砜(DMSO)中，此处-3的甲状腺激素优选三碘甲腺原氨酸，制备三碘甲腺原氨酸标准浓度反应液(1×10 mol/L)；
将抗甲状腺激素化合物溶解到DMSO中，此处的抗甲状腺激素化合物优选盐酸胺碘酮，制备-7 -1
一系列的盐酸胺碘酮标准浓度反应液(浓度范围2×10 ～2×10 mol/L)，按照0.5％的比例添加三碘甲腺原氨酸和盐酸胺碘酮标准浓度反应液到杂交酵母TR-GRIP1菌液中，制备暴露液；将暴露液接种至96孔板中(200μL/孔)；30℃培养2h后检测600nm处的吸光度值；再将含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液加入到96孔板中；30℃下充分反应后，添加1mol/L的碳酸钠溶液终止反应；在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制抗甲状腺激素化合物，即盐酸胺碘酮对杂交酵母细胞TR-GRIP1的β-半乳糖苷酶活性抑制的剂量-效应关系标准曲线。

[0040] 上述检测样品的具体步骤为：按照0.5％的比例添加甲状腺激素和二甲基亚砜(DMSO)溶解的待测样品到双杂交酵母细胞TR-GRIP1菌液中制备暴露液，此处的甲状腺激素优选为三碘甲腺原氨酸；暴露液接种至96孔板中(200μL/孔)；30℃培养2小时后检测600nm处的吸光度值；再将含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液加入到96孔板中；30℃下充分反应后，添加1mol/L的碳酸钠溶液终止反应；在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，来检测待测化合物是否具有抗甲状腺激素化合物，即将测得的结果与上述标准曲线比较，进而可以计算出环境样品中抗甲状腺激素化合物的含量，从而评价环境中抗甲状腺激素化合物的毒性效应。

[0041] 优选地，当待测样品为液态样品时，在步骤(4)之前所述的待测样品还通过以下方法进行前处理：

[0042] a.采用玻璃纤维滤膜过滤采集的液态样品；

[0043] b.所述的液态样品通过固相萃取柱萃取，再向固相萃取柱中加入有机溶剂洗脱后得到具有类/抗甲状腺激素活性的化合物；

[0044] c.将所述的具有类/抗甲状腺激素活性的化合物的溶剂置换成二甲基亚砜，得到待测样品。

[0045] 当待测样品为液态样品，尤其是环境中水样品的前处理过程中，前处理去处了干扰物质的富集和净化，该前处理方法包含了水样的采集，去除水中悬浮颗粒物，采用固相萃取柱对具有甲状腺激素干扰活性化合物的富集，有机溶剂对目标化合物的洗脱，以及有机溶剂吹氮去除和二甲基亚砜(DMSO)溶解制备生物测试样品。其中包括以下步骤：

[0046] (1)采用10L容量的棕色带塞细口玻璃瓶收集环境水样品，

[0047] (2)采用Millipore微滤系统，安装APFF玻璃纤维滤膜，过滤水样，

[0048] (3)采用500mg的HLB固相萃取柱用于水样的富集，

[0049] (4)采用有机溶剂洗脱环境样品并吹氮浓缩。

[0050] 上述方法中所述的水环境样品包括：污水样品、地表水样品、饮用水样品等。

[0051] 在上述步骤(1)中，样品瓶经重铬酸钾洗液润洗浸泡20min以上，以自来水、蒸馏水洗净后倒置晾干，待用。污水、地表水每个样品采集30L，饮用水每个样品采集45L。样品运回实验室后如不立即处理需4℃下保存；所采集样品应在2日内过滤完毕，7日内富集完毕。

[0052] 具体而言，在步骤(2)中，过滤水祥时，将污水、地表水或饮用水滤过水样收集于已洗净的带塞棕色玻璃瓶保存，加入5‰体积的甲醇，以抑制微生物的生长，待富集；

[0053] 具体而言，在步骤(3)水样的富集时，先安装好真空抽滤装置及固相萃取装置，HLB柱在使用前依次用二氯甲烷、甲醇、蒸馏水各5mL清洗，加液后保持5min，开真空泵抽取液体，处理完后小柱处于活化状态。调节好真空度，使水样过柱的流速恒定在5mL/min。

[0054] 具体而言，在步骤(4)有机溶剂洗脱环境样品时，首先以5mL甲醇/水(甲醇％＝5％)为清洗剂，浸泡5min后，抽干30min以上；然后以10mL甲醇/二氯甲烷(1∶9，v/v)为淋洗剂分三次(4mL、3mL、3mL)进行第一级洗脱，洗脱组分为中等极性至非极性组分；再以5mL正己烷/二氯甲烷(2∶1，v/v)为淋洗剂进行第二级洗脱，洗脱组分为非极性组分。
将同一样品的各级洗脱液合并，集中于一个250mL烧瓶中，添加3药匙无水硫酸钠，放置过夜；转移出清液后旋蒸浓缩，过无水硫酸钠小柱，用15mL二氯甲烷淋洗脱水，用柔和高纯氮气吹蒸并置换溶剂为二甲基亚砜500-1000μL。

[0055] 本发明提供的用于样品中类甲状腺激素化合物的双杂交酵母以及生物检测方法的有益之处在于，这种样品优选水环境样品：1)尽管水环境样品中具有甲状腺激素干扰活性的化合物的理化性质差别很大，本发明的前处理方法能够富集、收集这些环境水样中的类/抗甲状腺激素化合物，并制备成可用于生物检测的样品。2)双杂交酵母TR-GRIP1能够同时表达甲状腺激素受体蛋白、甲状腺激素受体共激活因子蛋白，支持最新的受体作用理论，最能模拟哺乳动物细胞内甲状腺激素受体的作用机制，且表达基因产生的β-半乳糖苷酶的酶活性易于检测，很适合作为化合物毒性筛选、环境样品类/抗甲状腺激素效应评价方面的试验研究；3)酵母细胞试验快速、简便可以对大量环境样品或化学物质的内分泌干扰物效应进行前期筛选，为活体试验提供基础数据支持，弥补了活体试验试验周期长，费-6 -1用高的不足；4)添加三碘甲腺原氨酸(5×10 mol·L )的X-gal缓冲液在菌落转移滤膜分析中的应用，大大的缩短了操作时间，相当程度上减轻了假阳性结果干扰的可能性；5)利用SD/-Trp/-Leu营养缺陷型培养基进行酵母培养，能够有效防止重组酵母细胞的回复突变，减轻传代过程中质粒丢失的情况，使得重组酵母细胞的蛋白表达稳定，试验测试结果之间的平行性较好；6)利用重组甲状腺激素受体基因双杂交酵母进行类甲状腺激素污染物的筛选和毒性毒理研究时，致毒机理明确，操作简便，省时省力，所需样品量少，成本低廉；
7)本发明重组了人的甲状腺激素受体基因，能够反映环境样品中的甲状腺激素化合物可能对人体产生的影响。8)本发明同时检测了样品中的类甲状腺激素化合物和抗甲状腺激素化合物，与类甲状腺激素化合物的单因素检测相比能够更全面的反映环境样品对甲状腺激素受体的干扰作用；5)与Kitagawa文献(参见，Kitagawa，Y.，Takatori，S.，2003.Journal of Health Science 49：99-104。)报道克隆鼠的甲状腺激素受体不同的是，本发明直接克隆人的甲状腺激素受体基因或基因片段构建双杂交酵母，因此在测定环境化合物的甲状腺激素干扰效应时能够直接体外预警化合物对人体内分泌系统可能存在的风险。在技术上采用了更先进的Y187(含有双拷贝数的编码β-半乳糖苷酶的LacZ基因)酿酒酵母菌株，使得构-9 -1
建的TR-GRIP1菌株具有更高的灵敏度，其T3的可检出浓度为8×10 mol·L ，而Kitagawa-8
报道为3×10 mol/L。

附图说明

[0056] 本发明提供的双杂交酵母TR-GRIP1是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的TR-GRIP1菌株，其保藏编号为：CGMCC No.2306。该酵母已于2007年12月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)进行了生物材料保藏。

[0057] 以下，结合附图来详细说明本发明，其中：

[0058] 图1为三碘甲腺原氨酸(T3)对酿酒酵母CGMCC No.2306的β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量-效应关系标准曲线。其中横坐标是三碘甲腺原氨酸(T3)浓度，纵坐标是三碘甲腺原氨酸诱导的β-半乳糖苷酶活性；

[0059] 图2为盐酸胺碘酮对三碘甲腺原氨酸(T3，5×10-6mol/L)诱导酿酒酵母CGMCC No.2306酶活性抑制的剂量-效应关系标准曲线。其中横坐标是盐酸胺碘酮浓度，纵坐标是盐酸胺碘酮抑制的β-半乳糖苷酶活性；

[0060] 图3为结合环境水样前处理方法，利用酿酒酵母CGMCC No.2306生物方法测试某污水处理厂不同处理出水样品类/抗甲状腺激素化合物的效应结果；其中横坐标是某污水处理厂不同处理工艺，纵坐标是酿酒酵母CGMCC No.2306的测试结果；其中□表示样品的类甲状腺激素化合物诱导效应；■表示样品的抗甲状腺激素化合物抑制效应。

具体实施方式

[0061] 实施例1

[0062] 双杂交酵母细胞TR-GRIP1的制备

[0063] 1.纯化包含甲状腺激素受体基因片段(即SEQ ID No.1所示序列)的pGBT9-TR酵母表达质粒。

[0064] 用10μL诱饵质粒pGBT9-TR(美国加州大学Stallcup教授惠赠)转化100μL感受态大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的培养基中筛选阳性克隆，提取质粒并纯化。0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA大小，同时对质粒DNA进行序列测定，测序引物为pGBT9通用引物(测序工作由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成)。所述含有氨苄青霉素的培养基包含100mg/L氨苄青霉素，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，15g/L琼脂糖。

[0065] 2.纯化包含甲状腺激素受体共激活因子基因片段(即SEQ ID No.2所示序列)的pGAD424-GRIP1酵母表达质粒。

[0066] 用10μL靶质粒pGAD424-GRIP1(美国加州大学Stallcup教授惠赠)转化100μL感受态大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的培养基中筛选阳性克隆，提取质粒并纯化。0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA大小，同时对质粒DNA进行序列测定，测序引物为pGAD424通用引物(测序工作由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成)。所述含有氨苄青霉素的培养基包含100mg/L氨苄青霉素，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，
15g/L琼脂糖。

[0067] 3.构建双杂交酵母细胞TR-GRIP1。

[0068] 同时加入0.1μgpGBT9-TR质粒和0.1μgpGAD424-GRIP1质粒混合均匀，并加入0.1mL新鲜制备的感受态Y187酿酒酵母细胞，200rpm，30℃孵育30min。加入70μL二甲基亚砜(DMSO)混合均匀后，42℃水浴放置15min；细胞迅速转移到冰浴，静置1-2min，构建双杂交酵母细胞TR-GRIP1。

[0069] 4.筛选双杂交酵母细胞TR-GRIP1。

[0070] 在上述方法中，筛选双杂交酵母细胞TR-GRIP1时，采用营养缺陷型筛选和菌落转移滤膜分析相结合的方法筛选双杂交酵母细胞，双杂交酵母细胞通过营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)粗筛出阳性菌落，进一步使用菌落转移滤膜分析方法，将菌落影印到无菌的1#干燥滤膜上，液氮反复冻融3～5次，破碎细胞；将1#滤膜置于含三碘甲腺原氨酸-6(5×10 mol/L)的X-gal缓冲液的2#滤膜上，30℃孵育直到克隆出现明显的蓝色。显色的菌落即为阳性菌落，阳性菌落继续培养24h后备用。所述SD/-Trp/-Leu包含20mg/L腺嘌呤半硫酸盐，20mg/L盐酸精氨酸，20mg/L一水合盐酸组氨酸，30mg/L异亮氨酸，30mg/L盐酸赖氨酸，20mg/L甲硫氨酸，50mg/L苯丙氨酸，200mg/L苏氨酸，30mg/L酪氨酸，20mg/L尿嘧啶，150mg/L缬氨酸，6.7g/L无氨基酸酵母氮源；X-gal缓冲液为20mg/L5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基甲酰胺溶液。

[0071] 实施例2

[0072] 利用酿酒酵母CGMCC No.2306测定三碘甲腺原氨酸(T3)的诱导效应来绘制标准诱导曲线。

[0073] 酵母细胞培养：将制备的酿酒酵母CGMCC No.2306接种到SD/-Trp/-Leu液体培养基(组成与实施例1中相同)中，检测菌液600nm处的吸光度值(以培养基为空白)，调节吸光度值为0.1～0.2，30℃空气浴摇床中培养24小时后调整菌液600nm处的吸光度值为0.7～0.8。

[0074] 绘制标准曲线：取菌悬液0.995mL至对应的Eppendorf管中，加入5μLDMSO(空白)或5μL用DMSO溶解的T3；将以上溶液各200μL依次转移到96孔板中。然后于130rpm，30℃于96孔板摇床振荡培养2h；培养结束后，首先检测600nm处的吸光度值；去除150μL酵母菌液；加入120μL测试缓冲液(每100mL基础缓冲液中加入3.33mL浓度为0.1％的SDS溶液和270μLβ-巯基乙醇)和20μL氯仿，在30℃的恒温摇床上预培养10min；再加入40μL邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液(0.04g/L)，启动酶反应，随着进一步的培养，可以逐渐看到培养液呈现越来越强的黄色；30℃下充分反应后，添加100μL碳酸钠溶液(1mol/L)终止反应；取200μL上清液在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制T3对酿酒酵母CGMCC No.2306的β-半乳糖苷酶活性的诱导剂量-效应关系标准曲线(图1)。

[0075] β-半乳糖苷酶活性u的计算公式如下：u＝(AS-AB)/t·V·D·ODS，式中，u为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间(min)；V为测试体积(mL)；D为稀释因子；ODS为测试样品595nm处的吸光度值；AS为测试样品在420nm处的吸光度值OD420；AB为空白对照在420nm处的吸光度。

[0076] 上述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液包含：21.51g/LNa2HPO4·12H2O，6.22g/LNaH2PO4·2H2O，0.75g/LKCl，0.25g/LMgSO4·7H2O，0.04g/L邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷。

[0077] 由图1可知，T3对酿酒酵母CGMCC No.2306的β-半乳糖苷酶的活性诱导剂量-效-7 -9 -7应关系标准曲线的EC50值为1.1×10 mol/L，在8×10 ～5×10 mol/L范围内存在线性关系；初步表明双杂交甲状腺激素受体基因酵母测评体系可以作为环境中类甲状腺激素化合物的毒性效应的定量分析标准。

[0078] 实施例3

[0079] 利用酿酒酵母CGMCC No.2306测定盐酸胺碘酮的抑制效应来绘制标准抑制曲线。

[0080] 酵母细胞培养：将制备的酿酒酵母CGMCC No.2306接种到SD/-Trp/-Leu液体培养基(组成与实施例2中相同)中，检测菌液600nm处的吸光度值(以培养基为空白)，调节吸光度值为0.1～0.2，30℃空气浴摇床中培养24h后调整菌液600nm处的吸光度值为0.7～0.8。

[0081] 绘制标准曲线：取菌悬液0.995mL至对应的Eppendorf管中，加入5μLT3和5μL用DMSO溶解的盐酸胺碘酮；将以上溶液各200μL依次转移到96孔板中。然后于130rpm，30℃于96孔板摇床振荡培养2h；培养结束后，首先检测600nm处的吸光度值；去除150μL酵母菌液；加入120μL测试缓冲液(每100mL基础缓冲液中加入3.33mL浓度为0.1％的SDS溶液和270μLβ-巯基乙醇)和20μL氯仿，在30℃的恒温摇床上预培养10min；再加入40μL邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液(0.04g/L)，启动酶反应，随着进一步的培养，可以逐渐看到培养液呈现越来越强的黄色；30℃下充分反应后，添加100μL碳酸钠溶液(1mol/L)终止反应；取200μL上清液在420nm处用分光光度计检测终产物邻硝基酚钠的吸光度值，并以此作为表示β-半乳糖苷酶的参数，绘制盐酸胺碘酮对T3诱导的酿酒酵母CGMCC No.2306的β-半乳糖苷酶的活性抑制剂量-效应关系标准曲线(图2)。

[0082] β-半乳糖苷酶活性u的计算公式如下：u＝(AS-AB)/t·V·D·ODS，式中，u为β-半乳糖苷酶活性；t为反应时间(min)；V为测试体积(mL)；D为稀释因子；ODS为测试样品595nm处的吸光度值；AS为测试样品在420nm处的吸光度值OD420；AB为空白对照在420nm处的吸光度。

[0083] 上述含有过量邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反应液包含：21.51g/LNa2HPO4·12H2O、6.22g/LNaH2PO4·2H2O、0.75g/LKCl、0.25g/LMgSO4·7H2O、0.04g/L邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷。

[0084] 由图2可知，盐酸胺碘酮对酿酒酵母CGMCC No.2306的β-半乳糖苷酶的活性抑-7 -8 -5制剂量-效应关系标准曲线的IC20值为2.7×10 mol/L，在1×10 ～1×10 mol/L范围内存在线性关系；初步表明双杂交甲状腺激素受体基因酵母测评体系可以作为环境中抗甲状腺激素化合物的毒性效应的定量分析标准。

[0085] 实施例4

[0086] 利用酿酒酵母CGMCC No.2306生物测试方法评价环境样品的类/抗甲状腺激素污染物毒性。

[0087] 分别采集某市污水处理厂的进水和不同处理工艺出水作为样品。采用本发明所述的样品前处理方法提取样品中的类/抗甲状腺激素污染物，将提取到的有机溶剂在高纯氮气中吹干，加入DMSO溶解并制备成在标准曲线线性范围内任一浓度的测试用样品溶液。

[0088] 利用实施例2中所述的酿酒酵母CGMCC No.2306生物测试方法评价环境样品的类甲状腺激素污染物毒性，测定结果参照图1绘制的诱导标准曲线，表示成为T3的当量浓度；同时利用实施例3中所述的酿酒酵母CGMCC No.2306生物测试方法评价环境样品的抗甲状腺激素污染物毒性，测定结果参照图2绘制的抑制标准曲线，表示成为盐酸胺碘酮的当量浓度，见图3。

[0089] 从图3可以看出，该污水处理厂的不同处理工艺阶段出水中均不含有类甲状腺激素物质，抗甲状腺激素物质则有检测，盐酸胺碘酮的当量浓度范围为0～7.2g/L，该处理工艺对抗甲状腺激素物质能够有很好的去除。图3的结果表示可以用本发明提出的方法，判断环境样品中类/抗甲状腺激素污染物的毒性当量或其潜在生态毒性的大小。

[0090] 序列表

[0091] <110>中国科学院生态环境研究中心

[0092] <120>检测类/抗甲状腺激素化合物的双杂交酵母及检测方法

[0093] <130>DIC07110128

[0094] <160>2

[0095] <170>PatentIn version 3.3

[0096] <210>1

[0097] <211>1286

[0098] <212>DNA

[0099] <213>人

[0100] <400>1

[0101] atagcagagt tgactgtatc gccggattcg aagagctgca gaagtccatc gggcacaagc 60[0102] cagagcccac agacgaggaa tgggagctca tcaaaactgt caccgaagcc catgtggcga 120[0103] ccaacgccca aggcagccac tggaagcaaa aacggaaatt tctgccagaa gacattggac 180[0104] aagcaccaat agtcaatgcc ccagaaggtg gaaaggttga cttggaagcc ttcagccatt 240[0105] ttacaaaaat catcacacca gcaattacca gagtggtgga ttttgccaaa aagttgccta 300[0106] tgttttgtga gctgccatgt gaagaccaga tcatcctcct caaaggctgc tgcatggaga 360[0107] tcatgtccct tcgcgctgct gtgcgctatg acccagaaag tgagacttta accttgaatg 420[0108] gggaaatggc agtgacacgg ggccagctga aaaatggggg tcttggggtg gtgtcagacg 480[0109] ccatctttga cctgggcatg tctctgtctt ctttcaacct ggatgacact gaagtagccc 540[0110] tccttcaggc cgtcctgctg atgtcttcag atcgcccggg gcttgcctgt gttgagagaa 600[0111] tagaaaagta ccaagatagt ttcctgctgg cctttgaaca ctatatcaat taccgaaaac 660[0112] accacgtgac acacttttgg ccaaaactcc tgatgaaggt gacagatctg cggatgatag 720[0113] gagcctgcca tgccagccgc ttcctgcaca tgaaggtgga atgccccaca gaactcttcc 780[0114] cccctttgtt cctggaagtg ttcgaggatt agtcgacgga tccgtcgacc tgcagccaag 840[0115] ctaattccgg gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa 900[0116] aataagtgta tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt 960[0117] gagtaactct ttcctgtagt cagttgcttt ctcaggtata gcatgagtcg ctcttattga 1020[0118] ccacactcta ccggcatgcc ggcagtgcac aacatactaa ataatactac tcagtatact 1080[0119] atttctagca ttttgacgaa tttgctattt ttgttagagt ctttaccatt gtctccacac 1140[0120] ctcgctactc acacatacgc aattatctag cgcatcacca cattttctgc tcagttcaca 1200[0121] gctaacataa aatgtaaagc tcgctcttgg ctcaactaag tcgatcggat catcaaagtt 1260[0122] caccgtgttc aacggcgctc gggatc 1286[0123] <210>2

[0124] <211>4374

[0125] <212>DNA

[0126] <213>小鼠

[0127] <400>2

[0128] ggagaaaaca cctctgaccc gtccagggca gagaccagaa aacgcaagga atgtcccgac 60[0129] cagctcggac ccagccccaa aaggagcact gagaaacgga accgcgagca ggagaataag 120[0130] tacatagagg agctggccga tctgatcttc gcaaacttta atgatattga caacttcaac 180[0131] ttcaaacctg acaaatgtgc catcctaaaa gaaactgtga agcagatccg ccagatcaaa 240[0132] gagcaagaga aagcagcagc tgccaacata gatgaagtgc agaagtcaga tgtgtcgtcc 300[0133] acggggcagg gtgtcatcga caaggatgca ctggggccca tgatgcttga ggccctcgat 360[0134] gggttcttct tcgttgtgaa cctggaaggc agtgtggtgt tcgtgtcaga gaatgtgaca 420[0135] cagtatctac ggtataacca agaagagctg atgaacaaga gtgtctacag catcctgcat 480[0136] gtcggggacc acactgaatt tgtcaagaac ctgctgccaa agtccatggt gaatggagga 540[0137] tcctggtctg gagaacctcc caggcggacg agccatacct tcaactgtcg catgctggtg 600[0138] aagcctttgc cagattcaga agaggaaggc catgatagcc aggaagccca tcagaaatac 660[0139] gaggcgatgc agtgcttcgc tgtgtctcag cccaagtcca tcaaagagga aggcgaagat 720[0140] ttgcagtcct gcttgatttg tgtggcacga agagtcccca tgaaggaaag accaactctt 780[0141] 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