一种治疗畜禽疾病的多聚核苷酸微囊及其制备方法

摘要

本发明一种治疗畜禽疾病的多聚核苷酸微囊及其制备方法，属于兽药制备的技术领域。称取聚肌苷酸和聚胞苷酸，分别放入预热的氯化钠-磷酸盐缓冲液中，制得多聚核苷酸溶液，加入到乙基纤维素中制备软材，并制得干粉；将干粉、硬脂酸镁加入到冰浴的丙酮中，搅拌并缓慢加入到含2％Span-80表面活性剂的液体石蜡中利用液中干燥法制得多聚核苷酸微囊。本发明有效延长了药物在体内的作用时间，减少了用药次数，达到了长效缓释的目的。试验证明，多聚核苷酸微囊高、中剂量组死亡率显著低于感染对照组的死亡率。治愈率较高，均为80％，两组的有效率均为100％。安全性试验证明本发明药物是安全的。

权利要求

1.一种治疗畜禽疾病的多聚核苷酸微囊，是以多聚核苷酸为原料，乙基纤维素为囊材制备的多聚核苷酸缓释微囊，其制备方法包括：

1)多聚核苷酸溶液制备

称取聚肌苷酸和聚胞苷酸各0.5g，分别放入预热至45℃±1℃的50ml氯化钠-磷酸盐缓冲液中，搅拌充分溶解，保持该温度30min；将两种溶液混合，并保持45℃±1℃、40min，冷却至室温得到的溶液即为10mg/ml的多聚核苷酸溶液，其中氯化钠-磷酸盐缓冲液为：pH7.2，取磷酸氢二钠1.546g、磷酸二氢钠NaH2PO4·2H2O 0.262g，氯化钠8.768g，加水溶解并稀释至1000ml制备而成；

2)多聚核苷酸-乙基纤维素软材制备

量取13ml多聚核苷酸溶液加入到10.0g乙基纤维素中制备软材，45℃烘干12h，研碎后即为含有13mg/g多聚核苷酸的乙基纤维素干粉；

3)多聚核苷酸微囊制备

称取过400目筛的含多聚核苷酸的乙基纤维素干粉0.75g、硬脂酸镁0.3g，加入到冰浴的丙酮中，200rpm搅拌，待乙基纤维素完全溶于丙酮中形成均匀的混悬液；在搅拌的条件下将上述混悬液缓慢加入到含质量比2％Span-80表面活性剂的液体石蜡中，充分混合后，逐渐升温至35℃±1℃，在400rpm的条件下使丙酮慢慢挥发，保持2-3h；然后升温至56℃，保持1-2小时；减压抽滤，所得固体用正己烷洗涤，加压干燥，得淡黄色粉状微囊即为多聚核苷酸微囊。

说明书

一种治疗畜禽疾病的多聚核苷酸微囊及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于兽用生物技术领域，特别是涉及一种在治疗畜禽疾病上应用的多聚核苷酸缓释微囊及其制备方法。是以多聚核苷酸为原料、乙基纤维素做为囊材制备的多聚核苷酸缓释微囊。

[0002] 背景技术

[0003] 随着我国加入WTO，国内畜禽养殖业将面临更大的挑战。据FAO统计数据资料显示，在过去的20年间，我国肉类生产量增加了4倍多，其中畜禽年养殖量近50亿羽，生猪近6亿头，生产能力有了很大提高，国内市场供需平衡已供大于求。

[0004] 然而目前畜禽疫病造成的严重损失已成为制约我国养殖业健康发展的主要障碍和瓶颈。畜禽病毒性疾病如鸡传染性法氏囊病、鸡传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎等疾病的群体阳性率高达90％以上，猪呼吸及繁殖障碍综合症、猪瘟及其它病毒性疾病的群体阳性率也很高，畜禽死亡率高达30％-40％。作为与畜禽养殖业关联密切的兽药、饲料行业，由于行业管理尚不规范，一些企业在饲料和动物药品中滥加抗生素和抗病毒药物，甚至国家明令禁止的、毒副作用大的、有残留的药物仍然使用，造成病毒和病源菌的耐药性大大增强，甚至出现超强毒株，畜禽混合、继发感染发生频繁，病症加重，常规方法治疗已经很难得到理想的效果。随着行业管理的规范化，一些抗病毒药物已不再允许使用，如利巴韦林、金刚烷胺等药物，因此在治疗畜禽的病毒性疾病方面面临着新的问题。目前该类药物在兽用药物中剂型主要为注射液，鉴于畜禽特殊的生理结构及生理反应，注射给药常常会造成一定的应激，影响畜禽的生长发育；因此通常饮水给药或拌料给药为较好的给药方式，现有药物从剂型和给药方式上均不能满足畜禽用药。因此研究一种用于治疗畜禽病毒性疾病的新型免疫增强剂迫在眉睫。目前尚未检索到有关多聚核苷酸缓释微囊在畜禽上的应用的相关专利。

[0005] 发明内容

[0006] 技术问题

[0007] 基于上述情况，本发明旨在提供一种能够用于治疗畜禽病毒性疾病的药物及其制备方法和其在畜禽临床上的应用。

[0008] 技术方案

[0009] 本发明目的的实现：用乙基纤维素做为囊材，多聚核苷酸做为原料，利用液中干燥法将其制成多聚核苷酸缓释微囊。

[0010] 包括：

[0011] 1)多聚核苷酸溶液制备

[0012] 称取等质量的聚肌苷酸和聚胞苷酸各0.5g，分别放入预热至45℃士1℃的50ml 氯化钠-磷酸盐缓冲液(pH7.2)[取磷酸氢二钠1.546g、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.262g，氯化钠8.768g，加水溶解并稀释至1000ml]中，搅拌充分溶解，保持该温度30min；将两种溶液混合，并保持45℃±1℃、40min，冷却至室温得到的溶液即为10mg/ml的多聚核苷酸溶液。

[0013] 2)多聚核苷酸-乙基纤维素软材制备

[0014] 准确量取13ml多聚核苷酸溶液加入到10.0g乙基纤维素中制备软材，45℃烘干12h，研碎后即为含有13mg/g多聚核苷酸的乙基纤维素干粉。

[0015] 3)多聚核苷酸微囊制备

[0016] 称取过400目筛的含多聚核苷酸的乙基纤维素粉末0.75g、硬脂酸镁0.3g，加入到冰浴的丙酮中，缓慢搅拌(200rpm)，待乙基纤维素完全溶于丙酮中形成均匀的混悬液；在搅拌的条件下将上述混悬液缓慢加入到含质量比2％Span-80表面活性剂的液体石蜡中，充分混合后，逐渐升温至35℃±1℃，在400rpm的条件下使丙酮慢慢挥发，保持2-3h；然后升温至56℃，保持1-2小时；减压抽滤，所得固体用正己烷洗涤多次，加压干燥，得流动性好的淡黄色粉状微囊。多聚核苷酸微囊可以在制备治疗鸡传染性法氏囊病、鸡传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎、猪呼吸及繁殖障碍综合症和猪传染性胃肠炎方面药物中得到应用。 [0017] 有益效果

[0018] 核酸是构成一切生物体细胞和病毒遗传基因的重要物质，有核糖核酸(DNA)和脱氧核糖核酸(RNA)之分。RNA由4种β-D-呋喃核苷酸通过磷酸键连结，而DNA是由4种β-D-脱氧呋喃核苷酸组成。对核苷酸的碱基或糖基部分进行修饰，或者同时对碱基和糖基进行双重修饰所得的核苷或核苷酸类似物是核酸的抗代谢产物，能取代病毒正常的核酸前体或抑制核酸合成酶，阻断病毒核酸的合成，对病毒有选择性的抑制作用。这类具有抗病毒活性的核苷或核苷酸类似物统称为核苷类抗病毒药，对病毒性疾病的治疗起着十分重要的作用。

[0019] 多聚核苷酸具有广谱抗病毒活性，在人类主要用于治疗疱疹病毒、呼吸道病毒感染和乙型肝炎等。近年来，越来越多的兽医临床应用证明，多聚核苷酸对鸡新城疫、鸡传染性法氏囊病等急性传染病的预防和治疗具有确实的疗效。

[0020] 多聚核苷酸为水溶性物质，若将其做成微囊通常可选的囊材都特别昂贵，且不稳定。借鉴目前已有的多聚核苷酸溶液，本发明采用乙基纤维素作为囊材将其制成多聚核苷酸缓释微囊。乙基纤维素为半降解材料，对机体无害且价格低廉，进入体内后会发生膨胀，有效药物可通过囊材外壁缓慢释放，从而达到缓释的目的。本发明取代了多聚核苷酸注射液，避免了药物注射对畜禽造成的应激，同时本发明采取缓释技术，药物可透过囊材缓慢、均匀释放药物，有效地延长了药物在体内的作用时间，减少了投药量和投药次数，提高了治愈率，降低了养殖成本。本发明技术成本低、操作简单、适用于大规模生产，同时作为一种生物药品，本发明药物没有副 作用，无药物残留。

[0021] 试验证明，多聚核苷酸微囊高、中剂量组死亡率显著低于感染对照组的死亡率。多聚核苷酸微囊高、中剂量组治愈率较高，均为80％，两组的有效率均为100％。经对健康猪的安全性试验(推荐剂量10倍给药)表明，使用期间未见临床异常表现，对健康猪无明显影响，说明本发明药物是安全的。

[0022] 具体实施方式

[0023] 1)多聚核苷酸溶液制备

[0024] 称取聚肌苷酸(250g/桶，江门市群科药业有限公司)和聚胞苷酸(250g/桶，江门市群科药业有限公司)各0.5g，分别放入预热至45℃士1℃的50ml氯化钠-磷酸盐缓冲液(pH7.2)[取磷酸氢二钠1.546g、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.262g，氯化钠8.768g，加水溶解并稀释至1000ml]中，搅拌充分溶解，保持该温度30min；将两种溶液混合，并保持45℃士1℃、40min，冷却至室温得到的溶液即为10mg/ml的多聚核苷酸溶液。 [0025] 2)多聚核苷酸-乙基纤维素软材制备

[0026] 量取13ml上述多聚核苷酸溶液加入到10.0g乙基纤维素(医药级，粘度10Cps，山东瑞泰化工(集团)有限公司)中制备软材，45℃烘干12h，研碎后即为含有13mg/g多聚核苷酸的乙基纤维素干粉。

[0027] 3)多聚核苷酸微囊制备

[0028] 称取过400目筛的含多聚核苷酸的乙基纤维素粉末7.5g、硬脂酸镁3g，加入到冰浴的丙酮中，缓慢搅拌(200rpm)，待乙基纤维素完全溶于丙酮中形成均匀的混悬液；在搅拌的条件下将上述混悬液缓慢加入到含2％Span-80表面活性剂的液体石蜡中，充分混合后，逐渐升温至35℃士1℃，在400rpm的条件下使丙酮慢慢挥发，保持2-3h；然后升温至56℃，保持1-2小时；减压抽滤，所得固体用正己烷洗涤多次，加压干燥，得流动性好的淡黄色粉状微囊10.2g，含药量为0.7％-0.9％。

[0029] 动物试验：

[0030] 用本发明药物治疗哺乳仔猪传染性胃肠炎。猪传染性胃肠炎是猪的一种高度接触性传染病。虽然发生于生长期猪、育肥猪和成年猪时，一般只表现数天厌食、呕吐和较严重腹泻，不会造成大的死亡，但一旦感染哺乳仔猪，就会引起严重腹泻和很高死亡率(最高达100％)，给养猪生产造成很大损失。

[0031] 1、试验药品

[0032] 多聚核苷酸微囊，主要成分多聚核苷酸，推荐使用剂量为1mg/kg·bw；对照药物为多聚核苷酸注射液(规格：1mg/ml)，推荐使用剂量0.02ml/kg·bw，每隔3日使用一次。 [0033] 2、试验动物

[0034] 天津市郊某养猪场约有400头2周龄仔猪自然发病，仔猪典型症状是先出现呕 吐，而后是水样腹泻，体重迅速下降，明显脱水。严重腹泻仔猪粪便中常含有未消化的凝乳块，气味腥臭。该猪场有多年猪传染性胃肠炎流行病史。根据流行病学、临床症状、微生物学及血清学检查等综合诊断为猪传染性胃肠炎。

[0035] 3、试验设计

[0036] 随机选取该猪场体重为6±1kg、2周龄和病理状态基本一致的患猪100头作为试验动物，均分为5个试验组。试验一组为多聚核苷酸微囊高剂量组(2mg/kg·bw)；试验二组为多聚核苷酸微囊中剂量组(1mg/kg·bw)；试验三组为多聚核苷酸微囊低剂量组(0.5mg/kg·bw)；试验四组为多聚核苷酸注射液药物对照组；试验五组为不给药对照组；另选择体重为6±1kg、2周龄健康猪40头，均分为两个实验组分别为试验六组(不发病不给药组)和试验七组(安全剂量组)。确诊当日按各组剂量口服或肌肉注射给药。各试验组猪饲料完全相同，其他管理各组均保持一致。分组见表1

[0037] 4、试验方法

[0038] 按表1对各组猪给药进行治疗，每天观察患猪临床变化、治愈、好转、死亡等情况，并进行记录。

[0039] 表1多聚核苷酸微囊对仔猪传染性胃肠炎的治疗试验

[0040]组别 实验猪数量 (头) 供试药物 药物用量用法 用药天数
1 20 多聚核苷酸微囊高剂量组 2mg/kg·bw 7天
2 20 多聚核苷酸微囊中剂量组 1mg/kg·bw 7天
3 20 多聚核苷酸微囊低剂量组 0.5mg/kg·bw 7天
4 20 多聚核苷酸注射液对照组 0.02ml/kg·bw 7天
5 20 感染不给药对照组 - -
6 20 不感染不给药对照组 - -
7 20 安全对照组 10mg/kg·bw 7天

[0041] 5、疗效判定标准

[0042] 死亡率：试验期间出现典型猪传染性胃肠炎临床症状并死亡的猪占该组猪的比例。

[0043] 治愈率：试验结束后精神、食欲、临床症状完全恢复正常的猪占该组猪的比例。 [0044] 有效率：试验结束后精神、食欲、临床症状明显好转的猪占该组猪的比例。 [0045] 6、数据的分析处理

[0046] 用生物统计进行数据的显著性检验。

[0047] 结果

[0048] 病猪治疗结果见表2

[0049] 表2临床试验结果

[0050]

[0051]

[0052] 死亡率

[0053] 各用药组相比较，多聚核苷酸微囊高、中剂量组死亡率为零。统计学分析表明，多聚核苷酸微囊高、中剂量组死亡率显著低于感染对照组的死亡率(p＜0.01)。 [0054] 治愈率与有效率

[0055] 多聚核苷酸微囊高、中剂量组治愈率较高，均为80％。上述两组的有效率均为100％。多聚核苷酸微囊低剂量组的治愈率、有效率相对较低。

[0056] 疗效对比

[0057] 多聚核苷酸微囊低剂量组、药物对照组的死亡率均显著低于感染对照组，但与多聚核苷酸微囊高、中剂量组相比疗效相对较低。

[0058] 安全性试验

[0059] 经对健康猪的安全性试验(推荐剂量10倍给药)表明，使用期间未见临床异常表现，对健康猪无明显影响，说明本发明药物是安全的。