表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢的制备方法

摘要

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌芽孢表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢制备方法。该方法是利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与具有三酰甘油脂水解和转酯功能的脂肪酶基因重组后，构建融合表达的整合性重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示脂肪酶的重组芽孢。与本领域已知的方法相比，本发明方法将不同来源的具有三酰甘油脂水解功能的脂肪酶展示于Bacillus subtilis芽孢的表面，利用芽孢所具有的独特抗逆性，能提高脂肪酶的催化活性和稳定性。

权利要求

1. 一种表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢的制备方法，其特征在于，利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因cotB、cotC或cotG为分子载体，与枯草芽孢杆菌脂肪酶基因lipA 重组后，构建融合表达的整合性重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到重组菌株，诱导重组菌株产生芽孢表面展示脂肪酶的重组芽孢。

2.如权利要求1所述的表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢的制备方法，其特征在于，所述的融合表达的整合性重组质粒是将所述的枯草芽孢衣壳蛋白基因与脂肪酶基因lipA重组构建的质粒，在这些重组质粒中含有整合基因amyE片段、适用于大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的抗性选择标记基因、芽孢衣壳蛋白基因的启动子和不含终止密码子的编码序列与脂肪酶基因lipA 的编码序列重组后的DNA片段。

3.如权利要求2所述的表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢的制备方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌重组菌株是整合性重组质粒转化枯草芽孢杆菌的所得菌株，该菌株染色体上含有适用于枯草芽孢杆菌的抗性选择标记基因、以及芽孢衣壳蛋白基因的启动子和不含终止密码子的编码序列与脂肪酶基因lipA的编码序列，这些基因插入淀粉酶基因中并导致淀粉酶失活。

4.如权利要求3所述的的表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢的制备方法，其特征在于，重组芽孢是枯草芽孢杆菌重组菌株诱导形成的枯草芽孢杆菌芽孢，其表面展示脂肪酶，该重组芽孢具有三酰甘油脂水解和转酯催化功能。

说明书

表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及芽孢表面展示技术领域，特别是一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)芽孢表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢制备方法。 背景技术

[0002] 脂肪酶(EC3.1.1.3)能催化酯类水解、合成或转酯反应，生成长链脂肪酸单酯，在医药、食品、制革、洗涤剂、能源等工业生产中具有极其广泛的应用价值。尤其是利用脂肪酶生产生物柴油，因其对原料的选择性低、反应条件温和、能耗低、产物及副产物较易分离且无污染排放，是一种更理想的节能、环保型工艺(Watanabe Y，et al.J.Mol.Catal.B：Enzymatic，2007，44(324)：99～105)。但限制生物酶法制备生物柴油规模化生产的主要问题是脂肪酶生产成本高、稳定性差、利用率低、甲醇等低碳醇对酶的失活效应等缺陷，难以达到大规模生产生物柴油的要求(邓利等，生物工程学报，2003，19(1)：97～101)。生产满足市场需求的脂肪酶产品最迫切解决的问题是研制低成本、高催化活性和良好稳定性的脂肪酶。为了提高酶催化效率，降低生产成本，提高酶的使用率，通过改良生产工艺已能显著提高酶的稳定性和催化活性，但不能从根本上降低脂肪酶的生产和使用成本。另外，通过固定化酶同连续化的生物反应器的结合，使脂肪酶具有良好的催化活性和稳定性，使用寿命延长，大大降低了酶制品及整个生产工艺的成本(Noureddini H，et al.Bioresour Technol，2005，96(7)：769～777)，但脂肪酶在纯化和固定化过程中，活性容易受到破坏，导致生产成本较高。全细胞生物催化剂可克服固定化酶所存在的不足，该技术将产脂肪酶的细胞固定在载体上(如生物支架颗粒，BSPs)用作全细胞生物催化剂。操作更为简便、经济，省掉纯化的繁琐工序，而且固定化过程可在批量培养微生物时同步完成。但脂肪酶是胞内酶，催化底物和产物的转运受到细胞膜的屏障作用而降低反应速度，并且细胞内脂肪酶的表达量受底物组成和浓度的调节，需要通过向培养基中添加相应的脂肪酸以提高胞内脂肪酶的含量、酶催化活性、稳定性及膜的通透性来加以调控；并且全细胞催化剂在无溶剂体[
系中稳定性差，而甲醇对细胞活性、脂肪酶表达和活性均有抑制作用(Li W，et al.J.Mol.Catal B：Enzymatic，2007，45：122～127)。

[0003] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为环境友好菌，其芽孢具有独特的抗逆 性、容易培养、芽孢比重大易分离、以芽孢表面展示技术制备的重组酶，不需要分离纯化；由于酶被展示在芽孢表面，可克服全细胞生物催化剂的细胞壁和细胞膜屏障；芽孢具有抗有机溶剂、高温等不利因素，能显著提高酶的催化活性和稳定性。基于上述优点，以枯草芽孢杆菌芽孢为载体，通过芽孢表面展示技术将催化活性的酶展示于芽孢表面，制备具有催化活性的重组芽孢成为工业化酶制剂研究和生产关注的焦点(Jung HC，et al.BMC Biotechnol.2006，6(23)：1-9)。本发明以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白为分子载体，将来源于细菌或动植物细胞具有三酰甘油脂水解功能的脂肪酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，构建表面展示具有脂肪酶催化活性的重组芽孢，迄今尚未见类似的报道或发明专利。 发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢的制备方法。该方法以枯草芽孢杆菌芽孢为载体，将具有催化三酰甘油脂水解功能的脂肪酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，制备表面展示具有脂肪酶催化活性的重组芽孢。 [0005] 本发明所采用的技术方案是：

[0006] 表面展示具有催化活性的脂肪酶(Lipase)的重组芽孢的制备方法，是以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白为分子载体，将衣壳蛋白基因与编码具有催化三酰甘油脂水解功能的脂肪酶基因重组后融合表达，使脂肪酶通过衣壳蛋白展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，构建表面展示具有脂肪酶催化活性的重组芽孢。

[0007] 本发明优选枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因cotB、cotC和cotG作为表面展示蛋白的分子载体，选择微生物或动植物细胞来源的具有三酰甘油脂水解和转酯催化功能脂肪酶基因lipase为供体基因。

[0008] 本发明涉及本发明所选择的芽孢衣壳蛋白基因cotB、cotC和cotG分别与脂肪酶基因(lipase)编码序列重组后构建的质粒，在这些重组质粒中分别含有芽孢衣壳蛋白基因的启动子、不含终止密码子的编码序列与lipase的编码序列的重组基因，可在枯草芽孢杆菌分化形成芽孢时分别融合表达重组蛋白CotB-Lipase、CotC-Lipase、CotG-Lipase。 [0009] 本发明还涉及本发明构建的融合表达CotB-Lipase、CotC-Lipase、CotG-Lipase的重组质粒转化Bacillus subtilis筛选所得到的重组菌株，这些重组菌株诱导形成的重组芽孢，重组芽孢表面展示的脂肪酶的催化活性以水解4-硝基苯基月桂酸酯生成黄色的4-硝基苯比色法鉴定。

[0010] 本发明涉及基因cotB启动子及不含终止密码子的编码序列片段扩增的引物序列：

[0011] cotB-1：GAGATCTAGAACGGATTAGGCCGTTTGTCC，(SEQ.ID.NO.1)

[0012] cotB-2：GAGAGGTACCGGATGATTGATCATCTGAAG，(SEQ.ID.NO.2)。 [0013] 本发明涉及基因cotC启动子及不含终止密码子的编码序列片段扩增的引物序列：

[0014] cotC-1：GACTGAGTCTAGATGTTCAAAATAAATGCATTC(SEQ.ID.NO.3) [0015] cotC-2：GACTGAGGGTACCGTAGTGTTTTTTATGCTTTTT(SEQ.ID.NO.4) [0016] 本发明涉及基因cotG启动子及不含终止密码子的编码序列片段扩增的引物序列：

[0017] cotG-1：GACAGGTCTAGACTCTGCCTTTGGAGACAGTGTCCC(SEQ.ID.NO.5) [0018] cotG-2：GAGACAGGTACCGTCGTCGCAGTGGTGGTGCG(SEQ.ID.NO.6)

[0019] 本发明涉及Bacillus subtilis淀粉酶基因amy-E片段扩增的引物序列： [0020] amyE-1：CATTGCTCGGGCTGTATGACTGG(SEQ.ID.NO.7)

[0021] amyE-2：GATTGTGAATTGATCTCCATCC(SEQ.ID.NO.8)

[0022] 与本领域已知的方法相比，本发明方法将不同来源的具有三酰甘油脂水解功能的脂肪酶展示于Bacillus subtilis芽孢的表面，利用芽孢所具有的独特抗逆性，提高脂肪酶的催化活性和稳定性。本发明构建的表面展示脂肪酶的Bacillussubtilis重组芽孢，可用于医药、食品、制革、洗涤剂、生物柴油生产等领域。

[0023] 附图说明

[0024] 图1融合表达CotC-LipA整合性重组质粒pJS433结构示意图。amyE5’-end和amyE3’-end分别表示淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端DNA片断，通过双交换整合在Bacillus - r r r
subtilis 168(trp)染色体的淀粉酶基因中；Cm，Em，Ap 分别表示氯霉素抗性基因，红-
霉素抗性基因和青霉素抗性基因，用于在大肠杆菌或Bacillus subtilis 168(trp)中的筛选；cotC-lipA为在枯草杆菌芽孢中融合表达CotC-LipA重组蛋白的基因片段，该片段含cotC启动子序列、不含cotC终止密码子的编码序列，以及来源于Bacillus subtilis -
168(trp)的脂肪酶基因(lipA)的全编码序列。oriC为大肠杆菌复制子片段。 [0025] 图2菌株DRJS433重组芽孢脂肪酶活性的4-硝基苯比色法测定。DRJS426为不含重组脂肪酶的重组芽孢；DRJS433为表面展示脂肪酶(LipA)的重组芽孢

[0026] 图3融合表达CotB-LipA整合性重组质粒pJS549结构示意图。amyE 5’-end和amyE 3’-end分别表示淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端DNA片断，通过双交换整合在- r r rBacillus subtilis(trp)染色体的淀粉酶基因中；Cm，Em，Ap 分别表示氯霉素抗性基因，-
红霉素抗性基因和青霉素抗性基因，用于在大肠杆菌或Bacillus subtilis(trp)中的筛选；cotB-lipA为在枯草杆菌芽孢中融合表达CotB-LipA重组蛋白的基因片段，该片段含cotB启动子序列、不含cotB终止密码子的CotB编码序列，以及来源于Bacillus subtilis -
168(trp)的脂肪酶基因(lipA)的全编码序列。oriC为大肠杆菌复制子片段。 [0027] 图4菌株DRJS549重组芽孢脂肪酶活性的4-硝基苯比色法测定。DRJS426为不含重组脂肪酶的重组芽孢；DRJS549为表面展示脂肪酶(LipA)的重组芽孢。 [0028] 图5融合表达CotG-LipA整合性重组质粒pJS551结构示意图。amyE 5’-end和amyE 3’-end分别表示淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端DNA片断，通过双交换整合在- r r r
Bacillus subtilis168(trp)染色体的淀粉酶基因中；Cm，Em，Ap 分别表示氯霉素抗性基-
因，红霉素抗性基因和青霉素抗性基因，用于在大肠杆菌或Bacillus subtilis 168(trp)中的筛选；cotG-lipA为在枯草杆菌芽孢中融合表达CotG-LipA重组蛋白的基因片段，该片段含cotG启动子序列、不含cotG终止密码子的CotG编码序列，以及来源于Bacillus -
subtilis 168(trp)的脂肪酶基因(lipA)全编码序列。oriC为大肠杆菌复制子片段。 [0029] 图6菌株DRJS551重组芽孢脂肪酶活性的4-硝基苯比色法测定。DRJS426为不含重组脂肪酶的重组芽孢；DRJS551为表面展示脂肪酶(LipA)的重组芽孢。 具体实施方式

[0030] 实施例1

[0031] 以CotC为载体蛋白表面展示枯草芽孢杆菌脂肪酶(LipA)的重组芽孢的制备 [0032] 1.分子生物学操作

[0033] 1.1枯草芽孢杆菌染色体的提取

[0034] 离 心 收 集 10mL Bacillus subtilis 168(trp-)(Bacillus Genetic Stock Center，Department of Biochemistry，The Ohio State University，West 12th Avenue，Columbus，Ohio，43210，USA)培养物，加0.5ml TE悬浮沉淀。每个微量离心管加入30μl溶菌酶(100mg/ml)，于37℃反应1小时；加入50μl SDS(10％)与20μl蛋白酶K(20mg/ml)，震荡均匀，于37℃反应2小时，加入等体积的苯酚/氯仿抽提后取上清，加入2倍体积的乙醇，室温下使DNA沉淀超过2小时12,000g离心10分钟，弃上清液后以75％乙醇500μl洗DNA沉淀物，以去除无机盐离子。待DNA沉淀物干燥后，加入30～50μl TE或ddH2O溶解DNA，于-20℃下保存备用。

[0035] 1.2分子生物学技术

[0036] 所有质粒的构建采用Sambrook等人(《分子克隆：试验手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)所述的标准分子生物学技术进行，用于本发明的所有回收DNA片段均采用上海生工生物工程有限公司凝胶回收试剂盒分离纯化。所有PCR产物克隆片段均经上海生工生物工程有限公司测序。

[0037] 1.3 PCR扩增

[0038] 用于基因扩增的引物由上海生工生物技术有限公司合成，为便于扩增产物的克隆部分引物5’端添加限制性内切酶识别位点，PCR反应体系中含10mmol/LTris·Cl(pH 8.3)，50mmol/L MgCl2，上下游引物各100pmol，200μmol/L dNTPs，50ng模板DNA，2.5U DNA聚合酶(Taq/Pfu＝1/1，U/U)。PCR反应程序根据不同引物特征设置。

[0039] 2.质粒的构建

[0040] 2.1基本质粒构建

[0041] 根据Bacillus subtilis 168染色体上的脂肪酶基因lipA(Gene Bank序列号：AAZ07988)序列合成引物：

[0042] lipA-1：GAGAGGAGCTCTCGGTCGTGTCGGCCATCC(SEQ.ID.NO.9)

[0043] lipA-2：GAGAGGAATTCTTAACTCGGTCTCAGTGCCAG(SEQ.ID.NO.10) [0044] 为便于克隆，上游引物lipA-1添加了KpnI位点，下游引物lipA-2添加了EcoRI-位点，以lipA-1和lipA-2：为引物，以Bacillus subtilis 168(trp)染色体为模板，PCR扩增lipA基因编码序列片段，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃ 1min，56℃ 1min，
72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物大小为709bp，分别以限制性内切酶SacI和EcoRI消化酶切产物用凝胶回收试剂盒回收后插入 pUC18(《分子克隆：试验手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)相应的克隆位点，克隆片段测序确定序列正确后命名为pJS422。

[0045] 以BamHI酶切由发明人保存的质粒pRL598(Black，T.A.，and C.P.Wolk.1994.r rJ.Bacteriol.176：2282-2292.)，回收含氯霉素(Cm)-红霉素抗性(Em)基因片段(约
1.9kb)，以T4DNA聚合酶处理后，与SalI酶切、T4DNA聚合酶补平的pJS422连接，分别以BamHI和KpnI酶切鉴定后重组质粒命名为pJS424。

[0046] 根据Bacillus subtilis 168染色体上的淀粉酶基因amyE(Gene BanK序列号：NP388186)序列，设计并合成引物：

[0047] amyE-1：CATTGCTCGGGCTGTATGACTGG

[0048] amyE-2：GATTGTGAATTGATCTCCATCC

[0049] 以amy-1和amy-2为引物，Bacillus subtilis 168(trp-)染色体为模板PCR扩增amyE基因部分编码序列片段。PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物大小约1kb，抽提沉淀后以T4DNA聚合酶处理后与PvuII酶切pUC18大片段连接，连接产物传化E.coli DH5α，鉴定后的重组质粒为整合平台质粒pJS225。

[0050] 以PvuII酶切质粒pJS424，回收Cmr-Emr-lipA(大小约2.6kb)重组DNA片段插入整合平台质粒pJS225中的SmaI位点，鉴定后的重组质粒命名为pJS426，该质粒为不含Bacillus subtilis复制位点的整合型质粒，可通过质粒中的被插入失活的amyE基因片段-与Bacillus subtilis 168(trp)染色体上的同源片段重组而整合与染色体上，并使重组基因得以稳定遗传。

[0051] 2.2融合表达CotC-LipA重组蛋白整合型重组质粒构建

[0052] 根据Bacillus subtilis 168染色体上的cotC(Gene BanK序列号：NP_389653)序列，设计并合成以下引物：

[0053] cotC-1：GACTGAGTCTAGATGTTCAAAATAAATGCATTC

[0054] cotC-2：GACTGAGGGTACCGTAGTGTTTTTTATGCTTTTT

[0055] 为便于克隆，上游引物cotC-1添加了XbaI位点，下游引物cotC-2添加了KpnI位-点。以cotC-1和cotC-2为引物，Bacillus subtilis 168(trp)染色体为模板，扩增含cotC基因的启动子和不含终止密码子的编码序列，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃ 1min，
52℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸5min。 为便于克隆，扩增各基因的上游引物添加了XbaI位点，下游引物添加了KpnI位点。扩增产物大小为650bp，抽提沉淀后以XbaI和KpnI酶切，插入质粒pJS426中的XbaI和KpnI位点，得到的重组质粒测序确定克隆基因正确后命名pJS433。整合型重组质粒pJS433中含重组基因cotC-lipA，该质粒的物理图谱见本发明附图1。

[0056] 3.融合表达重组蛋白的Bacillus subtilis菌株的筛选鉴定

[0057] 分别将整合型重组质粒pJS431和pJS433转化Bacillus subtilis 168(trp-)，以含0.4μg/mL红霉素的LB平板筛选转化子，从平板上挑单菌落接种在3mL含相同抗生素的液体LB培养基中培养过夜，按以下两种方法鉴定转化子：(1)淀粉平板碘液染色法。1％淀粉平板的制备：固体LB培养基中加可溶性淀粉至终浓度为1％，高压灭菌后制备平板. [0058] 碘液的配制：碘化钾2g；蒸馏水300ml；碘1g，先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，待全溶解后再加碘，振荡溶解后稀释至300mL，保存在棕色玻璃瓶内。

[0059] 取5μL于含红霉素液体培养基中培养的菌液涂在淀粉平板上，37℃培养16小时，取2mL碘液喷于淀粉平板上，菌落及周围颜色为白色表明重组基因插入Bacillus -subtilis 168(trp)染色体上的淀粉酶基因amyE中，菌落及周围颜色变蓝表明重组基因没有插入淀粉酶基因amyE中。鉴定后的重组菌株分别命名为DRJS426和DRJS433，其中DRJS426为对照重组菌株。

[0060] 4.表面展示LipA重组芽孢的诱导及其鉴定

[0061] 以DSM培养基诱导重组菌株DRJS431和DRJS433形成芽孢。

[0062] DSM培养基的配制：0.8％肉汤营养液(Difco)，0.1％KCl，0.025％MgSO4·7H2O，1.0mM Ca(NO3)2，10μM MnCl2，1.0μM FeSO4。

[0063] 分别取重组菌株DRJS431和DRJS433单菌落接种于3mL DSM培养基中，37℃震荡培养过夜，按1∶100接种于200mL LB液体培养基中，5000转/分钟离心10分钟收集芽孢，重悬于2mL无菌水中。以终浓度为10mg/mL溶菌酶37℃处理30分钟破坏营养细胞，5000转/分钟离心10分钟沉淀芽孢，加1mL 50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)重悬芽孢，以LB平板计10
数芽孢后，调整芽孢的浓度，使终浓度约为2×10 个/mL。重组芽孢脂肪酶活性利用4-硝基苯基月桂酸酯显色法鉴定。脂肪酶活性通过脂肪酶水解4-硝基苯基月桂酸酯生成的黄色产物4-硝基苯，4-硝基 苯对405nm可见光有最大吸收值，利用分光光度计测定405nm的光吸收值，确定重组芽孢脂肪酶活性。

[0064] 重组芽孢脂肪酶活性测定方法。

[0065] 反应液的配制：1mM 4-硝基苯基月桂酸酯，5％(v/v)异丙醇，0.6％(v/v)Triton X-100，50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)。

[0066] 重组芽孢脂肪酶水解反应：在50mL具塞锥形瓶中，加入1×1010个重悬的DRJS433重组芽孢，加反应液至20mL，于37℃摇床中，200转/分钟，每间隔40分钟取2mL反应混和物。

[0067] 阴性对照脂肪酶水解反应：在50mL具塞锥形瓶中，加入1×1010个重悬的DRJS431重组芽孢，加反应液至20mL，于37℃摇床中，200转/分钟，每间隔40分钟取2mL反应混和物。

[0068] 芽孢脂肪酶活性测定：一定时间间隔取出的2mL反应混和物8000转/分钟离心5分钟，沉淀芽孢，取2mL上清液于比色皿中，同时取2mL反应液于另一比色皿中作空白对照；以分光光度计测定405nm的光吸收值。菌株DRJS433重组芽孢及对照菌株DRJS426重组芽孢脂肪酶活性测定结果见本发明附图说明和附图2。

[0069] 实施例2

[0070] 以CotB为载体蛋白表面展示枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的重组芽孢的制备 [0071] 1.分子生物学操作

[0072] Bacillus subtilis 168(trp-)染色体的提取，分子生物学技术，PCR扩增操作同本发明实施例1中分子生物学操作

[0073] 2.质粒的构建

[0074] 2.1基本质粒构建操作方法同本发明实施例1中2.1基本质粒的构建。 [0075] 2.2融合表达CotB-LipA重组蛋白整合型重组质粒构建

[0076] 根据Bacillus subtilis 168染色体上的cotB(Gene BanK序列号：NP_391486)序列，设计并合成以下引物：

[0077] cotB-1：GAGATCTAGAACGGATTAGGCCGTTTGTCC，

[0078] cotB-2：GAGAGGTACCGGATGATTGATCATCTGAAG。

[0079] 为便于克隆，上游引物cotB-1添加了XbaI位点，下游引物cotB-2添加了 KpnI-位点。以cotB-1和cotB-2为引物，Bacillus subtilis 168(trp)染色体为模板，扩增含cotB基因的启动子和不含终止密码子的编码序列，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃
1min，52℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸5min。为便于克隆，扩增各基因的上游引物添加了XbaI位点，下游引物添加了KpnI位点。扩增产物大小为1,088bp，抽提沉淀后以XbaI和KpnI酶切，酶切产物插入质粒pJS426中的XbaI和KpnI位点，得到的重组质粒中克隆基因cotB测序正证明正确后命名为pJS549。整合型重组质粒pJS549中含重组基因cotB-lipA，该质粒的物理图谱见本发明说明书及附图3。

[0080] 3.融合表达重组蛋白的Bacillus subtilis菌株DRJS549的筛选鉴定 [0081] 融合表达重组蛋白的Bacillus subtilis 168(trp-)菌株的筛选鉴定操作方法同本发明实施例1中3.融合表达重组蛋白的Bacillus subtilis菌株的筛选鉴定。鉴定后的重组菌株命名为DRJS549。

[0082] 4.表面展示LipA重组芽孢的诱导及其鉴定

[0083] 表面展示LipA重组芽孢的诱导及其鉴定的操作方法同本发明实施例1中4.表面展示LipA重组芽孢的诱导及其鉴定，鉴定结果见本发明附图说明及附图4。 [0084] 实施例3

[0085] 以CotG为载体蛋白表面展示枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的重组芽孢的制备 [0086] 1.分子生物学操作

[0087] Bacillus subtilis染色体的提取，分子生物学技术，PCR扩增操作同本发明实施例1中分子生物学操作

[0088] 2.质粒的构建

[0089] 2.1基本质粒构建操作方法同本发明实施例1中2.1质粒的构建。 [0090] 2.2融合表达CotB-LipA重组蛋白整合型重组质粒构建

[0091] 根据Bacillus subtilis 168染色体上的cotG(Gene BanK序列号：NP_391486)序列，设计并合成以下引物：

[0092] cotG-1：GACAGGTCTAGACTCTGCCTTTGGAGACAGTGTCCC

[0093] cotG-2：GAGACAGGTACCGTCGTCGCAGTGGTGGTGCG

[0094] 为便于克隆，上游引物cotG-1添加了XbaI位点，下游引物cotG-2添加了 KpnI位-点。以cotG-1和cotG-2为引物，Bacillus subtilis 168(trp)染色体为模板，扩增含cotG基因的启动子和不含终止密码子的编码序列，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃ 1min，
52℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸5min。为便于克隆，扩增各基因的上游引物添加了XbaI位点，下游引物添加了KpnI位点。扩增产物大小为971bp，抽提沉淀后以XbaI和KpnI酶切，插入质粒pJS426中的XbaI和KpnI位点，得到的重组质粒测序确定克隆基因正确后命名pJS551。整合型重组质粒pJS551中含重组基因cotG-lipA，该质粒的物理图谱见本发明说明书及附图5。

[0095] 3.融合表达重组蛋白的Bacillus subtilis菌株DRJS551的筛选鉴定 [0096] 融合表达重组蛋白的Bacillus subtilis菌株的筛选鉴定操作方法同本发明实施例1中3.融合表达重组蛋白的Bacillus subtilis菌株的筛选鉴定。鉴定后的重组菌株命名为DRJS551。

[0097] 4.表面展示LipA重组芽孢的诱导及其鉴定

[0098] 表面展示LipA重组芽孢的诱导及其鉴定的操作方法同本发明实施例1中4.表面展示LipA重组芽孢的诱导及其鉴定，鉴定结果见本发明见本发明说明书及附图6。 [0099] SEQUENCE LISTING

[0100] <110>江苏大学

[0101] <120>表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢的制备方法

[0102] <160>10

[0103] <210>1

[0104] <211>30

[0105] <212>DNA

[0106] <213>人工序列

[0107] <400>1

[0108] gagatctaga acggattagg ccgtttgtcc 30

[0109] <210>2

[0110] <211>30

[0111] <212>DNA

[0112] <213>人工序列

[0113] <400>2

[0114] gagaggtacc ggatgattga tcatctgaag 30

[0115] <210>3

[0116] <211>33

[0117] <212>DNA

[0118] <213>人工序列

[0119] <400>3

[0120] gactgagtct agatgttcaa aataaatgca ttc 33

[0121] <210>4

[0122] <211>34

[0123] <212>DNA

[0124] <213>人工序列

[0125] <400>4

[0126] gactgagggt accgtagtgt tttttatgct tttt 34

[0127] <210>5

[0128] <211>36

[0129] <212>DNA

[0130] <213>人工序列

[0131] <400>5

[0132] gacaggtcta gactctgcct ttggagacag tgtccc 36

[0133] <210>6

[0134] <211>32

[0135] <212>DNA

[0136] <213>人工序列

[0137] <400>6

[0138] gagacaggta ccgtcgtcgc agtggtggtg cg 32

[0139] <210>7

[0140] <211>23

[0141] <212>DNA

[0142] <213>人工序列

[0143] <400>7

[0144] cattgctcgg gctgtatgac tgg 23

[0145] <210>8

[0146] <211>22

[0147] <212>DNA

[0148] <213>人工序列

[0149] <400>8

[0150] gattgtgaat tgatctccat cc 22

[0151] <210>9

[0152] <211>30

[0153] <212>DNA

[0154] <213>人工序列

[0155] <400>9

[0156] gagaggagct ctcggtcgtg tcggccatcc 30

[0157] <210>10

[0158] <211>32

[0159] <212>DNA

[0160] <213>人工序列

[0161] <400>10

[0162] gagaggaatt cttaactcgg tctcagtgcc ag 32