棉花花粉管微丝骨架的荧光标记方法

摘要

本发明是对棉花花粉管微丝骨架进行荧光标记的方法，属于生物技术领域。包括载玻片打孔做成培养花粉管的小室；将花粉在小室中培养，萌发出花粉管；培养好的花粉管用含4％多聚甲醛的50mM Pipes缓冲液(pH6.9)固定1-2h；洗涤后再置于0.1-0.2％的甘油(或0.1-0.2％浓度的TritonX-100)中室温渗透3-4h(或4℃冰箱过夜)；洗涤后用浓度为1-2.5μg/ml的TRITC(罗丹明)标记的鬼笔环肽避光染色2-4h；洗涤后在共聚焦扫描显微镜下观察。本发明操作简单，标记效果好，将在棉花花粉管细胞的骨架以及受精生殖研究中发挥重要作用，有重要的实际应用价值。

权利要求

1.一种棉花花粉管微丝骨架的荧光标记方法，包括以下步骤：

1)载玻片打孔

将25.5×76.2mm，1mm-1.2mm厚的载玻片中间用电钻打出直径为1cm的圆孔，其中将孔一边用盖玻片封住，形成小室，粘附剂为指甲油；

2)培养花粉管

晴天上午收集刚开放花朵上的花粉，使其充分混合；将花粉洒在半固体培养基表面，半固体培养基质量比成分：0.01％硼酸、0.03％四水硝酸钙、0.02％七水硫酸镁、15％聚乙二醇8000、20％蔗糖和1％低熔点琼脂糖，pH6.2，28℃光照培养2-3h；

3)荧光标记

培养好的花粉管用含有质量百分浓度4％多聚甲醛、pH为6.9的50mM Pipes缓冲液室温条件下固定1-2h；用Pipes缓冲液洗涤花粉管；将花粉管置于体积比为0.1-0.2％的甘油或体积比为0.1-0.2％浓度的Triton X-100中室温渗透3-4h或4℃冰箱过夜；用pH7-9的磷酸缓冲液洗涤花粉管；花粉管用浓度为1-2.5μg/ml的罗丹明TRITC标记的鬼笔环肽避光染色2-4h，微丝骨架被荧光标记；用pH7-9的磷酸缓冲液洗涤花粉管；荧光标记过的花粉管在共聚焦扫描显微镜下观察。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述棉花为陆地棉。

说明书

棉花花粉管微丝骨架的荧光标记方法

一、技术领域

[0001] 本发明涉及植物生物技术领域中花粉管微丝骨架的荧光标记方法，属于生物技术领域。二、背景技术

[0002] 花粉管作为有花植物受精过程中雄性生殖单位的载体，它的萌发及其伸长等一系列生理活动，直接影响着受精过程能否顺利完成，花粉管的生长与其它植物细胞不同，它具有极性顶端生长，并依赖于生长的花粉管中微丝正常聚合。因此，利用花粉管系统研究微丝骨架及其在生物体内的功能是目前最活跃的研究领域之一，也是当今植物生殖生物学领域的研究重点。近年来的研究表明，微丝是细胞骨架的重要组成部分，它在花粉萌发和花粉管生长中执行着多种功能，其中包括维持和建立细胞极性，参与细胞质流动与细胞器的运动，以及对各种环境刺激做出反应等。

[0003] 微丝是由肌动蛋白单体G-actin组成的直径约7nm-9nm的骨架纤维，又称肌动蛋白纤维(actin filament，AFs)。目前利用荧光标记法观察微丝的方法，主要有抗体间接标记和鬼笔环肽直接染色两种。由于微丝抗体在标记F-actin的同时也能标记G-actin，因此标记后得到的图像常有较高的背景。而鬼笔环肽的优点在于能专一性地标记F-actin，相比之下，鬼笔环肽直接染色法能提供相对理想的结果。迄今为止，由于实验材料自身的局限性和检测方法的局限性，对陆地棉花粉管中微丝骨架进行标记的有效方法和技术还未见报道。本方法探索了用TRITC-鬼笔环肽荧光染料进行检测陆地棉花粉管内微丝骨架的试验，建立了完整可行的试验方法，操作步骤简单，试验效果稳定、清晰，因此无论是在科研、检测以及学生试验中都能得到很好的应用。三、发明内容

[0004] 技术问题本发明的目的在于提供一种较快速、有效的的棉花花粉管微丝骨架的荧光标记方法。

[0005] 技术方案

[0006] 一种棉花花粉管微丝骨架的荧光标记方法，包括以下步骤：

[0007] 1)载玻片打孔

[0008] 将载玻片(25.5×76.2mm，1mm-1.2mm thick)中间用电钻打出直径为1cm的圆孔，其中孔的一边用将盖玻片封住，形成小室，粘附剂为指甲油；

[0009] 2)培养花粉管

[0010] 晴天上午收集刚开放花朵上的成熟花粉，使其充分混合；将花粉洒在半固体培养基表面(培养基成分：0.01％硼酸+0.03％四水硝酸钙+0.02％七水硫酸镁+15％聚乙二醇8000+20％蔗糖+1％低熔点琼脂糖，pH6.2)，28℃光照培养2-3h；

[0011] 3)荧光标记

[0012] 培养好的花粉管用含有4％多聚甲醛(质量百分浓度)的50mM Pipes缓冲液(pH6.9)室温条件下固定1-2h；用Pipes缓冲液洗涤花粉管；将花粉管置于0.1-0.2％的甘油或0.1-0.2％浓度的Triton X-100中室温渗透3-4h或4℃冰箱过夜；用pH7-9的磷酸缓冲液洗涤花粉管；花粉管用浓度为1-2.5μg/ml的TRITC标记的鬼笔环肽避光染色2-4h，微丝骨架被荧光标记；用pH7-9的磷酸缓冲液洗涤花粉管；荧光标记过的花粉管在共聚焦扫描显微镜下观察。上述的方法中所述棉花为陆地棉。

[0013] 有益效果

[0014] 本发明提供了一种对棉花花粉管微丝骨架进行荧光标记的方法。本发明的标记方法具有以下优点：

[0015] 1)简单，快速：省略了常规标记方法中对细胞壁进行酶解的步骤；

[0016] 2)用甘油或Triton X-100作为渗透试剂，使得荧光染色效率更高；

[0017] 3)标记效果好，可在共聚焦扫描显微镜下清晰观测到微丝骨架均呈较长的、密集的平行束状或表现出较为随机的以较短的、纤细的交叉网状结构分布。研究的方法和结果为开展与棉花受精有关的生殖生物学研究提供了新的途径和依据，为棉花花粉的开发应用提供相关技术参考。四、附图说明

[0018] 图1棉花花粉管内的微丝骨架结构

[0019] A)呈较长的、密集的平行束状的微丝骨架，Bar＝10μm；B)呈随机的、较短的、纤细的交叉网状结构分布的微丝骨架Bar＝10μm五、具体实施方式

[0020] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量如无特别说明均为质量百分含量。

[0021] 实施例1、鲁棉21花粉管微丝骨架的荧光标记及其显微镜观测

[0022] 首先用本发明的方法对鲁棉21(生产用种)花粉管进行荧光标记，包括以下步骤：

[0023] 1)载玻片打孔，将载玻片(25.5×76.2mm，1mm-1.2mm thick)中间用电钻打出直径为1cm的圆孔，其中孔的一边用将盖玻片封住，粘附剂为指甲油，室温静置至指甲油风干，盖玻片与载玻片粘在一起成一小室，备用；

[0024] 2)配制半固体花粉管培养基，分别称取0.01g硼酸、0.03g四水硝酸钙、0.02g七水硫酸镁、15g聚乙二醇8000和20g蔗糖，用去离子水溶解后调pH至6.2，再定容至100ml，再加入1％的低熔点琼脂糖，加热溶解后，用移液枪吸取加满载玻片上的小室，室温凝固后备用。

[0025] 3)培养花粉管，晴天上午收集刚开放花朵上的成熟花粉，使其充分混合(避免个体植株和花药不同引起的花粉生活力差异)；将花粉洒在半固体培养基表面，28℃光照培养2.5h；

[0026] 4)培养好的花粉管用含有4％多聚甲醛的50mM Pipes缓冲液(pH6.9)室温条件下固定1.5h；

[0027] 5)用不含多聚甲醛的Pipes缓冲液洗涤花粉管3次，每次漂洗10min后用吸水纸轻轻将洗液吸去；

[0028] 6)将花粉管置于0.15％的甘油(pH为8的磷酸缓冲液配制)中渗透3h；

[0029] 7)pH为8的磷酸缓冲液洗涤花粉管，每次漂洗10min后用吸水纸轻轻将洗液吸去；

[0030] 8)花粉管用浓度为2μg/ml的TRITC标记的鬼笔环肽(Sigma公司，USA)避光染色3h，微丝骨架被荧光标记；

[0031] 9)pH为8的磷酸缓冲液洗涤花粉管，每次漂洗10min后用吸水纸轻轻将洗液吸去；

[0032] 10)荧光标记过的花粉管在共聚焦扫描显微镜下观察。

[0033] 结果表明，花粉管内具有完整的微丝网络，微丝骨架均呈较长的、密集的平行束状(图1-A)或表现出较为随机的以较短的、纤细的交叉网状结构分布，但均交错平行于花粉管的长轴(图1-B)。微丝束在距花粉管顶端10-20μm处不再往前延伸，在花粉管的顶端不存在微丝束。

[0034] 上述步骤7)中将花粉管置于0.15％的甘油(pH为8的磷酸缓冲液配制)中渗透3h；用Triton X-100代替甘油，4℃冰箱过夜代替室温渗透3h都能起到同样的效果。