一种转化芽孢杆菌的方法

摘要

本发明公开了一种转化芽孢杆菌的方法。该方法，是以芽孢杆菌原生质体为转化受体，用电穿孔法将DNA分子导入芽孢杆菌原生质体中。本发明的芽孢杆菌转化方法以枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌原生质体为受体，将重组质粒导入枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌中，转化效率达到60％，对枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌基因工程表达系统具有重要的意义。另外，地衣芽孢杆菌的转化在一般情况下是很难进行的，本发明的芽孢杆菌转化方法对于地衣芽孢杆菌的转化也是很有效的。

权利要求

1.一种转化芽孢杆菌的方法，是以芽孢杆菌原生质体为转化受体，用电穿孔法将DNA分子导入芽孢杆菌原生质体中；

所述芽孢杆菌原生质体是按照如下方法制备的：芽孢杆菌在PAB培养液培养，收集所述芽孢杆菌，用菌体保护液重悬，然后加入溶菌酶获得芽孢杆菌原生质体；所述PAB培养液为25％(体积百分含量)4×PAB培养液，所述4×PAB培养液含有5-7g/L牛肉膏、

5-7g/L酵 母 膏、18-22g/L蛋 白 胨、4.3-6.5g/L KH2PO4、13-15g/L NaCl、17.5-20.3g/L K2HPO4·3H2O、3-5g葡萄糖；所述菌体保护液含有19-22g/L BSA、1.8-2.2M蔗糖、25％(体积百分含量)4×PAB培养液，50％(体积百分含量)2×SMM培养液，所述2×SMM培养液含有

3.8-5.0g/L马来酸、7.5-9.0g/L MgCl2·6H2O，1.8-2.2M蔗糖，pH6.2-6.8；

所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述电穿孔法为在25μF电容，400Ω电阻，0.3-0.5kV电击电转液中的枯草芽孢杆菌原生质体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述电穿孔法为在25μF电容，400Ω电阻，0.6-0.8kV电击电转液中的地衣芽孢杆菌原生质体。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述电转液含有19-22g/L BSA、

1.8-2.2M蔗糖、47％-55％(体积百分含量)2×SMM培养液、20-28％(体积百分含量)4×PAB培养液。

说明书

一种转化芽孢杆菌的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种转化芽孢杆菌的方法。

背景技术

[0002] 芽孢杆菌作为一个属，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。目前人们对芽孢杆菌的研究几乎涉及到了革兰氏阳性可生孢细菌的各个领域。尤其是在感受态、芽孢形成及其调控、遗传操作、菌种改良、生物技术等领域进行了大量的工作。科学研究中应用最多的当属枯草芽孢杆菌。

[0003] 枯草芽孢杆菌能发展成为芽孢杆菌中的第一个基因工程表达系统是与其早期的遗传学工作密切相关的。Spizizen于1958年发现枯草芽孢杆菌168菌株为可转化菌株以来，枯草芽孢杆菌的遗传学工作不断深入和发展。美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心(BGSC，http://www.bgsc.org)至1999年保藏的168菌株的遗传突变株就有890个。它牵涉到了诸多营养要求、各种酶、芽孢形成和发芽、感受态、Sigma因子、DNA重组与修复以及正负调控等各方面基因的突变体。70年代发明了DNA重组技术以后，特别是发现金黄色葡萄球菌的带有抗性标志的质粒可作为枯草芽孢杆菌的载体以后，克服了枯草芽孢杆菌只有隐秘性质粒的困难，枯草芽孢杆菌基因工程的工作更是加速发展。迄今，已经在枯草芽孢杆菌及其近缘种中克隆和表达了大量的原核和真核基因，其中有的已应用于工业化生产，取得了不少成绩。将携有外源基因载体导入宿主细菌中是细菌基因工程表达系统的必要条件。大肠杆菌的氯化钙转化法对枯草芽孢杆菌无效，所以枯草芽孢杆菌基因工程表达系统中的宿主菌株用的最广泛的就是在DNA重组技术发明之前就可以进行感受态转化(Spizizen 1958)的168菌株及其突变体。Spizizen感受态转化的基本原理：是细胞在Spizizen最低盐培养基中形成一段饥饿、易于摄取外源DNA片段的时期。一般步骤是先将其在较为丰富的培养基中培养，然后转接到贫瘠的培养基中，使其形成感受态(一般非常短暂)。

[0004] 以枯草芽孢杆菌感受态细胞为宿主进行转化的转化效率很低。

[0005] 细胞电穿孔具有普遍性，可用于动物、植物和微生物等各类细胞，且效率高、无残余毒性、参数容易控制。但一般电转化是将质粒直接导入宿主细胞。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种转化芽孢杆菌方法。

[0007] 本发明所提供的芽孢杆菌转化方法是以芽孢杆菌原生质体为转化受体，用电穿孔法将DNA分子导入芽孢杆菌原生质体中。

[0008] 其中，芽孢杆菌原生质体可以用现有的多种方法获得。所述芽孢杆菌原生质体具体可按照如下方法制备的：芽孢杆菌在PAB培养液培养，收集所述芽孢杆菌，用菌体保护液重悬，然后加入溶菌酶获得芽孢杆菌原生质体；所述PAB培养液为25％(体积百分含量)4×PAB培养液，所述4×PAB培养液由如下物质组成：5-7g/L牛肉膏、5-7g/L酵母膏、18-22g/L蛋 白 胨、4.3-6.5g/L KH2PO4、13-15g/L NaCl、17.5-20.3g/LK2HPO4·3H2O、3-5g葡萄糖；所述菌体保护液由如下物质组成：19-22g/L BSA、1.8-2.2M蔗糖、25％(体积百分含量)4×PAB培养液，50％(体积百分含量)2×SMM培养液，所述2×SMM培养液含有
3.8-5.0g/L马来酸、7.5-9.0g/L MgCl2·6H2O，1.8-2.2M蔗糖，pH6.2-6.8。

[0009] 所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。所述电穿孔法为在25μF电容，400Ω电阻，0.3-0.5kV电击电转液中的枯草芽孢杆菌原生质体。或者，所述电穿孔法为在
25μF电容，400Ω电阻，0.6-0.8kV电击电转液中的地衣芽孢杆菌原生质体。

[0010] 所述电转液由如下物质组成：19-22g/L BSA、1.8-2.2M蔗糖、47％-55％(体积百分含量)2×SMM培养液、20-28％(体积百分含量)4×PAB培养液。

[0011] 本发明的芽孢杆菌转化方法以枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌原生质体为受体，将重组质粒导入枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌中，转化效率达到60％，对枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌基因工程表达系统具有重要的意义。另外，地衣芽孢杆菌的转化在一般情况下是很难进行的，本发明的芽孢杆菌转化方法对于地衣芽孢杆菌的转化也是很有效的。

具体实施方式

[0012] 实施例1、枯草芽孢杆菌转化

[0013] 一、枯草芽孢杆菌原生质体的制备

[0014] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CICC 10157(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于PAB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日按照2.5ml/100ml转接入新鲜的PAB培养液中培养4小时，至对数生长前期。5000rpm离心10分钟收集菌体，用菌体保护液重悬，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyme，code0663)使其终浓度为10mg/mL，37℃，摇床培养60分钟，即形成原生质体。

[0015] PAB培养液：100ml 4×PAB培养液加入300ml灭菌水。

[0016] 4×PAB培养液由如下物质组成：6g牛肉膏、6g酵母膏、20g蛋白胨、5.5g KH2PO4、14g NaCl、19.5g K2HPO4·3H2O和4g葡萄糖。

[0017] 所述菌体保护液由如下物质组成：20g/L BSA、2M蔗糖、25％(体积百分含量)4×PAB培养液，50％(体积百分含量)2×SMM培养液。

[0018] 2×SMM培养液：4.6g/L马来酸、8.1g/L MgCl2·6H2O，2M蔗糖，pH6.5。

[0019] 二、枯草芽孢杆菌以原生质体为受体转化

[0020] 当95％的细胞变成原生质体时，4℃，6000rpm离心5分钟后，用预冷的电转液(20g/L BSA、1M蔗糖、50％(体积百分含量)2×SMM培养液、25％(体积百分含量)4×PAB8
培养液)洗两次，之后用500ul电转液重悬原生质体，使原生质体浓度为10cfu/mL；将原生质体以每管120μL分装，加入0.3μg pBCJ164.3(购自美国俄亥俄州立大学菌种保存中心，Bacillus Genetic Stock Center(BGSC)The Ohio StateUniversity)后冰置上5分钟；然后转移至预冷的电击杯中，设置25μF电容，400Ω电阻，以不同电压(0.1、0.2、0.3、
0.4、0.5、0.6、0.7或0.8kv)电击一次；电击后立即加入1mL电转液，转移至EP管中，37℃，
100rpm摇床培养12小时；然后涂于含氯霉素4.0μg/ml DM3培养基上筛选。实验重复3次。结果如表1所示。

[0021] DM3培养基由如下物质组成：8g/L琼脂、5g/L水解酪蛋白、5g/L酵母粉、1.5g/LKH2PO4、3.5g/L K2HPO4、45.5g/L山梨醇、10g/L淀粉、5g/L葡萄糖；0.09g/L BSA和0.02M MgCl2。

[0022] 表1.DM3培养基上筛选的阳性克隆

[0023]电压kv 平板A菌落数(个) 平板B菌落数(个) 平板C菌落数(个)
0.1 无 无 无
0.2 2 5 3
0.3 30 35 38
0.4 33 40 30
0.5 37 40 36
0.6 11 9 13
0.7 5 无 无
0.8 无 2 5

[0024] 实施例2、枯草芽孢杆菌转化

[0025] 一、枯草芽孢杆菌原生质体的制备

[0026] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)210 CICC 11210(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于PAB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日按照2.5ml/100ml转接入新鲜的PAB培养液中培养4小时，至对数生长前期。5000rpm离心10分钟收集菌体，用菌体保护液重悬，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyme，code0663)使其终浓度为10mg/mL，37℃，摇床培养60分钟，即形成原生质体。

[0027] PAB培养液：100ml 4×PAB培养液加入300ml灭菌水。

[0028] 4×PAB培养液由如下物质组成：5g牛肉膏、5g酵母膏、18g蛋白胨、4.3g KH2PO4、13g NaCl、17.5g K2HPO4·3H2O和3g葡萄糖。

[0029] 菌体保护液：19g/L BSA、1.8M蔗糖、25％(体积百分含量)4×PAB培养液，50％(体积百分含量)2×SMM培养液。

[0030] 2×SMM培养液：3.8g/L马来酸、7.5g/L MgCl2·6H2O，1.8M蔗糖，pH6.2。

[0031] 二、枯草芽孢杆菌以原生质体为受体转化

[0032] 当95％的细胞变成原生质体时，4℃，6000rpm离心5分钟后，用预冷的电转液[19g/LBSA、1.8M蔗糖、47％(体积百分含量)2×SMM培养液、20％(体积百分含量)4×PAB8
培养液]洗两次，之后用500ul电转液重悬原生质体，使原生质体浓度为10cfu/mL；将原生质体以每管120μL分装，加入0.5μg pBCJ164.3。后冰置上5分钟；然后转移至预冷的电击杯中，设置25μF电容，400Ω电阻，以0.3kv电击一次；电击后立即加入1mL电转液，转移至EP管中，37℃，100rpm摇床培养12小时；然后涂于氯霉素4.0μg/ml DM3培养基上筛选。实验重复3次。

[0033] DM3培养基上筛选后，平板上的菌落数为40个。

[0034] 实施例3、枯草芽孢杆菌转化

[0035] 一、枯草芽孢杆菌原生质体的制备

[0036] 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 074(BF-7658)，CICC 10074(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于PAB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日按照2.5ml/100ml转接如新鲜的PAB培养液中培养4小时，至对数生长前期。5000rpm离心10分钟收集菌体，用菌体保护液重悬，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyme，code0663)使其终浓度为10mg/mL，37℃，摇床培养60分钟，即形成原生质体。

[0037] PAB培养液：100ml 4×PAB培养液加入300ml灭菌水。

[0038] 4×PAB培养液由如下物质组成：7g/L牛肉膏、7g/L酵母膏、22g/L蛋白胨、6.5g/LKH2PO4、15g/L NaCl、20.3g/L K2HPO4·3H2O、5g葡萄糖。

[0039] 菌体保护液由如下物质组成：22g/L BSA、2.2M蔗糖、25％(体积百分含量)4×PAB培养液，50％(体积百分含量)2×SMM培养液。

[0040] 2×SMM培养液：5.0g/L马来酸、9.0g/L MgCl2·6H2O、2.2M蔗糖，pH6.8。

[0041] 二、枯草芽孢杆菌以原生质体为受体转化

[0042] 当95％的细胞变成原生质体时，4℃，6000rpm离心5分钟后，用预冷的电转液(22g/LBSA、2.2M蔗糖、55％(体积百分含量)2×SMM培养液、28％(体积百分含量)4×PAB8
培养液)洗两次，之后用500ul电转液重悬原生质体，使原生质体浓度为10cfu/mL；将原生质体以每管120μL分装，加入1μg pBCJ164.3。后冰置上5分钟；然后转移至预冷的电击杯中，设置25μF电容，400Ω电阻，以0.5kv电击一次；电击后立即加入1mL电转液，转移至EP管中，37℃，100rpm摇床培养12小时；然后涂于氯霉素4.0μg/ml DM3培养基上筛选。实验重复3次。

[0043] DM3培养基上筛选后，平板上的菌落数为30个。

[0044] 实施例4、地衣芽孢杆菌转化

[0045] 一、地衣芽孢杆菌原生质体的制备

[0046] 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CICC 10181(中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于PAB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日按照2.5ml/100ml转接如新鲜的PAB培养液中培养4小时，至对数生长前期。5000rpm离心10分钟收集菌体，用菌体保护液重悬，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyme，code0663)使其终浓度为10mg/mL，37℃，摇床培养60分钟，即形成原生质体。

[0047] PAB培养液：100ml 4×PAB培养液加入300ml灭菌水。

[0048] 4×PAB培养液由如下物质组成：6g牛肉膏、6g酵母膏、20g蛋白胨、5.5g KH2PO4、15g NaCl、17.5g K2HPO4·3H2O和3g葡萄糖。

[0049] 所述菌体保护液由如下物质组成：20g/L BSA、2M蔗糖、25％(体积百分含量)4×PAB培养液，50％(体积百分含量)2×SMM培养液。

[0050] 2×SMM培养液：4.6g/L马来酸、8.1g/L MgCl2·6H2O，2M蔗糖，pH6.5。

[0051] 二、地衣芽孢杆菌以原生质体为受体转化

[0052] 当95％的细胞变成原生质体时，4℃，6000rpm离心5分钟后，用预冷的电转液