用于选择和/或处理粒子，具体地用于选择性地和/或最优化地溶解细胞的方法和装置

摘要

用于选择和处理对施加外部刺激敏感的粒子的方法和装置，其中通过应用外部刺激，产生了至少一个选择的粒子的破裂/溶解或第一和第二选择的粒子的融合，通过利用由对可选择的电极阵列的电极(EL)选择性通电引起的第一力场(FMAN)组织粒子(CELL)，所述电极具有与粒子尺寸相似或更小的尺寸，对所述电极施加第一配置(PMAN)的电压；和对所述电极施加第二配置(PZAP)的电压，从而创建第二力场(FZAP)，所述第二力场位于基本接近至少一个选择的待溶解粒子(CELL)或接近待融合的一对第一和第二粒子，并且以致产生适合于引起它们溶解或融合的刺激的施用。

权利要求

1.用于选择或处理对外部刺激的施加敏感的粒子的方法，所述方法包括通过施加所述外部刺激产生至少一个选择的粒子破裂/溶解的步骤，其特征在于所述方法包括下列步骤：a)使所述粒子(CELL)接近可选择的电极阵列的电极(EL)，所述电极具有与所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，对所述电极施加第一模式(PMAN)的电压，从而通过选择性地为所述电极(EL)通电，依靠第一力场(FMAN)，组织所述粒子(CELL)；

b)对所述电极施加第二模式(PZAP)的电压，从而创建第二力场(FZAP)，所述第二力场基本上位于接近至少一个选择的待溶解粒子(CELL)并且以致对所述至少一个选择的粒子产生适合于引起其破裂或溶解的刺激的施加。

2.按照权利要求1的方法，其特征在于所述刺激由流体的局部加热组成，在所述流体中浸没所述至少一个选择的待溶解粒子。

3.按照权利要求2的方法，其特征在于所述第二模式(PZAP)的电压使得通过所述电极阵列中那些选择的电极的焦耳作用，产生选择性加热，利用所述电极产生所述第二力场(FZAP)。

4.按照权利要求3的方法，其特征在于以AC或DC方式无区别地产生所述第二电压模式。

5.按照权利要求1的方法，其特征在于用于产生所述第一力场(FMAN)的第一模式(PMAN)的电压表现出第一振幅(MA)和第一频率(MF)；并且其中用于产生所述第二力场(FZAP)的所述第二模式(PZAP)的电压表现出第二振幅(ZA)和第二频率(ZF)，至少其中之一与所述第一振幅(MA)和第一频率(MF)不同。

6.按照权利要求5的方法，其特征在于所述刺激由力组成，所述力能够通过所述第二力场(FZAP)施加到所述至少一个选择的粒子；所述第二电压模式以AC方式产生。

7.按照权利要求6的方法，其中所述至少一个选择的粒子是具有可溶解的膜的生物实体，其中所述刺激由下列所组成：使所述至少一个选择的粒子的跨膜电位达到引起所述膜破裂的数值。

8.按照权利要求7的方法，其中所述生物实体是细胞。

9.按照以上权利要求中任一项的方法，其特征在于所述方法包括检查所述至少一个选择的粒子溶解的步骤。

10.按照权利要求9的方法，其中检查所述溶解的步骤通过在单芯片中与所述电极阵列集成的传感器而进行。

11.按照权利要求1-8中任一项的方法，其中将所述粒子悬浮在流体中，其特征在于所述方法在步骤b)后，还包括下列步骤：c)对所述电极施加所述第一模式(PMAN)的电压；和

d)当进行步骤c)时，引起所述流体的缓慢且受控的移动，从而回收所述至少一个选择的粒子的溶解的选择的产物。

12.按照权利要求1-8中任一项的方法，其中将所述粒子悬浮在流体中，其特征在于以表现出相对低的电导率的方式选择所述流体。

13.用于从包括目的粒子的粒子群中分离所述目的粒子的方法，其特征在于所述方法包括下列步骤：a)将流体中悬浮的所述粒子群引入微室，并使所述粒子(CELL)接近所述微室中提供的可选择的电极阵列的电极(EL)，所述电极具有与所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，对所述电极施加第一模式(PMAN)的电压，从而通过选择性地为所述电极(EL)通电，依靠第一力场(FMAN)，组织所述粒子(CELL)；

b)对所述电极施加第二模式(PZAP)的电压，从而创建第二力场(FZAP)，所述第二力场基本上接近除目的粒子外所述粒子群中的全部粒子，并且以致对所述粒子群的全部粒子施加适合于引起除所述目的粒子外全部粒子的选择性溶解的相同刺激；

c)回收所述目的粒子。

14.按照权利要求13的方法，其特征在于通过对所述电极施加多种电压模式，对所述粒子群的全部粒子同时和/或重复地应用步骤b)，所述多种电压模式适合于对所述粒子施加一定强度和/或类型的刺激，以致引起除所述目的粒子外的所述粒子群中全部粒子的选择性溶解。

15.用于从污染的粒子中超-纯化目的粒子的方法，所述两种粒子均存在于粒子群中，其特征在于：应用了按照权利要求13或14的分离方法，其中仅对所述污染的粒子应用步骤b)。

16.用于分析粒子的方法，其特征在于所述方法包括下列步骤：

a)将流体中悬浮的所述粒子引入到微室中；

b)选择性地移动所述粒子，将每一个移动到预先确定的分析点中，所述分析点与所述微室分开但水力连接到所述微室；

c)对所述预先确定的分析点中存在的所述粒子应用按照权利要求1-10中任一项的方法；

d)对所述粒子溶解的各个碎片现场应用限定的分析方案。

17.按照权利要求16的方法，其中所述限定的分析方案选自包括下列的组：PCR、芯片上的毛细管电泳；它们的组合。

18.用于引起第一粒子与第二粒子融合的方法，其中所述第一和第二粒子是具有可溶解的膜的生物实体，并且其中所述粒子的膜对外部刺激的施加敏感，其特征在于所述方法包括下列步骤：a)使所述粒子(CELL)接近可选择的电极阵列的电极(EL)，所述电极具有与所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，对所述电极施加第一模式(PMAN)的电压，从而通过选择性地为所述电极(EL)通电，依靠第一力场(FMAN)，组织所述粒子(CELL)；

b)对所述电极施加第二模式(PZAP)的电压，从而产生第二力场(FZAP)，所述第二力场基本上接近将融合在一起的至少一个第一和一个第二选择的粒子(CELL)，并且以致对所述粒子产生刺激的施加，所述刺激适合于产生所述第一和第二选择的粒子膜的融合。

19.权利要求18的方法，其中所述生物实体是细胞或微生物。

20.用于选择和处理粒子的装置，所述装置包括至少一个第一微室，所述第一微室适合于容纳流体中悬浮的所述粒子，并且提供可选择的和可寻址的电极阵列，所述电极具有与所述粒子的尺寸基本相似或更小的尺寸，并且适合于产生与对所述电极施加第一模式(PMAN)电压所对应的第一力场(FMAN)；其特征在于所述装置还包括多个第二微室，每个所述第二微室具有与所述粒子尺寸相似但更大的尺寸，并提供至少一个适合于被选择性激活和选择的电极，并且通过将第二模式(PZAP)的电压施加到所述至少一个电极用于产生第二力场(FZAP)，所述第二力场位于基本上接近所述第二微室的所述至少一个电极；其中所述第二微室以这样的方式水力连接到所述一个第一微室，以便适合于通过各个具有这样配置的通道接收所述流体中悬浮的至少一个选择的所述粒子中的每一个，所述配置防止或至少基本减缓所述至少一个第一微室和所述第二微室之间以及所述第二微室自身之间的任何扩散现象。

21.按照权利要求20的装置，其特征在于至少一些所述第二微室连接到用于芯片上毛细管电泳的通道。

22.按照权利要求21的装置，其中至少一些所述第二微室通过交叉连接连接到用于芯片上毛细管电泳的通道。

23.按照权利要求21的装置，其特征在于在所述用于芯片上毛细管电泳的通道末端存在至少一个光学或阻抗计(impedenziometric)传感器。

24.按照权利要求20的装置，其特征在于至少一些所述第二微室通过所述第二微室的各个流体出口连接到用于电泳的毛细管。

说明书

用于选择和/或处理粒子，具体地用于选择性地和/或最优

化地溶解细胞的方法和装置

技术领域

[0001] 本发明涉及用于选择和/或处理粒子，特别是由细胞组成或包括细胞和/或细胞物质的粒子的方法和装置，例如用于选择性地和/或最优化地溶解细胞的方法和装置，并且主要应用于执行具有单细胞拆分的方案。术语细胞的“处理”在此和以下意指能够对单粒子或细胞，或对它们的组进行的任何类型的操作。现有技术

[0002] 授予G.Medoro的专利PCT/WO 00/69565描述了通过利用介电泳电 位(dielectrophoretic potential)和可能的集成传感器的封闭栅格(cages)对粒子进行操纵和鉴别/识别的装置和方法。所述方法教导如何在两维空间中控制独立于全部其它粒子的每一粒子。用来捕获悬浮在流体介质中的粒子的力是负的介电泳。通过与集成在相同衬底中的电极阵列和传感器的每一元件有关的存储器元件和电路的编程，实现对操纵操作的单独控制。该装置容许分离细胞，但需要使它们向着第二微室移动，与第一个细胞流体地分离。而且，没有预期用于转化细胞的方法。

[0003] 授予Becker等的美国专利6,294,063描述了一种方法和装置，其通过可编程的力的分配来操纵固态、液态或气态生物学材料的包装。该专利也提及传感器的使用。在该情形中，细胞的分离也可以仅通过使细胞物理地移动经过整个装置而发生。 [0004] 操纵粒子的又一种力是由电流体动力学流(EHD)产生的粘滞摩擦力，例如电热流(ETF)或AC电渗透。在NG.Green，A.Ramos和H.Morgan，物理学杂志D：应用物理学(J.Phys.D：Appl.Phys.)33(2000)中，EHD用来移动粒子。例如PCT WO 2004/071668A1描述一种利用上述电流体动力学 流将粒子浓缩在电极上的装置。

[0005] 在Medoro等的意大利专利申请BO2005A000481中，列出了一些用电极阵列操纵粒子的方法，以及鉴别它们的方法和装置。

[0006] 替代地，国际专利申请PCT/IT02/00524描述了一种方法，其中，通过使第一生物实体与第二生物实体(例如，含有DNA的脂质体、或微珠)相接触，而转化第一生物实体，其中，将第一生物实体固定在第一电极阵列所限定的表面上，所述电极可以至少部分被选择性激活和控制，朝向至少一个第二电极放置，并且与借助于介电泳栅格移动的第二生物实体接触。

[0007] 相同申请人名下的专利申请PCT IB 2006000636涉及利用非均匀时变力场和集成光学或阻抗计传感器(impedenziometric sensor)对粒子进行表征和/或计数的方法和装置。力场可以具有正的或负的介电泳、电泳或电流体动力学运动，其特征在于粒子(固态、液态或气态)的一组稳定平衡点；利用已知的效应，诸如电介质上的电润湿，同样的方法可适用于操纵小滴(液态粒子)，其目的是对存在于样本中的每一粒子的位置起控制作用，以便以确定性和统计学方法使这些粒子移动，用集成光学或阻抗计传感器检测它们的存在，和/或表征它们的类型，从而以有效的方法对它们进行计数和操纵。

[0008] 在相同申请人名下的2006年3月27日的意大利申请号TO2006A000226中，描述了用于处理(例如洗涤、培养、等)粒子的方法和装置，其中，在层流条件下，将悬浮在第一流体中的粒子引入到至少一个第一微室或该微室的第一区域中，其中通过不与第一流体相混合的方式，在层流条件下，将第二流体引入到微室或第二微室的至少一个第二区域中，并且其中在该微室中激活作用于粒子上的至少一个力场(F)，从而引起粒子仅在预定的方向上移动，并转移第二流体中的悬浮中的该粒子；优选使用的装置包括以一个方向彼此顺次排列的至少三个微室，并且每个微室均与它前面和后面紧挨着的微室连接，具有处于与微室序列方向垂直的方向上的彼此偏移的两个开口。

[0009] 近期，在文章“单细胞电穿孔芯片(A single cell electroporation chip)，芯片上的实验室(Lab on a Chip)，2005，5(1)，38-43，Michelle Khine， Adrian Lau，Cristian Ionescu-Zanetti，Jeonggi Seo和Luke P.Lee”中，描述了如何通过在单细胞上进行的电穿孔增加细胞膜的渗透性；通过这种方法，可以将以别的方式不能渗透过原生质膜的极性物质(诸如染料、药物、DNA、蛋白质、肽和氨基酸)引入到细胞中。

[0010] 文章“用于高效的单细胞遗传操纵的流经微-电穿孔芯片(Flow-through micro-electroporation chip for high efficiency single-cell genetic manipulation)，传感器和执行器A：物理的(Sensors and Actuators A：Physical)，卷104，刊3，2003年5月15日，Yong Huang，Boris Rubinsky”具体描述了各个细胞的遗传操纵，这在诸如生物学和生物工艺学中非常令人感兴趣，所述细胞是通过利用微-流体通道精确操纵单细胞的电穿孔芯片获得的；如已知地，电穿孔是使用强电场诱导细胞膜中结构重排的工艺；由于当跨膜电位超过膜的介电穿孔电压(0.2-1.5V)时，穿膜形成孔，这容许外部物质渗入膜并到达其包含的细胞质。

[0011] 单细胞的电穿孔是有趣的技术，还因为它容许逐个细胞地研究发生在细胞群中的变化，并还研究细胞内化学，例如，通过激活或阻断特异的和个别的蛋白质的表达而为各个细胞提供特异性表型。因此，利用基于使用装备在芯片上的阵列的工艺，可以产生用于HTS检验(高通量筛选)的装置，其与DNA和蛋白质的表达以及指向特异性细胞靶标(例如受体)的化学化合物(例如药物)均相关。

[0012] 单细胞电穿孔与通常使用的大量电穿孔方案相比，也是有利的技术，所述大量电穿孔方案需要非常高的电压(＞103V)，并不容许有效地控制各个细胞渗透性，因此，例如，很难重新关闭预先张开的孔。

[0013] 迄今为了获得单细胞电穿孔而作出的努力在将碳纤维微电极(Lundqvist等，1998)用于其它技术诸如充满电解质的毛细管、微吸移管、和显微加工芯片中的范围内。 [0014] 显微加工装置对分离单细胞和集中电场均是理想的。

[0015] 最后，文章“利用介电泳力控制细胞破裂”(“Controlling cell destruction using dielectrophoretic forces”)，A.Menachery和R.Pethig，IEE学报-纳米生物技术(IEE Proc.-Nanobiotechnol.)，卷152，第4期，2005年8月，报告了对齿形或多项式电极中不同类型的细胞进行的细胞溶解研究， 并且提出了混合物中存在的不同类型细胞区别性溶解(选择频率和幅度，诸如溶解一种类型而保存另一种)。

[0016] 然而，由于电极比细胞大得多，所以没有提议使用该方法，并且在不考虑其类型的条件下，可能不可以使用该方法选择性破坏单细胞。事实上，由于关于相对大的电极(和因此对它们起作用的场的强度)的位置显著变化，所以该方法不能均匀地作用于不同的细胞上。

[0017] 优选地，利用处于跨越频率(超过该频率细胞从负的介电泳(nDEP)到达正的(pDEP))间的频率间隔中，和低于这样的频率的场诱导溶解，超过所述频率，膜电位会由于超过膜松弛常数而削弱。

[0018] 发明概述

[0019] 本发明的目的是提供用于对包含粒子典型地是细胞的流体样品进行操作的方法，用于进行单细胞的纯化和/或分离和/或一个或多个细胞的转化的方法，所述方法没有关于现有技术所述的局限性和/或麻烦。

[0020] 具体地，本发明的目的是在样品中存在的每个粒子的位置控制上起作用，从而以确定的方式移动所述粒子，从而选择性地对每个细胞进行操作和/或以更有效的方式，诸如溶解、融合、等进行操作。

[0021] 在此和以下，复数的“粒子”或单数的“粒子”术语意指微米或纳米实体，天然的或人造的，如细胞、亚细胞组分、病毒、脂质体、泡囊(niosomes)。有时，将使用术语细胞，但除非另有说明，必须理解为是以上述更充分描述的方式使用“粒子”的非限制性示例。 [0022] 因此本发明涉及用于选择或处理对外部刺激的施加敏感的粒子的方法，所述方法包括通过施加所述外部刺激产生至少一个选择的粒子破裂/溶解的步骤，其特征在于所述方法包括下列步骤：

[0023] a)使所述粒子(CELL)接近可选择的电极阵列的电极(EL)，所述电极具有与所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，可以对所述电极施加第一模式(PMAN)的电压，从而任选地，如果需要，通过选择性地为所述电极(EL)通电，依靠第一力场(FMAN)，组织所述粒子(CELL)；

[0024] b)对所述电极施加第二模式(PZAP)的电压，从而创建第二力场(FZAP)，所述第二力场基本上位于接近至少一个选择的待溶解粒子 (CELL)并且以致对所述至少一个选择的粒子产生适合于引起其破裂或溶解的刺激的施加。

[0025] 本发明还涉及用于从包括目的粒子的粒子群中分离所述目的粒子的方法，其特征在于所述方法包括下列步骤：

[0026] a)将流体中悬浮的所述粒子群引入微室，并使所述粒子(CELL)接近所述微室中提供的可选择的电极阵列的电极(EL)，所述电极具有与所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，可以对所述电极施加第一模式(PMAN)的电压，从而任选地，如果需要，通过选择性地为所述电极(EL)通电，依靠第一力场(FMAN)，组织所述粒子(CELL)；

[0027] b)对所述电极施加第二模式(PZAP)的电压，从而创建第二力场(FZAP)，所述第二力场基本上接近除目的粒子外所述粒子群中的全部粒子，并且以致对所述粒子群的全部粒子施加适合于引起除所述目的粒子外全部粒子的选择性溶解的相同刺激； [0028] c)回收所述目的粒子。

[0029] 在本发明的上述用于从包括目的粒子的粒子群中分离所述目的粒子的方法中，通过对所述电极施加多种电压模式，对所述粒子群的全部粒子同时和/或重复地应用步骤b)，所述多种电压模式适合于对所述粒子施加一定强度和/或类型的刺激，以致引起除所述目的粒子外的所述粒子群中全部粒子的选择性溶解。

[0030] 本发明还涉及用于从污染的粒子中超-纯化目的粒子的方法，所述两种粒子均存在于粒子群中，其特征在于：应用了上述的分离方法，其中仅对所述污染的粒子应用步骤b)。

[0031] 本发明还涉及用于引起第一粒子与第二粒子融合的方法，其中所述第一和第二粒子是具有可溶解的膜的生物实体，并且其中所述粒子的膜对外部刺激的施加敏感，其特征在于所述方法包括下列步骤：

[0032] a)使所述粒子(CELL)接近可选择的电极阵列的电极(EL)，所述电极具有与所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，对所述电极施加第一模式(PMAN)的电压，从而通过选择性地为所述电极(EL)通电，依靠第一力场(FMAN)，组织所述粒子(CELL)；

[0033] b)对所述电极施加第二模式(PZAP)的电压，从而产生第二力场 (FZAP)，所述第二力场基本上接近将融合在一起的至少一个第一和一个第二选择的粒子(CELL)，并且以致对所述粒子产生刺激的施加，所述刺激适合于产生所述第一和第二选择的粒子膜的融合。 [0034] 本发明还涉及用于选择和处理粒子的装置，所述装置包括至少一个第一微室，所述第一微室适合于容纳流体中悬浮的所述粒子，并且提供可选择的和可寻址的电极阵列，所述电极具有与所述粒子的尺寸基本相似或更小的尺寸，并且适合于产生与对所述电极施加第一模式(PMAN)电压所对应的第一力场(FMAN)；其特征在于所述装置还包括多个第二微室，每个所述第二微室具有与所述粒子尺寸相似但更大的尺寸，并提供至少一个适合于被选择性激活和选择的电极，并且通过将第二模式(PZAP)的电压施加到所述至少一个电极用于产生第二力场(FZAP)，所述第二力场位于基本上接近所述第二微室的所述至少一个电极；其中所述第二微室以这样的方式水力连接到所述一个第一微室，以便适合于通过各个具有这样配置的通道接收所述流体中悬浮的至少一个选择的所述粒子中的每一个，所述配置防止或至少基本减缓所述至少一个第一微室和所述第二微室之间以及所述第二微室自身之间的任何扩散现象。

[0035] 具体地，利用非均匀、时变力场和集成光学传感器。力场可以具有正的或负的介电泳、电泳或电流体动力学运动，其特征在于关于粒子的一组稳定平衡点。 [0036] 这样，现有技术的局限性可通过本发明予以克服。

[0037] 按照本发明的方法的实现容许甚至从以低百分比存在的污染物精确地纯化细胞样品。它还容许通过引入遗传物质而有效地和选择性地转化细胞。最后，它容许从多相样品中快速分离一些目的细胞。

[0038] 通过参考附图中的图，从下列对本发明的非限制性实施方案的一些的描述中，本发明的其它特点和优点将是清楚的。

[0039] 附图简述

[0040] 图1示意性地说明了按照本发明的第一个方法的步骤，所述本发明是以正视图形式的截面中所示的操纵装置中进行的；

[0041] 图2显示了利用与图1中相同的装置进行图1中方法的步骤，但是以 俯视的布局图所图解；

[0042] 图3以与图2相同的视图显示了图1和2中方法的可能变化；

[0043] 图4用相片序列显示了图1中方法的启动；

[0044] 图5以与图2相同的视图显示了图1中方法的另一种变化；

[0045] 图6以与图2相同的视图显示了按照本发明的另一种操纵粒子的方法；和 [0046] 图7-9显示了特别有利地启动本发明方法的装置的不同实施方案。发明详述 [0047] 本发明的目的是实现用于操纵和/或分离和/或分析粒子的方法和装置。 [0048] 本发明的方法是基于(图1)非均匀力场(F)的使用，在其作用下将单个粒子或粒子组(CELL)吸引到稳定平衡位置(CAGE)。该场可以是例如负的(NDEP)或正的(PDEP)介电泳场(DEP)，或电流体动力学运动场(EHD)。

[0049] 对细胞进行的处理基于能够引起细胞膜永久破裂或两个粒子融合的局部化电场的施加。

[0050] 该方法还可以使用集成传感器，优选地，使用光学和/或阻抗计类型，例如在需要检查接近特定电极的粒子类型的全部那些步骤中。备选地，借助于与显微镜相连的非集成光学传感器可以获得类似的信息，这容许检查实现本发明方法的微室的内容物。 [0051] 力的产生

[0052] 根据现有技术，存在通过形成在衬底上的电极(EL)阵列用于产生移动粒子的力的不同方法。典型地，按照相同申请人以前的专利(图1)，使用覆盖物(LID)，它可以又是电极，它限定这样的微室，其中粒子(CELL)典型地悬浮在由液体组成的流体中。在介电泳(DED)的情况下，施加的电压以加号(+)标示的是周期同相电压(Vphip)，以减号(-)标示的是反相电压(Vphin)。术语“反相电压”意指电压偏离180°。这个场产生作用于空间区域(CAGE)的粒子的力，从而将它们吸引到平衡点(PEQ)。 在负的DEP(NDEP)的情况下，根据已有技术，如果覆盖物(LID)是导电的电极，可以产生封闭的力栅格；在这种情况下，稳定平衡点(MPEQ)对应于每一个与Vphin(-)相连的电极，其条件是如果相邻电极与反相的Vphip(+)相连并且如果覆盖物(LID)与同相的Vphin(-)相连。这个平衡点(MPEQ)通常在液体中相对于电极在一定距离，因此，粒子(CELL)以静态悬浮。

[0053] 在正的DEP(PDEP)的情况下，平衡点(ZPEQ)通常位于实现电极的表面上，并且粒子(CELL)以静态与其接触。关于PDEP，在覆盖物中不必须具有其它电极，因为PDEP的平衡点对应于电场的极大值。关于电流体动力学运动(EHD)，电极的配置产生流动，其推动粒子趋向最小的流动点。

[0054] 为了简便起见，纯粹认为以下是实施例，并且因此没有限制本发明的目的，使用具有负的介电泳的封闭栅格作为本发明的方法和装置描述中粒子运动步骤的激活力(为此需要使用起电极作用的覆盖物)。对于本领域的普通技术人员来说，明显的是，可以概括下述用于不同激活力和不同类型粒子的方法和装置。

[0055] 用于选择性溶解粒子的方法

[0056] 通过上述启动力的一种将待溶解的粒子在接近两电极间的间隙定位，对该电极用第一振幅(MA)和频率(MF)的正弦电压通电。该间隙优选地小于10μm，且典型地，大约1-3μm，因此，与集成电路提供的电压(例如，2.5、3.3或5V)相当的低电压刺激足够确定足以引起粒子不可逆破裂的跨膜电位。

[0057] 该刺激优选地由第二振幅(ZA)和第二频率(ZF)的一连串正弦脉冲组成。 [0058] 将电脉冲施加到两个选择的电极之间，从而引起细胞的溶解。

[0059] 图1按照本发明优选的实施方案，在截面图中显示了力场和对电极应用的电压“模式”(即电极(+)或(-)状态配置的复合体)随时间推移的发展。图1(a)中，细胞(CELL)处于nDEP，悬浮在处于第一平衡点(MPEQ)的液体中。在图1(b)中，施加到电极(EL)的电压模式改变， 因此施加的电压的频率和任选地，振幅，以及细胞受到的力改变为pDEP(FZAP)。然而，由于电压模式的改变，只有待溶解的细胞(CELLZ)受到显著的力，因此，吸引该细胞趋向新的稳定平衡点(ZPEQ)。在该点附近，电场最大，且所述频率引起溶解细胞的充分的跨膜电位。

[0060] 图2显示了与图1相同步骤(a)-(d)的电极配置布局图，其中，通过颜色表示具有施加到盖子的电压的同相和反相电极模式(同相灰色，反相白色)。

[0061] 该模式的序列是特别有利的，因为，在溶解过程中，附近区域中的其它细胞由于覆盖物和电极均处于同相而受到几乎零电场的作用。如果施加到覆盖物的电压振幅等于施加到电极的电压振幅，则那些细胞上的场为零。

[0062] 备选地，可以采用图3(a)-3(d)中显示的模式系列。在这种情况中，如由白色和灰色代表的同相和反相电极数量所显示地，其优势在于每次需要重新编程较少量的电极，如果为待启动的电极模式书写记忆细胞的过程很缓慢，则这可以是有利的。否则，采用之前图2中的方案通常是优选的。

[0063] 用限定微室底表面的电极阵列中集成的传感器，例如光学类型的，利用上述相同申请人的国际专利申请PCT IB 2006000636中所述的方法，将容易地检查何时发生溶解，从而观察与溶解的细胞相对应的栅格仍然是满的还是空的，或者更好地检查由溶解产生的碎片的存在。

[0064] 基本地，用所述方法，可以选择或处理对施加外部刺激灵敏的粒子，这是利用通常包括通过施加所述外部刺激产生至少一种选择的粒子的破裂或溶解步骤的方法实现的；且其中还预期了下列步骤：

[0065] a)使粒子(CELL)接近可选择的电极阵列的电极(EL)，所述电极具有与所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，可以对其施加第一模式(PMAN)的电压，从而任选地，如果需要，通过选择性地为所述电极通电，依靠第一力场(FMAN)，组织所述粒子(CELL)； [0066] b)对所述电极施加第二模式(PZAP)的电压，从而创建第二力场(FZAP)，所述第二力场位于基本接近至少一个选择的待溶解粒子(CELL)并且以致产生对所述至少一个选择的粒子施加适合于引起其破裂或溶解的刺激。

[0067] 如果希望使用从nDEP到pDEP的转变，则将粒子悬浮在选择的流体中，从而显现相对低的电导率。

[0068] 用于产生第一力场(FMAN)的第一模式(PMAN)的电压呈现第一振幅(MA)和第一频率(MF)；且用于产生第二力场(FZAP)的第二电压模式(PZAP)呈现第二振幅(ZA)和第二频率(ZF)，至少其中之一与所述第一振幅(MA)和第一频率(MF)不同。在这种情况中，为了获得细胞溶解所施加的刺激由力组成，所述力可以通过第二力场(FZAP)施加到至少一个选择的粒子，并且第一和第二电压模式均以AC(交流电)形式产生。具体地，所述至少一个选择的粒子是具有可溶解的膜的生物实体，在所述实例中描述为细胞，并且施加的刺激包括使所述至少一个选择的粒子的跨膜电位达到引起膜破裂的数值。

[0069] 按照本发明的方法的可能的变化，可在图2(b)中对其进行考虑说明，为了溶解所述选择的粒子而对其应用的刺激反之亦然地由位于流体中的加热组成，所述流体中悬浮了待溶解的所述选择的粒子。

[0070] 按照该可能的变化，特别有利地是，如果将所述粒子悬浮在呈现高电导率的流体(液体)(例如，生理溶液)中，则第二模式(PZAP)的电压使得通过电极阵列中那些选择的电极的焦耳(Joule)作用，产生选择性加热，在图2(b)中，电极显示为白色，其上，对所示装置提供的完整电流实际上是集中的。

[0071] 在该情况中，明显的是，可以以AC或DC(直流电)形式产生至少第二模式的电压。 [0072] 无论如何，按照本发明所述的方法包括检查至少一个选择的粒子溶解的步骤，优选地，通过已经提及的在单芯片中与电极阵列集成的传感器实现。

[0073] 最后，按照所述方法的另一个可能变化，如果对选择性回收由溶解产生的碎片感兴趣，则在上述步骤b)之后，可以进行下列步骤：

[0074] c)再次对所述电极施加所述第一模式(PMAN)的电压；和

[0075] d)当进行步骤c)时，引起所述流体的缓慢且受控的移动，从而回收溶解至少一个选择的粒子的选择性产物。

[0076] 事实上，如本领域技术人员所熟知地，在通过介电泳启动粒子运动的 情况中，作用于粒子上的力由于施加的场，与粒子半径的立方成比例，而流体动力学粘滞摩擦力仅与粒子半径成比例；因此，最小的粒子(在该具体情况中是溶解的碎片)可以随着悬浮所述粒子的流体的缓和冲洗而被带走，而最大的粒子(非溶解的细胞)被位于静态模式并在其中捕获细胞的nDEP栅格保持在静态位置(逆着粘滞冲洗作用)。

[0077] 图4中显示了所述方法，具体地按照图1和2的方法的功效。参见图4(a)，通过施加的(MA)电场(MF)，对悬浮在具有甘露糖醇280mM(毫摩尔)和KCl 6.25mM的水溶液中的两个Raji细胞进行组织，其中，阵列的电极具有含有3.3V峰-峰振幅的正弦曲线，导电覆盖物(LID)具有振幅6.6V，都具有频率50kHz。将细胞置于具有盖子的同相电极上，所述盖子被反相(偏差180°)电极包围。

[0078] 之后，施加到所述电极的电压模式改变，并且还将右下方细胞上的电极设置为反相，其必须被保持。尽管不存在栅格，但是细胞由于惯性保持在相同的位置。即刻地，施加的电场改变以产生正的介电泳(FZAP)，使电场(ZF)的频率达到400kHz，并且栅格中仍然存在的粒子(CELLZ)由于正的介电泳的力进入新的稳定平衡点，现在由所述场所产生，其在电极之间的间隙上，参见图4(b)。那个区域与电场的最大值对应，所述最大电场在该频率下，足以引起膜溶解，参见图4(c)。

[0079] 对本领域技术人员似乎明显地，可以以不同的方式，具体地还(或仅)在振幅上改变电场，或者可以不同地选择用于操纵和溶解的最初电极模式，例如如图5中所示。 [0080] 在该情况中，从nDEP模式开始，如5(a)，其将粒子定位在平衡点(MPEQ)，所述平衡点(MPEQ)处于与关于下一个电极模式的pDEP平衡点(ZPEQ)垂直。以这种方法，选择的细胞不从其垂直线移动，并且能够加速溶解过程，因为细胞需要更少的时间到达发生溶解的最大电场区域。由介电泳操纵协助的粒子融合方法

[0081] 在该情况中，通过由电极(EL)产生的力(F)，两个粒子在相同的稳定平衡点(MPEQ)中进行接触。选择紧挨着处于接触中的细胞对所施加的刺激具有一定的振幅和频率，以便引起两个细胞膜融合为单一实体(图 6)。

[0082] 用容纳电极阵列的芯片中集成的传感器，例如光学类型的，则可以在不需要外界显微镜的条件下检查融合的发生。

[0083] 融合的应用包括例如生成真核细胞和细菌、或植物的杂种。

[0084] 例如，能够考虑利用类似的方法，例如组合分化的细胞和无核干细胞重新编程分化细胞朝向干细胞。

[0085] 因此，按照该方法，产生了第一粒子与第二粒子的融合，其中所述第一和第二粒子是具有可溶解的膜的生物实体，例如细胞或微生物，并且其中所述粒子的膜对外部刺激的施加是敏感的，进行下列步骤：

[0086] a)使所述第一和第二粒子(CELL)接近可选择的电极阵列的电极(EL)，所述电极具有与所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，可以对其施加第一模式(PMAN)的电压，从而任选地，如果需要，通过选择性地为所述电极通电，依靠第一力场(FMAN)，组织所述第一和第二粒子(CELL)；

[0087] b)对所述电极施加第二模式(PZAP)的电压，从而创建第二力场(FZAP)，所述第二力场位于基本接近将融合在一起的至少一个第一和一个第二选择的粒子，并且以致产生与适合于引起所述第一和第二选择的粒子膜融合的刺激的相同的施加。

[0088] 由活力分离细胞的方法

[0089] 在具有电极阵列的微室中，在悬浮液中冲洗多种细胞。利用集成传感器(例如光学的和/阻抗计的)和/或外部传感器(例如与具有或没有荧光的显微镜相连的光学传感器)，识别了每个平衡点(PEQ)中存在的类型或细胞。然后选择性地将用于溶解的刺激施加到全部非目的细胞，保存邻近的目的细胞的活力。

[0090] 然后将样品洗出，回收目的活细胞和非目的细胞的溶解产物。

[0091] 因此，按照本说明书，进行用于从包括目的粒子的粒子群中分离目的粒子的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

[0092] a)将流体中悬浮的粒子群引入到微室中，其中对所述微室提供了可选择的电极阵列；

[0093] b)对所述粒子群施加上述选择性溶解的方法，从而产生除目的粒子外全部粒子的选择性溶解；

[0094] c)回收所述目的粒子。

[0095] 通过对所述电极施加多种电压模式，对所述粒子群的全部粒子同时和/或重复地应用步骤b)，特别是在这样的情况中，其中通过推理不知道目的粒子相对于电极阵列的位置，且目的粒子具有特性以致仅对确定强度和/或类型的刺激(通过推理也未知)敏感的特征，所述多种电压模式是适合于对所述粒子施加一定强度和/或类型的刺激，从而以该方式，产生选择性溶解所述粒子群中除目的粒子外的全部粒子。

[0096] 不同的类型可以例如包括施加具有确定频率的AC电压，已知所述确定的频率不能溶解目的粒子，但有效地溶解其余粒子。不同的强度可以例如是增长的强度。 [0097] 关于基于目的细胞移动进入第二微室从而进行回收的分离，上述方法表现出下列优势：

[0098] 1.实施的速度

[0099] 细胞在所述启动力(DEP，ETF，EHD)下缓慢移动，并且基于细胞移动进入用于回收的微室从而进行分类因此相对缓慢。反之亦然，完成基于活力的分类操作的时间仅需要一个细胞到达稳定平衡点(PEQ)最近处，和溶解该细胞的时间(大约1秒)，并且不需要将其移动经过整个选择微室。

[0100] 2.不需要冷却系统

[0101] 通过微室亚区的工作，可以连续地溶解待消除的细胞。以这种方式，不需要具有冷却系统，即使为了在具有相对导电的缓冲剂的非常大芯片上工作，因为产生的热量与通电面积成比例，可以将所述面积做到任意小。

[0102] 3.芯片可以具有非常大的尺寸

[0103] 因为不需要同时对完整芯片进行通电，所以相对地减少对不同电极进行刺激的轨道上的电阻降低(resistive drop on the tracks)的问题。首先，用相对导电的缓冲剂，并且用电极间的低间距，所以如果对整个电极阵列 通电，则芯片中轨道中电阻降低和/或盖子导电层上的降低(当使用NDEP栅格进行启动时)是不能忽视的。仅对所述层的一部分进行通电，则待处理的电阻负载是有限的，且减小了轨道中电压的降低。 [0104] 4.还对不能用力场操纵的细胞进行操作

[0105] 如果电极阵列足够密集(具有与细胞相似或更小的尺寸)，从而能够在甚至不预先选择它们的条件下，对细胞进行选择性溶解，则仍能够完成本发明的方法，特别是如果待保留的细胞，其表现出与非目的细胞不同的特征，对于施加到电极的电压的不同频率进行的刺激是敏感的。

[0106] 5.简化微流体包装

[0107] 不需要具有双微室，而单一隔间是足够的，且回收不需要是选择性的，因此，污染与回收流的特征无关。

[0108] 应该将芯片中集成的任何传感器用于

[0109] 1.确定目的粒子。

[0110] 2.检查不需要的细胞的溶解。

[0111] 细胞超纯化方法

[0112] 利用富集技术，通常容易消除以比目的细胞大若干数量级比例存在的细胞(例如，利用密度梯度离心或用磁珠富集，等)。然而，有时难以消除剩余的少量污染细胞(例如以0.1-10％的比例存在)，从而获得100％纯样品。这需要例如如果希望培养目的细胞，但是这些比非目的细胞增殖得慢，所述非目的细胞即使以低百分比存在，然后将会在增殖的下游占多数。

[0113] 如在前述的选择方法中，将细胞引入到微室中，细胞任选地在接近电极(PEQ)的稳定平衡点中排列起来，并且通过用电极溶解它们而消除污染的细胞，显然地，这发生在用合适的集成或外部传感器或基于固有的区别诸如对产生溶解的电极施加的电压频率识别它们之后。

[0114] 也在该情况中，集成的传感器，如果存在，能够任选地用于

[0115] 1.确定目的粒子。

[0116] 2.检查不需要的细胞的溶解。

[0117] 然后回收100％纯细胞，将其从样品中洗出。

[0118] 因此，基于本发明的这个方面，启动了用于从污染的粒子中超纯化目的粒子的方法，所述两种粒子均存在于粒子群中，其特征在于：应用了上述分离方法，其中仅对污染的粒子应用步骤b)。

[0119] 细胞分析方法

[0120] 在单细胞中的DNA和/或蛋白质的生物分子水平上的研究日益是有兴趣的。按照本发明的一个方面，提出了用于从第一多种点选择和移动可能从多种细胞中选择出的细胞，并将它们引到微米尺寸分析的第二多种点，所述每个分析点包括最多一个单细胞。溶解细胞并在芯片上分析其内容物，例如按照已知技术诸如PCR和/或芯片上的毛细管电泳。 [0121] 因此，基于本发明，提供了用于分析粒子的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

[0122] a)将流体中悬浮的所述粒子引入微室；

[0123] b)选择性地移动所述粒子，将每一个移动到预先确定的分析点中，所述分析点与所述微室分离，但与所述微室水力连接；

[0124] c)对所述预先确定的分析点中存在的所述粒子应用如上所述的选择性溶解方法；

[0125] d)对所述粒子溶解的各个碎片现场应用所限定的分析方案；

[0126] 其中，所述限定的分析方案选自包括：PCR、芯片上的毛细管电泳；它们的组合。 [0127] 细胞分析装置

[0128] 为了进行所述方法，具体地以上分析方法，优选地使用如图7、8和9所示的装置。该装置(图7)包括如现有技术中的电极阵列，但是其特征在于主微室(CHM)和多种第二微室(CHJ)。可以通过各个进口(IM1)和出口(OM1)，使主微室充满包括至少一个细胞的样品。
每个第二微室(CHJ)具有较大尺寸，优选地基本与细胞尺寸相似，如图7所示。优选地，每个第二微室通过具有这样配置(长度和/或形状)的通道(LCHG)与 主微室相连，所述配置足以在分析所需的时间内，防止(避免或至少限制)通过扩散的样品分散和对于其它微室的污染。按照可能的变化(图8)，存在多种用于溶解的第二微室(CHLJ)，所述第二微室与用于芯片上毛细管电泳的通道相连，例如具有交叉连接(TJ)。备选地，按照现有技术，利用双T连接可以产生一系列用于毛细管电泳的通道。任选地，在用于毛细管电泳的通道的末端存在阻抗计和/或光学类型的集成传感器(SENS_J)，其能够产生基于从所述连接(交叉或双T)到传感器本身分析的化合物移动时间的电泳图。在图9中说明了另一种变化，其中所述多种微室中的每一个通过每个第二微室的流体出口(OJ)与用于电泳的毛细管(CAPJ)相连。