用TCP作为偶联剂的放射治疗211At标记物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种可用作制备放射治疗标记物的偶联剂2，3，5，6-四氟苯酚3-丙酸酯TCP，由偶联剂2，3，5，6-四氟苯酚3-丙酸酯TCP制备的放射治疗标记物211At-TCP-BSA，以及偶联剂TCP和标记物211At-TCP-BSA的制备方法。采用本发明制备得到的标记物211At-TCP-BSA用于放射治疗，标记率达60％，放化纯度大于98％，室温下放置24h，放化纯度无明显变化。与游离211At和211At-ATE-BSA相比(ATE为3-正丁基锡N-琥珀酰亚胺苯甲酸脂)，标记物211At-TCP-BSA在体内、外均具有较高的稳定性，表明TCP是放射性砹标记蛋白质的良好的中间体，为下一步211At的肿瘤靶向放射治疗研究奠定了基础。

权利要求

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1.一种用TCP作为偶联剂的放射治疗 At标记物，其特征在于放射治疗 At标记物的分子结构为：其中X代表蛋白质或多肽，所述TCP为2，3，5，6-四氟苯酚3-(巢状碳硼烷)丙酸酯。

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2.根据权利要求1所述的用TCP作为偶联剂的放射治疗 At标记物，其特征在于所述蛋白质为单克隆抗体。

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3.权利要求1或2所述放射治疗 At标记物的制备方法，其特征包括以下步骤：(1)1质量份的偶联剂2，3，5，6-四氟苯酚3-(巢状碳硼烷)丙酸酯溶于10-15质量份的211

甲醇溶液中，然后加入0.05～0.15质量份的74MBq的Na At、0.05～0.15质量份的醋酸和0.15～0.25质量份的浓度为13.0～13.6mg/mL氯代琥珀酰亚胺的甲醇溶液，于5-30℃反应2-5min，用0.2～0.6质量份的浓度为35～45mg/mL的偏重亚硫酸钠溶液终止反应；

(2)步骤(1)所得到的反应混合溶液用N2吹干；

(3)经步骤(2)吹干的反应产物加入1.5质量份浓度为15～25mg/mL的靶向物X硼酸TM溶液，于5-30℃反应30-60min，采用Sephadex G-50柱对偶联混合物进行分离，即得到所要制备的放射治疗标记物。

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4.根据权利要求3所述的放射治疗 At标记物的制备方法，其特征在于所说的靶向物X为蛋白质或多肽。

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5.根据权利要求4所述的放射治疗 At标记物的制备方法，其特征在于所述蛋白质为单克隆抗体。

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6.根据权利要求3或4或5所述的放射治疗 At标记物的制备方法，其特征在于所说的靶向物X硼酸溶液是由靶向物X溶于pH为8.8-9.2的0.1-0.2mol/L硼酸缓冲溶液所形成的溶液。

说明书

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用TCP作为偶联剂的放射治疗 At标记物及其制备方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及恶性肿瘤放射治疗标记物技术领域，特别是涉及211At标记物及其制备用偶联剂技术。背景技术：

[0002] 用放射性核素标记偶联对肿瘤有高特异性和亲和力的载体，如蛋白质、单克隆抗体、多肽类配体及一些化合物等，以对肿瘤进行体内靶向放射治疗，被认为是很有希望的一种途径，已日益受到各国重视，并已在临床上取得相当进展。选择优良的靶向载体和与之匹配的理想核素，是核素靶向治疗研究中的首要问题。而采用适宜的标记方法以获得体内外稳定并保持载体靶向特性的放射性药物，则是核素靶向治疗研究的基础和关键。 [0003] 愈来愈多的研究表明，加速器制备的α核素211At是最适宜于靶向内放射治疗的211
理想核素之一。 At半衰期7.2小时，平均每衰变一次发射一个α粒子和6.3个俄歇电
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子。就放射治疗而言， At是除硼中子俘获治疗(BNCT)外，仅有的高传能线密度(LET)体系。它的α粒子在组织中射程短(55-80μm)，仅相当于6-8个细胞范围，其98.84KeV/μm的LET值与内放射治疗效应最佳LET值(100KeV/μm)非常接近，具有极强的细胞毒性；产生的DNA链断裂是不可修复的，而且它的辐射毒性几乎和剂量率、细胞分裂周期和氧浓度无关。同时其亚细胞射程(30μm)的俄歇电子，在细胞内有非常高的LET效应，也能打断
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DNA链，致死癌细胞。显然，将 At标记偶联到理想的靶向载体上，并通过适宜的给药途径，
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使 At特异性地浓聚在癌组织或进入癌细胞，其两种辐射产生的极强细胞毒性均能集中杀死癌细胞，而对周围正常组织损伤很小，从而达到降低毒副作用，提高疗效的目的，这也正是肿瘤放射治疗需要解决的核心问题。这种药物将对 微小癌、微转移癌和散在性癌的治疗开辟有效的新途径。

[0004] 对于211At标记蛋白质或多肽的方法，国内外学者进行了大量的研究，花费了相当的精力。采用直接标记法进行放射性砹标记蛋白质、单克隆抗体及一些生物分子最大的问题在于所获得的标记物在体内不稳定，具有明显的脱砹现象。为了提高标记物的体内稳定性，以一系列的芳环化合物，如苯环或吡啶环等为双功能偶联剂的间接标记法应运而生，并取得了一些可喜的进展。不过，研究也表明，以芳环化合物为中间体所获得的标记物虽然比直接标记法获得的标记物在体内具有较高的稳定性，但依然存在不同程度的脱砹现象。即使对芳环进行一些基团修饰，也不能使标记物的稳定性有显著提高。鉴于硼-卤键比碳-卤键具有更高的键能，卤素原子与硼原子结合时具有较高的稳定性，近期一些研究开始由芳环化合物转向硼烷及碳硼烷系列的一些衍生物。

[0005] 目前，用于硼中子俘获治疗及作为侧基用于放射性砹标记生物分子的富硼化合物2- -
主要包括：closo-B12H12 、closo-C2B10H12和nido-C2B9H12 及其异构体。由于在硼烷上引入碳原子更易于砹标记，并方便对其进行基团修饰以获得能够与蛋白质偶联的碳硼烷衍生物，且巢状碳硼烷具有良好的亲水性，有利于标记物的动物实验研究，许多关于硼烷的研究就涉及到巢状碳硼烷。Hawthorne等研究了硼烷的苯异硫氰衍生物，并将其用于生长因子的标记，并认为对巢状碳硼烷结构做一些适当修饰，可能获得用于放射性核素标记蛋白质的双功能偶联剂。Wilbur小组研究了巢状碳硼烷作为亲水性侧基用于放射性砹标记生物素及其衍生物，发现它们在体内的稳定性高于通过C-At健制得的标记物。目前，拟用于放射性砹标记蛋白质或单克隆抗体(Mabs)的巢状碳硼烷中间体主要为硼烷的异硫氰衍生物或苯异硫氰衍生物。硼烷异硫氰衍生物可通过以2，3，5，6-四氟苯酚3-(巢状碳硼烷)丙酸酯(TCP)为母体经基团修饰获得，但反应复杂、产率低且难于分离。
发明内容：

[0006] 鉴于目前拟用于放射性砹标记蛋白质、单克隆抗体(Mabs)和多肽的巢状碳硼烷中间体主要为硼烷的异硫氰衍生物或苯异硫氰衍生物，硼烷的异硫氰衍生物或苯异硫氰 衍生物通过2，3，5，6-四氟苯酚3-(巢状碳硼烷)丙酸酯(TCP)为母体经基团修饰获得，其反应复杂、产率低且难于分离的现状，本发明的目的是提供一种新的放射治疗标记物技术，211
直接利用 At通过2，3，5，6-四氟苯酚3-(巢状碳硼烷)丙酸酯(TCP)标记偶联蛋白质，或单克隆抗体或多肽，以避免硼烷异硫氰衍生物或苯异硫氰衍生物的复杂反应和分离，简化操作程序和提高产率。

[0007] 本发明的内容包括，提供制备放射治疗标记物的偶联剂和由该偶联剂制备的放射治疗标记物，以及偶联剂和标记物的制备方法。

[0008] 本发明提供的放射治疗标记物用偶联剂，其分子结构为：

[0009]

[0010] 其中●代表C或C-H，θ代表负离子。

[0011] 上述制备放射治疗标记物用的偶联剂，其制备方法主要包括以下步骤： [0012] (1)1质量份的4-戊炔酸用50～55质量份的无水四氢呋喃溶解后加入1.2-1.5质量份的二环己基碳二亚胺和1.2-1.5质量份的2，3，5，6-四氟苯酚，于5-30℃搅拌反应12-15h加入0.1-0.2份冰醋酸，继续搅拌反应1-2h分离除去沉淀；

[0013] (2)分离所得液相经减压蒸馏，所得产物用58～65质量份的正己烷溶解，将不溶物分离除去，所得液相减压蒸馏去除溶剂后溶于15～25质量份的乙酸乙酯质量浓度为4～5％的正己烷乙酸乙酯溶液中，用15-20质量份的饱和碳酸氢钠溶液洗涤除去醋酸，分离所得有机相再用无水硫酸镁干燥12-15h，再分离所得液相经减压蒸馏除去溶剂，干燥5-8h，得到所需初级中间产物；

[0014] (3)将1质量份的癸硼烷溶于18～22份的无水乙氰中，加热回流反应30-60min后加入1.0～1.4质量份的步骤(2)所得的初级中间产物，搅拌反应25-30h，停止加热，待反应混合物降至5-30℃加入1-1.2质量份的硅胶并继续反应1-2h，即得到闭环状 碳硼烷化合物3；

[0015] (4)将所得到的1质量份的闭环状碳硼烷化合物与2-2.5质量份的四氢吡咯于5-30℃下反应30-60min，即得到可用作制备放射治疗标记物的偶联剂巢状碳硼烷化合物(TCP)。

[0016] 为了提高作为偶联剂的TCP的产率，取得更好的效果，在上述放射治疗标记物制备用偶联剂的制备方法中，本发明还可进一步采取以下技术措施：

[0017] 将步骤(1)分离得到的沉淀用20-25质量份的无水THF洗涤，洗涤后的洗涤液加入到该沉淀分离过程的分离液中。

[0018] 将步骤(2)分离得到的不溶沉淀用10-15质量份的正己烷洗涤沉淀，洗涤后的洗涤液加入到该沉淀分离过程的分离液中。

[0019] 闭环状碳硼烷化合物与四氢吡咯反应得到的偶联剂在165-175℃下进行升华处理。

[0020] 所说的液相减压蒸馏在旋转蒸发仪上进行完成。

[0021] 由上述放射治疗标记物制备用偶联剂所制备的放射治疗标记物，其分子结构为： [0022]

[0023] 其中X可以是蛋白质、单克隆抗体或多肽等。

[0024] 制备上述放射治疗标记物的方法，主要包括以下步骤：

[0025] (1)用1质量份的偶联剂巢状碳硼烷化合物TCP溶于10-15质量份的甲醇溶液中，211
然后加入0.05～0.15质量份的74MBq的Na At、0.05～0.15质量份的醋酸和0.15～0.25质量份的浓度为13.0～13.6mg/mL氯代琥珀酰亚胺的甲醇溶液，于5-30℃反应2-5min，用
0.2～0.6质量份的浓度为35～45mg/mL的偏重亚硫酸钠溶液终止反应；

[0026] (2)步骤(1)所得到的反应混合溶液用N2吹干；

[0027] (3)经步骤(2)吹干的反应产物加入1.5～.25质量份浓度为15～25mg/mL的TM靶向物X硼酸溶液，于5-30℃反应30-60min，采用Sephadex G-50柱对偶联混合物进行分离，即得到所要制备的放射治疗标记物。

[0028] 在上述放射治疗标记物的制备方法中，所说的靶向物X可以是蛋白质、单克隆抗体或多肽等；所说的靶向物X硼酸溶液是由靶向物X溶于pH为8.8-9.2的0.1-0.2mol/L硼酸缓冲溶液所形成的溶液。

[0029] 放射治疗标记物的制备，除了上述以偶联剂巢状碳硼烷化合物TCP为原料进行制备外，还可以采取将上述偶联剂巢状碳硼烷化合物TCP的制备与放射治疗标记物的制备合二为一，即紧接着上述偶联剂巢状碳硼烷化合物TCP的制备过程进行标记物的制备。当巢状碳硼烷化合物TCP不能从市场上购买取得，通常是采取后一种方法制备本发明提供的放射治疗标记物。

[0030] 本发明在合成了偶联剂2，3，5，6-四氟苯酚3-(巢状碳硼烷)丙酸酯(TCP)后，211
以其作为中间体研究了 At标记偶联蛋白质、单克隆抗体或多肽的标记偶联条件，在此基
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础上对标记物 At-TCP-BSA的体内、外稳定性进行了评估，并将其与游离 At和芳环化合
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物为中间体所获得的标记物 At-ATE-BSA(ATE为3-正丁基锡-N-琥珀酰亚胺苯甲酸脂)
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在体内、外的稳定性进行了比较。结果表明，At-TCP-BSA的标记率达60％，放化纯度大于
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98％，室温下放置24h，放化纯度无明显变化。与游离 At和 At-ATE-BSA相比，标记物
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At-TCP-BSA在体内、外均具有较高的稳定性，表明TCP是放射性砹标记蛋白质、单克隆抗
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体或多肽的良好的中间体，这为下一步 At的肿瘤靶向放射治疗研究奠定了基础。 [0031] 本发明的偶联剂和由其制备的放射治疗标记物的合成工艺，与现有技术的偶联剂和放射治疗标记物合成工艺相比，本发明的合成工艺路线，反应步骤少，反应较为简单、易
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操作，产率较高，且易于分离，实现了 At通过TCP直接标记偶联蛋白质、单克隆抗体或多肽。
附图说明：

[0032] 附图1是已有技术的一种标记物合成工艺路线示意图。

[0033] 附图2是已有技术的另一种标记物合成工艺路线示意图。

[0034] 附图3是本发明提供的偶联剂TCP的合成路线示意图。

[0035] 附图4是本发明提供的以TCP为偶联剂211At标记靶向物的路线示意图。 具体实施方式：

[0036] 下面通过实施例对本发明作进一步的说明。在下面实施例中，所提到的组分份数如无特别说明，均为质量份数。

[0037] (1)TCP的合成实施例

[0038] TCP的合成路线如附图3所示。

[0039] 称取4-戊炔酸2.0g(20.4mmol)于150mL的三颈烧瓶，用60mL的无水THF溶解，随后紧接着往烧瓶中加入6.45g(31mmol)DCC和6.83g(41mmol)TFP，混合物立即变浅黄色并产生白色沉淀。混合物在室温下搅拌反应过夜后加入0.1mL冰醋酸，继续搅拌1h。过滤，用无水THF洗涤沉淀，滤液经旋转蒸发仪上减压蒸馏，所得旋干物用80mL正己烷溶解，将不溶物过滤除去并用10mL正己烷洗涤沉淀，滤液经旋干溶剂后溶于24mL正己烷/1m L乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤(5×20mL)。有机相经无水硫酸镁干燥过夜，过滤，经减压蒸馏，真空干燥5h，得2.9g白色固体2，产率为58.0％。测其熔点(未矫正)：49.4-49.9℃(文献值为47-49℃)。

[0040] 在50mL的三颈烧瓶中，称取1.25g(9.75mmol)的癸硼烷溶于20mL的无水乙氰中，回流反应30min后加入2.5g(10.65mmol)上述产物2，混合物回流搅拌反应25h。停止加热，待反应混合物降至室温后加入0.5g硅胶并继续反应1h。过滤，减压蒸馏，真空干燥过夜，得含3的初产物。初产物经自行设计的简易升华装置在170℃下升华得到380mg白色固体3，产率为25％。测其熔点(未矫正)：132.1-132.6℃(文献值为135-136℃)。化合物3的1 1
H NMR、MS与其结构相符。H NMR：(CDCl3，400MHz)δ： 1.23～2.25(m，10H)；2.72(t，2H)；
- -
2.93(t，2H)；7.02～7.05(m，1H)，MS(ESI) ：(M+Cl)，399。

[0041] 闭状碳硼烷化合物3与四氢吡咯在室温下反应30min，每个碳硼环上脱掉一个硼原子，就将其转化为相应的巢状碳硼烷化合物TCP，一种黄色高度粘稠状物。开环所得巢状碳硼烷化合物未经进一步分离直接进入下一步标记实验。

[0042] TCP的合成过程中，每一步反应都经HPLC进行质量监控。化合物2，3及TCP在HPLC上的保留时间分别为4.0min，7.6min，2.1min。

[0043] (2)靶向物的211At标记实施例

[0044] 211At标记TCP的流程如附图4所示.。

[0045] 在含有0.5mg TCP(四氢吡咯盐)的甲醇溶液的微型反应管中加入4μL(74MBq)211
At、3μL醋酸和13.3mg/mLNCS的甲醇溶液5μL，室温下反应2min后，用15μl(40mg/mL)的偏重亚硫酸钠终止反应。反应混合溶液在N2下吹至近干(作TLC分析，TLC条件：
H2O∶CH3CN∶MeOH∶HOAc，60∶30∶10∶2)，备用。

[0046] 在上述N2吹至近干的反应管中加入50μL(20mg/mL)BSA(0.1mol/L硼酸缓冲溶TM液，pH＝9.0)，室温下反应30min。采用Sephadex G-50柱(15cm×10mm)进行偶联物
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At-TCP-BSA的分离，以pH＝7.0，0.1mol/L PBS作淋洗液，收集淋洗液，1mL/管，测定每管的放射性，绘出淋洗曲线。用TLC分析计算标记率和标记产物的放化纯度。淋洗液经HPLCTM
分析(带放射性检测器)。HPLC分析条件：反相色谱柱Dikma，diamonsil -C18，(5μm，
250mm×4.6mm)，流动相：0.1mol/L PBS pH＝7.0的磷酸缓冲溶液，紫外检测波长＝278nm，流速＝1ml/min，t＝20℃。TLC条件：H2O∶CH3CN∶MeOH∶HOAc，60∶30∶10∶2。其标记
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率为60％，放化纯度达98％，含标记物 At-TCP-BSA的PBS淋洗液可直接用于体内动物实
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验。BSA通过ATE的 At标记与上述标记方法相同，分离条件及分析方法如 At-TCP-BSA。 [0047] (3)标记偶联物211At-TCP-BSA、211At-ATE-BSA的体外稳定性评价

[0048] 将含有211At-TCP-BSA和211At-ATE-BSA的0.1mol/L PBS淋洗液室温放置3天， 分别于不同时间取样，以H2O∶CH3CN∶MeOH∶HOAc，60∶30∶10∶2为展开剂，用TLC分211 211 211
析 At-TCP-BSA和 At-ATE-BSA的放化纯度。 At-TCP-BSA在室温下放置24h后，放化纯度无明显变化，仍然在97％以上，表明以TCP为双功能偶联剂的标记物具有较高的体外
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稳定性；At-ATE-BSA在室温下放置24h后，放化纯度略有降低，从96％降为93％。 [0049] (4)标记物在小鼠体内分布实验

[0050] 将28只小鼠(雌雄各半)随机分为7组，经腹腔注射0.1mL(20kBq)标记物211
At-TCP-BSA，注射后分别于0.5、1、4、8、12、24、48h处死小鼠。取血、心脏、肝、脾、肾、肺、胃、小肠、肌肉、甲状腺(含颈部)等组织器官，称重并测其放射性计数，计算组织摄取率。放
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射性摄取率用0.1mL At-TCP-BSA的放射性计数作为标准，以每克组织摄取放射性占总放射量的百分比％ID/g表示(甲状腺的摄取率以％ID表示)。

[0051] 用游离211At和211At-ATE-BSA分别代替211At-TCP-BSA进行小鼠体内分布实验可获211 211
得游离 At和 At-ATE-BSA在鼠体内的分布实验结果。

[0052] 211At-TCP-BSA、211At-ATE-BSA和游离211At的小鼠体内分布结果列于表1。由于游211 211
离 At一般主要分布在胃、肺、脾及甲状腺中，特别是甲状腺是游离 At的特征指标，因
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此，观察 At-TCP-BSA和 At-ATE-BSA在胃、肺、脾特别是甲状腺中的放射性，就能判断标
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记物的体内稳定性。从表1可以看出，At-TCP-BSA和 At-ATE-BSA在注入小鼠体内后，
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在胃、肺、脾中的放射性在所考察的时间内都低于游离 At的；在甲状腺中的放射性也都
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低于游离 At的，说明 At-TCP-BSA和 At-ATE-BSA在小鼠体内具有较高的稳定性。从
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表1还发现， At-TCP-BSA与 At-ATE-BSA两者相比， At-TCP-BSA在胃、肺、脾特别是
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甲状腺中的放射性摄取都低于 At-ATE-BSA的，表明 At-TCP-BSA的体内稳定性更胜于
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At-ATE-BSA的稳定性。

[0053] 表1 211At-TCP-BSA、211At-ATE-BSA和游离211At的小鼠体内分布实验(X±S.D.％，n＝4)

[0054]