一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法

摘要

本发明涉及一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法。稀土纳米粒子由SiO2包裹发光稀土配合物构成；稀土配合物由配体吡啶二羧酸结合稀土离子生成；通过稀土配合物在微乳液中的聚合反应和硅烷化形成表面含有活性官能团的SiO2纳米粒子。制备的稀土发光纳米粒子发光强度高，水溶性好，可用于各种时间分辨荧光分析和成像。本制备方法与同类稀土纳米粒子制备方法相比，制备成本低，方法简单，可被广泛应用。

权利要求

1.一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法，其特征是以稀土配合物作为发光分子，通过微乳液中聚合反应形成SiO2包裹稀土配合物的纳米粒子，纳米粒子的表面具有可连接探针分子的活性官能团，用于生物分子的荧光检测和成像，发光分子为吡啶二羧酸与稀土离子生成的配合物。

2.根据权利要求1所述的一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法，其特征是制备方法具体的步骤为：第一步，将稀土离子硝酸盐或盐酸盐的水溶液与吡啶二羧酸溶液按1∶3摩尔比混合反应形成稀土配合物；

第二步，稀土纳米粒子的制备：油包水反相微乳液体系中，将油相试剂、表面活性剂及助表面活性剂混合搅拌均匀后，加入第一步生成的稀土配合物的水溶液，充分搅拌形成油包水的微乳液后，加入正硅酸乙酯和氨水进行水解反应；在水解反应过程中或反应后，加入硅烷化试剂继续反应，反应完成后在乳白色悬浮液中加入丙酮离心沉降，经乙醇、水洗涤以除去反应溶液，离心分离得到SiO2包裹的稀土纳米粒子悬浮于水溶液中或干燥后备用。

3.根据权利要求1所述的一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法，其特征是所述的稀土离子是铽离子、铕离子、钐离子、镝离子中的一种。

4.根据权利要求1或2所述的一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法，其特征是与稀土离子生成配合物的配体是吡啶-2，6-二羧酸，即两个羧基取代基是分别连在吡啶环的2位和6位。

5.根据权利要求1所述的一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法，其特

3+

征是吡啶二羧酸“DPA”与稀土离子“Ln ”生成的配合物是Ln(DPA)3或Ln(DPA)2或Ln(DPA)类型配合物中的一种。

6.根据权利要求2所述的一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法，其特征是油包水反相微乳液体系中油相为环己烷，表面活性剂为TritonX-100或壬基酚聚氧乙烯醚，助表面活性剂为正己醇或正辛醇，水相为含有发光稀土配合物的水溶液。

7.根据权利要求2所述的一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法，其特征是所制备的稀土纳米粒子由油包水反相微乳液体系中氨水催化正硅酸乙酯水解形成的SiO2构成。

8.根据权利要求2所述的一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法，其特征是所制备的稀土纳米粒子表面的活性官能团通过在微乳液中加入带有不同活性官能团的硅烷化试剂生成，硅烷化试剂是氨基硅烷化试剂，或巯基硅烷化试剂，或3-缩水甘油醚氧丙基硅烷化试剂，这些活性官能团可进一步共价连接各种探针分子DNA、抗体、生物素、酶以识别和检测或示踪对应的生物分子。

说明书

一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法，主要用于生物分子的荧光检测和示踪，属于生物分子纳米标记物制备的技术领域。

背景技术

[0002] 荧光检测、成像技术在生命科学、医学等众多领域有着广泛的应用，然而传统的荧光分析使用的各种有机染料分子易受到各种非特异性荧光的干扰(激发光、散射光及分析物背景荧光)，同时染料分子容易发生光漂白及淬灭效应导致荧光强度降低。纳米标记物是近年来发展起来的一种新型标记物，由于纳米粒子通过表面吸附或包埋等方式装载了若干个荧光分子，因此用纳米粒子标记后，荧光发射强度将大大增强，有力的提升测定的灵敏度。

[0003] 有关荧光纳米粒子的制备方法报道的有商业上(Bangs Laboratories，DynalInc，Molecular Probe etc)可获得的各种装载染料荧光分子的高分子微球，但大部分高分子微球粒径在μm量级(＞100nm)，作为标记物尺寸常过大，疏水性的表面在水溶液中容易相互聚集，装载的染料分子存在泄漏。国内报道过通过微乳液中聚合反应制备纳米到微米级的聚苯乙烯、聚丙稀酰胺、聚丙烯酸等微球的方法(中国专利公开号CN1278534A，2002年，赵艺强，高海峰，杨武利，府寿宽，荧光标记的高分子微球及其制备方法)，在这些微球的表面吸附或共价键合了多个FITC、Rhodamine 6G、Cy类荧光染料分子，由于是在微球表面携带荧光分子，荧光分子本身易被光漂白和在水溶液中易受溶剂分子淬灭的不足，没有得到克服。

[0004] 文献报道了SiO2包裹荧光分子制备纳米粒子的方法(Nynke A.M.Verhaeghand Alfons van Blaaderen，Langmuir，1994，10，1427-1438；Swadeshmukul Santra，Peng Zhang，Kemin Wang，Rovelyn Tapec and Weihong Tan，Anal Chem，2001，73，4988-4993；Swadeshmukul Santra，Heesun Yang，Debamitra Dutta，Jessie T.Stanley，Paul H.Holloway，Weihong Tan，Brij M.Moudgilb and Robert A.Mericle，ChemCommun，2004，
2810-2811)，中国专利公开号CN 1342515A，2002年，谭蔚泓，王柯敏，肖丹，核壳型纳米颗粒，公开了包裹荧光物质的纳米粒子制备方法。以上这些方法以荧光染料分子Rhodamine、FITC、Ru(bpy)3等作为纳米粒子的发光内核，通过在微乳液中聚合的方法形成SiO2包裹的荧光纳米粒子。这种纳米粒子标记物具有亲水性、表面容易修饰，且与荧光分子相比具有更好的光学稳定性和亮度。但荧光分子固有的Stokes位移小、易受各种非特异性荧光干扰的不足仍没有得到克服。

[0005] 以稀土化合物作荧光标记物具有一些独特的优点，如发射波长与激发波长相距远，Stokes位移可达150nm以上；荧光发射峰窄，常小于10nm；荧光寿命长，可达毫秒级，比一般本底物质的荧光寿命高5～6个数量级，因此可通过荧光延迟测量技术进行时间分辨荧光分析，有效地消除各种非特异性荧光的干扰获得高的灵敏度和更清晰的荧光图像。用稀土化合物制备的纳米粒子则集合了稀土化合物和纳米粒子两者的优点，包含了许多发光分子具有更高的荧光强度。包裹层避免了环境因素(溶剂分子、氧气)对荧光的淬灭作用且更加容易修饰探针分子。

[0006] 有关稀土纳米粒子的制备文献(Jun Feng，Guomin Shan，Angel Maquieira，Marja E.Koivunen，Bing Guo，Bruce D.Hammock and Ian M.Kennedy，Anal Chem，2003，75，5282-5286)报道了一种包裹稀土氧化物的纳米粒子制备方法；中国专利公开号CN
1378083A，2002年，孙宝全，衣光舜，陈德朴，赵淑英，周玉祥，程京，用于生物材料标记的稀土纳米粒子、其制备方法及用途，公开了一种包裹稀土混合物的粒子制备的方法。由于这些方法使用非溶液均相制备，所制备粒子形状的均一性，大小的可控性，在水溶液中的分散性不够理想。

[0007] 中国专利公开号CN 1493647A，2004年，袁景利，谭明乾，叶志强，王桂兰，一种功能性纳米稀土荧光微粒及其制备和应用，公开了一种包裹稀土配合物的粒子制备方法，其方法是以发光强的稀土配合物为中心，采用SiO2包裹成纳米粒子作为标记物，制备出的粒子有良好的均一性和较强的荧光强度，可用于时间分辨荧光分析，但使用的稀土配合物的配体没有商业来源，需通过多步有机反应专门合成，配体制备是复杂的，不易获得。

[0008] 中国专利公开号CN 1775898A，2006年，陈扬，基于荧光能量转移原理发光的稀土纳米粒子及制备方法，公开了一种包裹稀土配合物的粒子制备方法，其方法是通过敏化分子荧光增强的方法制备水溶性的稀土配合物，所制备的稀土配合物发光强度高，水溶性好，合成原料有商业来源，容易制备。制备出的粒子有良好的均一性和强的荧光强度。

[0009] 吡啶二羧酸与稀土离子能生成具有很强荧光强度的稀土配合物，曾用于测定稀土离子Tb、Eu、Dy的含量(慈云祥，宁民柱，阳芳英，高等学校化学学报，1983，4(1)，115-118；谭培功，李兰英，黄汉国，分析试验室，1993，12(5)，44-46)。应用吡啶二羧酸与稀土离子形成的配合物制备发光纳米粒子用于检测各种生物分子国内外尚未见报道。通过溶液均相反应制备SiO2包裹的稀土纳米粒子的关键是合成具有良好水溶性、稳定性、高发光强度的稀土配合物，目前这样的稀土配合物种类很少，且需要复杂的有机合成，成本昂贵，不易获得。

发明内容

[0010] 技术问题：本发明的目的是提供一种基于吡啶二羧酸的稀土发光纳米粒子的制备方法，既是一种无需复杂合成和使用昂贵原料制备稀土发光纳米粒子的制备方法，基于吡啶二羧酸方法制备的稀土纳米粒子发光强度高、水溶性好，可用于各种时间分辨荧光分析和成像。

[0011] 技术方案：本发明是通过以下技术方案实现的：以稀土配合物作为发光分子，通过微乳液中聚合反应形成SiO2包裹稀土配合物的纳米粒子，纳米粒子的表面具有可连接探针分子的活性官能团，用于生物分子的荧光检测和成像，发光分子为吡啶二羧酸与稀土离子生成的配合物。

[0012] 所述的稀土离子是铽离子(Tb3+)、铕离子(Eu3+)、钐离子(Sm3+)、镝离子(Dy3+)中的一种。

[0013] 与稀土离子生成配合物的配体是吡啶-2，6-二羧酸，即两个羧基取代基是分别连在吡啶环的2位和6位。

[0014]

[0015] 吡啶-2，6-二羧酸3+

[0016] 吡啶-2，6-二羧酸(DPA)与稀土离子(Ln )生成的配合物是Ln(DPA)3或Ln(DPA)2或Ln(DPA)类型配合物中的一种。

[0017] 具体的步骤为：

[0018] 第一步，将稀土离子硝酸盐或盐酸盐的水溶液与吡啶二羧酸溶液按1∶3摩尔比混合反应形成稀土配合物；

[0019] 第二步，稀土纳米粒子的制备：油包水反相微乳液体系中，将油相试剂、表面活性剂及助表面活性剂混合搅拌均匀后，加入第一步生成的稀土配合物的水溶液，充分搅拌形成油包水的微乳液后，加入正硅酸乙酯和氨水进行水解反应；在水解反应过程中或反应后，加入硅烷化试剂继续反应，反应完成后在乳白色悬浮液中加入丙酮离心沉降，经乙醇、水洗涤以除去反应溶液，离心分离得到SiO2包裹的稀土纳米粒子悬浮于水溶液中或干燥后备用。

[0020] 油包水反相微乳液体系中油相为环己烷，表面活性剂为Triton X-100或壬基酚聚氧乙烯醚(OP-10)，助表面活性剂为正己醇或正辛醇，水相为含有发光稀土配合物的水溶液。

[0021] 所制备的稀土纳米粒子由油包水反相微乳液体系中氨水催化正硅酸乙酯水解形成的SiO2构成。

[0022] 所制备的稀土纳米粒子表面的活性官能团通过在微乳液中加入带有不同活性官能团的硅烷化试剂生成，硅烷化试剂是氨基硅烷化试剂，或巯基硅烷化试剂，或3-缩水甘油醚氧丙基硅烷化试剂，这些活性官能团可进一步共价连接各种探针分子如DNA、抗体、生物素、酶等以识别和检测或示踪对应的生物分子。

[0023] 有益效果：目前文献报道的具有良好水溶性、稳定性、高发光强度的稀土配合物种类很少，配体制备需要复杂的有机合成，成本昂贵，不易获得。本发明的稀土配体吡啶-2，6-二羧酸与稀土离子Tb、Eu、Dy、Sm都能生成荧光配合物，且荧光强度强，而一般配体通常只能与Eu、Tb离子生成具有一定水溶性的足够强荧光的配合物。吡啶-2，6-二羧酸与稀土离子生成的配合物具有良好的水溶性和稳定性，由于水溶性好，能制得更高掺杂发光分子浓度的纳米粒子，具有高的发光强度和能应用于时间分辨荧光分析的长荧光寿命。所使用的配体吡啶二羧酸可以从商业上获得，价格便宜，与先前的稀土纳米粒子制备方法相比，避免了合成配体的复杂有机合成，制备成本大大降低，方法更简单，有助于稀土纳米标记物在更广泛的领域被应用。

附图说明

[0024] 图1.吡啶二羧酸-Eu纳米粒子的透射电镜图。

[0025] 图2.吡啶二羧酸-Eu纳米粒子的时间分辨荧光光谱图。

[0026] 图3.吡啶二羧酸-Tb纳米粒子的透射电镜图。

[0027] 图4.吡啶二羧酸-Tb纳米粒子的时间分辨荧光光谱图。

[0028] 图5.吡啶二羧酸-Dy纳米粒子的时间分辨荧光光谱图。

具体实施方式

[0029] 稀土纳米粒子由SiO2包裹发光稀土配合物构成；稀土配合物由配体吡啶二羧酸结合稀土离子生成；SiO2包裹稀土配合物通过油包水反相微乳液中氨水催化正硅酸乙酯的水解形成SiO2生成。稀土纳米粒子的直径大小可通过控制水相与表面活性剂的摩尔比及正硅酸乙酯和氨水的摩尔用量来控制。生成的纳米粒子大小通常在10-150nm。在水解聚合过程中使用带有不同活性官能团的硅烷化试剂，可在SiO2表面分别生成不同的活性官能团，如硅烷化试剂3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-巯丙基三甲氧基硅烷、3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷可在SiO2表面分别生成-NH2、-SH、3-缩水甘油醚氧丙基官能团，这些官能团可进一步共价连接各种探针分子如DNA、抗体、生物素、酶等以识别和检测或示踪对应的生物分子。

[0030] 实施例1：寡核苷酸探针修饰的吡啶二羧酸-Eu纳米粒子的制备

[0031] 稀土配合物的制备：将稀土Eu3+水溶液(Eu3+的盐酸盐)与吡啶二羧酸溶液按1∶3摩尔比混合反应10分钟。

[0032] 稀土纳米粒子的制备：将环己酮、正己醇、Triton X-100(v/v，4∶1∶1)混合并搅拌均匀，加入适量稀土配合物溶液(水相)，充分搅拌形成油包水微乳液后，加入正硅酸乙酯和浓氨水，搅拌2小时后，加入氨丙基三乙氧基硅烷(氨基硅烷化试剂)，反应混合物在搅拌下反应20小时，反应完成后在乳白色悬浮液中加入适量丙酮离心沉降，分别用乙醇、水洗涤以除去反应溶液，离心分离得到SiO2包裹的稀土纳米粒子悬浮于水溶液中或干燥后备用，图1是制得的吡啶二羧酸-Eu纳米粒子的透射电镜图，显示具有良好的均一性和单一性。图2是吡啶二羧酸-Eu纳米粒子的时间分辨荧光光谱图。

[0033] 稀土纳米粒子标记的寡核苷酸探针的制备：称取一定量干燥的表面NH2修饰的稀土纳米粒子重新分散于1×PBS溶液中，加入25％的戊二醛(最终浓度约1％)溶液，室温下反应2小时，反应完成后经0.5％Tween-20水洗后，离心移走上清液，加入含适量链亲和素的1×PBS溶液，室温搅拌下反应16小时，反应完成后，用含0.5％Tween-20的1×PBS溶液洗涤，离心分离后加入足量Biotin-oligo的1×PBS溶液，室温下反应3小时，反应完成后，用1×PBS溶液洗涤3次，洗涤后寡核苷酸修饰的纳米粒子悬浮于1×PBS溶液中备用。

[0034] 实施例2：吡啶二羧酸-Tb纳米粒子的制备

[0035] 稀土配合物的制备：将稀土Tb3+水溶液(Tb3+的硝酸盐或盐酸盐)与吡啶二羧酸溶液按1∶3摩尔比混合反应10分钟。

[0036] 稀土纳米粒子的制备：将环己酮、正己醇、Triton X-100(v/v，4∶1∶1)混合并搅拌均匀，加入适量稀土配合物溶液(水相)，充分搅拌形成油包水微乳液后，加入正硅酸乙酯和浓氨水，搅拌2小时后，加入氨丙基三乙氧基硅烷(硅烷化试剂)，反应混合物在搅拌下反应20小时，反应完成后在乳白色悬浮液中加入适量丙酮离心沉降，分别用乙醇、水洗涤以除去反应溶液，离心分离得到SiO2包裹的稀土纳米粒子悬浮于水溶液中或干燥后备用。图3是制得的吡啶二羧酸-Tb纳米粒子的透射电镜图。图4是其时间分辨荧光光谱图。

[0037] 实施例3：吡啶二羧酸-Dy纳米粒子的制备

[0038] 稀土配合物的制备：将稀土Dy3+水溶液(Dy3+的盐酸盐)与吡啶二羧酸溶液按1∶3摩尔比混合反应10分钟。

[0039] 稀土纳米粒子的制备：将环己酮、正己醇、Triton X-100(v/v，4∶1∶1)混合并搅拌均匀，加入适量稀土配合物溶液(水相)，充分搅拌形成油包水微乳液后，加入正硅酸乙酯和浓氨水，搅拌2小时后，加入氨丙基三乙氧基硅烷(硅烷化试剂)，反应混合物在搅拌下反应20小时，反应完成后在乳白色悬浮液中加入适量丙酮离心沉降，分别用乙醇、水洗涤以除去反应溶液，离心分离得到SiO2包裹的稀土纳米粒子悬浮于水溶液中或干燥后备用。图5是制得的吡啶二羧酸-Dy纳米粒子的时间分辨荧光光谱图。