抗体和免疫偶联物及其用途转让专利
申请号 : CN200780026117.5
文献号 : CN101490087B
文献日 : 2013-11-06
发明人 : 小艾伦·J·埃本斯 , 阿兰·M·格雷 , 梁伟庆 , 吴雁 , 于尚凡
申请人 : 健泰科生物技术公司
摘要 :
提供了抗CD22抗体及其免疫偶联物。提供了使用抗CD22抗体及其免疫偶联物的方法。
权利要求 :
1.一种结合人CD22的抗体，其中该抗体包含：(a)HVR-L1，其为选自SEQ ID NO：10、9、
19-23、32和33的氨基酸序列，和(b)五种HVR，其选自(1)HVR-H1，其为SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(2)HVR-H2，其为SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(3)HVR-H3，其为SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
(4)HVR-L2，其为SEQ ID NO：12的氨基酸序列；和(5)HVR-L3，其为SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
2.权利要求1的抗体，该抗体包含HVR-L1，其为SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
3.权利要求1的抗体，其中所述HVR-L1为SEQ ID NO：9。
4.权利要求1的抗体，其中所述HVR-L1为SEQ ID NO：19。
5.权利要求1的抗体，其中所述HVR-L1为SEQ ID NO：20。
6.权利要求1的抗体，其中所述HVR-L1为SEQ ID NO：21。
7.权利要求1的抗体，其中所述HVR-L1为SEQ ID NO：22。
8.权利要求1的抗体，其中所述HVR-L1为SEQ ID NO：23。
9.权利要求1的抗体，其中所述HVR-L1为SEQ ID NO：32。
10.权利要求1的抗体，其中所述HVR-L1为SEQ ID NO：33。
11.权利要求1的抗体，该抗体进一步包含至少一种框架，其选自VH亚组III共有框架和VL亚组I共有框架。
12.权利要求1的抗体，其中该抗体包含重链可变域，其为SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
13.权利要求1的抗体，其中该抗体包含轻链可变域，其为SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
14.权利要求1的抗体，其中该抗体包含轻链可变域，其为SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
15.权利要求1的抗体，其中该抗体包含重链可变域，其包含一种、两种、三种或四种选自SEQ ID NO：1、3、5和7的框架氨基酸序列。
16.权利要求1的抗体，其中该抗体包含轻链可变域，其包含一种、两种、三种或四种选自SEQ ID NO：8、11、13和15的框架氨基酸序列。
17.权利要求12的抗体，该抗体进一步包含轻链可变域，其为SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
18.权利要求12的抗体，该抗体进一步包含轻链可变域，其为SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
19.权利要求1的抗体，其中该抗体包含重链，其为SEQ ID NO：88的氨基酸序列。
20.权利要求1的抗体，其中该抗体包含轻链，其为SEQ ID NO：87的氨基酸序列。
21.权利要求1的抗体，其中该抗体包含重链和轻链，重链为SEQ ID NO：88的氨基酸序列，轻链为SEQ ID NO：87的氨基酸序列。
22.权利要求1的抗体，其中该抗体包含一种、两种、三种、四种、五种或六种来自杂交瘤ATCC编号PTA-7621(10F4.4.1)所产生的抗体的HVR。
23.权利要求1的抗体，其中该抗体是人源化的。
24.权利要求12的抗体，其中该抗体是人源化的。
25.一种编码权利要求1的抗体的多核苷酸。
26.一种编码权利要求12的抗体的多核苷酸。
27.一种包含权利要求25的多核苷酸的载体。
28.一种包含权利要求26的多核苷酸的载体。
29.一种包含权利要求27的载体的宿主细胞。
30.一种包含权利要求28的载体的宿主细胞。
31.权利要求29的宿主细胞，其中该宿主细胞是真核的。
32.权利要求31的宿主细胞，其中该宿主细胞是CHO细胞。
33.权利要求30的宿主细胞，其中该宿主细胞是真核的。
34.权利要求33的宿主细胞，其中该宿主细胞是CHO细胞。
35.一种制备抗CD22抗体的方法，其中该方法包括：a)在适于表达编码该抗体的多核苷酸的条件下培养权利要求29的宿主细胞，和b)分离该抗体。
36.一种制备抗CD22抗体的方法，其中该方法包括：a)在适于表达编码该抗体的多核苷酸的条件下培养权利要求30的宿主细胞，和b)分离该抗体。
37.权利要求23的抗体，其中所述CD22是在细胞表面上表达的。
38.权利要求37的抗体，其中所述细胞是B细胞。
39.权利要求24的抗体，其中所述CD22是在细胞表面上表达的。
40.权利要求39的抗体，其中所述细胞是B细胞。
41.权利要求1的抗体，其中该抗体结合CD22中SEQ ID NO：27的第22-240位氨基酸的区域内的表位。
42.权利要求12的抗体，其中该抗体结合CD22中SEQ ID NO：27的第22-240位氨基酸的区域内的表位。
43.权利要求38的抗体，其中所述B细胞与B细胞增殖性病症有关。
44.权利要求43的抗体，其中所述B细胞增殖性病症是癌症。
45.权利要求43的抗体，其中所述B细胞增殖性病症选自：淋巴瘤和白血病。
46.权利要求45的抗体，其中所述淋巴瘤选自：非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
47.权利要求46的抗体，其中所述非何杰金氏淋巴瘤(NHL)选自：攻击性NHL和顽固性NHL。
48.权利要求46的抗体，其中所述非何杰金氏淋巴瘤(NHL)选自：复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL和顽固性无痛性NHL。
49.权利要求45的抗体，其中所述白血病选自：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
50.权利要求40的抗体，其中所述B细胞与B细胞增殖性病症有关。
51.权利要求50的抗体，其中所述B细胞增殖性疾病是癌症。
52.权利要求50的抗体，其中所述B细胞增殖性病症选自：淋巴瘤和白血病。
53.权利要求52的抗体，其中所述淋巴瘤选自：非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
54.权利要求53的抗体，其中所述非何杰金氏淋巴瘤(NHL)选自：攻击性NHL和顽固性NHL。
55.权利要求53的抗体，其中所述非何杰金氏淋巴瘤(NHL)选自：复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL和顽固性无痛性NHL。
56.权利要求52的抗体，其中所述白血病选自：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
57.权利要求1的抗体，其中该抗体是单克隆抗体。
58.权利要求57的抗体，其中该抗体是抗体片段，其选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。
59.权利要求57的抗体，其中该抗体是人源化的。
60.权利要求12的抗体，其中该抗体是单克隆抗体。
61.权利要求60的抗体，其中该抗体是抗体片段，其选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。
62.权利要求60的抗体，其中该抗体是人源化的。
63.权利要求1的抗体，其中该抗体与选自下组的抗体结合相同的表位：ATCC PTA-7621(10F4.4.1)；ATCC PTA-7620(5E8.1.8)；及包含SEQ ID NO：88的重链序列和SEQ ID NO：87的轻链序列的抗体。
64.权利要求12的抗体，其中该抗体与选自下组的抗体结合相同的表位：ATCC PTA-7621(10F4.4.1)；ATCC PTA-7620(5E8.1.8)；及包含SEQ ID NO：88的重链序列和SEQ ID NO：87的轻链序列的抗体。
65.权利要求1的抗体在制备检测试剂中的用途，该检测试剂用于一种检测CD22在生物学样品中存在的方法，该方法包括：使该生物学样品与权利要求1的抗体在容许该抗体结合至CD22的条件下接触，和检测该抗体和CD22之间是否形成复合物。
66.权利要求65的用途，其中所述生物学样品来自怀疑患有B细胞增殖性病症的患者。
67.权利要求66的用途，其中所述B细胞增殖性病症选自：淋巴瘤和白血病。
68.权利要求67的用途，其中所述淋巴瘤选自：非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
69.权利要求68的用途，其中所述非何杰金氏淋巴瘤(NHL)选自：攻击性NHL和顽固性NHL。
70.权利要求68的用途，其中所述非何杰金氏淋巴瘤(NHL)选自：复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL和顽固性无痛性NHL。
71.权利要求67的用途，其中所述白血病选自：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
72.权利要求12的抗体在制备检测试剂中的用途，该检测试剂用于一种检测CD22在生物学样品中存在的方法，该方法包括：使该生物学样品与权利要求12的抗体在容许该抗体结合至CD22的条件下接触，和检测该抗体和CD22之间是否形成复合物。
73.权利要求72的用途，其中所述生物学样品来自怀疑患有B细胞增殖性病症的患者。
74.权利要求73的用途，其中所述B细胞增殖性病症选自：淋巴瘤和白血病。
75.权利要求74的用途，其中所述淋巴瘤选自：非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
76.权利要求75的用途，其中所述非何杰金氏淋巴瘤(NHL)选自：攻击性NHL和顽固性NHL。
77.权利要求75的用途，其中所述非何杰金氏淋巴瘤(NHL)选自：复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL和顽固性无痛性NHL。
78.权利要求74的用途，其中所述白血病选自：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
79.一种药物组合物，其包含权利要求1的抗体和药学可接受载体。
80.权利要求79的药物组合物在制备用于治疗B细胞增殖性病症的药物中的用途，其中所述B细胞增殖性病症为淋巴瘤。
81.权利要求1的抗体在制备用于抑制B细胞增殖的药物中的用途，所述抑制包括使细胞暴露于权利要求1的抗体，该暴露在容许该抗体结合至CD22的条件下进行，其中所述B细胞增殖与淋巴瘤有关。
82.权利要求81的用途，其中所述B细胞是异种移植物。
83.权利要求81的用途，其中所述暴露在体外发生。
84.权利要求81的用途，其中所述暴露在体内发生。
85.权利要求12的抗体，其中该抗体是包含一个具有在0.6至1.0范围内的硫醇反应性值的游离半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造抗体，其中该半胱氨酸改造抗体是通过包括用半胱氨酸替代亲本抗体的一个氨基酸残基的方法制备的，其中半胱氨酸位于轻链第205位、重链第118位或重链第400位。
86.权利要求85的抗体，其中该半胱氨酸改造抗体比亲本抗体更能与硫醇反应性试剂起反应。
87.权利要求85的抗体，其中所述方法进一步包括通过使半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性试剂起反应来测定该半胱氨酸改造抗体的硫醇反应性；其中该半胱氨酸改造抗体比亲本抗体更能与硫醇反应性试剂起反应。
88.权利要求85的抗体，其中所述一个游离半胱氨酸氨基酸残基是位于轻链中的。
89.权利要求85的抗体，其中该抗体是共价附着至捕获标记物、检测标记物或固体支持物的。
90.权利要求89的抗体，其中该抗体是共价附着至生物素捕获标记物的。
91.权利要求89的抗体，其中该抗体是共价附着至荧光染料检测标记物的。
92.权利要求91的抗体，其中所述荧光染料选自荧光素类、罗丹明类、丹酰、丽丝胺、花青、藻红蛋白和德克萨斯红。
93.权利要求89的抗体，其中该抗体是共价附着至放射性核素检测标记物的，所述放
3 11 14 18 32 35 64 68 86 99 111 123 124 125 131射性核素检测标记物选自 H、C、C、F、P、S、Cu、Ga、Y、Tc、 In、I、 I、I、 I、
133 177 211 213
Xe、 Lu、At和 Bi。
94.权利要求93的抗体，其中该抗体是通过螯合配体共价附着至检测标记物的。
95.权利要求94的抗体，其中所述螯合配体选自DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA。
96.权利要求1的抗体，其包含清蛋白结合肽。
97.权利要求96的抗体，其中所述清蛋白结合肽选自SEQ ID NO：42-46。
98.权利要求12的抗体，其包含清蛋白结合肽。
99.权利要求98的抗体，其中所述清蛋白结合肽选自SEQ ID NO：42-46。
100.权利要求1的抗体，其中该抗体进一步包含在一个选自下组的位置上的半胱氨酸：依照Kabat编号规则的轻链第205位和依照EU编号规则的重链第118位和第400位，其中该抗体是通过包括用半胱氨酸替代亲本抗体的一个氨基酸残基的方法制备的。
101.权利要求100的抗体，其中半胱氨酸位于轻链第205位。
102.权利要求100的抗体，其中半胱氨酸位于重链第118位。
103.权利要求100的抗体，其中半胱氨酸位于重链第400位。
104.权利要求100的抗体，其中该抗体选自单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。
105.权利要求100的抗体，其是抗体片段，其选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。
106.权利要求105的抗体，其中所述抗体片段是Fab片段。
107.权利要求100的抗体，其选自嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
108.权利要求100的抗体，其是在细菌中产生的。
109.权利要求100的抗体，其是在CHO细胞中产生的。
110.权利要求100的抗体，其中该抗体比亲本抗体更能与硫醇反应性试剂起反应。
111.权利要求100的抗体，其中该抗体是共价附着至捕获标记物、检测标记物或固体支持物的。
112.权利要求111的抗体，其中该抗体是共价附着至生物素捕获标记物的。
113.权利要求111的抗体，其中该抗体是共价附着至荧光染料检测标记物的。
114.权利要求113的抗体，其中所述荧光染料选自荧光素类、罗丹明类、丹酰、丽丝胺、花青、藻红蛋白和德克萨斯红。
115.权利要求111的抗体，其中该抗体是共价附着至放射性核素检测标记物的，所述
3 11 14 18 32 35 64 68 86 99 111 123 124 125放射性核素检测标记物选自 H、C、C、F、P、S、Cu、Ga、Y、Tc、In、 I、I、 I、
131 133 177 211 213
I、 Xe、Lu、 At和 Bi。
116.权利要求111的抗体，其中该抗体是通过螯合配体共价附着至检测标记物的。
117.权利要求116的抗体，其中所述螯合配体选自DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA。
118.权利要求100的抗体在制备检测试剂中的用途，该检测试剂用于一种测定CD22蛋白在怀疑含所述CD22蛋白的样品中存在的方法，所述方法包括使所述样品暴露于权利要求100的抗体，和测定所述抗体对所述样品中的所述CD22蛋白的结合，其中所述抗体对所述CD22蛋白的结合表明所述样品中存在所述CD22蛋白。
119.权利要求118的用途，其中所述样品包含怀疑表达所述CD22蛋白的细胞。
120.权利要求118的用途，其中所述细胞是B细胞。
121.权利要求118的用途，其中所述抗体是共价附着至标记物的，所述标记物选自荧光染料、放射性同位素、生物素或金属螯合配体。
122.一种药物配制剂，其包含权利要求100的抗体，和药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
123.权利要求1的抗体在制备用于检测B细胞的试剂盒中的用途，所述检测包括：(1)使细胞暴露于权利要求1的抗体；和
(2)测定该抗体对该细胞的结合程度。
124.一种制品，其包含：
权利要求122的药物配制剂；
容器；和
包装插页或标签，其表明该药物配制剂可用于治疗以CD22多肽过表达为特征的癌症。
125.权利要求124的制品，其中所述癌症选自：淋巴瘤和白血病。
126.权利要求125的制品，其中所述淋巴瘤选自：非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
127.权利要求126的制品，其中所述非何杰金氏淋巴瘤(NHL)选自：攻击性NHL和顽固性NHL。
128.权利要求126的制品，其中所述非何杰金氏淋巴瘤(NHL)选自：复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL和顽固性无痛性NHL。
129.权利要求125的制品，其中所述白血病选自：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
130.权利要求100的抗体，其中该抗体包含选自SEQ ID NO：88、92和93的重链序列。
131.权利要求100的抗体，其中该抗体包含选自SEQ ID NO：87和91的轻链序列。
132.权利要求100的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO：87的轻链序列和SEQ ID NO：
92的重链序列。
133.权利要求100的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO：87的轻链序列和SEQ ID NO：
93的重链序列。
134.权利要求100的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO：91的轻链序列和SEQ ID NO：
88的重链序列。
说明书 :
抗体和免疫偶联物及其用途
[0001] 本申请是依据37 CFR 1.53(b)款提交的非临时申请，依据35 USC 119(e)款要求2006年5月30日提交的美国临时申请流水号60/809,328、2007年3月29日提交的
60/908,941和2007年4月13日提交的60/911,829的优先权，将这些申请的全部内容完整
收入本文作为参考。
发明领域
60/908,941和2007年4月13日提交的60/911,829的优先权，将这些申请的全部内容完整
收入本文作为参考。
发明领域
[0002] 本发明涉及抗CD22抗体及其免疫偶联物。本发明进一步涉及使用抗CD22抗体及其免疫偶联物的方法。
[0003] 发明背景
[0004] 淋巴细胞是造血过程中在骨髓中生成的许多类型白血球之一。有两大类淋巴细胞：B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。本文中特别感兴趣的淋巴细胞是B细
胞。
胞。
[0005] B细胞在骨髓内成熟，然后离开骨髓并在其细胞表面上表达抗原结合抗体。当幼稚B细胞初次遭遇其膜结合抗体对之特异性的抗原时，该细胞开始快速分裂且其后代分化
成记忆B细胞和称作“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有较长的寿命并继续表达与最
初的亲本细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不生成膜结合抗体，但改为生成可分
泌形式的抗体。分泌型抗体是体液免疫的主要效应分子。
成记忆B细胞和称作“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有较长的寿命并继续表达与最
初的亲本细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不生成膜结合抗体，但改为生成可分
泌形式的抗体。分泌型抗体是体液免疫的主要效应分子。
[0006] B细胞相关病症包括但不限于恶性淋巴瘤(非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin’slymphomas，NHL))、多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞性白血病(CLL，B细胞白血病(CD5+B淋
巴细胞))。非何杰金氏淋巴瘤(NHL)(主要源自B淋巴细胞的不同种类的一组癌症)代表
所有新诊断癌症中的大约4％(Jemal，A.等，CA-Cancer J Clin，52：23-47，(2002))。攻击
性NHL占据成人NHL的大约30-40％(Harris，N.L.等，Hematol.J.1：53-66(2001))，并包
括弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、外周T细胞淋巴瘤和间变性大细
胞淋巴瘤。一线组合化疗治愈不到一半的攻击性NHL患者，而大多数患者 最终死于他们所
患疾病(Fisher，R.I.，Semin.Oncol.27(suppl 12)：2-8(2000))。
巴细胞))。非何杰金氏淋巴瘤(NHL)(主要源自B淋巴细胞的不同种类的一组癌症)代表
所有新诊断癌症中的大约4％(Jemal，A.等，CA-Cancer J Clin，52：23-47，(2002))。攻击
性NHL占据成人NHL的大约30-40％(Harris，N.L.等，Hematol.J.1：53-66(2001))，并包
括弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、外周T细胞淋巴瘤和间变性大细
胞淋巴瘤。一线组合化疗治愈不到一半的攻击性NHL患者，而大多数患者 最终死于他们所
患疾病(Fisher，R.I.，Semin.Oncol.27(suppl 12)：2-8(2000))。
[0007] B细胞相关病症还包括自身免疫性疾病。自身免疫性疾病仍然是临床上重要的人类疾病。顾名思义，自身免疫性疾病通过身体自己的免疫系统起作用。虽然自身免疫性疾
病的各个类型间病理学机制不同，但是一种普遍的机制涉及某些抗体(本文中称为自身反
应性抗体或自身抗体)对身体的内源性蛋白质的结合。内科医生和科学家已经鉴定了超过
70种临床上不同的自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化、血管炎、免疫介导
的糖尿病、和狼疮(诸如系统性红斑狼疮)。虽然许多自身免疫性疾病是罕见的(影响不到
200,000个体)，总的来说，这些疾病折磨着数百万美国人(估计占5％的人口)，其中大多
数疾病不成比例地影响着妇女。这些疾病的慢性特性导致极大的社会和财政负担。
病的各个类型间病理学机制不同，但是一种普遍的机制涉及某些抗体(本文中称为自身反
应性抗体或自身抗体)对身体的内源性蛋白质的结合。内科医生和科学家已经鉴定了超过
70种临床上不同的自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化、血管炎、免疫介导
的糖尿病、和狼疮(诸如系统性红斑狼疮)。虽然许多自身免疫性疾病是罕见的(影响不到
200,000个体)，总的来说，这些疾病折磨着数百万美国人(估计占5％的人口)，其中大多
数疾病不成比例地影响着妇女。这些疾病的慢性特性导致极大的社会和财政负担。
[0008] 靶向B细胞表面抗原的细胞毒剂是B细胞相关癌症疗法的重要焦点。这样的一种B细胞表面抗原是CD20。利妥昔单抗(Rituximab)(Rituxan；Genentech，Inc.(South San
Francisco，CA)和IDEC Pharmaceutical Corp.(SanDiego，CA))(一种嵌合(小鼠/人)抗
CD20单克隆抗体)是由美国食品和药品管理局批准的第一种用于治疗复发性或顽固性低
级或滤泡性NHL的治疗性抗体(Leonard，J.P.等，Clin.Canc.Res.10：5327-5334(2004))。
Francisco，CA)和IDEC Pharmaceutical Corp.(SanDiego，CA))(一种嵌合(小鼠/人)抗
CD20单克隆抗体)是由美国食品和药品管理局批准的第一种用于治疗复发性或顽固性低
级或滤泡性NHL的治疗性抗体(Leonard，J.P.等，Clin.Canc.Res.10：5327-5334(2004))。
[0009] 其它B细胞抗原(诸如CD19、CD22和CD52)代表潜在用于治疗淋巴瘤的治疗剂的靶物(Grillo-Lopez A.J.等，Curr Pharm Biotechnol，2：301-11(2001))。CD22是仅
在分化的成熟期在B细胞表面上表达的135kDa B细胞限定的(B-cell-restricted)唾液
酸糖蛋白(Dorken，B.等，J.Immunol.136：4470-4479(1986))。CD22在人中的最主要形式
是CD22β，其含有胞外结构域中的7个免疫球蛋白超家族结构域(图1)(Wilson，G.L.等，
J.Exp.Med.173：137-146(1991))。一种变体形式即CD22α缺乏免疫球蛋白超家族结构域3
和4(Stamenkovic，I.和Seed，B.，Nature 345：74-77(1990))。已经显示了对人CD22的配
体结合与免疫球蛋白超家族结构域1和2(也称为表位1和2)有关(Engel，P.等，J.Exp.
Med.181：1581-1586(1995))。
在分化的成熟期在B细胞表面上表达的135kDa B细胞限定的(B-cell-restricted)唾液
酸糖蛋白(Dorken，B.等，J.Immunol.136：4470-4479(1986))。CD22在人中的最主要形式
是CD22β，其含有胞外结构域中的7个免疫球蛋白超家族结构域(图1)(Wilson，G.L.等，
J.Exp.Med.173：137-146(1991))。一种变体形式即CD22α缺乏免疫球蛋白超家族结构域3
和4(Stamenkovic，I.和Seed，B.，Nature 345：74-77(1990))。已经显示了对人CD22的配
体结合与免疫球蛋白超家族结构域1和2(也称为表位1和2)有关(Engel，P.等，J.Exp.
Med.181：1581-1586(1995))。
[0010] 在B细胞NHL中，CD22表达在攻击性和无痛性群体中的范围分别从91％至99％(Cesano，A.等，Blood 100：350a(2002))。CD22不仅可充当B细胞活化复合体的成
分(Sato，S.等，Semin.Immunol.10：287-296(1998))还可充当粘着分子(Engel，P.等，
J.Immunol.150：4719-4732(1993))。CD22缺陷小鼠的B细胞具 有较短的寿命和增强的
凋亡，这表明该抗原在B细胞存活中起关键作用(Otipoby，K.L.等，Nature(Lond)384：
634-637(1996))。在与其天然配体或抗体结合后，CD22被快速地内在化，这在初级B细胞
中提供有力的共刺激信号并在赘生性B细胞中提供促凋亡信号(proapoptotic signal)
(Sato，S.等，Immunity5：551-562(1996))。
分(Sato，S.等，Semin.Immunol.10：287-296(1998))还可充当粘着分子(Engel，P.等，
J.Immunol.150：4719-4732(1993))。CD22缺陷小鼠的B细胞具 有较短的寿命和增强的
凋亡，这表明该抗原在B细胞存活中起关键作用(Otipoby，K.L.等，Nature(Lond)384：
634-637(1996))。在与其天然配体或抗体结合后，CD22被快速地内在化，这在初级B细胞
中提供有力的共刺激信号并在赘生性B细胞中提供促凋亡信号(proapoptotic signal)
(Sato，S.等，Immunity5：551-562(1996))。
[0011] 已经研究了抗CD22抗体作为用于B细胞癌症和其它B细胞增殖性疾病的潜在疗法。此类抗CD22抗体包括RFB4(Mansfield，E.等，Blood 90：2020-2026(1997))、
CMC-544(DiJoseph，J.F.，Blood 103：1807-1814(2004)) 和 LL2(Pawlak-Byczkowska，
E.J.等，Cancer Res.49：4568-4577(1989))。LL2抗体(以前称为HPB-2)是针对CD22抗
原的IgG2a小鼠单克隆抗体(Pawlak-Byczkowska，E.J.等(1989)，见上文)。体外免疫组织
学评估证明了LL2抗体对51个所测试的B细胞NHL标本中的50个有反应性，但对其它恶性
肿瘤或正常非淋巴样组织没有反应性(Pawlak-Byczkowska(1989)，见上文；Stein，R.等，
Cancer Immunol.Immunother.37：293-298(1993))。
CMC-544(DiJoseph，J.F.，Blood 103：1807-1814(2004)) 和 LL2(Pawlak-Byczkowska，
E.J.等，Cancer Res.49：4568-4577(1989))。LL2抗体(以前称为HPB-2)是针对CD22抗
原的IgG2a小鼠单克隆抗体(Pawlak-Byczkowska，E.J.等(1989)，见上文)。体外免疫组织
学评估证明了LL2抗体对51个所测试的B细胞NHL标本中的50个有反应性，但对其它恶性
肿瘤或正常非淋巴样组织没有反应性(Pawlak-Byczkowska(1989)，见上文；Stein，R.等，
Cancer Immunol.Immunother.37：293-298(1993))。
[0012] 抗体-药物偶联物用于局部投递细胞毒剂或细胞抑制剂(即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的应用(Syrigos和Epenetos(1999)AnticancerResearch
19：605-614；Niculescu-Duvaz 和 Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26：151-172；美
国专利4975278))容许将药物模块靶向投递至肿瘤并在其中进行胞内蓄积，在那里
系统施用这些未偶联的药物可导致在试图消除肿瘤细胞的同时也对正常细胞产生了
不可接受的毒性水平(Baldwin等(1986)Lancetpp.(Mar.15，1986)：603-05；Thorpe，
(1985)″Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy：A Review″，
于Monoclonal Antibodies′84：BiologicalAnd Clinical Applications，A.Pinchera
等编，pp.475-506)。由此寻求最高的功效与最低的毒性。已经报道多克隆抗体和单克
隆抗体在这些策略中都是有用的(Rowland等(1986)Cancer Immunol.Immunother.，21：
183-87)。用于这些方法的药物包括柔红霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland
等，CancerImmunol.Immunother.21：183-87(1986))。用于抗体-毒素偶联物的毒素包括细
菌毒素(诸如白喉毒素)、植物毒素(诸如蓖麻毒蛋白)、小分子毒素(诸如格尔德霉素)
(Kerr等 (1997)Bioconjugate Chem.8(6)：781-784；Mandler等 (2000)Journal of the
Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters
10：1025-1028；Mandler等(2002) Bioconjugate Chem.13：786-791)、美登木素生物碱(EP
1391213；Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)和加利车霉素(Lode等
(1998)CancerRes.58：2928；Hinman等(1993)Cancer Res.53：3336-3342)。毒素可以通
过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制实现其细胞毒性和细胞抑制
性效果(Meyer，D.L.和Senter，P.D.，“Recent Advances in AntibodyDrug Conjugates
for Cancer Therapy”，于Annual Reports in MedicinalChemistry，卷38(2003)章23，页
229-237)。有些细胞毒性药物在偶联至大的抗体或蛋白质受体配体时趋于失活或活性降
低。
19：605-614；Niculescu-Duvaz 和 Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26：151-172；美
国专利4975278))容许将药物模块靶向投递至肿瘤并在其中进行胞内蓄积，在那里
系统施用这些未偶联的药物可导致在试图消除肿瘤细胞的同时也对正常细胞产生了
不可接受的毒性水平(Baldwin等(1986)Lancetpp.(Mar.15，1986)：603-05；Thorpe，
(1985)″Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy：A Review″，
于Monoclonal Antibodies′84：BiologicalAnd Clinical Applications，A.Pinchera
等编，pp.475-506)。由此寻求最高的功效与最低的毒性。已经报道多克隆抗体和单克
隆抗体在这些策略中都是有用的(Rowland等(1986)Cancer Immunol.Immunother.，21：
183-87)。用于这些方法的药物包括柔红霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland
等，CancerImmunol.Immunother.21：183-87(1986))。用于抗体-毒素偶联物的毒素包括细
菌毒素(诸如白喉毒素)、植物毒素(诸如蓖麻毒蛋白)、小分子毒素(诸如格尔德霉素)
(Kerr等 (1997)Bioconjugate Chem.8(6)：781-784；Mandler等 (2000)Journal of the
Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters
10：1025-1028；Mandler等(2002) Bioconjugate Chem.13：786-791)、美登木素生物碱(EP
1391213；Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)和加利车霉素(Lode等
(1998)CancerRes.58：2928；Hinman等(1993)Cancer Res.53：3336-3342)。毒素可以通
过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制实现其细胞毒性和细胞抑制
性效果(Meyer，D.L.和Senter，P.D.，“Recent Advances in AntibodyDrug Conjugates
for Cancer Therapy”，于Annual Reports in MedicinalChemistry，卷38(2003)章23，页
229-237)。有些细胞毒性药物在偶联至大的抗体或蛋白质受体配体时趋于失活或活性降
低。
[0013] (ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性111 90
B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与 In或 Y放射性同位素
通过硫脲接头-螯合剂相结合而构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等(2000)
Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77；Wiseman 等 (2002)Blood 99(12)：4336-42；Witzig
等 (2002)J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63；Witzig 等 (2002)J.Clin.Oncol.20(15)：
3262-69)。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药
TM
在大多数患者中导致严重且持久的血细胞减少。MYLOTARG (gemtuzumab ozogamicin，
Wyeth Pharmaceuticals)(由hu CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物)
在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)：
686；美 国 专 利 No.4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；
5773001)。Cantuzumab mertansine(Immunogen，Inc.)(由huC242抗体与美登木素生物碱
药物模块DM1经二硫化物接头SPP连接而构成的抗体-药物偶联物)正开发用于治疗表达
CanAg抗原的癌症，诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL
Biologics，ImmunogenInc.)(由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物
碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物)正在开发用于前列腺肿瘤的潜在治疗。
相同的美登木素生物碱药物模块DM1经非二硫化物接头SMCC与小鼠鼠单克隆抗体TA.1连
接(Chari等(1992)Cancer Research 52：127-131)。据报道，该偶联物的效力比相应的二
硫化物接头偶联物的效力低200倍。其中认为SMCC接头是“不可切割的”。
B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与 In或 Y放射性同位素
通过硫脲接头-螯合剂相结合而构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等(2000)
Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77；Wiseman 等 (2002)Blood 99(12)：4336-42；Witzig
等 (2002)J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63；Witzig 等 (2002)J.Clin.Oncol.20(15)：
3262-69)。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药
TM
在大多数患者中导致严重且持久的血细胞减少。MYLOTARG (gemtuzumab ozogamicin，
Wyeth Pharmaceuticals)(由hu CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物)
在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)：
686；美 国 专 利 No.4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；
5773001)。Cantuzumab mertansine(Immunogen，Inc.)(由huC242抗体与美登木素生物碱
药物模块DM1经二硫化物接头SPP连接而构成的抗体-药物偶联物)正开发用于治疗表达
CanAg抗原的癌症，诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL
Biologics，ImmunogenInc.)(由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物
碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物)正在开发用于前列腺肿瘤的潜在治疗。
相同的美登木素生物碱药物模块DM1经非二硫化物接头SMCC与小鼠鼠单克隆抗体TA.1连
接(Chari等(1992)Cancer Research 52：127-131)。据报道，该偶联物的效力比相应的二
硫化物接头偶联物的效力低200倍。其中认为SMCC接头是“不可切割的”。
[0014] 已经从海洋软体动物耳状截尾海兔(Dolabella auricularia)中分离出数种短肽化合物，并发现它们具有生物学活性(Pettit等(1993)Tetrahedron 49：9151；Nakamura
等 (1995)Tetrahedron Letters 36：5059-5062；Sone 等 (1995)Journal Org Chem.60：
4474)。还制备出这些化合物的类似物，并且发现有些具有生物学活性(对于综述，参
见Pettit等(1998)Anti-Cancer Drug Design13：243-277)。 例 如，auristatin E(US
5635483)是海洋天然产物多拉司他汀10(一种通过结合至微管蛋白上与抗癌药长春新碱
相同的位点来抑制微管蛋白聚合的药剂(G.R.Pettit(1997)Prog.Chem.Org.Nat.Prod.70：
1-79))的合成类似物。多拉司他汀10、auristatin PE和auristatin E是具有四个氨基
酸(其中三个对于多拉司他汀类化合物是独特的)和C末端酰胺的线性肽。
等 (1995)Tetrahedron Letters 36：5059-5062；Sone 等 (1995)Journal Org Chem.60：
4474)。还制备出这些化合物的类似物，并且发现有些具有生物学活性(对于综述，参
见Pettit等(1998)Anti-Cancer Drug Design13：243-277)。 例 如，auristatin E(US
5635483)是海洋天然产物多拉司他汀10(一种通过结合至微管蛋白上与抗癌药长春新碱
相同的位点来抑制微管蛋白聚合的药剂(G.R.Pettit(1997)Prog.Chem.Org.Nat.Prod.70：
1-79))的合成类似物。多拉司他汀10、auristatin PE和auristatin E是具有四个氨基
酸(其中三个对于多拉司他汀类化合物是独特的)和C末端酰胺的线性肽。
[0015] 将auristatin肽，auristain E(AE)和monomethylauristatin(MMAE)，多拉司他汀的合成类似物偶联至：(i)嵌合单克隆抗体cBR96(对癌瘤上的Lewis Y特异性的)；
(ii)对血液学恶性肿瘤上的CD30特异性的cAC10(Klussman等(2004)，Bioconjugate
Chemistry 15(4)：765-773；Doronina 等 (2003)NatureBiotechnology 21(7)：778-784；
“Monomethylvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands”；Francisco 等
(2003)Blood 102(4)：1458-1465；US2004/0018194)；(iii)抗CD20抗体，诸如
(利妥昔单抗)(WO04/032828)，用于治疗表达CD20的癌症和免疫病症；(iv)抗EphB2抗体
2H9和抗IL-8，用于治疗结肠直肠癌(Mao等(2004)Cancer Research64(3)：781-788)；(v)
E-选择蛋白抗体(Bhaskar等(2003)Cancer Res.63：6387-6394)；和(vi)其它抗CD30抗体
(WO 03/043583)。还已经将monomethylauristatin(MMAE)偶联至2H9，即一种针对EphB2R
的抗体，EphB2R是小鼠和人之间具有密切同源性的1型TM酪氨酸激酶受体，而且在结肠直
肠癌细胞中过表达(Mao等(2004)Cancer Res.64：781-788)。
(ii)对血液学恶性肿瘤上的CD30特异性的cAC10(Klussman等(2004)，Bioconjugate
Chemistry 15(4)：765-773；Doronina 等 (2003)NatureBiotechnology 21(7)：778-784；
“Monomethylvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands”；Francisco 等
(2003)Blood 102(4)：1458-1465；US2004/0018194)；(iii)抗CD20抗体，诸如
(利妥昔单抗)(WO04/032828)，用于治疗表达CD20的癌症和免疫病症；(iv)抗EphB2抗体
2H9和抗IL-8，用于治疗结肠直肠癌(Mao等(2004)Cancer Research64(3)：781-788)；(v)
E-选择蛋白抗体(Bhaskar等(2003)Cancer Res.63：6387-6394)；和(vi)其它抗CD30抗体
(WO 03/043583)。还已经将monomethylauristatin(MMAE)偶联至2H9，即一种针对EphB2R
的抗体，EphB2R是小鼠和人之间具有密切同源性的1型TM酪氨酸激酶受体，而且在结肠直
肠癌细胞中过表达(Mao等(2004)Cancer Res.64：781-788)。
[0016] 已经报道monomethylauristatin MMAF(一种在C末端具有苯丙氨酸的auristatin E(MMAE)变体)(US 5767237；US 6124431)比MMAE具有更低的效力，但在偶联
至单克隆抗体时具有更高的效力(Senter等，Proceedings of theAmerican Association
for Cancer Research，卷45，摘要号623，2004年3月28日)。将Auristatin F苯二胺
(AFP)(MMAE的一种苯丙氨酸变体)连接至抗CD70单克隆抗体1F6，经1F6的C末端通过
苯二胺间隔物来实现(Law等，Proceedingsof the American Association for Cancer
Research，卷45，摘要号625，2004年3月28日)。
至单克隆抗体时具有更高的效力(Senter等，Proceedings of theAmerican Association
for Cancer Research，卷45，摘要号623，2004年3月28日)。将Auristatin F苯二胺
(AFP)(MMAE的一种苯丙氨酸变体)连接至抗CD70单克隆抗体1F6，经1F6的C末端通过
苯二胺间隔物来实现(Law等，Proceedingsof the American Association for Cancer
Research，卷45，摘要号625，2004年3月28日)。
[0017] 还已经研究了抗CD22抗体-毒素偶联物作为潜在的治疗性化合物。例如， 早期报道描述了针对抗CD22的含有篦麻毒蛋白A链的免疫毒素作为潜在的抗癌剂(May，R.D.等，
Chemical Abstracts 106(21)：168656x pages 35-36(1987)；Ghetie，M.A. 等，Cancer
Research 48：2610-2617(1988)；及Amlot，P.L.等，Blood82(9)：2624-2633(1993))。若
毒素是放射性同位素，Epratuzumab即LL2的人源化(CDR嫁接的)IgG1型式已经显示了
放射性免疫偶联物的治疗活性的证据(Juweid，M.E.等，Clin.Cancer Res.5(Suppl 10)：
3292s-3303s(1999)；Griffiths，G.L. 等，J.Nucl.Med.44：77-84(2003)；Linden，O. 等，
Clin.Cancer Res.5(suppl10)：3287s-3291s(1999))。
Chemical Abstracts 106(21)：168656x pages 35-36(1987)；Ghetie，M.A. 等，Cancer
Research 48：2610-2617(1988)；及Amlot，P.L.等，Blood82(9)：2624-2633(1993))。若
毒素是放射性同位素，Epratuzumab即LL2的人源化(CDR嫁接的)IgG1型式已经显示了
放射性免疫偶联物的治疗活性的证据(Juweid，M.E.等，Clin.Cancer Res.5(Suppl 10)：
3292s-3303s(1999)；Griffiths，G.L. 等，J.Nucl.Med.44：77-84(2003)；Linden，O. 等，
Clin.Cancer Res.5(suppl10)：3287s-3291s(1999))。
[0018] 本领域中需要别的药物以治疗各种B细胞相关癌症，诸如淋巴瘤，诸如非何杰金氏淋巴瘤和其它B细胞增殖性病症。对于该目的特别有用的药物包括靶向B细胞的抗CD22
抗体-药物偶联物，其具有显著更低的毒性，但仍具有有用的治疗功效。本发明解决了过去
的这些和其它限制和问题。
抗体-药物偶联物，其具有显著更低的毒性，但仍具有有用的治疗功效。本发明解决了过去
的这些和其它限制和问题。
[0019] 本申请中的任何参考文献的叙述不是承认该参考文献是本申请的现有技术。将本文中所引用的所有参考文献(包括专利、专利申请和出版物)完整收入本文作为参考。
[0020] 发明概述
[0021] 本发明提供了抗CD22抗体及其使用方法。
[0022] 在一个方面，提供了一种结合CD22的抗体，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种HVR，其选自：
[0023] (1)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
[0024] (2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
[0025] (3)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
[0026] (4)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；
[0027] (5)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列；和
[0028] (6)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
[0029] 在另一个方面，结合CD22的抗体包含：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和(b)至少一种、两种、三种、四种或五种HVR，其选自：
[0030] (1)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
[0031] (2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
[0032] (3)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
[0033] (4)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列；和
[0034] (5)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
[0035] 在另一个方面，结合CD22的抗体包含：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，和(b)至少一种、两种、三种、四种或五种HVR，其选自：
[0036] (1)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
[0037] (2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
[0038] (3)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
[0039] (4)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列；和
[0040] (5)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
[0041] 在另一个方面，结合CD22的抗体包含：(a)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，和(b)至少一种、两种、三种、四种或五种HVR，其选自：
[0042] (1)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
[0043] (2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
[0044] (3)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列；
[0045] (4)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列；和
[0046] (5)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
[0047] 在另一个方面，结合CD22的抗体包含：(a)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，和(b)至少一种、两种、三种、四种或五种HVR，其选自：
[0048] (1)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
[0049] (2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
[0050] (3)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；
[0051] (4)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列；和
[0052] (5)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
[0053] 在一个实施方案中，该抗体包含HVR-L1，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体进一步包含：HVR-H1，其包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列；和
HVR-H2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体进一步包含：
HVR-L2，其包含SEQ NO：12的氨基酸序列；和HVR-L3，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
HVR-H2，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体进一步包含：
HVR-L2，其包含SEQ NO：12的氨基酸序列；和HVR-L3，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
[0054] 在某些实施方案中，任何上述抗体进一步包含至少一种框架，其选自VH亚组III共有框架和VL亚组I共有框架。
[0055] 在一个方面，提供了一种结合CD22的抗体，其中该抗体包含重链可变 域，其与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至
少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。在一个实施方案中，
该抗体包含SEQ ID NO：16的重链可变域。
少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。在一个实施方案中，
该抗体包含SEQ ID NO：16的重链可变域。
[0056] 在一个方面，该抗体进一步包含轻链可变域，其与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、
至少98％、或至少99％的序列同一性。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：17的轻
链可变域。
至少98％、或至少99％的序列同一性。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：17的轻
链可变域。
[0057] 在一个方面，该抗体进一步包含轻链可变域，其与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、
至少98％、或至少99％的序列同一性。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：18的轻
链可变域。
至少98％、或至少99％的序列同一性。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：18的轻
链可变域。
[0058] 在一个实施方案中，该抗体包含：重链可变域，其与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少
97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；和轻链可变域，其与SEQ ID NO：17的氨
基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、
至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个实施方案中，该抗体包含：
重链可变域，其与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少
93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一
性；和轻链可变域，其与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、
至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序
列同一性。在一个实施方案中，重链可变域包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，且轻链可变
域包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变域包含SEQ ID NO：16
的氨基酸序列，且轻链可变域包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；和轻链可变域，其与SEQ ID NO：17的氨
基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、
至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个实施方案中，该抗体包含：
重链可变域，其与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少
93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一
性；和轻链可变域，其与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、
至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序
列同一性。在一个实施方案中，重链可变域包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，且轻链可变
域包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变域包含SEQ ID NO：16
的氨基酸序列，且轻链可变域包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
[0059] 在某些实施方案中，提供了编码任何上述抗体的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了包含该多核苷酸的载体。在一个实施方案中，提供了包含该载体的宿主细胞。在一个
实施方案中，该宿主细胞是真核的。在一个实施方案中，该宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)
细胞。在一个实施方案中，提供了制备抗CD22抗体的方法，其中该方法包括在适于表达编
码该抗体的多核苷酸的条件下培养该宿主细胞，和分离该抗体。
实施方案中，该宿主细胞是真核的。在一个实施方案中，该宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)
细胞。在一个实施方案中，提供了制备抗CD22抗体的方法，其中该方法包括在适于表达编
码该抗体的多核苷酸的条件下培养该宿主细胞，和分离该抗体。
[0060] 在一个方面，提供了一种结合细胞表面上所表达的CD22的抗体。在一个实施方案中，该抗体结合人或鼠CD22中包含结构域1或结构域2或结构域1和2的区域内的表位。
在一个实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该细胞是人细胞。在一个
实施方案中，该细胞是癌细胞。在一个实施方案中，该细胞是B细胞。在一个实施方案中，
该癌细胞是B细胞。
在一个实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该细胞是人细胞。在一个
实施方案中，该细胞是癌细胞。在一个实施方案中，该细胞是B细胞。在一个实施方案中，
该癌细胞是B细胞。
[0061] 在某些实施方案中，任何上述抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，该抗体是抗体片段，其选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。在一个实施方案中，该抗体是人
源化的。在一个实施方案中，该抗体是人的。
源化的。在一个实施方案中，该抗体是人的。
[0062] 在一个方面，提供了一种检测CD22在生物学样品中存在的方法，该方法包括将该生物学样品与任何上述抗体在容许该抗体结合CD22的条件下接触，和检测该抗体和CD22
之间是否形成复合物。在一个实施方案中，该生物学样品包含B细胞。在一个实施方案中，
该生物学样品来自经历或怀疑经历B细胞病症和/或B细胞增殖性病症的哺乳动物，该病
症包括但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性
无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴
瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
之间是否形成复合物。在一个实施方案中，该生物学样品包含B细胞。在一个实施方案中，
该生物学样品来自经历或怀疑经历B细胞病症和/或B细胞增殖性病症的哺乳动物，该病
症包括但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性
无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴
瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
[0063] 在一个方面，提供了一种诊断与CD22表达升高有关的细胞增殖性病症的方法，该方法包括将测试细胞与任何上述抗体接触；通过检测该抗体对CD22的结合来测定CD22的
表达水平；和比较该测试细胞的CD22表达水平和对照细胞的CD22表达水平，其中测试细胞
的CD22表达水平高于对照细胞的CD22表达水平表明存在与CD22表达升高有关的细胞增
殖性病症。在一个实施方案中，该测试细胞是来自怀疑患有细胞增殖性病症(诸如B细胞
增殖性病症)的患者的细胞。在一个实施方案中，该细胞增殖性病症选自B细胞病症，包括
但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性
NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白
血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。在一个实施方
案中，该方法包括测定该测试细胞表面上的CD22表达水平，和比较测试细胞表面上的CD22
表达水平与对照细胞表面上的CD22表达水平。
表达水平；和比较该测试细胞的CD22表达水平和对照细胞的CD22表达水平，其中测试细胞
的CD22表达水平高于对照细胞的CD22表达水平表明存在与CD22表达升高有关的细胞增
殖性病症。在一个实施方案中，该测试细胞是来自怀疑患有细胞增殖性病症(诸如B细胞
增殖性病症)的患者的细胞。在一个实施方案中，该细胞增殖性病症选自B细胞病症，包括
但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性
NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白
血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。在一个实施方
案中，该方法包括测定该测试细胞表面上的CD22表达水平，和比较测试细胞表面上的CD22
表达水平与对照细胞表面上的CD22表达水平。
[0064] 在一个方面，提供了一种诊断与表达CD22的细胞(诸如B细胞)增加有 关的细胞增殖性病症的方法，该方法包括将生物学样品中的测试细胞与任何上述抗体接触；通过
检测该抗体对CD22的结合来测定结合至该样品中测试细胞的抗体的水平；和比较结合至
对照样品中细胞的抗体的水平，其中将所结合的抗体的水平相对于测试和对照样品中表达
CD22的细胞数进行标准化，且其中测试样品中所结合的抗体的水平高于对照样品中所结合
的抗体的水平表明存在与表达CD22的细胞有关的细胞增殖性病症。
检测该抗体对CD22的结合来测定结合至该样品中测试细胞的抗体的水平；和比较结合至
对照样品中细胞的抗体的水平，其中将所结合的抗体的水平相对于测试和对照样品中表达
CD22的细胞数进行标准化，且其中测试样品中所结合的抗体的水平高于对照样品中所结合
的抗体的水平表明存在与表达CD22的细胞有关的细胞增殖性病症。
[0065] 在一个方面，提供了一种检测血液或血清中的可溶性CD22的方法，该方法包括将来自怀疑经历B细胞增殖性病症的哺乳动物的血液或血清测试样品与本发明的抗CD22抗
体接触，和检测测试样品中可溶性CD22相对于来自正常哺乳动物的血液或血清的对照样
品中可溶性CD22的升高。在一个实施方案中，该检测方法可用作一种诊断与哺乳动物血液
或血清中可溶性CD22升高有关的B细胞增殖性病症的方法。
体接触，和检测测试样品中可溶性CD22相对于来自正常哺乳动物的血液或血清的对照样
品中可溶性CD22的升高。在一个实施方案中，该检测方法可用作一种诊断与哺乳动物血液
或血清中可溶性CD22升高有关的B细胞增殖性病症的方法。
[0066] 在一个方面，本发明的抗体包括半胱氨酸改造抗体，其中用游离半胱氨酸氨基酸替代亲本抗体的一个或多个氨基酸，正如WO2006/034488中所披露的(完整收入本文作
为参考)。可以对任何形式的抗CD22抗体进行如此改造，即突变。例如，可以改造亲本
Fab抗体片段以形成半胱氨酸改造的Fab，在本文中称为“ThioFab”。类似地，可以改造亲
本单克隆抗体以形成“ThioMab”。应当注意，单位点突变在ThioFab中产生单个改造的
半胱氨酸残基，而单位点突变在ThioMab中产生两个改造的半胱氨酸残基，由于IgG抗体
的二聚体特性。本发明的半胱氨酸改造抗CD22抗体包括单克隆抗体，人源化的或嵌合的
单克隆抗体，及抗体的抗原结合片段、融合多肽和类似物，其优先结合细胞相关CD22多肽
(cell-associated CD22 polypeptide)。或者，半胱氨酸改造抗体可以包括下述抗体，其在
抗体或Fab中在本文中所公开的位置包含半胱氨酸，该抗体由抗体的序列设计和/或选择
产生，而不必改变亲本抗体，诸如通过噬菌体展示抗体设计和选择或经由轻链和/或重链
框架序列和恒定区的重新设计。半胱氨酸改造抗体包含一个或多个游离半胱氨酸氨基酸，
其具有范围为0.6至1.0；0.7至1.0；或0.8至1.0的硫醇反应性值。游离的半胱氨酸氨
基酸指已经被改造入亲本抗体且不是二硫桥的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸改造抗体
可用于在改造的半胱氨酸位点附着细胞毒性化合物和/或成像化合物，例如经由马来酰亚
胺或卤代乙酰基。Cys残基的硫醇官能度对马来酰亚胺基团的亲核反应性比蛋白质中任何
其它氨基酸官能度(诸如赖氨酸残基 的氨基或N末端氨基)高大约1000倍。碘代乙酰基
和马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性官能度可以与胺基团起反应，但需要较高的pH(＞9.0)
和较长的反应时间(Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach，
Academic Press，London)。
为参考)。可以对任何形式的抗CD22抗体进行如此改造，即突变。例如，可以改造亲本
Fab抗体片段以形成半胱氨酸改造的Fab，在本文中称为“ThioFab”。类似地，可以改造亲
本单克隆抗体以形成“ThioMab”。应当注意，单位点突变在ThioFab中产生单个改造的
半胱氨酸残基，而单位点突变在ThioMab中产生两个改造的半胱氨酸残基，由于IgG抗体
的二聚体特性。本发明的半胱氨酸改造抗CD22抗体包括单克隆抗体，人源化的或嵌合的
单克隆抗体，及抗体的抗原结合片段、融合多肽和类似物，其优先结合细胞相关CD22多肽
(cell-associated CD22 polypeptide)。或者，半胱氨酸改造抗体可以包括下述抗体，其在
抗体或Fab中在本文中所公开的位置包含半胱氨酸，该抗体由抗体的序列设计和/或选择
产生，而不必改变亲本抗体，诸如通过噬菌体展示抗体设计和选择或经由轻链和/或重链
框架序列和恒定区的重新设计。半胱氨酸改造抗体包含一个或多个游离半胱氨酸氨基酸，
其具有范围为0.6至1.0；0.7至1.0；或0.8至1.0的硫醇反应性值。游离的半胱氨酸氨
基酸指已经被改造入亲本抗体且不是二硫桥的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸改造抗体
可用于在改造的半胱氨酸位点附着细胞毒性化合物和/或成像化合物，例如经由马来酰亚
胺或卤代乙酰基。Cys残基的硫醇官能度对马来酰亚胺基团的亲核反应性比蛋白质中任何
其它氨基酸官能度(诸如赖氨酸残基 的氨基或N末端氨基)高大约1000倍。碘代乙酰基
和马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性官能度可以与胺基团起反应，但需要较高的pH(＞9.0)
和较长的反应时间(Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach，
Academic Press，London)。
[0067] 在一个实施方案中，本发明的半胱氨酸改造抗CD22抗体包含任何一个如下位置的改造的半胱氨酸，其中该位置是轻链中依照Kabat等的编号(参见Kabat等(1991)
Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，
National Institutes of Health，Bethesda，MD)和重链(包括Fc区)中依照EU编号方
式(参见Kabat等(1991)，见上文)的编号，其中通过在图17A中划下划线来描述的轻链恒
定区开始于第108位(Kabat编号方式)，且通过在图17B和17C中划下划线来描述的重链
恒定区开始于第118位(EU编号方式)。该位置还可以通过其在图17A-17C中所示全长轻
链或重链的氨基酸顺序编号方式中的位置来提到。依照本发明的一个实施方案，抗CD22抗
体包含LC-V205C处的改造的半胱氨酸(Kabat编号：Val 205；图17A中顺序编号210，在那
个位置改造成Cys)。在图17A中以粗体、双下划线文本显示了轻链中改造的半胱氨酸。依
照一个实施方案，抗CD22抗体包含HC-A118C处的改造的半胱氨酸(EU编号：Ala 118；图
17B中顺序编号121，在那个位置改造成Cys)。在图17B中以粗体、双下划线文本显示了重
链中改造的半胱氨酸。依照一个实施方案，抗CD22抗体包含Fc-S400C处的改造的半胱氨
酸(EU编号：Ser 400；图17C中顺序编号403，在那个位置改造成Cys)。在图17C中以粗
体、双下划线文本显示了重链Fc区中的改造的半胱氨酸。在其它实施方案中，重链(包括
Fc区)的改造的半胱氨酸位于任何一个下列位置(依照EU编号方式)：41、88、116、118、
120、171、282、375或400。如此，本发明的亲本抗CD22抗体在这些位置上的氨基酸改变是：
A41C、A88C、S116C、A118C、T120C、A171C、V282C、S375C或S400C。在其它实施方案中，轻链
的改造的半胱氨酸位于任何一个下列位置(依照Kabat编号方式)：15、43、110、144、168、
205。如此，本发明的亲本抗CD22抗体在这些位置上的氨基酸改变是：V15C、A43C、V110C、
A144C、S168C或V205C。
Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，
National Institutes of Health，Bethesda，MD)和重链(包括Fc区)中依照EU编号方
式(参见Kabat等(1991)，见上文)的编号，其中通过在图17A中划下划线来描述的轻链恒
定区开始于第108位(Kabat编号方式)，且通过在图17B和17C中划下划线来描述的重链
恒定区开始于第118位(EU编号方式)。该位置还可以通过其在图17A-17C中所示全长轻
链或重链的氨基酸顺序编号方式中的位置来提到。依照本发明的一个实施方案，抗CD22抗
体包含LC-V205C处的改造的半胱氨酸(Kabat编号：Val 205；图17A中顺序编号210，在那
个位置改造成Cys)。在图17A中以粗体、双下划线文本显示了轻链中改造的半胱氨酸。依
照一个实施方案，抗CD22抗体包含HC-A118C处的改造的半胱氨酸(EU编号：Ala 118；图
17B中顺序编号121，在那个位置改造成Cys)。在图17B中以粗体、双下划线文本显示了重
链中改造的半胱氨酸。依照一个实施方案，抗CD22抗体包含Fc-S400C处的改造的半胱氨
酸(EU编号：Ser 400；图17C中顺序编号403，在那个位置改造成Cys)。在图17C中以粗
体、双下划线文本显示了重链Fc区中的改造的半胱氨酸。在其它实施方案中，重链(包括
Fc区)的改造的半胱氨酸位于任何一个下列位置(依照EU编号方式)：41、88、116、118、
120、171、282、375或400。如此，本发明的亲本抗CD22抗体在这些位置上的氨基酸改变是：
A41C、A88C、S116C、A118C、T120C、A171C、V282C、S375C或S400C。在其它实施方案中，轻链
的改造的半胱氨酸位于任何一个下列位置(依照Kabat编号方式)：15、43、110、144、168、
205。如此，本发明的亲本抗CD22抗体在这些位置上的氨基酸改变是：V15C、A43C、V110C、
A144C、S168C或V205C。
[0068] 半胱氨酸改造抗CD22抗体包含一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸，其中该半胱氨酸改造抗CD22抗体结合CD22多肽，且是通过包括用半胱氨酸替代亲本抗CD22抗体的一
个或多个氨基酸残基的方法来制备的，其中该亲本 抗体包含至少一种HVR序列，其选自：
个或多个氨基酸残基的方法来制备的，其中该亲本 抗体包含至少一种HVR序列，其选自：
[0069] (a)HVR-L1序列RSSQSIVHSNGNTFLE(SEQ ID NO：9)或序列RSSQSIVHSVGNTFLE(SEQID NO：10)(图2B)；
[0070] (b)HVR-L2序列KVSNRFS(SEQ ID NO：12)(图2B)；
[0071] (c)HVR-L3序列FQGSQFPYT(SEQ ID NO：14)(图2B)；
[0072] (d)HVR-H1序列GYEFSRSWMN(SEQ ID NO：2)(图2A)；
[0073] (e)HVR-H2序列GRIYPGDGDTNYSGKFKG(SEQ ID NO：4)(图2A)；和
[0074] (f)HVR-H3序列DGSSWDWYFDV(SEQ ID NO：6)(图2A)。
[0075] 在某个方面中，本发明涉及一种半胱氨酸改造抗CD22抗体，其包含与具有如本文中所公开的全长氨基酸序列的半胱氨酸改造抗体具有至少约80％氨基酸序列同一性，或者
至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或缺乏如本文中所
公开的信号肽的半胱氨酸改造抗体。
至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或缺乏如本文中所
公开的信号肽的半胱氨酸改造抗体。
[0076] 在又一个方面中，本发明涉及一种分离的半胱氨酸改造抗CD22抗体，其包含由如下核苷酸序列所编码的氨基酸序列，该核苷酸序列能与编码下列各项的DNA分子的互补链
发生杂交：(a)半胱氨酸改造抗体，其具有如本文中所公开的全长氨基酸序列，(b)半胱氨
酸改造抗体氨基酸序列，其缺乏如本文中所公开的信号肽，(c)跨膜的半胱氨酸改造抗体蛋
白的胞外结构域，其带有或不带有如本文中所公开的信号肽，(d)由任何在本文中所公开的
核酸序列所编码的氨基酸序列，或(e)如本文中所公开的全长的半胱氨酸改造抗体氨基酸
序列的任何其它明确限定的片段。
发生杂交：(a)半胱氨酸改造抗体，其具有如本文中所公开的全长氨基酸序列，(b)半胱氨
酸改造抗体氨基酸序列，其缺乏如本文中所公开的信号肽，(c)跨膜的半胱氨酸改造抗体蛋
白的胞外结构域，其带有或不带有如本文中所公开的信号肽，(d)由任何在本文中所公开的
核酸序列所编码的氨基酸序列，或(e)如本文中所公开的全长的半胱氨酸改造抗体氨基酸
序列的任何其它明确限定的片段。
[0077] 在一个具体的方面中，本发明提供了一种分离的半胱氨酸改造抗CD22抗体，其不带有N末端信号序列和/或不带有起始甲硫氨酸，并且是由编码如本文中所描述的氨基酸
序列的核苷酸序列所编码的。其产生方法在本文中也有描述，其中那些方法包括在适于表
达半胱氨酸改造抗体的条件下培养包含含有合适的编码核酸分子的载体的宿主细胞和从
该细胞培养物中回收半胱氨酸改造抗体。
序列的核苷酸序列所编码的。其产生方法在本文中也有描述，其中那些方法包括在适于表
达半胱氨酸改造抗体的条件下培养包含含有合适的编码核酸分子的载体的宿主细胞和从
该细胞培养物中回收半胱氨酸改造抗体。
[0078] 本发明的另一个方面提供了一种分离的半胱氨酸改造抗CD22抗体，其或是跨膜结构域删除的或是跨膜结构域失活的。其产生方法在本文中也有描述，其中那些方法包括
在适于表达半胱氨酸改造抗体的条件下培养包含含有 合适的编码核酸分子的载体的宿主
细胞和从该细胞培养物中回收半胱氨酸改造抗体。
在适于表达半胱氨酸改造抗体的条件下培养包含含有 合适的编码核酸分子的载体的宿主
细胞和从该细胞培养物中回收半胱氨酸改造抗体。
[0079] 在其它实施方案中，本发明提供了分离的抗CD22嵌合半胱氨酸改造抗体，其包含与异源(非CD22)多肽融合的任何本文所述半胱氨酸改造抗体。此类嵌合分子的例子包括
与异源多肽(诸如例如表位标签序列或免疫球蛋白Fc区)融合的任何本文所述半胱氨酸
改造抗体。
与异源多肽(诸如例如表位标签序列或免疫球蛋白Fc区)融合的任何本文所述半胱氨酸
改造抗体。
[0080] 半胱氨酸改造抗CD22抗体可以是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、或竞争性抑制抗CD22多肽抗体与其相应抗原表位结合的抗体。本发明的抗体可
以任选地偶联至生长抑制剂或细胞毒剂，诸如毒素，包括例如auristatin、抗生素、放射性
同位素、核溶酶等。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞或细菌细胞中产生，且优选地抑制
它们所结合的细胞的生长或增殖或诱导与它们所结合的细胞的死亡。为了诊断目的，本发
明的抗体可以带上可检测标记物、附着至固体支持物、等等。
以任选地偶联至生长抑制剂或细胞毒剂，诸如毒素，包括例如auristatin、抗生素、放射性
同位素、核溶酶等。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞或细菌细胞中产生，且优选地抑制
它们所结合的细胞的生长或增殖或诱导与它们所结合的细胞的死亡。为了诊断目的，本发
明的抗体可以带上可检测标记物、附着至固体支持物、等等。
[0081] 在本发明的其它实施方案中，本发明提供了包含编码任何本文所述抗CD22抗体和抗CD22半胱氨酸改造抗体的DNA的载体。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。举
例而言，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌细胞或酵母细胞。用于产生任何本文所述多肽
的方法有进一步的提供，且包括在适于表达期望多肽的条件下培养宿主细胞和从该细胞培
养物中回收期望多肽。
例而言，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌细胞或酵母细胞。用于产生任何本文所述多肽
的方法有进一步的提供，且包括在适于表达期望多肽的条件下培养宿主细胞和从该细胞培
养物中回收期望多肽。
[0082] 半胱氨酸改造抗体可用于治疗癌症，并包括对细胞表面和跨膜受体及肿瘤相关抗原(TAA)特异性的抗体。此类抗体可以以裸抗体(未偶联至药物或标记物模块)或抗
体-药物偶联物(ADC)的形式使用。本发明的半胱氨酸改造抗体可以位点特异性地且高效
地偶联有硫醇反应性试剂。该硫醇反应性试剂可以是多功能接头试剂、捕获标记物试剂、荧
光团试剂或药物-接头中间体。半胱氨酸改造抗体可以用可检测标记物标记，固定化在固
相支持物上和/或与药物模块偶联。可以将硫醇反应性普及至任何抗体，其中可以用反应
性半胱氨酸氨基酸进行氨基酸替代，这发生在轻链中选自下列氨基酸范围的范围内：L-10
至L-20；L-38至L-48；L-105至L-115；L-139至L-149；L-163至L-173，及重链中选自下
列氨基酸范围的范围内：H-35至H-45；H-83至H-93；H-114至H-127；和H-170至H-184，
及Fc区中选自下组的范围内：H-268至H-291；H-319至H-344；H-370至H-380；和H-395
至H-405，其中氨基酸位置的编号方式开始于Kabat编号系统(Kabat等(1991)Sequences
of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National
Institutes ofHealth，Bethesda，MD)的第1位并在其后顺序延续，正如WO2006034488中所
披露的。还可以将硫醇反应性普及至抗体的某些结构域，诸如轻链恒定结构域(CL)和重链
恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。可以进行导致0.6和更高的硫醇反应性值的半胱氨酸替代，
这分别发生在完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM(包括IgG亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，
IgA1和IgA2)的重链恒定域α、δ、ε、γ和μ中。此类抗体及其用途在WO2006/034488
中有披露。
体-药物偶联物(ADC)的形式使用。本发明的半胱氨酸改造抗体可以位点特异性地且高效
地偶联有硫醇反应性试剂。该硫醇反应性试剂可以是多功能接头试剂、捕获标记物试剂、荧
光团试剂或药物-接头中间体。半胱氨酸改造抗体可以用可检测标记物标记，固定化在固
相支持物上和/或与药物模块偶联。可以将硫醇反应性普及至任何抗体，其中可以用反应
性半胱氨酸氨基酸进行氨基酸替代，这发生在轻链中选自下列氨基酸范围的范围内：L-10
至L-20；L-38至L-48；L-105至L-115；L-139至L-149；L-163至L-173，及重链中选自下
列氨基酸范围的范围内：H-35至H-45；H-83至H-93；H-114至H-127；和H-170至H-184，
及Fc区中选自下组的范围内：H-268至H-291；H-319至H-344；H-370至H-380；和H-395
至H-405，其中氨基酸位置的编号方式开始于Kabat编号系统(Kabat等(1991)Sequences
of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National
Institutes ofHealth，Bethesda，MD)的第1位并在其后顺序延续，正如WO2006034488中所
披露的。还可以将硫醇反应性普及至抗体的某些结构域，诸如轻链恒定结构域(CL)和重链
恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。可以进行导致0.6和更高的硫醇反应性值的半胱氨酸替代，
这分别发生在完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM(包括IgG亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，
IgA1和IgA2)的重链恒定域α、δ、ε、γ和μ中。此类抗体及其用途在WO2006/034488
中有披露。
[0083] 本发明的半胱氨酸改造抗体优选地保留它们野生型、亲本抗体对应物的抗原结合能力。如此，半胱氨酸改造抗体能够结合(优选特异性地)抗原。此类抗原包括例
如肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白和其它细胞表面分子、跨膜蛋白、信号传导蛋
白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化有关的(例如已知或怀疑
在功能上促进的)分子、淋巴因子、细胞因子、牵涉细胞周期调控的分子、牵涉脉管发生
(vasculogenesis)的分子、和与血管发生(angiogenesis)有关的(例如已知或怀疑在功能
上促进的)分子。肿瘤相关抗原可以是簇分化因子(cluster differentiation factor)
(即CD蛋白，包括但不限于CD22)。本发明的半胱氨酸改造抗CD22抗体保留它们亲本抗
CD22抗体对应物的抗原结合能力。如此，本发明的半胱氨酸改造抗CD22抗体能够结合(优
选特异性地)CD22抗原，包括人抗CD22同种型β和/或α，包括在细胞(包括但不限于B
细胞)表面表达此类抗原时。
如肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白和其它细胞表面分子、跨膜蛋白、信号传导蛋
白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化有关的(例如已知或怀疑
在功能上促进的)分子、淋巴因子、细胞因子、牵涉细胞周期调控的分子、牵涉脉管发生
(vasculogenesis)的分子、和与血管发生(angiogenesis)有关的(例如已知或怀疑在功能
上促进的)分子。肿瘤相关抗原可以是簇分化因子(cluster differentiation factor)
(即CD蛋白，包括但不限于CD22)。本发明的半胱氨酸改造抗CD22抗体保留它们亲本抗
CD22抗体对应物的抗原结合能力。如此，本发明的半胱氨酸改造抗CD22抗体能够结合(优
选特异性地)CD22抗原，包括人抗CD22同种型β和/或α，包括在细胞(包括但不限于B
细胞)表面表达此类抗原时。
[0084] 本发明的抗体可以偶联至其它硫醇反应性试剂，其中该反应性基团是例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物(pyridyl disulfide)或其它硫醇反应性偶联配偶
(Haugland，2003，Molecular Probes Handbook of FluorescentProbes and Research
Chemicals，Molecular Probes，Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.3：2；Garman，
1997，Non-Radioactive Labelling：A PracticalApproach，Academic Press，London；
Means(1990)Bioconjugate Chem.1：2；Hermanson，G.于Bioconjugate Techniques(1996)
Academic Press，San Diego，pp.40-55，643-671)。该配偶可以是细胞毒剂(例如毒
素，诸如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团(诸如荧光染料，像荧光素或罗丹明)、用
于成像或放射性治疗金属的螯合剂、肽基或非肽基标记物或检测标签、或清除调节剂
(clearance-modifying agent)(诸如聚乙二醇的各种异构体)、与第三成分结合的肽、或另
一种碳水化合物或亲脂剂。
(Haugland，2003，Molecular Probes Handbook of FluorescentProbes and Research
Chemicals，Molecular Probes，Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.3：2；Garman，
1997，Non-Radioactive Labelling：A PracticalApproach，Academic Press，London；
Means(1990)Bioconjugate Chem.1：2；Hermanson，G.于Bioconjugate Techniques(1996)
Academic Press，San Diego，pp.40-55，643-671)。该配偶可以是细胞毒剂(例如毒
素，诸如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团(诸如荧光染料，像荧光素或罗丹明)、用
于成像或放射性治疗金属的螯合剂、肽基或非肽基标记物或检测标签、或清除调节剂
(clearance-modifying agent)(诸如聚乙二醇的各种异构体)、与第三成分结合的肽、或另
一种碳水化合物或亲脂剂。
[0085] 在一个方面，本发明的抗体可以与任何标记物模块偶联，所述标记物模块可以通过反应性模块、活化的模块或反应性半胱氨酸硫醇基团共价附着至抗体(Singh等(2002)
Anal.Biochem.304：147-15；Harlow E.和Lane，D.(1999)Using Antibodies：A Laboratory
Manual，Cold Springs Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Lundblad
R.L.(1991)Chemical Reagents for ProteinModification，第 2 版，CRC Press，Boca
Raton，FL)。所附着的标记物可以发挥下列功能：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记
物相互作用以修饰由第一或第二标记物所提供的可检测信号，例如以给出FRET(荧光共振
能量转移)；(iii)稳定与抗原或配体的相互作用或提高与抗原或配体结合的亲和力；(iv)
通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数来影响迁移率，例如电泳迁移率或细胞通透性；或
(v)提供捕获模块以调控配体亲和力、抗体/抗原结合或离子络合。
Anal.Biochem.304：147-15；Harlow E.和Lane，D.(1999)Using Antibodies：A Laboratory
Manual，Cold Springs Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Lundblad
R.L.(1991)Chemical Reagents for ProteinModification，第 2 版，CRC Press，Boca
Raton，FL)。所附着的标记物可以发挥下列功能：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记
物相互作用以修饰由第一或第二标记物所提供的可检测信号，例如以给出FRET(荧光共振
能量转移)；(iii)稳定与抗原或配体的相互作用或提高与抗原或配体结合的亲和力；(iv)
通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数来影响迁移率，例如电泳迁移率或细胞通透性；或
(v)提供捕获模块以调控配体亲和力、抗体/抗原结合或离子络合。
[0086] 经过标记的半胱氨酸改造抗体可以用于诊断测定法，例如用于在特定细胞、组织或血清中检测感兴趣抗原的表达。为了诊断应用，典型地用可检测模块标记抗体。许多标
记物是可获得的，一般可将它们分组成下列种类：
记物是可获得的，一般可将它们分组成下列种类：
[0087] 放射性同位素(放射性核素)，诸如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或213Bi。放射性同位素标记的抗
体可用于受体靶向的成像实验。使用Current Protocols in Immunology，卷1和2，Coligen
等编，Wiley-Interscience，New York，NY，Pubs.(1991)中记载的技术，可以用结合、螯合或
以其它方式络合放射性同位素金属的配体试剂来标记该抗体，其中该试剂与该抗体的改造
的半胱氨酸硫醇具有反应性。可以络合金属离子的螯合配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA
和TETA(Macrocyclics，Dallas，TX)。放射性核素可以通过与本发明的抗体-药物偶联物
络合来靶向(Wu等(2005)NatureBiotechnology 23(9)：1137-1146)。
体可用于受体靶向的成像实验。使用Current Protocols in Immunology，卷1和2，Coligen
等编，Wiley-Interscience，New York，NY，Pubs.(1991)中记载的技术，可以用结合、螯合或
以其它方式络合放射性同位素金属的配体试剂来标记该抗体，其中该试剂与该抗体的改造
的半胱氨酸硫醇具有反应性。可以络合金属离子的螯合配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA
和TETA(Macrocyclics，Dallas，TX)。放射性核素可以通过与本发明的抗体-药物偶联物
络合来靶向(Wu等(2005)NatureBiotechnology 23(9)：1137-1146)。
[0088] 接头试剂，诸如DOTA-马来酰亚胺(4-马来酰亚氨基丁酰亚氨基苄基-DOTA)(4-maleimidobutyramidobenzyl-DOTA)可以通过氨基苄基-DOTA与用氯甲酸异丙
酯(isopropylchloroformate)(Aldrich)活化的4-马来酰亚氨基丁酸(Fluka)反应
来制备，其遵循Axworthy等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(4)：1802-1807)的规
程。DOTA-马来酰亚胺试剂与半胱氨酸改造抗体的游离半胱氨酸氨基酸起反应，并在
该抗体上提供金属络合配体(Lewis等(1998)Bioconj.Chem.9：72-86)。螯合接头标
记试剂，诸如DOTA-NHS(1，4，7，10-四 氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(N-羟基
琥 珀 酰 亚 胺 酯))(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic acid
mono(N-hydroxysuccinimideester))是商品化的(Macrocyclics，Dallas，TX)。用放射性
核素标记的抗体进行的受体靶物成像可以通过检测和定量抗体在肿瘤组织中的逐渐积累
来提供途径活化的标志(Albert等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8：1207-1210)。在溶酶
体降解后，所偶联的放射性金属可以保留在细胞内。
酯(isopropylchloroformate)(Aldrich)活化的4-马来酰亚氨基丁酸(Fluka)反应
来制备，其遵循Axworthy等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(4)：1802-1807)的规
程。DOTA-马来酰亚胺试剂与半胱氨酸改造抗体的游离半胱氨酸氨基酸起反应，并在
该抗体上提供金属络合配体(Lewis等(1998)Bioconj.Chem.9：72-86)。螯合接头标
记试剂，诸如DOTA-NHS(1，4，7，10-四 氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(N-羟基
琥 珀 酰 亚 胺 酯))(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic acid
mono(N-hydroxysuccinimideester))是商品化的(Macrocyclics，Dallas，TX)。用放射性
核素标记的抗体进行的受体靶物成像可以通过检测和定量抗体在肿瘤组织中的逐渐积累
来提供途径活化的标志(Albert等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8：1207-1210)。在溶酶
体降解后，所偶联的放射性金属可以保留在细胞内。
[0089] 适合作为用于成像实验的抗体标记物的金属-螯剂复合体披露于：US5342606；US5428155；US 5316757；US 5480990；US 5462725；US 5428139；US 5385893；US 5739294；
US 5750660；US 5834456；Hnatowich等 (1983)J.Immunol.Methods 65：147-157；Meares
等 (1984)Anal.Biochem.142：68-78；Mirzadeh 等 (1990)Bioconjugate Chem.1：59-65；
Meares等(1990)J.Cancer1990，Suppl.10：21-26；Izard等(1992)Bioconjugate Chem.3：
346-350；Nikula 等 (1995)Nucl.Med.Biol.22：387-90；Camera 等 (1993)Nucl.Med.
Biol.20：955-62；Kukis 等 (1998)J.Nucl.Med.39：2105-2110；Verel 等 (2003)J.Nucl.
Med.44：1663-1670；Camera 等 (1994)J.Nucl.Med.21：640-646；Ruegg 等 (1990)Cancer
Res.50：4221-4226；Verel 等 (2003)J.Nucl.Med.44：1663-1670；Lee 等 (2001)Cancer
Res.61：4474-4482；Mitchell等(2003)J.Nucl.Med.44：1105-1112；Kobayashi等(1999)
Bioconjugate Chem.10：103-111；Miederer 等 (2004)J.Nucl.Med.45：129-137；DeNardo
等 (1998)ClinicalCancer Research 4：2483-90；Blend 等 (2003)Cancer Biotherapy
&Radiopharmaceuticals 18：355-363；Nikula 等 (1999)J.Nucl.Med.40：166-76；
Kobayashi等(1998)J.Nucl.Med.39：829-36；Mardirossian等(1993)Nucl.Med.Biol.20：
65-74；Roselli等(1999)Cancer Biotherapy &Radiopharmaceuticals，14：209-20。
US 5750660；US 5834456；Hnatowich等 (1983)J.Immunol.Methods 65：147-157；Meares
等 (1984)Anal.Biochem.142：68-78；Mirzadeh 等 (1990)Bioconjugate Chem.1：59-65；
Meares等(1990)J.Cancer1990，Suppl.10：21-26；Izard等(1992)Bioconjugate Chem.3：
346-350；Nikula 等 (1995)Nucl.Med.Biol.22：387-90；Camera 等 (1993)Nucl.Med.
Biol.20：955-62；Kukis 等 (1998)J.Nucl.Med.39：2105-2110；Verel 等 (2003)J.Nucl.
Med.44：1663-1670；Camera 等 (1994)J.Nucl.Med.21：640-646；Ruegg 等 (1990)Cancer
Res.50：4221-4226；Verel 等 (2003)J.Nucl.Med.44：1663-1670；Lee 等 (2001)Cancer
Res.61：4474-4482；Mitchell等(2003)J.Nucl.Med.44：1105-1112；Kobayashi等(1999)
Bioconjugate Chem.10：103-111；Miederer 等 (2004)J.Nucl.Med.45：129-137；DeNardo
等 (1998)ClinicalCancer Research 4：2483-90；Blend 等 (2003)Cancer Biotherapy
&Radiopharmaceuticals 18：355-363；Nikula 等 (1999)J.Nucl.Med.40：166-76；
Kobayashi等(1998)J.Nucl.Med.39：829-36；Mardirossian等(1993)Nucl.Med.Biol.20：
65-74；Roselli等(1999)Cancer Biotherapy &Radiopharmaceuticals，14：209-20。
[0090] (b)荧光标记物，诸如稀土螯合物，铕螯合物；荧光素类，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明类，包括TAMRA；丹酰；丽丝胺；花青；藻红蛋白；德克萨斯红；和
它们的类似物。使用例如Current Protocols inImmunology(见上文)中披露的技术，可以
将荧光标记物偶联至抗体。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自Invitrogen/Molecular
Probes(Eugene，OR)和Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，IL)的那些。
它们的类似物。使用例如Current Protocols inImmunology(见上文)中披露的技术，可以
将荧光标记物偶联至抗体。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自Invitrogen/Molecular
Probes(Eugene，OR)和Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，IL)的那些。
[0091] (c)各种酶-底物标记物是可获得的或有披露的(US 4275149)。该酶一般 催化显色底物的化学改变，其可以采用各种技术来测量。例如，该酶可以催化底物的颜色变化，其
可以用分光光度法来测量。或者，该酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光变
化的技术在上文有描述。化学发光底物通过化学反应而成为电子激发的，然后可以发射可
测量的光(例如使用化学发光计)或给荧光受体贡献能量。酶标记物的例子包括萤光素酶
(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；US 4737456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸
脱氢酶、脲酶、过氧化物酶，诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、
葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢
酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将
酶偶联至抗体的技术披露于：O′Sullivan等(1981)“Methods for the Preparation of
Enzyme-AntibodyConiugates for use in Enzyme Immunoassay”，于Methods in Enzym.
(J.Langone和H.Van Vunakis编)，Academic Press，New York，73：147-166。
可以用分光光度法来测量。或者，该酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光变
化的技术在上文有描述。化学发光底物通过化学反应而成为电子激发的，然后可以发射可
测量的光(例如使用化学发光计)或给荧光受体贡献能量。酶标记物的例子包括萤光素酶
(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；US 4737456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸
脱氢酶、脲酶、过氧化物酶，诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、
葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢
酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将
酶偶联至抗体的技术披露于：O′Sullivan等(1981)“Methods for the Preparation of
Enzyme-AntibodyConiugates for use in Enzyme Immunoassay”，于Methods in Enzym.
(J.Langone和H.Van Vunakis编)，Academic Press，New York，73：147-166。
[0092] 酶-底物组合的例子包括例如：
[0093] (i)辣根过氧化物酶(HRP)与作为底物的过氧化氢，其中该过氧化氢氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
[0094] (ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和
[0095] (iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷)。
[0096] 许多其它的酶-底物组合对本领域技术人员而言是可获得的。一般综述参见US4275149和US 4318980。
[0097] 标记物可以间接地与氨基酸侧链、活化的氨基酸侧链、半胱氨酸改造抗体等偶联。例如，抗体可以与生物素偶联，并且任何上述三大类标记物可以与亲合素或链霉亲合
素偶联，反之亦然。生物素选择性结合链霉亲合素，如此，标记物可以以该间接方式与抗体
偶联。或者，为了实现标记物与多肽变体的间接偶联，多肽变体与小的半抗原(例如地高
辛)偶联，并且上述不同类型的标记物之一与抗半抗原多肽变体(例如抗地高辛抗体)偶
联。如此，可以实现标记物与多肽变体的间接偶联(Hermanson，G.(1996)于Bioconjugate
Techniques Academic Press，San Diego)。
素偶联，反之亦然。生物素选择性结合链霉亲合素，如此，标记物可以以该间接方式与抗体
偶联。或者，为了实现标记物与多肽变体的间接偶联，多肽变体与小的半抗原(例如地高
辛)偶联，并且上述不同类型的标记物之一与抗半抗原多肽变体(例如抗地高辛抗体)偶
联。如此，可以实现标记物与多肽变体的间接偶联(Hermanson，G.(1996)于Bioconjugate
Techniques Academic Press，San Diego)。
[0098] 可以在任何已知的测定方法中使用本发明的抗体，诸如ELISA、克争性结合测定法、直接和间接三明治式测定法或夹心式测定法、和免疫沉淀测定 法(Zola，(1987)
Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158，CRC Press，Inc.)。
Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158，CRC Press，Inc.)。
[0099] 检测标记物可用于对结合或识别事件进行定位、显现和定量。经过标记的本发明抗体可检测细胞表面受体。经过可检测标记的抗体的另一种用途是基于珠子的免疫捕获方
法，其包括将珠子与荧光标记的抗体偶联，和在配体结合后检测荧光信号。类似的结合检测
方法学利用表面等离振子共振(SPR)效应来测量和检测抗体-抗原相互作用。
法，其包括将珠子与荧光标记的抗体偶联，和在配体结合后检测荧光信号。类似的结合检测
方法学利用表面等离振子共振(SPR)效应来测量和检测抗体-抗原相互作用。
[0100] 检测标记物(诸如荧光染料和化学发光染料)(Briggs等(1997)″SynthesisofFunctionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and AminoAcids″，
J.Chem.Soc.，Perkin-Trans.1：1051-1058)提供可检测的信号，并且一般可用于标记抗
体，优先具有下列性质：(i)经过标记的抗体应产生很高的信号但低的背景，使得在无细胞
测定法和基于细胞的测定法中都能灵敏地检测出少量的抗体；和(ii)经过标记的抗体应
是光稳定的，使得可以观察、监测和记录荧光信号，但没有显著的光漂白。对于涉及经标记
抗体对膜或细胞表面(尤其是活细胞)的细胞表面结合的应用，标记物优选地(iii)具有
优良的水溶性以实现有效的偶联物浓度和检测灵敏度，且(iv)对活细胞是无毒性的，免得
破坏细胞的正常代谢过程或引起过早的细胞死亡。
J.Chem.Soc.，Perkin-Trans.1：1051-1058)提供可检测的信号，并且一般可用于标记抗
体，优先具有下列性质：(i)经过标记的抗体应产生很高的信号但低的背景，使得在无细胞
测定法和基于细胞的测定法中都能灵敏地检测出少量的抗体；和(ii)经过标记的抗体应
是光稳定的，使得可以观察、监测和记录荧光信号，但没有显著的光漂白。对于涉及经标记
抗体对膜或细胞表面(尤其是活细胞)的细胞表面结合的应用，标记物优选地(iii)具有
优良的水溶性以实现有效的偶联物浓度和检测灵敏度，且(iv)对活细胞是无毒性的，免得
破坏细胞的正常代谢过程或引起过早的细胞死亡。
[0101] 可以在用活细胞或珠子自动实施混合和读取(mix-and-read)、非放射性测定法的系统( 8100 HTS System，Applied Biosystems，Foster City，Calif.)
上进行细胞荧光强度的直接定量和荧光标记事件(例如肽-染料偶联物的细胞表面
结 合)的 点 查 (Miraglia， ″Homogeneous cell-and bead-based assays forhigh
throughput screening using fluorometric microvolume assay technology″，(1999)
J.of Biomolecular Screening 4：193-204)。经过标记的抗体的用途还包括细胞表面受
体结合测定法、免疫捕获测定法、荧光连接的免疫吸附测定法(FLISA)、胱天蛋白酶切割
(Zheng，″Caspase-3 controls both cytoplasmic andnuclear events associated with
Fas-mediated apoptosis in vivo ″，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：618-23；US
6372907)、凋亡(Vermes，″A novel assay forapoptosis.Flow cytometric detection
of phosphatidylserine expression on earlyapoptotic cells using fluorescein
labelled Annexin V″(1995)J.Immunol.Methods 184：39-51)和细胞毒性测定法。可
以使用荧光计量微体积测定法(fluorometric microvolume assay)技术鉴定由靶向细
胞表面的分子所引起的上 调或下调(Swartzman，″A homogeneous and multiplexed
immunoassay forhigh-throughput screening using fluorometric microvolume assay
technology″，(1999)Anal.Biochem.271：143-51)。
上进行细胞荧光强度的直接定量和荧光标记事件(例如肽-染料偶联物的细胞表面
结 合)的 点 查 (Miraglia， ″Homogeneous cell-and bead-based assays forhigh
throughput screening using fluorometric microvolume assay technology″，(1999)
J.of Biomolecular Screening 4：193-204)。经过标记的抗体的用途还包括细胞表面受
体结合测定法、免疫捕获测定法、荧光连接的免疫吸附测定法(FLISA)、胱天蛋白酶切割
(Zheng，″Caspase-3 controls both cytoplasmic andnuclear events associated with
Fas-mediated apoptosis in vivo ″，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：618-23；US
6372907)、凋亡(Vermes，″A novel assay forapoptosis.Flow cytometric detection
of phosphatidylserine expression on earlyapoptotic cells using fluorescein
labelled Annexin V″(1995)J.Immunol.Methods 184：39-51)和细胞毒性测定法。可
以使用荧光计量微体积测定法(fluorometric microvolume assay)技术鉴定由靶向细
胞表面的分子所引起的上 调或下调(Swartzman，″A homogeneous and multiplexed
immunoassay forhigh-throughput screening using fluorometric microvolume assay
technology″，(1999)Anal.Biochem.271：143-51)。
[0102] 经过标记的本发明抗体可通过生物医学和分子成像的各种方法和技术用作成像生物标志物和探针，诸如：(i)MRI(磁共振成像)；(ii)microCT(计算机化断层成像)；
(iii)SPECT(单光子发射计算机化断层成像)；(iv)PET(正电子发射断层成像)Chen等
(2004)Bioconjugate Chem.15：41-49；(v)生物发光；(vi)荧光；和(vii)超声。免疫闪烁
照相术是一种成像规程，其中给动物或人患者施用用放射性物质标记的抗体，并拍摄身体
中该抗体定位的部位的照片(US 6528624)。可以将成像生物标志物作为正常生物学过程、
病理学过程、或对治疗性干涉的药理学应答的指示客观地测量并评估。生物标志物可以是
数种类型：类型0是疾病的天然历史标志物，并与已知临床指标(例如类风湿性关节炎中滑
膜炎症的MRI评估)纵向相关；类型I标志物捕获依照作用机制(mechanism-of-action)
的干涉效应，即使该机制可能与临床结果无关；类型II标志物充当代用终点(surrogate
endpoint)，其中该生物标志物的改变或来自该生物标志物的信号预示临床益处以“证实”
靶向应答，诸如通过CT在类风湿性关节炎中测量到的骨侵蚀。如此，成像生物标志物可以
提供关于下列各项的药效学(PD)治疗信息：(i)靶蛋白的表达，(ii)治疗剂对靶蛋白的结
合，即选择性，和(iii)清除和半衰期药动学数据。体内成像生物标志物相对于基于实验室
的生物标志物的优点包括：非侵入性处理(non-invasivetreatment)，可定量，全身评估，
重复定量给药和评估(即多个时间点)，及从临床前结果(小动物)结果至临床结果(人)
的潜在可转换效应。对于一些应用，生物成像代替或最少化临床前研究中动物实验的数目。
(iii)SPECT(单光子发射计算机化断层成像)；(iv)PET(正电子发射断层成像)Chen等
(2004)Bioconjugate Chem.15：41-49；(v)生物发光；(vi)荧光；和(vii)超声。免疫闪烁
照相术是一种成像规程，其中给动物或人患者施用用放射性物质标记的抗体，并拍摄身体
中该抗体定位的部位的照片(US 6528624)。可以将成像生物标志物作为正常生物学过程、
病理学过程、或对治疗性干涉的药理学应答的指示客观地测量并评估。生物标志物可以是
数种类型：类型0是疾病的天然历史标志物，并与已知临床指标(例如类风湿性关节炎中滑
膜炎症的MRI评估)纵向相关；类型I标志物捕获依照作用机制(mechanism-of-action)
的干涉效应，即使该机制可能与临床结果无关；类型II标志物充当代用终点(surrogate
endpoint)，其中该生物标志物的改变或来自该生物标志物的信号预示临床益处以“证实”
靶向应答，诸如通过CT在类风湿性关节炎中测量到的骨侵蚀。如此，成像生物标志物可以
提供关于下列各项的药效学(PD)治疗信息：(i)靶蛋白的表达，(ii)治疗剂对靶蛋白的结
合，即选择性，和(iii)清除和半衰期药动学数据。体内成像生物标志物相对于基于实验室
的生物标志物的优点包括：非侵入性处理(non-invasivetreatment)，可定量，全身评估，
重复定量给药和评估(即多个时间点)，及从临床前结果(小动物)结果至临床结果(人)
的潜在可转换效应。对于一些应用，生物成像代替或最少化临床前研究中动物实验的数目。
[0103] 肽标记方法是公知的。参见Haugland，2003，Molecular Probes HandbookofFluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular Probes，Inc.；Brinkley，
1992，Bioconjugate Chem.3：2；Garman，(1997)Non-Radioactive Labelling：APractical
Approach，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1：2；Glazer 等
(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniquesin Biochemistry
and Molecular Biology(T.S.Work 和E.Work 编 )AmericanElsevier Publishing Co.，
New York；Lundblad，R.L. 和 Noyes，C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein
Modification，卷 I 和 II，CRC Press，New York； Pfleiderer，G.(1985)“Chemical
Modification of Proteins”，Modern Methods inProtein Chemistry，H.Tschesche编，
Walter DeGryter，Berlin和New York；及Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation
and Cross-linking，CRC Press，Boca Raton，Fla.)；De Leon-Rodriguez等(2004)Chem.
Eur.J.10：1149-1155；Lewis 等 (2001)Bioconjugate Chem.12：320-324；Li 等 (2002)
BioconjugateChem.13：110-115；Mier等(2005)Bioconjugate Chem.16：240-237。
1992，Bioconjugate Chem.3：2；Garman，(1997)Non-Radioactive Labelling：APractical
Approach，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1：2；Glazer 等
(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniquesin Biochemistry
and Molecular Biology(T.S.Work 和E.Work 编 )AmericanElsevier Publishing Co.，
New York；Lundblad，R.L. 和 Noyes，C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein
Modification，卷 I 和 II，CRC Press，New York； Pfleiderer，G.(1985)“Chemical
Modification of Proteins”，Modern Methods inProtein Chemistry，H.Tschesche编，
Walter DeGryter，Berlin和New York；及Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation
and Cross-linking，CRC Press，Boca Raton，Fla.)；De Leon-Rodriguez等(2004)Chem.
Eur.J.10：1149-1155；Lewis 等 (2001)Bioconjugate Chem.12：320-324；Li 等 (2002)
BioconjugateChem.13：110-115；Mier等(2005)Bioconjugate Chem.16：240-237。
[0104] 用两种模块即荧光报道物和淬灭剂标记的肽和蛋白质在足够接近时经历荧光共振能量转移(FRET)。报道物基团典型地是荧光染料，其由某个波长的光激发并转移能量给
受体或淬灭剂基团，其具有合适的斯托克司频移(Stokes shift)以在最高亮度发光。荧光
染料包括具有延伸芳香性的分子，诸如荧光素和罗丹明及其衍生物。荧光报道物可以由完
整肽中的淬灭剂模块部分地或显著地淬灭。在肽酶或蛋白酶切割肽后，可以测量可检测的
荧光增加(Knight，C.(1995)“Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes”，Methods
inEnzymology，Academic Press，248：18-34)。
受体或淬灭剂基团，其具有合适的斯托克司频移(Stokes shift)以在最高亮度发光。荧光
染料包括具有延伸芳香性的分子，诸如荧光素和罗丹明及其衍生物。荧光报道物可以由完
整肽中的淬灭剂模块部分地或显著地淬灭。在肽酶或蛋白酶切割肽后，可以测量可检测的
荧光增加(Knight，C.(1995)“Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes”，Methods
inEnzymology，Academic Press，248：18-34)。
[0105] 经过标记的本发明抗体还可以用作亲和纯化剂。在该方法中，使用本领域公知的方法将经过标记的抗体固定化在固相(诸如Sephadex树脂或滤纸)上。使固定化的抗体
与含有待纯化抗原的样品接触，其后用合适的溶剂清洗支持物，这会清除该样品中除待纯
化抗原(其结合至固定化的多肽变体)以外的基本上所有材料。最后，用另一种合适的溶
剂(诸如甘氨酸缓冲液，pH5.0)清洗支持物，这会从多肽变体中释放抗原。
与含有待纯化抗原的样品接触，其后用合适的溶剂清洗支持物，这会清除该样品中除待纯
化抗原(其结合至固定化的多肽变体)以外的基本上所有材料。最后，用另一种合适的溶
剂(诸如甘氨酸缓冲液，pH5.0)清洗支持物，这会从多肽变体中释放抗原。
[0106] 标记试剂典型地具有反应性官能度，其可以(i)与半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸硫醇直接反应以形成经过标记的抗体，(ii)与接头试剂反应以形成接头-标记物中间体，
或(iii)与接头抗体反应以形成经过标记的抗体。标记试剂的反应性官能度包括：马来酰
亚胺、卤乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亚氨基酯(例如NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸、磺
酰氯、2，6-二氯三嗪基、五氟苯基酯、和亚磷酰胺，尽管还可以使用其它官能团。
或(iii)与接头抗体反应以形成经过标记的抗体。标记试剂的反应性官能度包括：马来酰
亚胺、卤乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亚氨基酯(例如NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸、磺
酰氯、2，6-二氯三嗪基、五氟苯基酯、和亚磷酰胺，尽管还可以使用其它官能团。
[0107] 例示性的反应性官能团是可检测标记物(例如生物素或荧光染料)的羧基取代基的N-羟基琥珀酰亚氨基酯(NHS)。可以预制、分离、纯化和/或表征该标记物的NHS酯，
或者可以使其原位形成，并与抗体的亲核基团起反应。典型地，将羧基形式的标记物通
过与碳二亚胺试剂(例如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺)、或脲阳离子试剂(例
如TSTU(O-(N-琥珀酰亚氨 基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟化硼盐)、HBTU((O-苯并三
唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)或HATU((O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，
N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)、活化剂(诸如1-羟基苯并三唑(HOBt)和N-羟基琥珀酰
亚胺)的一些组合起反应而活化以给出该标记物的NHS酯。在一些情况中，可以通过标记
物的原位活化和与抗体反应来偶联标记物和抗体以在一个步骤中形成标记物-抗体偶联
物。其它活化和偶联试剂包括TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1-1，3，3-四甲基脲六氟磷
酸盐)、TFFH(N，N’，N”，N”’-四甲基脲2-氟-六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧
代-三吡咯烷膦六氟磷酸盐)、EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢-喹啉)、DCC(二
环己基碳二亚胺)、DIPCDI(二异丙基碳二亚胺)、MSNT(1-(均三甲基苯-2-磺酰)-3-硝
基-1H-1，2，4-三唑和芳基磺酰卤化物，例如三异丙基苯磺酰氯。
或者可以使其原位形成，并与抗体的亲核基团起反应。典型地，将羧基形式的标记物通
过与碳二亚胺试剂(例如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺)、或脲阳离子试剂(例
如TSTU(O-(N-琥珀酰亚氨 基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟化硼盐)、HBTU((O-苯并三
唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)或HATU((O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，
N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)、活化剂(诸如1-羟基苯并三唑(HOBt)和N-羟基琥珀酰
亚胺)的一些组合起反应而活化以给出该标记物的NHS酯。在一些情况中，可以通过标记
物的原位活化和与抗体反应来偶联标记物和抗体以在一个步骤中形成标记物-抗体偶联
物。其它活化和偶联试剂包括TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1-1，3，3-四甲基脲六氟磷
酸盐)、TFFH(N，N’，N”，N”’-四甲基脲2-氟-六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧
代-三吡咯烷膦六氟磷酸盐)、EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢-喹啉)、DCC(二
环己基碳二亚胺)、DIPCDI(二异丙基碳二亚胺)、MSNT(1-(均三甲基苯-2-磺酰)-3-硝
基-1H-1，2，4-三唑和芳基磺酰卤化物，例如三异丙基苯磺酰氯。
[0108] 本发明的清蛋白结合肽-Fab化合物
[0109] 在一个方面，本发明的抗体融合至清蛋白结合蛋白。血浆蛋白结合可以是改善短命分子的药动学性质的有效手段。清蛋白是血浆中最丰富的蛋白质。血清清蛋白
结合肽(ABP)可以改变所融合的活性结构域蛋白质的药效学，包括改变组织摄取、渗
透和扩散。可以通过合适的血清清蛋白结合肽序列的具体选择来调控这些药效学参
数(US 20040001827)。通过噬菌体展示筛选鉴定了一系列清蛋白结合肽(Dennis等
(2002“) Albumin Binding As A GeneralStrategy For Improving The Pharmacokinetics
Of Proteins”J Biol Chem.277：35035-35043；WO 01/45746)。本发明的化合物包括由下
列文献所教导的ABP序列：(i)Dennis等(2002)J Biol Chem.277：35035-35043表III和
IV，第35038页；(ii)US 20040001827段[0076]SEQ ID NOS：9-22；和(iii)WO01/45746，第
12-13页，都收入本文作为参考。通过以1∶1化学计量比(1ABP/1Fab)将清蛋白结合肽融
合至Fab重链的C末端来改造清蛋白结合(ABP)-Fab。显示了这些ABP-Fab与清蛋白的结
合使抗体在家兔和小鼠中的半衰期增加了25倍多。因此，可以将上述反应性Cys残基导入
这些ABP-Fab，并用于与细胞毒性药物的位点特异性偶联，接着是体内动物研究。
结合肽(ABP)可以改变所融合的活性结构域蛋白质的药效学，包括改变组织摄取、渗
透和扩散。可以通过合适的血清清蛋白结合肽序列的具体选择来调控这些药效学参
数(US 20040001827)。通过噬菌体展示筛选鉴定了一系列清蛋白结合肽(Dennis等
(2002“) Albumin Binding As A GeneralStrategy For Improving The Pharmacokinetics
Of Proteins”J Biol Chem.277：35035-35043；WO 01/45746)。本发明的化合物包括由下
列文献所教导的ABP序列：(i)Dennis等(2002)J Biol Chem.277：35035-35043表III和
IV，第35038页；(ii)US 20040001827段[0076]SEQ ID NOS：9-22；和(iii)WO01/45746，第
12-13页，都收入本文作为参考。通过以1∶1化学计量比(1ABP/1Fab)将清蛋白结合肽融
合至Fab重链的C末端来改造清蛋白结合(ABP)-Fab。显示了这些ABP-Fab与清蛋白的结
合使抗体在家兔和小鼠中的半衰期增加了25倍多。因此，可以将上述反应性Cys残基导入
这些ABP-Fab，并用于与细胞毒性药物的位点特异性偶联，接着是体内动物研究。
[0110] 例示性的清蛋白结合肽序列包括但不限于SEQ ID NO：42-46中列出的氨基酸序列：
[0111] CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO：42
[0112] QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO：43
[0113] QRLIEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO：44
[0114] RLIEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO：45
[0115] DICLPRWGCLW SEQ ID NO：46
[0116] 抗体-药物偶联物
[0117] 在另一个方面，本发明提供了包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物或抗体-药物偶联物(ADC)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真
菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。在另一个
方面，本发明还提供了使用免疫偶联物的方法。在一个方面，免疫偶联物包含共价附着至细
胞毒剂或可检测试剂的任何上述抗CD22抗体。
菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。在另一个
方面，本发明还提供了使用免疫偶联物的方法。在一个方面，免疫偶联物包含共价附着至细
胞毒剂或可检测试剂的任何上述抗CD22抗体。
[0118] 抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂或细胞抑制剂(即杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research
19：605-614；Niculescu-Duvaz 和 Springer(1997)Adv.DrgDel.Rev.26：151-172；US
4,975,278)容许将药物模块靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些
未经偶联的药物试剂在试图消除的肿瘤细胞以外可导致不可接受的对正常细胞的毒性水
平(Baldwin等(1986)Lancet(Mar.15，1986)：603-05；Thorpe(1985)″Antibody Carriers
Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy：A Review″，于Monoclonal Antibodies′84：
BiologicalAnd Clinical Applications(A.Pinchera等编)pp.475-506)。由此寻求最
大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略(Rowland等
(1986)Cancer Immunol.Immunother.21：183-87)。这些方法中所使用的药物包括道诺
霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛
(vindesine)(Rowland等(1986)见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒
素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)
(Mandler 等 (2000)Jour..of the Nat.CancerInst.92(19)：1573-1581；Mandler 等
(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters10：1025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate
Chem.13：786-791)、美登木素生物碱(EP 1391213；Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
93：8618-8623)、和加利车霉素(Lode等(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等(1993)
Cancer Res.53：3336-3342)。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制
在内的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制性效应。有些细胞毒性药物在与大的抗体或蛋白质
受体配体偶联时趋于失活或活性降低。
19：605-614；Niculescu-Duvaz 和 Springer(1997)Adv.DrgDel.Rev.26：151-172；US
4,975,278)容许将药物模块靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些
未经偶联的药物试剂在试图消除的肿瘤细胞以外可导致不可接受的对正常细胞的毒性水
平(Baldwin等(1986)Lancet(Mar.15，1986)：603-05；Thorpe(1985)″Antibody Carriers
Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy：A Review″，于Monoclonal Antibodies′84：
BiologicalAnd Clinical Applications(A.Pinchera等编)pp.475-506)。由此寻求最
大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略(Rowland等
(1986)Cancer Immunol.Immunother.21：183-87)。这些方法中所使用的药物包括道诺
霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛
(vindesine)(Rowland等(1986)见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒
素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)
(Mandler 等 (2000)Jour..of the Nat.CancerInst.92(19)：1573-1581；Mandler 等
(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters10：1025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate
Chem.13：786-791)、美登木素生物碱(EP 1391213；Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
93：8618-8623)、和加利车霉素(Lode等(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等(1993)
Cancer Res.53：3336-3342)。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制
在内的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制性效应。有些细胞毒性药物在与大的抗体或蛋白质
受体配体偶联时趋于失活或活性降低。
[0119] (ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的
111 90
In或 Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等(2000)Eur.Jour.
Nucl.Med.27(7)：766-77；Wiseman 等 (2002)Blood 99(12)：4336-42；Witzig 等 (2002)
J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63；Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69)。尽管
ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严
TM
重且持久的血细胞减少。MYLOTARG (gemtuzumab ozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals)，
即由hu CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注
射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)：686；美国专利No.4970198；
5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumab
mertansine(Immunogen，Inc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药
物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进入用于治疗表达CanAg的癌症诸如结
肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，
Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物部
分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，在开发用于前列腺肿瘤的潜在治疗。将多拉司他汀
(dolastatin)的合成类似物auristatin肽，auristatinE(AE)和单甲基auristatin(MMAE)
与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌瘤上的Lewis Y特异)和cAC10(对血液学恶性肿瘤上的
CD30特异)偶联(Doronina等(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784)，且正在进
行治疗性开发。
111 90
In或 Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等(2000)Eur.Jour.
Nucl.Med.27(7)：766-77；Wiseman 等 (2002)Blood 99(12)：4336-42；Witzig 等 (2002)
J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63；Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69)。尽管
ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严
TM
重且持久的血细胞减少。MYLOTARG (gemtuzumab ozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals)，
即由hu CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注
射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)：686；美国专利No.4970198；
5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumab
mertansine(Immunogen，Inc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药
物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进入用于治疗表达CanAg的癌症诸如结
肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，
Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物部
分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，在开发用于前列腺肿瘤的潜在治疗。将多拉司他汀
(dolastatin)的合成类似物auristatin肽，auristatinE(AE)和单甲基auristatin(MMAE)
与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌瘤上的Lewis Y特异)和cAC10(对血液学恶性肿瘤上的
CD30特异)偶联(Doronina等(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784)，且正在进
行治疗性开发。
[0120] 本文中描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌
(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根
毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石
竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、
苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂
草(sapaonaria officinalis) 抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、
局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素
(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。多种放射性核素可
212 131 131 90 186
用于生成放射偶联抗体。例子包括 Bi、 I、In、Y、和 Re。抗体和细胞毒剂的偶联物
使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯
(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛
二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰
基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸
如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功
能衍生物。例如，可如Vitetta等(1987)Science，238：1098中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒
素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放
射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂(WO94/11026)。
(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根
毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石
竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、
苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂
草(sapaonaria officinalis) 抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、
局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素
(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。多种放射性核素可
212 131 131 90 186
用于生成放射偶联抗体。例子包括 Bi、 I、In、Y、和 Re。抗体和细胞毒剂的偶联物
使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯
(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛
二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰
基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸
如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功
能衍生物。例如，可如Vitetta等(1987)Science，238：1098中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒
素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放
射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂(WO94/11026)。
[0121] 本文还涵盖抗体和一种或多种小分子毒素(诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、auristatin、单端孢霉素
(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的片段)的偶联物。
(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的片段)的偶联物。
[0122] (1)美登素和美登木素生物碱
[0123] 在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的本发明抗体(全长抗体或抗体片段)。
[0124] 美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利No.3,896,111)。
随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利
No.4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；
4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；
4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；
4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。
随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利
No.4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；
4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；
4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；
4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。
[0125] 美登木素生物碱药物模块是有吸引力的抗体-药物偶联物中药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非
二硫化物接头偶联抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳 定；且(iv)有效针对多种肿瘤
细胞系。
二硫化物接头偶联抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳 定；且(iv)有效针对多种肿瘤
细胞系。
[0126] 适于用作美登木素生物碱药物模块的美登素化合物是本领域公知的，而且可以依照已知方法从天然来源分离，使用遗传工程技术生产(参见Yu等(2002)PNAS 99：
7968-7973)，或者美登醇和美登醇类似物也可以依照已知方法合成制备。
7968-7973)，或者美登醇和美登醇类似物也可以依照已知方法合成制备。
[0127] 例示性的美登木素生物碱药物模块包括那些具有修饰的芳香环的，诸如：C-19-脱氯(US 4256746)(通过安丝菌素(ansamytocin)P2的氢化铝锂还原来制备)；
C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4361650和4307016)(通过使
用链霉菌或放线菌的脱甲基化或使用LAH的脱氯化来制备)；及C-20-脱甲氧基，C-20-酰
氧基(-OCOR)，+/-脱氯(美国专利No.4,294,757)(通过使用酰氯的酰化来制备)，以及那
些在其它位置具有修饰的。
C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4361650和4307016)(通过使
用链霉菌或放线菌的脱甲基化或使用LAH的脱氯化来制备)；及C-20-脱甲氧基，C-20-酰
氧基(-OCOR)，+/-脱氯(美国专利No.4,294,757)(通过使用酰氯的酰化来制备)，以及那
些在其它位置具有修饰的。
[0128] 例示性的美登木素生物碱药物模块还包括那些具有修饰的，诸如：C-9-SH(US4424219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应来制备)；C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)
(US 4331598)；C-14-羟甲基或酰氧甲基(CH2OH或CH2OAc)(US 4450254)(自诺卡氏菌制
备)；C-15-羟基/酰氧基(US 4364866)(通过链霉菌对美登醇的转化来制备)；C-15-甲氧
基(美国专利No.4313946和4315929)(自Trewia nudlflora分离)；C-18-N-脱甲基(美
国专利No.4362663和4322348)(通过链霉菌对美登醇的脱甲基化来制备)；及4，5-脱氧
(US4371533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原来制备)。
(US 4331598)；C-14-羟甲基或酰氧甲基(CH2OH或CH2OAc)(US 4450254)(自诺卡氏菌制
备)；C-15-羟基/酰氧基(US 4364866)(通过链霉菌对美登醇的转化来制备)；C-15-甲氧
基(美国专利No.4313946和4315929)(自Trewia nudlflora分离)；C-18-N-脱甲基(美
国专利No.4362663和4322348)(通过链霉菌对美登醇的脱甲基化来制备)；及4，5-脱氧
(US4371533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原来制备)。
[0129] 美登木素生物碱药物模块的例示性实施方案包括具有如下结构的DM1、DM3和DM4：
[0130]
[0131]
[0132] 其中波形线指示药物的硫原子对抗体-药物偶联物的接头(L)的共价附着。(trastuzumab，抗HER2抗体)经SMCC连接DM1已有报道(WO2005/037992，
明确地完整收入本文作为参考)。本发明的抗体-药物偶联物可以依照其中披露的规程来
制备。
明确地完整收入本文作为参考)。本发明的抗体-药物偶联物可以依照其中披露的规程来
制备。
[0133] 其它例示性的美登木素生物碱抗体-药物偶联物具有如下结构和缩写(其中Ab是抗体，而p是1到大约8)：
[0134]
[0135] 其中DM1经BMPEO接头连接抗体硫醇基的例示性抗体-药物偶联物具有如下结构和缩写：
[0136]
[0137] 其中Ab是抗体；n是0、1、或2；而p是1、2、3、或4。
[0138] 例如下列专利公开了包含美登木素生物碱的免疫偶联物及其制备方法和治疗用途：美国专利No.5,208,020；5,416,064；6,441,163；及欧洲专利EP 0 425 235B1，明确将
其公开内容收入本文作为参考。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)
记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的
免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤
生长测定法中显示出抗肿瘤活性。Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)记载
了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合
HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳腺癌细
胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达
5
3×10 个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了程度与游离美登木素生物碱药物相似的细胞
毒性，这可通过增加每个抗体分子所偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素
生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。
其公开内容收入本文作为参考。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)
记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的
免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤
生长测定法中显示出抗肿瘤活性。Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)记载
了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合
HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳腺癌细
胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达
5
3×10 个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了程度与游离美登木素生物碱药物相似的细胞
毒性，这可通过增加每个抗体分子所偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素
生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。
[0139] 抗CD22抗体-美登木素生物碱偶联物通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例如美国专利
No.5,208,020，明确将其公开内容收入本文作为参考。每个抗体分子偶联平均3-4个美登
木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有
负面影响，尽管预计甚至每个抗体偶联一分子毒素也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。
美登木素生物碱在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例
如美国专利No.5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木
素生物碱。优选的美登木素生物碱是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的
美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
No.5,208,020，明确将其公开内容收入本文作为参考。每个抗体分子偶联平均3-4个美登
木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有
负面影响，尽管预计甚至每个抗体偶联一分子毒素也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。
美登木素生物碱在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例
如美国专利No.5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木
素生物碱。优选的美登木素生物碱是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的
美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
[0140] 本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利No.5,208,020；6441163；或欧洲专利0 425 235B1；Chari等，Cancer Research 52：
127-131(1992)；及US 2005/0169933A1中所公开的，明确将其公开内容收入本文作为参
考。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱偶联物可以如2005年5月31日提交的美
国专利申请No.11/141344，“Antibody Drug Conjugates and Methods”中所披露的来制备。
接头基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或
酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的。本文中描述和例示了别的接头基团。
127-131(1992)；及US 2005/0169933A1中所公开的，明确将其公开内容收入本文作为参
考。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱偶联物可以如2005年5月31日提交的美
国专利申请No.11/141344，“Antibody Drug Conjugates and Methods”中所披露的来制备。
接头基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或
酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的。本文中描述和例示了别的接头基团。
[0141] 可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨
基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸
二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物
(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙
二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，
4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二
硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基
4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。
基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸
二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物
(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙
二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，
4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二
硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基
4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。
[0142] 根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲
基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实
施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。
基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实
施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。
[0143] 在一个实施方案中，任何本发明抗体(全长抗体或抗体片段)偶联有一个或多个美登木素生物碱分子。在免疫偶联物的一个实施方案中，所述细胞毒剂D是美登木素生物
碱DM1。在免疫偶联物的一个实施方案中，所述接头是SMCC。在一个实施方案中，所述抗
体-接头-药物偶联物是经SMCC接头共价偶联的本文所披露的抗CD22抗体和DM1细胞毒
剂。
碱DM1。在免疫偶联物的一个实施方案中，所述接头是SMCC。在一个实施方案中，所述抗
体-接头-药物偶联物是经SMCC接头共价偶联的本文所披露的抗CD22抗体和DM1细胞毒
剂。
[0144] Auristatin和多拉司他汀
[0145] 在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀(dolastatin)或多拉司他汀肽类似物和衍生物auristatin(美国专利No.5,635,483；5,780,588)偶联的本发明
抗体。多拉司他汀和auristatin已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分
裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗
癌(US 5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：
2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或
C(羧基)末端附着于抗体(WO02/088172)。
抗体。多拉司他汀和auristatin已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分
裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗
癌(US 5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：
2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或
C(羧基)末端附着于抗体(WO02/088172)。
[0146] 例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块DE和DF，披露于Senter等，Proceedings of the American Association for Cancer
Research，卷45，摘要号623，2004年3月28日，明确将其公开内容完整收入本文作为参考。
Research，卷45，摘要号623，2004年3月28日，明确将其公开内容完整收入本文作为参考。
[0147] 一种例示性auristatin实施方案是MMAE，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)：
[0148]
[0149] 另一种例示性auristatin实施方案是MMAF，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)(US 2005/0238649)：
[0150]
[0151] 包含MMAE或MMAF及各种接头构件(本文有进一步描述)的别的例示性实施方案具有如下结构和缩写(其中Ab是抗体；而p是1到大约8)：
[0152]
[0153]
[0154] 典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参
见E. 和K.Lübke，“The Peptides”，卷1，pp 76-136，1965，Academic Press)。
auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US 5635483；US
5780588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等(1998)Anti-Cancer
Drug Design 13：243-277；Pettit，G.R.等Synthesis，1996，719-725；Pettit等(1996)
J.Chem.Soc.Perkin Trans.15：859-863； 及 Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：
778-784。
见E. 和K.Lübke，“The Peptides”，卷1，pp 76-136，1965，Academic Press)。
auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US 5635483；US
5780588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等(1998)Anti-Cancer
Drug Design 13：243-277；Pettit，G.R.等Synthesis，1996，719-725；Pettit等(1996)
J.Chem.Soc.Perkin Trans.15：859-863； 及 Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：
778-784。
[0155] 加利车霉素
[0156] 在其它实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家
族偶联物的制备参见美国专利5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；
5,770,710；5,773,001；5,877,296(都是美国Cyanamid公司的)。可用的加利车霉素结
I I I I I
构类似物包括但不限于γ1、α2、α3、N-乙酰基-γ1、PSAG和θ1(Hinman等，Cancer
Research 53：3336-3342(1993)；Lode等，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述
美国Cyanamid公司的美国专利)。可以与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种
抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经
由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效应。
族偶联物的制备参见美国专利5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；
5,770,710；5,773,001；5,877,296(都是美国Cyanamid公司的)。可用的加利车霉素结
I I I I I
构类似物包括但不限于γ1、α2、α3、N-乙酰基-γ1、PSAG和θ1(Hinman等，Cancer
Research 53：3336-3342(1993)；Lode等，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述
美国Cyanamid公司的美国专利)。可以与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种
抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经
由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效应。
[0157] 其它细胞毒剂
[0158] 可以与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中记载的统称为
LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素(esperamicin)(美国专利No.5,877,296)。
LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素(esperamicin)(美国专利No.5,877,296)。
[0159] 可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋 白(ricin)A
链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、
油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca
americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯
树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、
白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素
(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年
10月28日公布的WO 93/21232。
链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、
油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca
americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯
树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、
白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素
(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年
10月28日公布的WO 93/21232。
[0160] 本发明还涵盖抗体和具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
[0161] 为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生211 131 125 90 186 188 153 212 32 212
成放射偶联抗体。例子包括At 、I 、I 、Y 、Re 、Re 、Sm 、Bi 、P 、Pb 和Lu的放
99m
射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc 或
123
I ，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)，诸如同样是
碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
成放射偶联抗体。例子包括At 、I 、I 、Y 、Re 、Re 、Sm 、Bi 、P 、Pb 和Lu的放
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射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc 或
123
I ，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)，诸如同样是
碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
[0162] 可以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可
99m 123 186 188 111
以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如tc 或I 、Re 、Re 和In 。可以经赖
氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：
49-57)可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，
CRC Press，1989)详细记载了其它方法。
99m 123 186 188 111
以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如tc 或I 、Re 、Re 和In 。可以经赖
氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：
49-57)可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，
CRC Press，1989)详细记载了其它方法。
[0163] 可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲
基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲
酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸
如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二
胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，
4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所
述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙
酸 (MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接
头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感
性接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52：
127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲
酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸
如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二
胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，
4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所
述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙
酸 (MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接
头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感
性接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52：
127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
[0164] 本发明的化合物明确涵盖但不限于用如下交联试剂制备的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、
sulfo-GMB S、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、sulfo-SMPB、和SVSB(琥
珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们可通过商业途径获得(例如Pierce
Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。参见2003-2004年度应用手册和产品目录
(2003-2004Applications Handbook and Catalog)第467-498页。
sulfo-GMB S、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、sulfo-SMPB、和SVSB(琥
珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们可通过商业途径获得(例如Pierce
Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。参见2003-2004年度应用手册和产品目录
(2003-2004Applications Handbook and Catalog)第467-498页。
[0165] 抗体-药物偶联物的制备
[0166] 在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，抗体(Ab)经接头(L)偶联有一个或多个药物模块(D)，例如大约1个到大约20个药物模块每个抗体。可以采用本领域技术人员知
道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基
团经共价键与二价接头试剂反应形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲
核基团经共价键与二价接头试剂反应形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。本文中描述了
用于制备ADC的别的方法。
道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基
团经共价键与二价接头试剂反应形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲
核基团经共价键与二价接头试剂反应形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。本文中描述了
用于制备ADC的别的方法。
[0167] Ab-(L-D)p 式I
[0168] 接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯
丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊
酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”)、
和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。本领域知道别的接头构
件，本文也描述了一些。
丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊
酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”)、
和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。本领域知道别的接头构
件，本文也描述了一些。
[0169] 在有些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。例示性的氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽、或五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)；丙氨酸-苯丙
氨酸(af或ala-phe)。例示性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸 -瓜氨酸(gly-val-cit)和甘
氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基可以包括天然
存在的氨基酸残基，以及次要氨基酸和非天然存在氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头
构件可以在它们对特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或血浆蛋白酶)的
酶促切割的选择性方面进行设计和优化。
氨酸(af或ala-phe)。例示性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸 -瓜氨酸(gly-val-cit)和甘
氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基可以包括天然
存在的氨基酸残基，以及次要氨基酸和非天然存在氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头
构件可以在它们对特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或血浆蛋白酶)的
酶促切割的选择性方面进行设计和优化。
[0170] 例示性接头构件结构如下所示(其中波形线指示ADC其它构件共价附着的位点)：
[0171]
[0172] 别的例示性接头构件和缩写包括(其中描绘了抗体(Ab)和接头，而p是1到大约8)：
[0173]
[0174]
[0175] 抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。胺、硫醇、和羟基
是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性
酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代
乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即
半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理，从而具有与接头试剂偶联的反应
性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可将额外亲核基团引入抗体，
经由使赖氨酸残基与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)起反应，导致胺转变为硫醇。可以通
过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一个或多个非
天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体)而将反应性硫醇基导入抗体(或其片段)。
是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性
酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代
乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即
半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理，从而具有与接头试剂偶联的反应
性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可将额外亲核基团引入抗体，
经由使赖氨酸残基与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)起反应，导致胺转变为硫醇。可以通
过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一个或多个非
天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体)而将反应性硫醇基导入抗体(或其片段)。
[0176] 还可通过修饰抗体以导入能与接头试剂或药物上的亲核取代基起反应的亲电子模块来生成本发明的抗体-药物偶联物。可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化
抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺
Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连
接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的
反应可以在蛋白质中生成羰基 (醛和酮)，它能与药物上的适宜基团反应(Hermanson，
BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋
白质可以与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan和Stroh，(1992)
Bioconjugate Chem.3：138-146；US 5362852)。此类醛能与药物模块或接头亲核体反应。
抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺
Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连
接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的
反应可以在蛋白质中生成羰基 (醛和酮)，它能与药物上的适宜基团反应(Hermanson，
BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋
白质可以与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan和Stroh，(1992)
Bioconjugate Chem.3：138-146；US 5362852)。此类醛能与药物模块或接头亲核体反应。
[0177] 类似的，药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价
键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)
烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。
键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)
烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。
[0178] 在又一个方面，抗体具有一个或多个赖氨酸残基，其可以化学修饰以引入一个或多个硫氢基。所述抗体单元与接头单元经硫氢基的硫原子成键。可用于修饰赖氨酸的试剂
包括但不限于N-琥珀酰亚氨基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)和盐酸2-亚氨基硫烷(Traut
氏试剂)。
包括但不限于N-琥珀酰亚氨基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)和盐酸2-亚氨基硫烷(Traut
氏试剂)。
[0179] 在另一个实施方案中，抗体可以具有一个或多个碳水化合物基团，其可以化学修饰以具有一个或多个硫氢基。所述抗体单元与接头单元(诸如延伸物单元)经硫氢基的硫
原子成键，如本文中所公开的。
原子成键，如本文中所公开的。
[0180] 在又一个实施方案中，抗体可以具有一个或多个碳水化合物基团，其可以氧化以提供醛基(-CHO)(参见例如Laguzza，等，J.Med.Chem.1989，32(3)，548-55)。相应的醛可
以与延伸物上的反应性位点形成键。延伸物上可以与抗体上的羰基起反应的反应性位点包
括但不限于肼和羟胺。用于修饰蛋白质以附着或结合药物单元的其它方案记载于Coligan
等，Current Protocols inProtein Science，卷2，John Wiley & Sons(2002)，收入本文作
为参考。
以与延伸物上的反应性位点形成键。延伸物上可以与抗体上的羰基起反应的反应性位点包
括但不限于肼和羟胺。用于修饰蛋白质以附着或结合药物单元的其它方案记载于Coligan
等，Current Protocols inProtein Science，卷2，John Wiley & Sons(2002)，收入本文作
为参考。
[0181] 用于将接头-药物模块偶联至细胞靶向蛋白质(诸如抗体、免疫清蛋白或其片段)的方法可见于例如US5,208,020；US6,441,163；WO2005037992；WO2005081711；和
WO2006/034488，都明确地完整收入本文作为参考。
WO2006/034488，都明确地完整收入本文作为参考。
[0182] 或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可以包含各自编码偶联物的两部分的区域，彼此或是毗邻或是由编码接头肽的区域
分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
[0183] 在又一个实施方案中，可以将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除 剂由循环中清除未结合的
偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。
偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。
[0184] 在免疫偶联物的一个实施方案中，所述细胞毒剂D是式DE或DF的auristatin
[0185]
[0186] 且其中R2和R6各自是甲基；R3和R4各自是异丙基；R7是仲丁基；各个R8独立地选9 10 11
自CH3、O-CH3、OH、和H；R 是H；R 是芳基；Z是-O-或-NH-；R 是H、C1-C8烃基、或-(CH2)2
18 8 8
-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH3；且R 是-C(R)2-C(R)2-芳基；且
自CH3、O-CH3、OH、和H；R 是H；R 是芳基；Z是-O-或-NH-；R 是H、C1-C8烃基、或-(CH2)2
18 8 8
-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH3；且R 是-C(R)2-C(R)2-芳基；且
[0187] (d)p的范围为大约1至8。
[0188] 关于任何上述免疫偶联物，进一步提供了以下实施方案。在一个实施方案中，免疫偶联物具有体外或体内细胞杀伤活性。在一个实施方案中，所述接头经抗体上的硫醇基团
附着于抗体。在一个实施方案中，所述接头是蛋白酶可切割的(即能够被蛋白酶切割的)。
在一个实施方案中，所述接头包含val-cit二肽。在一个实施方案中，所述接头包含对氨基
苄基单元。在一个实施方案中，所述对氨基苄基单元部署在药物与接头中的蛋白酶切割位
点之间。在一个实施方案中，所述对氨基苄基单元是对氨基苄氧羰基(PAB)。在一个实施方
案中，所述接头包含6-马来酰亚氨基己酰基。在一个实施方案中，所述6-马来酰亚氨基己
酰基部署在抗体与接头中的蛋白酶切割位点之间。上述实施方案可以单独的或彼此任意组
合的发生。
附着于抗体。在一个实施方案中，所述接头是蛋白酶可切割的(即能够被蛋白酶切割的)。
在一个实施方案中，所述接头包含val-cit二肽。在一个实施方案中，所述接头包含对氨基
苄基单元。在一个实施方案中，所述对氨基苄基单元部署在药物与接头中的蛋白酶切割位
点之间。在一个实施方案中，所述对氨基苄基单元是对氨基苄氧羰基(PAB)。在一个实施方
案中，所述接头包含6-马来酰亚氨基己酰基。在一个实施方案中，所述6-马来酰亚氨基己
酰基部署在抗体与接头中的蛋白酶切割位点之间。上述实施方案可以单独的或彼此任意组
合的发生。
[0189] 在一个实施方案中，所述药物选自MMAE和MMAF。在一个实施方案中，所述免疫偶联物具有通式
[0190]
[0191] 其中Ab是任何上述抗CD22抗体，S是硫原子，而p的范围是自2至5。在一个实施方案中，所述免疫偶联物具有通式
[0192]
[0193] 其中Ab是任何上述抗CD22抗体，S是硫原子，而p的范围是自大约1至大约6、自大约2至大约5、自大约2至大约6、自大约2至大约4、自大约2至大约3、自大约3至大约
4、自大约3至大约5、自大约3至大约6、或自大约4至大约6。
4、自大约3至大约5、自大约3至大约6、或自大约4至大约6。
[0194] 经标记抗体成像方法
[0195] 在本发明的另一个实施方案中，可以用放射性核素、荧光染料、生物发光触发性底物模块、化学发光触发性底物模块、酶和其它检测标记物通过半胱氨酸硫醇来标记半胱氨
酸改造抗体以用于具有诊断、药效学和治疗应用的成像实验。一般而言，通过注射、输注或
口服摄入给活的生物体(例如人、啮齿类动物或其它小动物)，灌注器官或组织样品施用经
过标记的半胱氨酸改造抗体，即“生物标志物”或“探针”。在一段时间上检测探针的分布并
由影像显示。
酸改造抗体以用于具有诊断、药效学和治疗应用的成像实验。一般而言，通过注射、输注或
口服摄入给活的生物体(例如人、啮齿类动物或其它小动物)，灌注器官或组织样品施用经
过标记的半胱氨酸改造抗体，即“生物标志物”或“探针”。在一段时间上检测探针的分布并
由影像显示。
[0196] 制品
[0197] 在本发明的另一个实施方案中，提供了包含可用于治疗上文所述病症的物质的制品或“试剂盒”。所述制品包括容器和容器上的或与容器相关的标签或包装插页。合适的容
器包括例如药瓶、药管、注射器、泡罩包装、等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或
塑料。所述容器装有有效治疗所述疾患的抗体-药物偶联物(ADC)组合物，可以具有无菌
存取口(例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶)。所
述组合物中的至少一种活性药剂是ADC。标签或包装插页指明该组合物用于治疗所选疾患，
诸如癌症。或者/另外，所述制品可进一步包括第二(或第三)容器，其中装有药学可接受
的缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、 林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶
液。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤
器、针头、和注射器。
器包括例如药瓶、药管、注射器、泡罩包装、等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或
塑料。所述容器装有有效治疗所述疾患的抗体-药物偶联物(ADC)组合物，可以具有无菌
存取口(例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶)。所
述组合物中的至少一种活性药剂是ADC。标签或包装插页指明该组合物用于治疗所选疾患，
诸如癌症。或者/另外，所述制品可进一步包括第二(或第三)容器，其中装有药学可接受
的缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、 林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶
液。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤
器、针头、和注射器。
[0198] 药用组合物
[0199] 一方面，提供了包含任何上述免疫偶联物和药学可接受载体的药用组合物。一方面，提供了治疗B细胞增殖性病症的方法，其中所述方法包括给个体施用所述药用组合物。
在一个实施方案中，所述B细胞增殖性病症选自淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性
NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性
白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病
(ALL)、和套细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述细胞增殖性病症与细胞表面上CD22表达
升高有关。
在一个实施方案中，所述B细胞增殖性病症选自淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性
NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性
白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病
(ALL)、和套细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述细胞增殖性病症与细胞表面上CD22表达
升高有关。
[0200] 一方面，提供了抑制细胞增殖的方法，其中所述方法包括在容许免疫偶联物结合CD22的条件下使细胞暴露于任何上述免疫偶联物。在一个实施方案中，所述B细胞是肿瘤
细胞。在一个实施方案中，所述肿瘤细胞是发生或怀疑发生选自下组的B细胞增殖性病症
的哺乳动物的B细胞：淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复
发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞
性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细胞淋巴瘤，
所述细胞是异种移植物。在一个实施方案中，所述暴露发生于体外。在一个实施方案中，所
述暴露发生于体内。
细胞。在一个实施方案中，所述肿瘤细胞是发生或怀疑发生选自下组的B细胞增殖性病症
的哺乳动物的B细胞：淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复
发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞
性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细胞淋巴瘤，
所述细胞是异种移植物。在一个实施方案中，所述暴露发生于体外。在一个实施方案中，所
述暴露发生于体内。
[0201] 一方面，提供了使用本发明的抗CD22抗体的方法，其用以测定发生白血病或淋巴瘤的哺乳动物中的血清可溶性CD22以诊断B细胞白血病或B细胞淋巴瘤、测量疾病的
临床进展或消退、或评估肿瘤负荷或复发。此类方法披露于US 20050244828(Kreitman，
R.J.等，将其完整内容收入本文作为参考)，其中使用抗CD22RFB4抗体-PE38(假单胞菌外
毒素A片段38)毒素偶联物(Kreitman，R.J.等，NEJM 345：241-247(2001))。
临床进展或消退、或评估肿瘤负荷或复发。此类方法披露于US 20050244828(Kreitman，
R.J.等，将其完整内容收入本文作为参考)，其中使用抗CD22RFB4抗体-PE38(假单胞菌外
毒素A片段38)毒素偶联物(Kreitman，R.J.等，NEJM 345：241-247(2001))。
[0202] 附图简述
[0203] 图1A-1D：图1A是CD22的示图，其指明β同种型的胞外结构域的7个免疫球蛋白样结构域。α同种型缺乏结构域3和4。“TM”指跨膜结构域。图1B描 绘了β形式的
CD22的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)。α形式的CD22缺乏以斜体所示的氨基酸(编码胞
外结构域的结构域3和4)。该蛋白质成熟形式的胞外结构域划有下划线(SEQ ID NO：28)。
氨基酸1-21描绘了从该成熟形式切除的信号序列。图1C是CD22α的氨基酸序列(SEQ ID
NO：29)。CD22α的ECD划有下划线(SEQ ID NO：30)。图1D是来自猕猴(cyno)的CD22的
氨基酸序列(SEQID NO：31)。猕猴CD22的最初19个氨基酸是信号序列。
CD22的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)。α形式的CD22缺乏以斜体所示的氨基酸(编码胞
外结构域的结构域3和4)。该蛋白质成熟形式的胞外结构域划有下划线(SEQ ID NO：28)。
氨基酸1-21描绘了从该成熟形式切除的信号序列。图1C是CD22α的氨基酸序列(SEQ ID
NO：29)。CD22α的ECD划有下划线(SEQ ID NO：30)。图1D是来自猕猴(cyno)的CD22的
氨基酸序列(SEQID NO：31)。猕猴CD22的最初19个氨基酸是信号序列。
[0204] 图2A-2B：图2A描绘了本发明的鼠10F4抗CD22抗体(h10F)与人源化10F4型式1抗体(h10F4v1)及人亚组III序列的重链可变域氨基酸序列比对。给HVR划上方框
(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)。包夹HVR的序列是框架序列(FR-H1至FR-H4)。依照Kabat编
号方式给序列编号。关于划了方框的HVR指明了Kabat、Chothia和接触CDR。图2B描绘了
本发明的鼠10F4抗CD22抗体(h10F4)与人源化10F4型式1抗体(h10F4v1)及人κI序
列的轻链可变域氨基酸序列比对。人源化10F4抗体的型式2和3(h10F4v2和h10F4v3)在
分泌的成熟形式上具有相同的氨基酸序列。抗体h10F4v2和h10F4v3与h10F4v1在HVR-L1
的第28位氨基酸上不同(N28V)。给HVR划上方框。FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4序列包
夹HVR(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。依照Kabat编号方式给序列编号。关于划了方框的HVR
指明了Kabat、Chothia和接触CDR。
(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)。包夹HVR的序列是框架序列(FR-H1至FR-H4)。依照Kabat编
号方式给序列编号。关于划了方框的HVR指明了Kabat、Chothia和接触CDR。图2B描绘了
本发明的鼠10F4抗CD22抗体(h10F4)与人源化10F4型式1抗体(h10F4v1)及人κI序
列的轻链可变域氨基酸序列比对。人源化10F4抗体的型式2和3(h10F4v2和h10F4v3)在
分泌的成熟形式上具有相同的氨基酸序列。抗体h10F4v2和h10F4v3与h10F4v1在HVR-L1
的第28位氨基酸上不同(N28V)。给HVR划上方框。FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4序列包
夹HVR(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。依照Kabat编号方式给序列编号。关于划了方框的HVR
指明了Kabat、Chothia和接触CDR。
[0205] 图3A和3B显示了用于实施本发明的例示性的受体人重链可变域(VH)共有框架序列，其具有如下序列标识符，其中按FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4的顺序列出了FR SEQ ID
NO：
NO：
[0206] -人VH亚组I共有框架“A”减去Kabat CDR(SEQ ID NO：26，47，48，7)。
[0207] -人VH亚组I共有框架“B”、“C”和“D”减去延伸的高变区(SEQ ID NO：50、51、52、7；SEQ ID NO：50、51、52、7；和SEQ ID NO：50、51、53、7)。
[0208] -人VH亚组II共有框架“A”减去Kabat CDR(SEQ ID NO：54、55、56、7)。
[0209] -人VH亚组II共有框架“B”、“C”和“D”减去延伸的高变区(SEQ ID NO：57、58、56、7；SEQ ID NOs：57、58、59、7；和SEQ ID NO：57、58、60、7)。
[0210] -人VH亚组III共有框架“A”减去Kabat CDR(SEQ ID NO：61、62、63、7)。
[0211] -人VH亚组III共有框架“B”、“C”和“D”减去延伸的高变区(SEQ ID NO：64、65、63、7；SEQ ID NO：64、65、66、7；和SEQ ID NO：64、65、67、7)。
[0212] -人VH受体1框架“A”减去Kabat CDR(SEQ ID NO：68、62、69、7)。
[0213] -人VH受体框架“B”和“C”减去延伸的高变区(SEQ ID NO：64、65、69、7；和SEQID NO：64、65、70、7)。
[0214] -人VH受体2框架“A”减去Kabat CDR(SEQ ID NO：68、62、71、7)。
[0215] -人VH受体2框架“B”、“C”和“D”减去延伸的高变区(SEQ ID NO：64、65、71、7；SEQ ID NOs：64、65、72、7；和SEQ ID NO：64、65、73、7)。
[0216] 图4A和4B显示了用于实施本发明的例示性的受体人轻链可变域(VL)共有框架序列，其具有如下序列标识符：
[0217] -人VLκ亚组I-1共有框架(κv1-1)：SEQ ID NO：74、75、76、77
[0218] -人VLκ亚组I共有框架(κv1)：SEQ ID NO：74、78、76、77
[0219] -人VLκ亚组II共有框架(κv2)：SEQ ID NO：49、79、80、77
[0220] -人VLκ亚组III共有框架(κv3)：SEQ ID NO：81、82、83、77
[0221] -人VLκ亚组IV共有框架(κv4)：SEQ ID NO：84、85、86、77
[0222] 图5A和5B：图5A描绘了天然序列人IgG Fc区序列，人IgG1(非A同种异型，SEQ ID NO：38；和A同种异型，其中SEQ ID NO：38内的氨基酸序列SREEM变成SRDEL)、人
IgG2(SEQ ID NO：39)、人IgG3(SEQ ID NO：40)和人IgG4(SEQ ID NO：41)的比对，其中用
星号标示序列间差异。序列上方的数字代表EU编号系统。还显示了例示性的κ恒定区。
图5B描绘了人源化抗CD22抗体10F4v2，同种型IgG1的轻链和重链的全长氨基酸序列(可
变区和恒定区)。划有下划线的部分描绘恒定域。
IgG2(SEQ ID NO：39)、人IgG3(SEQ ID NO：40)和人IgG4(SEQ ID NO：41)的比对，其中用
星号标示序列间差异。序列上方的数字代表EU编号系统。还显示了例示性的κ恒定区。
图5B描绘了人源化抗CD22抗体10F4v2，同种型IgG1的轻链和重链的全长氨基酸序列(可
变区和恒定区)。划有下划线的部分描绘恒定域。
[0223] 图6A-6D显示了测量CD22ADC在淋巴瘤细胞系中功效的各种决定因素的测定法的结果。图6A表明较高的细胞表面CD22水平与较低的抗CD22-MCC-DM1IC50(较高的功效)
相关。图6B表明抗CD22-MCC-DM1内在化增加与较低的抗CD22-MCC-DM1IC50相关。图6C
表明细胞对游离药物的内在敏感性增加与较低的抗CD22-MCC-DM1IC50相关。图6D是显微
照片，其显示荧光标记的抗CD22抗体在结合至细胞表面上的CD22后的内在化。
相关。图6B表明抗CD22-MCC-DM1内在化增加与较低的抗CD22-MCC-DM1IC50相关。图6C
表明细胞对游离药物的内在敏感性增加与较低的抗CD22-MCC-DM1IC50相关。图6D是显微
照片，其显示荧光标记的抗CD22抗体在结合至细胞表面上的CD22后的内在化。
[0224] 图7A-7B：图7A是异种移植物模型中体内肿瘤体积缩小的曲线图，其显示了给具有人B细胞肿瘤的SCID小鼠施用抗CD22抗体mu10F4-smcc-DM1和hu10F4v1-smcc-DM1
显著降低了肿瘤体积。药物负载是大约4和4.6，参见表4。图7B是类似研究的曲线
图，但药物负载略微低些，为大约2.9和3.0(参见表5)，并且将mu10F4-smcc-DM1和
hu10F4v2-smcc-DM1功效与对照抗体和未偶联的mu10F4进行了比较。图7C是异种移植物
模型中体内肿瘤降低的曲线图， 其中如表6中所示的那样施用抗CD22-spp-DM1。
显著降低了肿瘤体积。药物负载是大约4和4.6，参见表4。图7B是类似研究的曲线
图，但药物负载略微低些，为大约2.9和3.0(参见表5)，并且将mu10F4-smcc-DM1和
hu10F4v2-smcc-DM1功效与对照抗体和未偶联的mu10F4进行了比较。图7C是异种移植物
模型中体内肿瘤降低的曲线图， 其中如表6中所示的那样施用抗CD22-spp-DM1。
[0225] 图8A和8B：图8A是 给 Ramos细 胞 异 种 移 植 物 施 用 的 抗CD22抗 体5E8.1.8-smcc-DM1和RFB4-smcc-DM1的曲线图。图8B是给BJAB-luc异种移植物施用的抗
CD22抗体5E8.1.8-smcc-DM1和RFB4-smcc-DM1的曲线图。
CD22抗体5E8.1.8-smcc-DM1和RFB4-smcc-DM1的曲线图。
[0226] 图9的曲线图显示了在施用处于低的、中等的和高的药物负载的抗CD22(RFB4)-smcc-DM1后随时间对肿瘤体积的相对影响。
[0227] 图10的曲线图显示了在Ramos异种移植物中施用抗CD22(RFB4)-MC-vcPAB-MMAF或抗CD22(RFB4)-MC-MMAF后随时间对肿瘤体积的相对影响。
[0228] 图11的曲线图显示了在施用抗CD22(RFB4)-smcc-DM1或-MCvcPAB-MMAE后随时间对肿瘤体积的相对影响。
[0229] 图12的曲线图显示了在施用MMAF或DM1免疫偶联物形式的人源化抗CD2210F4变体(如表12中所披露的)后随时间对肿瘤体积的相对影响。
[0230] 图13A-13C的曲线图显示了在不同B细胞淋巴瘤异种移植物模型：SuDHL-4(图13A)、DoHH2(图13B)和Granta-519(图13C)中施用抗CD22-smcc-DM1或抗CD22-MC-MMAF
后随时间对肿瘤体积的相对影响。
后随时间对肿瘤体积的相对影响。
[0231] 图14显示了为表位绘图而删除的CD22结构域的示图(如实施例中所述的)。将结构域编号为1-7。“TM”指跨膜结构域。
[0232] 图15显示了半胱氨酸改造抗CD22抗体-药物偶联物(ADC)的描绘，其中将药物模块附着至轻链(LC-ADC)、重链(HC-ADC)和Fc区(Fc-ADC)中改造的半胱氨酸基团。
[0233] 图16显示了下列步骤：(i)用还原剂TCEP(盐酸三(2-羧基乙基)膦)(tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)还原半胱氨酸改造抗CD22抗体
(ThioMab)中的半胱氨酸二硫化物加合物及链间和链内二硫化物；(ii)用dhAA(脱氢抗坏
血酸)部分地氧化，即再氧化以再形成链间和链内二硫化物；和(iii)将再氧化后的抗体与
药物-接头中间体偶联以形成半胱氨酸改造抗CD22抗体-药物偶联物(ADC)。
(ThioMab)中的半胱氨酸二硫化物加合物及链间和链内二硫化物；(ii)用dhAA(脱氢抗坏
血酸)部分地氧化，即再氧化以再形成链间和链内二硫化物；和(iii)将再氧化后的抗体与
药物-接头中间体偶联以形成半胱氨酸改造抗CD22抗体-药物偶联物(ADC)。
[0234] 图17A-17C描绘了本发明抗CD22半胱氨酸改造抗体的氨基酸序列，其中改变轻链或重链或Fc区以在所选择的氨基酸位置上改造半胱氨酸。图17A描绘了抗CD2210F4变体
轻链的氨基酸序列，其中将Kabat第205位缬氨酸(顺序位置缬氨酸210)变为半胱氨酸。
图17B描绘了抗CD2210F4变体重链的氨 基酸序列，其中将EU第118位丙氨酸(顺序位置
丙氨酸121)变为半胱氨酸。图17C描绘了抗CD2210F4变体Fc区的氨基酸序列，其中将EU
第400位丝氨酸(顺序位置丝氨酸403)变为半胱氨酸。在各幅图中，以粗体文本与双下划
线方式显示了改变的氨基酸。单下划线指出恒定区。可变区没有加下划线。
轻链的氨基酸序列，其中将Kabat第205位缬氨酸(顺序位置缬氨酸210)变为半胱氨酸。
图17B描绘了抗CD2210F4变体重链的氨 基酸序列，其中将EU第118位丙氨酸(顺序位置
丙氨酸121)变为半胱氨酸。图17C描绘了抗CD2210F4变体Fc区的氨基酸序列，其中将EU
第400位丝氨酸(顺序位置丝氨酸403)变为半胱氨酸。在各幅图中，以粗体文本与双下划
线方式显示了改变的氨基酸。单下划线指出恒定区。可变区没有加下划线。
[0235] 图18A-18E的FACS图示表明：对于LC、HC和Fc thiomab变体以及所示的不同药物偶联物，本发明抗CD22thiomab药物偶联物(TDC)对BJAB-lucs细胞表面上所表达的CD22
的结合是相似的。
的结合是相似的。
[0236] 图19的曲线图标绘了用不同抗CD22TDC处理的异种移植物模型中平均肿瘤体积随时间的变化，其由于改造的半胱氨酸的位置(LC、HC或Fc)和/或药物偶
联 物(MMAF或MMAE)而 改 变。 用 抗CD22TDC即 10F4-LC-V210C-MCvcPAB-MMAE和 抗
CD2210F4-HC-A121C-MCvcPAB-MMAE处理的异种移植物模型显示了研究期间肿瘤体积的下
降。
联 物(MMAF或MMAE)而 改 变。 用 抗CD22TDC即 10F4-LC-V210C-MCvcPAB-MMAE和 抗
CD2210F4-HC-A121C-MCvcPAB-MMAE处理的异种移植物模型显示了研究期间肿瘤体积的下
降。
[0237] 图20A的曲线图标绘了CB17SCID小鼠中人套细胞淋巴瘤Granta-519异种移植物中平均肿瘤体积随时间的改变，所述CB17SCID小鼠用与不同接头药物模
块偶联的重链A118C抗CD22TDC处理和/或以不同剂量施用，如所示的。看来抗
CD2210F4-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE TDC是本实验的测试药剂中最有效的。图20B的曲
线图标绘了CB17SCID小鼠中滤泡性淋巴瘤DOHH2异种移植物中平均肿瘤体积随时间的改
变，所述CB17SCID小鼠用相同的重链A118C抗CD22TDC处理，但在更高的剂量。看来抗
CD2210F4-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE TDC是本实验的测试药剂中最有效的。图20C是来自
DOHH2异种移植物研究的小鼠中百分比体重改变的图示，其显示本研究的最初14天期间体
重没有显著的改变。
块偶联的重链A118C抗CD22TDC处理和/或以不同剂量施用，如所示的。看来抗
CD2210F4-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE TDC是本实验的测试药剂中最有效的。图20B的曲
线图标绘了CB17SCID小鼠中滤泡性淋巴瘤DOHH2异种移植物中平均肿瘤体积随时间的改
变，所述CB17SCID小鼠用相同的重链A118C抗CD22TDC处理，但在更高的剂量。看来抗
CD2210F4-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE TDC是本实验的测试药剂中最有效的。图20C是来自
DOHH2异种移植物研究的小鼠中百分比体重改变的图示，其显示本研究的最初14天期间体
重没有显著的改变。
[0238] 图21A和21B的柱状图显示了第0天和第5天血清ASTM(天冬氨酸转氨酶)(图21A)和血清嗜中性细胞(图21B)的变化，其中施用了包含可切割的和不可切割的接头的
ADC。
ADC。
[0239] 图22A和22B的曲线图显示了服用10、20和30mg/kg抗CD22MMAF(图22A)和抗+
CD22DM1(图22B)的猕猴中外周B细胞(CD20 细胞)的消减。
CD22DM1(图22B)的猕猴中外周B细胞(CD20 细胞)的消减。
[0240] 图23A和23B的曲线图显示了在10、20和30mg/kg抗CD22MMAF(图23A)和抗+
CD22DM1(图23B)时，CD4 淋巴细胞没有显著的改变。
CD22DM1(图23B)时，CD4 淋巴细胞没有显著的改变。
[0241] 图24A和24B显示了猕猴扁桃体的组织学样品，其中生发中心B细胞的消 减(在媒介对照中是明显的)(图24A)在来自服用10mg/kghu10F4v3-SMCC-DM1的动物的扁桃体
样品中消减了。
样品中消减了。
[0242] 图25A的图示指出从中为研究而采集的组织样品的脾滤泡区域，该组织样品显示了抗CD22ADC使猕猴静息组织中的B细胞免于伤害(spare)。猕猴脾滤泡生发中心中正在
分裂的细胞在来自服用10mg/kg hu10F4v3-MC-MMAF的动物的猕猴脾的正在分裂生发细胞
中消减了(图25B和25C)。非分裂的幼稚B细胞在相同条件下没有消减(图25D和25E)。
分裂的细胞在来自服用10mg/kg hu10F4v3-MC-MMAF的动物的猕猴脾的正在分裂生发细胞
中消减了(图25B和25C)。非分裂的幼稚B细胞在相同条件下没有消减(图25D和25E)。
[0243] 本发明实施方案的详述
[0244] 提供了能结合CD22的分离的抗体。还提供了包含抗CD22抗体的免疫偶联物。还提供了经过半胱氨酸改造的抗CD22抗体及其免疫偶联物。本发明的抗体和免疫偶联物可
用于例如与CD22表达改变(例如升高)有关的病症的诊断或治疗。在某些实施方案中，本
发明的抗体或免疫偶联物可用于细胞增殖性病症(诸如肿瘤或癌症)的诊断或治疗。在某
些实施方案中，本发明的抗体或免疫偶联物可用于CD22(例如细胞表面上所表达的CD22)
的检测。
用于例如与CD22表达改变(例如升高)有关的病症的诊断或治疗。在某些实施方案中，本
发明的抗体或免疫偶联物可用于细胞增殖性病症(诸如肿瘤或癌症)的诊断或治疗。在某
些实施方案中，本发明的抗体或免疫偶联物可用于CD22(例如细胞表面上所表达的CD22)
的检测。
[0245] 提供了编码抗CD22抗体的多核苷酸。提供了包含编码抗CD22抗体的多核苷酸的载体，并提供了包含此类载体的宿主细胞。还提供了包含本发明的多核苷酸、抗CD22抗体、
或免疫偶联物中的任何一种或多种的组合物(包括药物配制剂)。
或免疫偶联物中的任何一种或多种的组合物(包括药物配制剂)。
[0246] 通用技术
[0247] 本文中所描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法得以采用，诸如例如下列文献中所记载的广泛应用的方法：Sambrook
等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第 3 版 (2001)Cold Spring Harbor
Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；CurrentProtocols in Molecular
Biology(F.M.Ausubel 等 编，2003)；丛 书 Methods inEnzymology(Academic Press，
Inc.)：PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames 和 G.R.Taylor 编，
1995)，Harlow和Lane编(1988) Antibodies，A Laboratory Manual，and Animal Cell
Culture(R.I.Freshney 编，1987)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait 编，1984)；
Methods in MolecularBiology，Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.
E.Cellis 编， 1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney 编，1987)；
Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum
Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths和
D.G.Newell 编，1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook ofExperimental Immunology(D.
M.Weir和C.C.Blackwell编)；Gene TransferVectors for Mammalian Cells(J.M.Miller
和 M.P.Calos 编，1987)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction，(Mullis 等 编，1994)；
Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan 等 编，1991)；Short Protocols in
Molecular Biology(Wiley and Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，
1997)； Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty 编，
IRLPress，1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd 和
C.Dean编，Oxford University Press，2000)；Using Antibodies：A LaboratoryManual(E.
Harlow 和 D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；TheAntibodies(M.
Zanetti和J.D.Capra编，Harwood Academic Publishers，1995)；及Cancer：Principles
and Practice of Oncology(V.T.DeVita等编，J.B.LippincottCompany，1993)。
等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第 3 版 (2001)Cold Spring Harbor
Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；CurrentProtocols in Molecular
Biology(F.M.Ausubel 等 编，2003)；丛 书 Methods inEnzymology(Academic Press，
Inc.)：PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames 和 G.R.Taylor 编，
1995)，Harlow和Lane编(1988) Antibodies，A Laboratory Manual，and Animal Cell
Culture(R.I.Freshney 编，1987)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait 编，1984)；
Methods in MolecularBiology，Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.
E.Cellis 编， 1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney 编，1987)；
Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum
Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths和
D.G.Newell 编，1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook ofExperimental Immunology(D.
M.Weir和C.C.Blackwell编)；Gene TransferVectors for Mammalian Cells(J.M.Miller
和 M.P.Calos 编，1987)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction，(Mullis 等 编，1994)；
Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan 等 编，1991)；Short Protocols in
Molecular Biology(Wiley and Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，
1997)； Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty 编，
IRLPress，1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd 和
C.Dean编，Oxford University Press，2000)；Using Antibodies：A LaboratoryManual(E.
Harlow 和 D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；TheAntibodies(M.
Zanetti和J.D.Capra编，Harwood Academic Publishers，1995)；及Cancer：Principles
and Practice of Oncology(V.T.DeVita等编，J.B.LippincottCompany，1993)。
[0248] 定义和缩写
[0249] 定义
[0250] “分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染物成分指会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、
和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例
如Lowry法的测定，抗体重量超过95％，而在有些实施方案中，重量超过99％，(2)足以通过
使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根
据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗
体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，
分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例
如Lowry法的测定，抗体重量超过95％，而在有些实施方案中，重量超过99％，(2)足以通过
使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根
据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗
体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，
分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
[0251] “分离的”核酸分子指与例如该核酸分子的天然来源中通常与之关联的至少一种其它核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子进一步包括包含在正常情况下表达该核酸
分子的细胞中的核酸分子，但是所述核酸分子是以染 色体外形式存在的或在染色体上的
定位不同于其天然染色体定位。
分子的细胞中的核酸分子，但是所述核酸分子是以染 色体外形式存在的或在染色体上的
定位不同于其天然染色体定位。
[0252] “纯化的”意味着分子以至少95％(以重量计)、或至少98％(以包含它的样品的重量计)的浓度存在于样品中。
[0253] 短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值(例如，一个与本发明的抗体有关而另一个与参照/比较抗体有关)之间足够高的相似程度，以致本领域技
术人员会认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差
异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值
之间的差异例如小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，和/或小于约10％。
术人员会认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差
异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值
之间的差异例如小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，和/或小于约10％。
[0254] 短语“实质性降低”或“实质性不同”在用于本文时表示两个数值(通常一个与某分子有关而另一个与参照/比较分子有关)之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员
会认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有
统计学显著性。作为参照/比较分子该数值的函数，所述两个数值之间的差异例如大于约
10％，大于约20％，大于约30％，大于约40％，和/或大于约50％。
会认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有
统计学显著性。作为参照/比较分子该数值的函数，所述两个数值之间的差异例如大于约
10％，大于约20％，大于约30％，大于约40％，和/或大于约50％。
[0255] 术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接别的DNA区段的环状双链DNA。另一类载体是噬菌体载体。另一
类载体是病毒载体，其中可将别的DNA区段连接入病毒基因组。某些载体能够在其所导入
的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其
它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，
由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此
类载体在本文中称为“重组表达载体”，或简称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中有
用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是
载体的最常用形式。
类载体是病毒载体，其中可将别的DNA区段连接入病毒基因组。某些载体能够在其所导入
的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其
它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，
由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此
类载体在本文中称为“重组表达载体”，或简称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中有
用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是
载体的最常用形式。
[0256] “多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其
类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核
苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结
构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多
核 苷酸可以在合成后包含修饰，诸如偶联至标记物。其它类型的修饰包括例如“帽”、将一
个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代、核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例
如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接
(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰、含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如
蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖
啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、
含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)
等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如
膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制
备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。5′和3′末端OH可磷
酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护
基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如
2′-氧-甲基-、2′-氧-烯丙基-、2′-氟-或2′-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端
基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类
似物及碱性(basic)核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷
酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代
酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))、
P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R′各自独立为H或
者取代或未取代的烃基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或
芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中
提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核
苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结
构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多
核 苷酸可以在合成后包含修饰，诸如偶联至标记物。其它类型的修饰包括例如“帽”、将一
个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代、核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例
如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接
(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰、含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如
蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖
啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、
含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)
等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如
膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制
备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。5′和3′末端OH可磷
酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护
基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如
2′-氧-甲基-、2′-氧-烯丙基-、2′-氟-或2′-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端
基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类
似物及碱性(basic)核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷
酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代
酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))、
P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R′各自独立为H或
者取代或未取代的烃基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或
芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中
提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
[0257] “寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上
文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。
文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。
[0258] 关于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部
分时，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相 同的氨基酸残基的百分率。为测定百
分比氨基酸序列同一性目的的比对可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众
可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术
人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大比对所需的任何算
法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2
获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，源代码已经连同用户文档一
起提交给美国版权局(USCopyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册
号TXU510087注册。公众可自Genentech公司(South San Francisco，California)得到
ALIGN-2程序，或者可以自源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统(优选数
码UNIX V4.0D上)使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
分时，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相 同的氨基酸残基的百分率。为测定百
分比氨基酸序列同一性目的的比对可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众
可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术
人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大比对所需的任何算
法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2
获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，源代码已经连同用户文档一
起提交给美国版权局(USCopyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册
号TXU510087注册。公众可自Genentech公司(South San Francisco，California)得到
ALIGN-2程序，或者可以自源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统(优选数
码UNIX V4.0D上)使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
[0259] 在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有
或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序
列A)如下计算：
或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序
列A)如下计算：
[0260] 分数X/Y乘100
[0261] 其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基
酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨
基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依
照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨
基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依
照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
[0262] “B细胞表面标志物”或“B细胞表面抗原”在本文中指在B细胞表面上表达的抗原，可以用能结合它的拮抗剂来靶向它，所述拮抗剂包括但不限于针对B细胞表面抗原或可溶
形式B细胞表面抗原、能够拮抗配体对天然存在B细胞抗原的结合的抗体。例示性的B细胞
表面标志物包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、
CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和
CD86白细胞表面标志物(有关说明参见TheLeukocyte Antigen Facts Book，第2版，1997，
Barclay等编，Academic Press， Harcourt Brace & Co.，New York)。其它B细胞表面标
志物包括RP105、FcRH2、B细胞CR2、CCR6、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、BAFF、BLys、
Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA、和239287。
特别感兴趣的B细胞表面标志物是在B细胞上较之哺乳动物的其它非B细胞组织优先表达
的，而且可以是在前体B细胞和成熟B细胞二者上都表达的。
形式B细胞表面抗原、能够拮抗配体对天然存在B细胞抗原的结合的抗体。例示性的B细胞
表面标志物包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、
CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和
CD86白细胞表面标志物(有关说明参见TheLeukocyte Antigen Facts Book，第2版，1997，
Barclay等编，Academic Press， Harcourt Brace & Co.，New York)。其它B细胞表面标
志物包括RP105、FcRH2、B细胞CR2、CCR6、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、BAFF、BLys、
Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA、和239287。
特别感兴趣的B细胞表面标志物是在B细胞上较之哺乳动物的其它非B细胞组织优先表达
的，而且可以是在前体B细胞和成熟B细胞二者上都表达的。
[0263] 术语“CD22”在用于本文时指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人类、猕猴(cyno))和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然CD22，除非
另有说明。该术语涵盖“全长的”、未加工的CD22，以及因细胞中的加工而产生的任何形式
CD22。该术语还涵盖CD22的天然存在变体，例如剪接变体、等位变体和同等型(isoform)。
CD22的主要同等型(CD22β)包含847个氨基酸且在胞外结构域中包含7个免疫球蛋白样
区(参见Wilson，G.L.等，J.Exp.Med.173：137-146(1991))。次要同等型(CD22α)包含
647个氨基酸且在胞外结构域中缺少免疫球蛋白样结构域3和4(参见Stamenkovic，I.和
Seed，B.，Nature 345：74-77(1990)及Wilson等(1991)，见上文)。CD22β的氨基酸序列
描绘于图1B，其中标有下划线的部分是胞外结构域(ECD)，而标为斜体的部分是从CD22α
胞外结构域序列缺失的氨基酸。图1C描绘了CD22α的氨基酸序列，其中ECD标有下划线。
自氨基酸1至氨基酸21的氨基酸序列代表从成熟形式蛋白质切除的信号序列。在一个实
施方案中，CD22在细胞表面上表达，诸如在正常B细胞或肿瘤β细胞的表面上表达。图1D
描绘了来自猕猴的CD22的氨基酸序列。
另有说明。该术语涵盖“全长的”、未加工的CD22，以及因细胞中的加工而产生的任何形式
CD22。该术语还涵盖CD22的天然存在变体，例如剪接变体、等位变体和同等型(isoform)。
CD22的主要同等型(CD22β)包含847个氨基酸且在胞外结构域中包含7个免疫球蛋白样
区(参见Wilson，G.L.等，J.Exp.Med.173：137-146(1991))。次要同等型(CD22α)包含
647个氨基酸且在胞外结构域中缺少免疫球蛋白样结构域3和4(参见Stamenkovic，I.和
Seed，B.，Nature 345：74-77(1990)及Wilson等(1991)，见上文)。CD22β的氨基酸序列
描绘于图1B，其中标有下划线的部分是胞外结构域(ECD)，而标为斜体的部分是从CD22α
胞外结构域序列缺失的氨基酸。图1C描绘了CD22α的氨基酸序列，其中ECD标有下划线。
自氨基酸1至氨基酸21的氨基酸序列代表从成熟形式蛋白质切除的信号序列。在一个实
施方案中，CD22在细胞表面上表达，诸如在正常B细胞或肿瘤β细胞的表面上表达。图1D
描绘了来自猕猴的CD22的氨基酸序列。
[0264] “抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相似结构特征的糖蛋白。虽然抗体展现出对特定抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和一般缺乏抗原特异性的其它抗体
样分子二者。后一类多肽例如由淋巴系统以低水平生成而由骨髓瘤以升高的水平生成。
样分子二者。后一类多肽例如由淋巴系统以低水平生成而由骨髓瘤以升高的水平生成。
[0265] 术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，
只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为详细
描述的)。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为详细
描述的)。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
[0266] 术语“抗CD22抗体”或“结合CD22的抗体”指能够以足够亲和力结合 CD22，使得该抗体可用作靶向CD22的治疗剂和/或诊断剂的抗体。优选的是，抗CD22抗体结合无关、
非CD22蛋白的程度小于抗体对CD22结合的约10％，根据例如放射免疫测定法(RIA)的测
量。在某些实施方案中，结合CD22的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、或≤0.1nM
的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗CD22抗体结合在来自不同物种的CD22间保守的
CD22表位。
非CD22蛋白的程度小于抗体对CD22结合的约10％，根据例如放射免疫测定法(RIA)的测
量。在某些实施方案中，结合CD22的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、或≤0.1nM
的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗CD22抗体结合在来自不同物种的CD22间保守的
CD22表位。
[0267] 抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且
包含抗原结合位点。
包含抗原结合位点。
[0268] 术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变
域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区(HVR)的三个区段。
可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个
FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过三个形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠
片结构一部分的CDR连接。每条链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条
链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences ofProteins
of Immunological Interest， 第 5 版，National Institute of Health，Bethesda，
MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依
赖性细胞的细胞毒性中抗体的参与。
域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区(HVR)的三个区段。
可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个
FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过三个形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠
片结构一部分的CDR连接。每条链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条
链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences ofProteins
of Immunological Interest， 第 5 版，National Institute of Health，Bethesda，
MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依
赖性细胞的细胞毒性中抗体的参与。
[0269] 根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
[0270] 根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、
IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、
δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于
例如Abbas等，Cellularand Mol.Immunology，第4版(2000)。抗体可以是抗体与一种或
多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。
IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、
δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于
例如Abbas等，Cellularand Mol.Immunology，第4版(2000)。抗体可以是抗体与一种或
多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。
[0271] 术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗 体。
[0272] “抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、多至大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体片段包含
完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例
如包含Fc区的抗体片段，保留通常与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项
生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，
抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，此类抗体片段可包含一
个抗原结合臂且该抗原结合臂与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。
完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例
如包含Fc区的抗体片段，保留通常与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项
生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，
抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，此类抗体片段可包含一
个抗原结合臂且该抗原结合臂与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。
[0273] 用木瓜蛋白酶消化抗体产生：两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点；及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白
酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
[0274] “Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)
种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和
重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，每个可变域的
三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个CDR一起赋予
抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个CDR
的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和
重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，每个可变域的
三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个CDR一起赋予
抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个CDR
的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
[0275] Fab片段包含重链可变域和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少
数残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半
胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在成对Fab′
片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
数残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半
胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在成对Fab′
片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
[0276] “单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接
头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见 Pluckthun，
于 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies， 卷 113，Rosenburg 和 Moore 编，
Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994。
头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见 Pluckthun，
于 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies， 卷 113，Rosenburg 和 Moore 编，
Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994。
[0277] 术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一
条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而
产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例
如EP 404,097；WO93/1161；Hudson等(2003)Nat.Med.9：129-134；及Hollinger等，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)也
记载于Hudson等(2003)Nat.Med.9：129-134。
条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而
产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例
如EP 404,097；WO93/1161；Hudson等(2003)Nat.Med.9：129-134；及Hollinger等，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)也
记载于Hudson等(2003)Nat.Med.9：129-134。
[0278] 术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变形式外，例如天然存在的突变
形式。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同的抗体的混合物的特征。在某些实施方案
中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列
是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择
过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克
隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶
物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异
性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包
含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每
种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在
于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
形式。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同的抗体的混合物的特征。在某些实施方案
中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列
是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择
过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克
隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶
物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异
性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包
含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每
种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在
于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
[0279] 修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生
成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler等，Nature256：495(1975)；Harlow等，Antibodies：
A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，第2版，1988；Hammerling
等，于：MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas，563-681，Elsevier，N.Y.，1981)、
重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson
等， Nature 352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等，
J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee 等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；
Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等，J.Immunol.
Methods 284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编
码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 98/24893；
WO 96/34096；WO 96/33735；WO91/10741；Jakobovits 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
90：2551(1993)；Jakobovits 等，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann 等，Year
in Immuno.7：33(1993)；美 国 专 利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；
5,633,425；5,661,016；Marks 等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg 等，
Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild等，Nature
Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)； 及
Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler等，Nature256：495(1975)；Harlow等，Antibodies：
A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，第2版，1988；Hammerling
等，于：MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas，563-681，Elsevier，N.Y.，1981)、
重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson
等， Nature 352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等，
J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee 等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；
Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等，J.Immunol.
Methods 284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编
码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 98/24893；
WO 96/34096；WO 96/33735；WO91/10741；Jakobovits 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
90：2551(1993)；Jakobovits 等，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann 等，Year
in Immuno.7：33(1993)；美 国 专 利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；
5,633,425；5,661,016；Marks 等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg 等，
Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild等，Nature
Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)； 及
Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
[0280] 单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分
与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类
抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567及Morrison等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855(1984))。
与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类
抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567及Morrison等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855(1984))。
[0281] 非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变
区残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家
兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的
框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体
中没有找到的残基。可以进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体
将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应
于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗
体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细
节参见Jones等，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；
及Presta，Curr. Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的
参考文献：Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；
Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；及 Hurle 和 Gross，Curr.
Op.Biotech.5：428-433(1994)。
区残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家
兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的
框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体
中没有找到的残基。可以进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体
将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应
于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗
体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细
节参见Jones等，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；
及Presta，Curr. Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的
参考文献：Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；
Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；及 Hurle 和 Gross，Curr.
Op.Biotech.5：428-433(1994)。
[0282] “人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人
抗原结合残基的人源化抗体。
抗原结合残基的人源化抗体。
[0283] 术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个在VH中(H1、H2、H3)，三
个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个高变区的最大多样性，而且认
为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。Xu等(2000)Immunity 13：37-45；
Johnson和Wu(2003)于：Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo编，Human Press，
Totowa，NJ)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的
且稳定的。Hamers-Casterman等(1993)Nature 363：446-448；Sheriff等(1996)Nature
Struct.Biol.3：733-736。
个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个高变区的最大多样性，而且认
为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。Xu等(2000)Immunity 13：37-45；
Johnson和Wu(2003)于：Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo编，Human Press，
Totowa，NJ)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的
且稳定的。Hamers-Casterman等(1993)Nature 363：446-448；Sheriff等(1996)Nature
Struct.Biol.3：733-736。
[0284] 本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological
Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，
MD.(1991))。Chothia改 为 指 结 构 环 的 位 置(Chothia和 Lesk J.Mol.Biol.196：
901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到
Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”高变区是以对可获得的复合物晶
体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，
MD.(1991))。Chothia改 为 指 结 构 环 的 位 置(Chothia和 Lesk J.Mol.Biol.196：
901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到
Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”高变区是以对可获得的复合物晶
体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
[0285] 环 Kabat AbM Chothia 接触
[0286] --- ----------- ----------- ----------- ----------
[0287] L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
[0288] L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
[0289] L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
[0290] H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
[0291] (Kabat编号方式)
[0292] H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
[0293] (Chothia编号方式)
[0294] H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
[0295] H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
[0296] 高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、
94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编
号的。本发明的抗CD22 10F4抗体的HVR-H1和HVR-H2高变区是使用Kabat编号方式的
H26-H35和H49-H65。
94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编
号的。本发明的抗CD22 10F4抗体的HVR-H1和HVR-H2高变区是使用Kabat编号方式的
H26-H35和H49-H65。
[0297] “框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基外的那些残基。
[0298] 术语“如Kabat中的可变域残基编号方式”或“如Kabat中的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第
5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中
用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸
序列可以包含较少的或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链
可变域可以包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat的残基52a)和重链FR残基
82后的插入残基(例如依照Kabat的残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编
号方式可以通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列比对同源区来确定。
5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中
用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸
序列可以包含较少的或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链
可变域可以包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat的残基52a)和重链FR残基
82后的插入残基(例如依照Kabat的残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编
号方式可以通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列比对同源区来确定。
[0299] “游离半胱氨酸”指已经工程改造入亲本抗体的、具有硫醇官能团(-SH)的、且没有配对或以其它方式成为分子内或分子间二硫桥一部分的半胱氨酸残基。
[0300] 术语“硫醇反应性值”是游离半胱氨酸氨基酸的反应性的定量表征。硫醇反应性值指经过半胱氨酸改造的抗体中与硫醇反应性试剂反应的游离半胱氨酸氨基酸的百分比，
且换算成最大值1。例如，经过半胱氨酸改造的抗体上与硫醇反应性试剂(诸如生物素-马
来酰亚胺试剂)以100％产率反应(以形成生物素标记的抗体)的游离半胱氨酸氨基酸
具有1.0的硫醇反应性值。已工程改造入相同或不同亲本抗体、与硫醇反应性试剂以80％
产率反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有0.8的硫醇反应性值。已工程改造入相同或不同
亲本抗体、完全不能与硫醇反应性试剂反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有0的硫醇 反应
性值。特定半胱氨酸的硫醇反应性值的测定可以通过ELISA测定法、质谱、液相层析、放射
自显影、或其它定量分析测试来进行。容许捕捉经过半胱氨酸改造的抗体及比较和定量半
胱氨酸反应性的硫醇反应性试剂包括生物素-PEO-马来酰亚胺((+)-生物素基-3-马来
酰亚氨基丙酰氨基-3，6-二噁辛烷二胺((+)-biotinyl-3-maleimidopropionamidyl-3，
6-dioxaoctaine diamine)，Oda 等 (2001)Nature Biotechnology 19：379-382，Pierce
Biotechnology，Inc.)、生物素-BMCC、PEO-吲哚乙酰基生物素、吲哚乙酰基-LC-生物素、和
生物素-HPDP(Pierce Biotechnology，Inc.)、及Nα-(3-马来酰亚氨基丙酰基)生物胞素
(MPB，Molecular Probes，Eugene，OR)。生物素化、双功能和多功能接头试剂的其它商业来
源包括Molecular Probes(Eugene，OR)和Sigma(St.Louis，MO)。
且换算成最大值1。例如，经过半胱氨酸改造的抗体上与硫醇反应性试剂(诸如生物素-马
来酰亚胺试剂)以100％产率反应(以形成生物素标记的抗体)的游离半胱氨酸氨基酸
具有1.0的硫醇反应性值。已工程改造入相同或不同亲本抗体、与硫醇反应性试剂以80％
产率反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有0.8的硫醇反应性值。已工程改造入相同或不同
亲本抗体、完全不能与硫醇反应性试剂反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有0的硫醇 反应
性值。特定半胱氨酸的硫醇反应性值的测定可以通过ELISA测定法、质谱、液相层析、放射
自显影、或其它定量分析测试来进行。容许捕捉经过半胱氨酸改造的抗体及比较和定量半
胱氨酸反应性的硫醇反应性试剂包括生物素-PEO-马来酰亚胺((+)-生物素基-3-马来
酰亚氨基丙酰氨基-3，6-二噁辛烷二胺((+)-biotinyl-3-maleimidopropionamidyl-3，
6-dioxaoctaine diamine)，Oda 等 (2001)Nature Biotechnology 19：379-382，Pierce
Biotechnology，Inc.)、生物素-BMCC、PEO-吲哚乙酰基生物素、吲哚乙酰基-LC-生物素、和
生物素-HPDP(Pierce Biotechnology，Inc.)、及Nα-(3-马来酰亚氨基丙酰基)生物胞素
(MPB，Molecular Probes，Eugene，OR)。生物素化、双功能和多功能接头试剂的其它商业来
源包括Molecular Probes(Eugene，OR)和Sigma(St.Louis，MO)。
[0301] “亲本抗体”指包含其中一个或多个氨基酸残基有待用一个或多个半胱氨酸残基替换的氨基酸序列的抗体。亲本抗体可以包含天然的或野生型的序列。亲本抗体可具有相
对于其它天然的、野生型的、或修饰形式的抗体而言的现有氨基酸序列修饰(诸如添加、删
除和/或替代)。亲本抗体可以针对感兴趣的靶抗原，例如生物学重要的多肽。还涵盖针对
非多肽抗原(诸如肿瘤相关糖脂抗原；参见US 5091178)的抗体。
对于其它天然的、野生型的、或修饰形式的抗体而言的现有氨基酸序列修饰(诸如添加、删
除和/或替代)。亲本抗体可以针对感兴趣的靶抗原，例如生物学重要的多肽。还涵盖针对
非多肽抗原(诸如肿瘤相关糖脂抗原；参见US 5091178)的抗体。
[0302] 下列缩写在本文中有使用，而且具有所规定的定义：BME指β-巯基乙醇，Boc指N-(叔丁氧羰基)，cit指瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戊酸)，dap指dolaproine，DCC指1，3-二
环己基碳二亚胺，DCM指二氯甲烷，DEA指二乙胺，DEAD指偶氮二羧酸二乙酯，DEPC指氰基磷
酸二乙酯(diethylphosphorylcyanidate)，DIAD指偶氮二羧酸二异丙酯，DIEA指N，N-二
异丙基乙胺，dil指多拉异亮氨酸(dolaisoleucine)，DMA指二甲基乙酰胺，DMAP指4-二
甲基氨基吡啶，DME指乙二醇二甲醚(或1，2-二甲氧基乙烷)，DMF指N，N-二甲基甲酰胺，
DMSO指二甲亚砜，doe指dolaphenine，dov指N，N-二甲基缬氨酸，DTNB指5，5’-二硫代双
(2-硝基苯甲酸)，DTPA指二乙烯三胺五乙酸，DTT指二硫苏糖醇，EDCI指盐酸1-(3-二甲
基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，EEDQ指2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉，ES-MS
指电喷射质谱，EtOAc指乙酸乙酯，Fmoc指N-(9-芴基甲氧羰基)，gly指甘氨酸，HATU指
六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲，HOBt指1-羟基苯并三唑，
HPLC指高压液相层析，ile指异亮氨酸，lys指赖氨酸，MeCN(CH3CN)指乙腈，MeOH指甲醇，
Mtr指4-茴香基二苯基甲基(或4-甲氧基三苯甲基)，nor指(1S，2R)-(+)-去甲麻黄 碱，
PAB指对氨基苄基氨基甲酰基，PBS指磷酸盐缓冲盐水(pH 7)，PEG指聚乙二醇，Ph指苯基，
Pnp指对硝基苯基，MC指6-马来酰亚氨基己酰基，phe指L-苯丙氨酸，PyBrop指六氟磷酸
溴tris-吡咯烷膦，SEC指大小排阻层析，Su指琥珀酰亚胺，TFA指三氟乙酸，TLC指薄层层
析，UV指紫外线，而val指缬氨酸。
环己基碳二亚胺，DCM指二氯甲烷，DEA指二乙胺，DEAD指偶氮二羧酸二乙酯，DEPC指氰基磷
酸二乙酯(diethylphosphorylcyanidate)，DIAD指偶氮二羧酸二异丙酯，DIEA指N，N-二
异丙基乙胺，dil指多拉异亮氨酸(dolaisoleucine)，DMA指二甲基乙酰胺，DMAP指4-二
甲基氨基吡啶，DME指乙二醇二甲醚(或1，2-二甲氧基乙烷)，DMF指N，N-二甲基甲酰胺，
DMSO指二甲亚砜，doe指dolaphenine，dov指N，N-二甲基缬氨酸，DTNB指5，5’-二硫代双
(2-硝基苯甲酸)，DTPA指二乙烯三胺五乙酸，DTT指二硫苏糖醇，EDCI指盐酸1-(3-二甲
基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，EEDQ指2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉，ES-MS
指电喷射质谱，EtOAc指乙酸乙酯，Fmoc指N-(9-芴基甲氧羰基)，gly指甘氨酸，HATU指
六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲，HOBt指1-羟基苯并三唑，
HPLC指高压液相层析，ile指异亮氨酸，lys指赖氨酸，MeCN(CH3CN)指乙腈，MeOH指甲醇，
Mtr指4-茴香基二苯基甲基(或4-甲氧基三苯甲基)，nor指(1S，2R)-(+)-去甲麻黄 碱，
PAB指对氨基苄基氨基甲酰基，PBS指磷酸盐缓冲盐水(pH 7)，PEG指聚乙二醇，Ph指苯基，
Pnp指对硝基苯基，MC指6-马来酰亚氨基己酰基，phe指L-苯丙氨酸，PyBrop指六氟磷酸
溴tris-吡咯烷膦，SEC指大小排阻层析，Su指琥珀酰亚胺，TFA指三氟乙酸，TLC指薄层层
析，UV指紫外线，而val指缬氨酸。
[0303] “亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方
案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟
的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)记
载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残
基的随机诱变：Barbas等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier等，
Gene 169：147-155(1995)；Yelton 等，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson 等，
J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟
的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)记
载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残
基的随机诱变：Barbas等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier等，
Gene 169：147-155(1995)；Yelton 等，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson 等，
J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
[0304] “阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。
[0305] “激动性抗体”在用于本文时指模拟感兴趣多肽的至少一项功能性活性的抗体。
[0306] 抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补
体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细
胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细
胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
[0307] “Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中，FcR是天然人FcR。在有些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII
和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括
FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别
主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸
的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的
抑制基序(ITIM)(参见 Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参
见Ravetch 和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel 等，Immunomethods4：
25-34(1994)；及de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-341(1995)。术语“FcR”在本文中
涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。
和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括
FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别
主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸
的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的
抑制基序(ITIM)(参见 Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参
见Ravetch 和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel 等，Immunomethods4：
25-34(1994)；及de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-341(1995)。术语“FcR”在本文中
涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。
[0308] 术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，其负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))和调节免疫
球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997，Hinton
2004)。可以测定人FcRn高亲和力结合多肽对人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表
达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了Fc变体多肽的灵长类动物中。
球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997，Hinton
2004)。可以测定人FcRn高亲和力结合多肽对人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表
达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了Fc变体多肽的灵长类动物中。
[0309] WO00/42072(Presta)记载了对FcR的结合得到改进或消除的抗体变体。将该专利出版物的内容明确收入本文作为参考。还可参见Shields等，J.Biol.Chem.9(2)：
6591-6604(2001)。
6591-6604(2001)。
[0310] “人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包
括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性细
胞。效应细胞可以自其天然来源分离，例如血液。
括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性细
胞。效应细胞可以自其天然来源分离，例如血液。
[0311] “抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型
Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶
细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达
FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第
464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外
ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或Presta美国专利No.6,737,056
中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤
(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如
Clynes等，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。
Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶
细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达
FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第
464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外
ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或Presta美国专利No.6,737,056
中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤
(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如
Clynes等，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。
[0312] “补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经 典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)与结合至关联抗原的抗体(适宜亚类的)结合起始的。
为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods
202：163(1996)中所记载的。
为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods
202：163(1996)中所记载的。
[0313] 具有改变的Fc区氨基酸序列及提高的或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1和WO99/51642。将那些专利出版物的内容明确收入本文作为参
考。还可参见Idusogie等，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
考。还可参见Idusogie等，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
[0314] 术语“含Fc区多肽”指包含Fc区的多肽，诸如抗体或免疫粘附素。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以消除，例如在纯化多肽的过程中或者通过重
组改造编码多肽的核酸。因而，依照本发明包含具有Fc区的多肽的组合物可包含都具有
K447的多肽、都消除了K447的多肽、或具有与没有K447残基的多肽的混合物。
组改造编码多肽的核酸。因而，依照本发明包含具有Fc区的多肽的组合物可包含都具有
K447的多肽、都消除了K447的多肽、或具有与没有K447残基的多肽的混合物。
[0315] 就本文目的而言，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框
架可包含与之相同的氨基酸序列，或者可包含预先存在的氨基酸序列变化。在有些实施方
案中，预先存在的氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6
个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或者2个或更少。当VH中存在预先存在的
氨基酸变化时，优选那些变化只存在于71H、73H和78H中的三个、两个或一个位置；例如，位
于那些位置的氨基酸残基可以是71A、73T和/或78A。在一个实施方案中，VL受体人框架
在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
架可包含与之相同的氨基酸序列，或者可包含预先存在的氨基酸序列变化。在有些实施方
案中，预先存在的氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6
个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或者2个或更少。当VH中存在预先存在的
氨基酸变化时，优选那些变化只存在于71H、73H和78H中的三个、两个或一个位置；例如，位
于那些位置的氨基酸残基可以是71A、73T和/或78A。在一个实施方案中，VL受体人框架
在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
[0316] “人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是
如Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health
Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中的亚组。在一个实施方
案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组
是如Kabat等，见上文中的亚组III。
如Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health
Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中的亚组。在一个实施方
案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组
是如Kabat等，见上文中的亚组III。
[0317] “VH亚组III共有框架”包含从Kabat等，见上文的可变重链亚组III中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VH亚组III共有框架氨基酸序列包含下列各序
列的至少一部分或整个：
列的至少一部分或整个：
[0318] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(FR-H1，SEQ ID NO ：1)-HVR-H1-WVRQAPGKGLEWV(FR-H2，SEQ ID NO：3)-HVR-H2-RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAV
YYCAR(FR-H3，SEQ ID NO：5)-HVR-H3-WGQGTLVTVSS(FR-H4，SEQ ID NO：7)。
YYCAR(FR-H3，SEQ ID NO：5)-HVR-H3-WGQGTLVTVSS(FR-H4，SEQ ID NO：7)。
[0319] “VL亚组I共有框架”包含从Kabat等，见上文的可变轻链κ亚组I中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VL亚组I共有框架氨基酸序列包含下列各序列
的至少一部分或整个：
的至少一部分或整个：
[0320] DIQ MTQ SP SSL SAS VGD RVT IT C(F R-L 1，S EQ ID NO ：8)-HVR-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(FR-L2，SEQ ID NO：11)-HVR-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP
EDFATYYC(FR-L3，SEQ ID NO：13)-HVR-L3-FGQGTKVEIK(FR-L4，SEQ ID NO：15)。
EDFATYYC(FR-L3，SEQ ID NO：13)-HVR-L3-FGQGTKVEIK(FR-L4，SEQ ID NO：15)。
[0321] “分泌信号序列”或“信号序列”指编码可用于指导新合成的感兴趣蛋白质穿过细胞膜的短信号肽的核酸序列，所述细胞膜通常指原核生物的内膜或者内膜和外膜二者。如
此，感兴趣蛋白质诸如免疫球蛋白轻链或重链多肽分泌进入原核宿主细胞的周质或者进入
培养基。由分泌信号序列编码的信号肽对宿主细胞可以是内源的，或者它们可以是外源的，
包括对待表达多肽是天然的信号肽。分泌信号序列通常存在于待表达多肽的氨基末端，而
且通常在多肽的生物合成和从细胞质分泌出去之间酶促切除。如此，信号肽通常不存在于
成熟蛋白质产物中。
此，感兴趣蛋白质诸如免疫球蛋白轻链或重链多肽分泌进入原核宿主细胞的周质或者进入
培养基。由分泌信号序列编码的信号肽对宿主细胞可以是内源的，或者它们可以是外源的，
包括对待表达多肽是天然的信号肽。分泌信号序列通常存在于待表达多肽的氨基末端，而
且通常在多肽的生物合成和从细胞质分泌出去之间酶促切除。如此，信号肽通常不存在于
成熟蛋白质产物中。
[0322] “结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指
反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对
其配偶Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法
来测量，包括本文中所描述的。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲
和力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力
的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。
反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对
其配偶Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法
来测量，包括本文中所描述的。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲
和力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力
的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。
[0323] 在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的：通过
125
在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的( I)标记抗原平衡Fab，然后用抗
Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen，等，J Mol
Biol 293：865-881(1999))。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕
捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2％(w/v)
牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM
125
或26pM[ I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合(例如与Presta等，Cancer Res.57：
4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣Fab保温过夜；不
过，保温可持续更长时间(例如约65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕
捉板以进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液，并用含0.1％Tween-20的PBS洗板
8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MicroScint-20；Packard)，然后在Topcount伽
马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％
的浓度用于竞争性结合测定法。
125
在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的( I)标记抗原平衡Fab，然后用抗
Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen，等，J Mol
Biol 293：865-881(1999))。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕
捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2％(w/v)
牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM
125
或26pM[ I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合(例如与Presta等，Cancer Res.57：
4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣Fab保温过夜；不
过，保温可持续更长时间(例如约65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕
捉板以进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液，并用含0.1％Tween-20的PBS洗板
8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MicroScint-20；Packard)，然后在Topcount伽
马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％
的浓度用于竞争性结合测定法。
[0324] 依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用TM TM
BIAcore -2000或BIAcore -3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗
原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙
基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基
化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至
5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋
白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约
25μl/分钟的流速注入在含0.05％Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM
至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcoreEvaluation Software
version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。
平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen，Y.，等，J Mol Biol 293：
6 -1 -1
865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10M s ，那么结
合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a
stop-flow equippedspectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光
光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件 下，
测量PBS，pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；
发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
BIAcore -2000或BIAcore -3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗
原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙
基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基
化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至
5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋
白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约
25μl/分钟的流速注入在含0.05％Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM
至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcoreEvaluation Software
version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。
平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen，Y.，等，J Mol Biol 293：
6 -1 -1
865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10M s ，那么结
合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a
stop-flow equippedspectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光
光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件 下，
测量PBS，pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；
发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
[0325] 依照本发明的“结合速率”(on-rate，rate of association，association rate)TM TM
或“kon”也可如上所述使用BIAcore -2000或BIAcore -3000系统(BIAcore，Inc.，
Piscataway，NJ)来测定。
或“kon”也可如上所述使用BIAcore -2000或BIAcore -3000系统(BIAcore，Inc.，
Piscataway，NJ)来测定。
[0326] “病症”指任何会受益于使用本发明物质/分子或方法的治疗的疾患或疾病。这包括慢性和急性病症，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗
的病症的非限制性例子包括癌性疾患，诸如B细胞增殖性病症和/或B细胞肿瘤，例如淋
巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性
NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细
胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细胞淋巴瘤。
的病症的非限制性例子包括癌性疾患，诸如B细胞增殖性病症和/或B细胞肿瘤，例如淋
巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性
NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细
胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细胞淋巴瘤。
[0327] 术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。
[0328] “肿瘤”在用于本文时指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、
“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
[0329] 术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中典型特征为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌性B细胞增殖性病症。B细胞增殖性病症，其选
自淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽
固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、
毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细胞淋巴瘤。其它癌症疾患包括
例如癌瘤、淋巴瘤(例如何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。
此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、
腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、
肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列
腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴增殖性病症、及各
种类型的头颈癌。
自淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽
固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、
毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细胞淋巴瘤。其它癌症疾患包括
例如癌瘤、淋巴瘤(例如何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。
此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、
腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、
肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列
腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴增殖性病症、及各
种类型的头颈癌。
[0330] “B细胞恶性肿瘤”在本文中包括非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，其包括低级/滤泡性NHL、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高
级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞NHL、贮积病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、
和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s Macroglobulinemia)、非何杰金氏淋巴
瘤(NHL)、淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细
胞性白血病(CLL)、无痛性NHL(包括复发性无痛性NHL和利妥昔单抗不应性无痛性NHL)；
白血病，其包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白
血病、慢性成髓细胞白血病；套细胞淋巴瘤；和其它血液学恶性肿瘤。此类恶性肿瘤可以用
针对B细胞表面标志物(诸如CD22)的抗体来治疗。此类疾病涵盖在本文中，以通过施用
针对B细胞表面标志物(诸如CD22)的抗体来治疗，包括施用未偶联的抗体(“裸抗体”)
或偶联有细胞毒剂的抗体，正如本文中所公开的。此类疾病还涵盖在本文中，以通过包括本
发明的抗CD22抗体或抗CD22抗体-药物偶联物联合另一抗体或抗体-药物偶联物、另一
细胞毒剂、放射或其它治疗的联合疗法(同时施用或顺次施用)来治疗。在本发明的例示
性治疗方法中，联合施用本发明的抗CD22抗体及抗CD20抗体、免疫球蛋白、或其CD20结合
片段，或是一起施用或是顺次施用。所述抗CD20抗体可以是裸抗体或抗体-药物偶联物。
在联合疗法的一个实施方案中，所述抗CD22抗体是本发明的抗体，而所述抗CD20抗体是
(利妥昔单抗，即rituximab)。
级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞NHL、贮积病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、
和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s Macroglobulinemia)、非何杰金氏淋巴
瘤(NHL)、淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细
胞性白血病(CLL)、无痛性NHL(包括复发性无痛性NHL和利妥昔单抗不应性无痛性NHL)；
白血病，其包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白
血病、慢性成髓细胞白血病；套细胞淋巴瘤；和其它血液学恶性肿瘤。此类恶性肿瘤可以用
针对B细胞表面标志物(诸如CD22)的抗体来治疗。此类疾病涵盖在本文中，以通过施用
针对B细胞表面标志物(诸如CD22)的抗体来治疗，包括施用未偶联的抗体(“裸抗体”)
或偶联有细胞毒剂的抗体，正如本文中所公开的。此类疾病还涵盖在本文中，以通过包括本
发明的抗CD22抗体或抗CD22抗体-药物偶联物联合另一抗体或抗体-药物偶联物、另一
细胞毒剂、放射或其它治疗的联合疗法(同时施用或顺次施用)来治疗。在本发明的例示
性治疗方法中，联合施用本发明的抗CD22抗体及抗CD20抗体、免疫球蛋白、或其CD20结合
片段，或是一起施用或是顺次施用。所述抗CD20抗体可以是裸抗体或抗体-药物偶联物。
在联合疗法的一个实施方案中，所述抗CD22抗体是本发明的抗体，而所述抗CD20抗体是
(利妥昔单抗，即rituximab)。
[0331] 术语“非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤”或“NHL”在用于本文时指何杰金氏淋巴瘤以外的淋巴系统癌症。通常可通过何杰金氏淋巴瘤中存在里-施(Reed-Sternberg)细胞
而非何杰金氏淋巴瘤中不存在所述细胞将何杰金氏淋巴瘤与非何杰金氏淋巴瘤区分开来。
非何杰金氏淋巴瘤在该术语用于本文时所涵盖的例子包括本领域技术人员(例如肿瘤学
家或病理学家)依照本领域已知的分类表将鉴定为此类的任何淋巴瘤，诸如Color Atlas
of ClinicalHematology，第3版，Victor A.Hoffbrand和John E.Pettit编，Harcourt
PublishersLtd.，2000中记载的Revised European-American Lymphoma(REAL)scheme(欧
美淋巴瘤修正表)。具体参见图11.57、11.58和11.59中的表。更具体例子包括但不限于
复发性或顽固性NHL、前线(front line)低级HL、阶段III/IV NHL、化疗耐受性NHL、前体
B成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤、小淋巴细胞性淋 巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血
病和/或前淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性淋巴瘤、免
疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性(lymphoplasmacytic)淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘
区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、节外边缘区(extranodal marginal zone)-MALT淋巴
瘤、节边缘区(nodal marginal zone)淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓
瘤、低级/滤泡淋巴瘤、中级/滤泡NHL、套细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤(滤泡的)、中级弥
漫性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、攻击性(agressive)NHL(包括攻击性前线NHL和攻击性
复发性NHL)、自体干细胞移植后复发性或顽固性NHL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、原发性
渗出性淋巴瘤、高级成免疫细胞NHL、高级成淋巴细胞NHL、高级小无核裂细胞NHL、贮积病
(bulky disease)NHL、伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤、前体(外周)大粒状淋巴细胞性白血病、
蕈样肉芽肿病和/或塞扎里(Sezary)综合征、皮肤(表皮)淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、
血管中心性淋巴瘤。
而非何杰金氏淋巴瘤中不存在所述细胞将何杰金氏淋巴瘤与非何杰金氏淋巴瘤区分开来。
非何杰金氏淋巴瘤在该术语用于本文时所涵盖的例子包括本领域技术人员(例如肿瘤学
家或病理学家)依照本领域已知的分类表将鉴定为此类的任何淋巴瘤，诸如Color Atlas
of ClinicalHematology，第3版，Victor A.Hoffbrand和John E.Pettit编，Harcourt
PublishersLtd.，2000中记载的Revised European-American Lymphoma(REAL)scheme(欧
美淋巴瘤修正表)。具体参见图11.57、11.58和11.59中的表。更具体例子包括但不限于
复发性或顽固性NHL、前线(front line)低级HL、阶段III/IV NHL、化疗耐受性NHL、前体
B成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤、小淋巴细胞性淋 巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血
病和/或前淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性淋巴瘤、免
疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性(lymphoplasmacytic)淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘
区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、节外边缘区(extranodal marginal zone)-MALT淋巴
瘤、节边缘区(nodal marginal zone)淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓
瘤、低级/滤泡淋巴瘤、中级/滤泡NHL、套细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤(滤泡的)、中级弥
漫性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、攻击性(agressive)NHL(包括攻击性前线NHL和攻击性
复发性NHL)、自体干细胞移植后复发性或顽固性NHL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、原发性
渗出性淋巴瘤、高级成免疫细胞NHL、高级成淋巴细胞NHL、高级小无核裂细胞NHL、贮积病
(bulky disease)NHL、伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤、前体(外周)大粒状淋巴细胞性白血病、
蕈样肉芽肿病和/或塞扎里(Sezary)综合征、皮肤(表皮)淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、
血管中心性淋巴瘤。
[0332] “自身免疫病”在本文中指源于且针对个体自身组织或器官的疾病或病症或其共分离(co-segregate)或表现或由其导致的状况。在这些自身免疫性和炎性病症的许多中，
可以存在许多临床和实验室标志物，包括但不限于：高丙种球蛋白血症、高水平自身抗体、
组织中抗原-抗体复合物沉积、得益于皮质类固醇或免疫抑制治疗、及受侵害组织中的淋
巴样细胞集合体。不限于任意一种有关B细胞介导的自身免疫病的理论，认为B细胞通过众
多机械论途径在人自身免疫病中表现出致病作用，包括自身抗体产生、免疫复合物形成、树
突细胞和T细胞活化、细胞因子合成、直接趋化因子释放和提供用于异位新淋巴生成的巢。
这些途径中的每一种可以以不同程度参与自身免疫病的病理学。
可以存在许多临床和实验室标志物，包括但不限于：高丙种球蛋白血症、高水平自身抗体、
组织中抗原-抗体复合物沉积、得益于皮质类固醇或免疫抑制治疗、及受侵害组织中的淋
巴样细胞集合体。不限于任意一种有关B细胞介导的自身免疫病的理论，认为B细胞通过众
多机械论途径在人自身免疫病中表现出致病作用，包括自身抗体产生、免疫复合物形成、树
突细胞和T细胞活化、细胞因子合成、直接趋化因子释放和提供用于异位新淋巴生成的巢。
这些途径中的每一种可以以不同程度参与自身免疫病的病理学。
[0333] 自身免疫病可以为器官特异性疾病(即免疫应答特异性针对一种器官系统，诸如内分泌系统、造血系统、皮肤、心肺系统、胃肠和肝系统、肾系统、甲状腺、耳、神经肌肉
系统、中枢神经系统等)或可以影响多器官系统的系统性疾病(例如系统性红斑狼疮
(SLE)、类风湿性关节炎、多肌炎等)。优选的此类疾病包括自身免疫性风湿病学病症(诸
如例如类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征( syndrome)、硬皮病、狼疮(诸
如SLE和狼疮肾炎)、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征、和银屑病关节
炎)、自身免疫性胃肠和肝病症(诸如例如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏 病
(Crohn′s disease))、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬
化、原发性硬化性胆管炎、和乳糜泻)、血管炎(诸如例如ANCA阴性血管炎和ANCA相关血
管炎，包括丘施二氏血管炎(Churg-Straussvasculitis)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′s
granulomatosis)、和微观多脉管炎)、自身免疫性神经病学病症(诸如例如多发性硬化、视
性眼阵挛肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、
阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、和自身免疫性多神经病)、肾病症(诸如例如
肾小球肾炎、古德帕斯丘氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、和贝格尔氏病(Berger’s
disease))、自身免疫性皮肤病学病症(诸如例如银屑病、荨麻疹、hives、寻常型天疱疮、大
疱性类天疱疮、和皮肤红斑狼疮)、血液学病症(诸如例如血小板减少性紫癜、血栓性血小
板减少性紫癜、输血后紫癜、和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免
疫性听觉疾病(诸如例如内耳病和听力损失)、贝切特氏病(Behcet′s disease)、雷诺氏
综合征(Raynaud′s syndrome)、器官移植、和自身免疫性内分泌病症(诸如例如糖尿病相
关自身免疫病诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病(Addison’sdisease)、和自身
免疫性甲状腺病(例如格雷夫斯氏病(Graves’disease)和甲状腺炎))。更优选的此类疾
病包括例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关血管炎、狼疮、多发性硬化、斯耶格伦
氏综合征、格雷夫斯氏病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎、和肾小球肾炎。
系统、中枢神经系统等)或可以影响多器官系统的系统性疾病(例如系统性红斑狼疮
(SLE)、类风湿性关节炎、多肌炎等)。优选的此类疾病包括自身免疫性风湿病学病症(诸
如例如类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征( syndrome)、硬皮病、狼疮(诸
如SLE和狼疮肾炎)、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征、和银屑病关节
炎)、自身免疫性胃肠和肝病症(诸如例如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏 病
(Crohn′s disease))、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬
化、原发性硬化性胆管炎、和乳糜泻)、血管炎(诸如例如ANCA阴性血管炎和ANCA相关血
管炎，包括丘施二氏血管炎(Churg-Straussvasculitis)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′s
granulomatosis)、和微观多脉管炎)、自身免疫性神经病学病症(诸如例如多发性硬化、视
性眼阵挛肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、
阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、和自身免疫性多神经病)、肾病症(诸如例如
肾小球肾炎、古德帕斯丘氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、和贝格尔氏病(Berger’s
disease))、自身免疫性皮肤病学病症(诸如例如银屑病、荨麻疹、hives、寻常型天疱疮、大
疱性类天疱疮、和皮肤红斑狼疮)、血液学病症(诸如例如血小板减少性紫癜、血栓性血小
板减少性紫癜、输血后紫癜、和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免
疫性听觉疾病(诸如例如内耳病和听力损失)、贝切特氏病(Behcet′s disease)、雷诺氏
综合征(Raynaud′s syndrome)、器官移植、和自身免疫性内分泌病症(诸如例如糖尿病相
关自身免疫病诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病(Addison’sdisease)、和自身
免疫性甲状腺病(例如格雷夫斯氏病(Graves’disease)和甲状腺炎))。更优选的此类疾
病包括例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关血管炎、狼疮、多发性硬化、斯耶格伦
氏综合征、格雷夫斯氏病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎、和肾小球肾炎。
[0334] 本文中所定义的其它自身免疫性疾病的具体例子(在有些情况中涵盖上文所列举的那些)包括但不限于关节炎(急性的和慢性的，类风湿性关节炎，包括幼发型类风湿性
关节炎和关节炎的各个阶段诸如类风湿性滑膜炎、痛风或痛风性关节炎、急性免疫性关节
炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱发的关节炎、感染性关节炎、莱姆(Lyme)
关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、斯提耳氏(Still)病、脊椎关节炎、骨关节炎、慢
性进行性关节炎、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎、绝经期关节炎、雌激
素消减性关节炎、和强直性脊柱炎/类风湿性脊椎炎)，自身免疫性淋巴细胞增生性疾病，
炎性过度增殖性皮肤病，银屑病诸如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑
病，特应性包括特应性疾病诸如干草热和乔布氏(Job)综合征，皮炎包括接触性皮炎、慢性
接触性皮炎、剥脱性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、荨麻疹、疱疹样皮炎、钱币状皮
炎、 脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎和特应性皮炎，x连锁的高IgM
综合征，变应性眼内炎性疾病，荨麻疹诸如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹(包括
慢性自身免疫性荨麻疹)，肌炎，多肌炎/皮肌炎，青少年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解
症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化诸如系统性硬化、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼
(spino-optical)MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发性消退性(relapsing remitting)
MS(RRMS)、进行性系统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化、共济失调性(ataxic)
硬化，视神经脊髓炎(NMO)，炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏(Crohn)病、自身免疫介导的胃
肠病、胃肠炎症、结肠炎诸如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，colitis ulcerosa)、微
观结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎、和自身免疫
性炎性肠病)，肠炎，坏疽性脓皮症，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，呼吸窘迫综合征包
括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，整个或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络
膜炎，自身免疫性血液学病症，移植物抗宿主疾病，血管性水肿诸如遗传性血管性水肿，脑
神经损伤像脑膜炎中的，妊娠疱疹，妊娠性类天疱疮，阴囊瘙癣(pruritis scroti)，自身免
疫性早熟性卵巢衰竭，因自身免疫性疾患引起的突发性听觉丧失，IgE介导的疾病诸如过敏
反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen)脑炎和边缘系和/或脑干
脑炎，葡萄膜炎(诸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄
膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和没有肾病综合征
的肾小球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜
性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜增殖性或膜性增殖性GN(MPGN)(包括I型
和II型)、和急进性GN(RPGN)，增殖性肾炎，自身免疫性多腺体内分泌衰竭，龟头炎包括浆
细胞性局限性龟头炎，龟头包皮炎，离心性环状红斑，持久性色素异常性红斑，多形性红斑，
环状肉芽肿，光泽苔藓，硬化萎缩性苔藓，慢性单纯苔藓，小棘苔藓，扁平苔藓，片层状鱼鳞
癣，表皮松解性角化过度，恶变前角化，坏疽性脓皮症，变应性疾患和应答，食物过敏，药物
过敏，昆虫过敏，罕见的过敏性病症诸如肥大细胞增生病，过敏反应，湿疹包括变应性或特
应性湿疹、干性湿疹、汗疱和水泡性掌跖湿疹(vesicular palmoplantar eczema)，哮喘诸
如支气管哮喘(asthma bronchiale，bronchial asthma)和自身免疫性哮喘，涉及T细胞
浸润和慢 性炎性应答的疾患，针对外来抗原诸如妊娠期间胎儿A-B-O血型的免疫反应，慢
性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，狼疮包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科
狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、狼疮脱发、SLE(诸如皮肤SLE或亚急
性皮肤SLE)、新生儿狼疮综合征(NLE)、和播散性红斑狼疮，幼发型(I型)糖尿病包括儿
科IDDM，成人期发作的糖尿病(II型糖尿病)，自身免疫性糖尿病，特发性尿崩症，糖尿病
视网膜病变，糖尿病肾病，糖尿病结肠炎，糖尿病大动脉病症，与细胞因子和T-淋巴细胞介
导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽
肿病、粒细胞缺乏，血管炎病(包括大血管血管炎(诸如风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏
(Takayasu))动脉炎)、中血管血管炎(诸如川崎氏(Kawasaki)病和结节性多动脉炎/结节
性动脉周围炎)、免疫血管炎、CNS血管炎、皮肤性血管炎、超敏感性血管炎、坏死性血管炎
(诸如类纤维蛋白坏死性血管炎和系统性坏死性血管炎)、ANCA阴性血管炎、和ANCA相关血
管炎诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)综合征(CSS)，韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病、和微
观多脉管炎)，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，库姆斯(Coombs)
阳性贫血，戴-布二氏(Diamond Blackfan)贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自
身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血(pernicious anemia，anemia perniciosa)，阿狄
森氏(Addison)病，单纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身
免疫性嗜中性粒细胞减少症，细胞减少症诸如全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞
渗出的疾病，CNS炎性病症，阿耳茨海默氏(Alzheimer)病，帕金森氏(Parkinson)病，多
器官损伤综合征诸如那些脓毒症、外伤或出血继发的，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗
肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，运动神经炎，变应性神经炎，贝切特氏(Behcet)病/
综合征，卡斯尔曼氏(Castleman)综合征，古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征，雷诺氏
(Reynaud)综合征，斯耶格伦氏 综合征，史-约二氏(Stevens-Johnson)综合
征，类天疱疮或天疱疮诸如大疱性类天疱疮、瘢痕性(粘膜)类天疱疮、皮肤类天疱疮、寻
常型天疱疮、副肿瘤性天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮和红斑性天疱疮，获
得性大疱性表皮松解症，眼部炎症(优选变应性眼部炎症，诸如变应性结膜炎、线性IgA大
疱性疾病、自身免疫诱发的结膜炎症)，自身免疫性多内分泌病，莱特氏(Reiter)病或综
合征，由自身免疫性疾患引起的热伤， 先兆子痫，免疫复合物病症诸如免疫复合物肾炎，抗
体介导的肾炎，神经炎性病症，多神经病，慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经
病，血小板减少症(例如心肌梗死患者发生的)包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血
后紫癜(PTP)、肝素诱发的血小板减少症、和自身免疫或免疫介导的血小板减少症(包括
例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP)，巩膜炎诸如特发性角膜-巩
膜炎、巩膜外层炎，睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状
腺功能减退症，甲状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎(诸如自身免疫性
甲状腺炎、桥本氏(Hashimoto)病、慢性甲状腺炎(桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎)或亚
急性甲状腺炎)、自身免疫性甲状腺病、特发性甲状腺功能减退症、格雷夫斯氏(Graves)
病，格雷夫斯氏眼病(Grave′s eye disease)(眼病或甲状腺相关眼病)，多腺性综合征
诸如自身免疫性多腺体综合征例如I型(或多腺性内分泌病综合征)，瘤外综合征包括
神经学瘤外综合征诸如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特
(Lambert-Eaton)综合征，僵体或僵人综合征，脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎(allergic
encephalomyelitis，encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，
重症肌无力诸如胸腺瘤相关重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，视性眼阵挛或视性眼阵
挛肌阵挛综合征(OMS)，和感觉神经病，多病灶运动神经病，席汉氏(Sheehan)综合征，自
身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性
活动性肝炎，肺炎诸如淋巴样间质性肺炎(LIP)，梗阻性细支气管炎(非移植物)对NSIP，
格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征，贝格尔氏(Berger)病(IgA肾病)，特发性IgA肾
病，线性IgA皮肤病，急性热性嗜中性白细胞皮肤病，角质层下脓疱皮肤病，一过性棘层松
解性皮肤病，硬化诸如原发性胆汁性肝硬化和肺硬变，自身免疫性肠病综合征，乳糜泻，腹
腔或腹部疾病，口炎性腹泻(麸质肠病)，顽固性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白
血症诸如混合型冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS)(卢格里克氏(Lou Gehrig)病)，冠
状动脉病，自身免疫性耳病诸如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听觉丧失，多软骨炎
诸如顽固性或复发的或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，角膜炎诸如寇甘氏(Cogan)综
合征/非梅毒性间质性角膜炎，贝耳氏(Bell)麻痹，斯威特氏(Sweet)病/综合征，自身
免疫性酒糟鼻，带状疱疹相关疼痛，淀粉样变，非癌性淋巴细胞增多，原发性 淋巴细胞增多
包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和性质未确定的单克隆
丙种球蛋白病(MGUS))，周围神经病，瘤外综合征，通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌
肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病，孤独症，炎性肌病，局灶性或节段性或局
灶性节段性肾小球硬化(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免
疫性肝脏病学病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特氏(Schmidt)综合征，肾上腺炎，
胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病，德
雷斯勒氏(Dressler)综合征，斑秃，全秃，CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏(Raynaud)
现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细管扩张)，男性和女性自身免疫性不孕不育例
如由于抗精虫抗体的，混合性结缔组织病，恰加斯氏(Chagas)病，风湿热，习惯性流产，农
民肺，多形红斑，心脏切开术后综合征，柯兴氏(Cushing)综合征，养鸟者肺，变应性肉芽
肿性血管炎，良性淋巴细胞性血管炎，阿尔波特氏(Alport)综合征，肺泡炎诸如变应性肺
泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风，疟疾，寄生虫病诸如利什曼病、锥虫病
(kypanosomiasis)、血吸虫病、蛔虫病，曲霉病，Sampter氏综合征，卡普兰氏(Caplan)综
合征，登革，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺纤维化，纤维性
纵隔炎，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑，胎儿成红细胞
增多症，嗜曙红细胞性筋膜炎(faciitis)、舒尔曼氏(Shulman)综合征，费尔提氏(Felty)
综合征，flariasis，睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性
或慢性)、或Fuch氏睫状体炎，亨诺-许兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人免疫缺陷病
毒(HIV)感染，SCID，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，艾柯病毒感染，脓毒症(系统性炎性
应答综合征(SIRS))，内毒素血症，胰腺炎，甲状腺毒症(thyroxicosis)，细小病毒感染，风
疹病毒感染，种痘后综合征，先天性风疹感染，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染，
腮腺炎，埃文斯(Evans)综合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病，链
球菌后肾炎，闭塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络
膜炎，巨细胞性多肌痛，慢性超敏感性肺炎，结膜炎，诸如春季卡他、干燥性角膜结膜炎、和
流行性角膜结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血-再灌注损伤，
移植器官再灌注，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道/肺部 疾病，硅
沉着病，口疮，口疮性口炎，动脉硬化性病症(大脑血管功能不全)诸如动脉硬化性脑病和
动脉硬化性视网膜病，无精子发生(aspermiogenese)，自身免疫性溶血，伯克氏(Boeck)
病，冷球蛋白血症，杜普伊特伦氏(Dupuytren)挛缩，晶体过敏性眼内炎(endophthalmia
phacoanaphylactica)，变应性小肠炎(enteritis allergica)，麻风节结性红斑，特发性
面瘫，慢性疲乏综合征，风湿热(febris rheumatica)，哈-里二氏(Hamman-Rich)病，感
觉神经性听觉丧失，阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)，性腺功能减
退，局限性回肠炎(ileitis regionalis)，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯性
(traverse)脊髓炎，原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmiasymphatica)
(sympathetic ophthalmitis)，新生儿眼炎，视神经炎，肉芽肿性睾丸炎(orchitis
granulomatosa)，胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮症，奎尔万氏(Quervain)甲状腺
炎，获得性脾萎缩，非恶性胸腺瘤，淋巴滤泡性胸腺炎，白癜风，中毒性休克综合征，食物中
毒，涉及T细胞浸润的疾患，白细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟
发性超敏感性有关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复
合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性粘液水肿，
自身免疫性萎缩性胃炎，风湿病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，
自身免疫性多腺性综合征，包括多腺性综合征I型，成人期发作的特发性甲状旁腺功能减
退(AOIH)，心肌病诸如扩张型心肌病，获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosa
acquisita，EBA)，血色素沉着，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化
脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎，上颌窦炎或蝶窦炎，变应性鼻窦炎，嗜曙
红细胞相关病症诸如嗜曙红细胞增多症、肺嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌
痛综合征、吕弗勒氏(Loffler)综合征、慢性嗜曙红细胞性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、
支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含有嗜曙红细胞的肉芽肿，过敏反应，脊椎关节病，血清阴性
脊椎关节炎病，多内分泌自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝
酵母病，布鲁顿氏(Bruton)综合征，婴儿期一过性低丙种球蛋白血症，威斯科特-奥尔德
里齐(Wiskott-Aldrich)综合征，共济失调性毛细管扩张综合征，血管扩张，与以下各项
有关的自身免疫性病症：胶原病、风湿病诸如慢性关节风湿病、淋巴结炎、血压应答降低
(reduction in blood pressure response)、血管功能障 碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉
过敏、肾缺血、脑缺血和伴随血管化的疾病，变应性超敏感性病症，肾小球肾炎病，再灌注损
伤，缺血再灌注病症，心肌或其它组织的再灌注损伤，淋巴瘤气管支气管炎，炎性皮肤病，具
有急性炎性成分的皮肤病，多器官衰竭，大疱病，肾皮质坏死，急性化脓性脑膜炎或其它中
枢神经系统炎性病症，眼和眶炎性病症，粒细胞输血相关综合征，细胞因子诱发的中毒，发
作性睡病，急性重度炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎，和子
宫内膜异位症。此类疾病涵盖在本文中，以通过施用结合B细胞表面标志物(诸如CD22)的
抗体来治疗，包括施用未偶联的抗体(“裸抗体”)或偶联有细胞毒剂的抗体，正如本文中所
公开的。此类疾病还涵盖在本文中，以通过包括本发明的抗CD22抗体或抗CD22抗体-药物
偶联物联合另一抗体或抗体-药物偶联物、另一细胞毒剂、放射或其它治疗的联合疗法(同
时施用或顺次施用)来治疗。
关节炎和关节炎的各个阶段诸如类风湿性滑膜炎、痛风或痛风性关节炎、急性免疫性关节
炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱发的关节炎、感染性关节炎、莱姆(Lyme)
关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、斯提耳氏(Still)病、脊椎关节炎、骨关节炎、慢
性进行性关节炎、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎、绝经期关节炎、雌激
素消减性关节炎、和强直性脊柱炎/类风湿性脊椎炎)，自身免疫性淋巴细胞增生性疾病，
炎性过度增殖性皮肤病，银屑病诸如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑
病，特应性包括特应性疾病诸如干草热和乔布氏(Job)综合征，皮炎包括接触性皮炎、慢性
接触性皮炎、剥脱性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、荨麻疹、疱疹样皮炎、钱币状皮
炎、 脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎和特应性皮炎，x连锁的高IgM
综合征，变应性眼内炎性疾病，荨麻疹诸如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹(包括
慢性自身免疫性荨麻疹)，肌炎，多肌炎/皮肌炎，青少年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解
症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化诸如系统性硬化、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼
(spino-optical)MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发性消退性(relapsing remitting)
MS(RRMS)、进行性系统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化、共济失调性(ataxic)
硬化，视神经脊髓炎(NMO)，炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏(Crohn)病、自身免疫介导的胃
肠病、胃肠炎症、结肠炎诸如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，colitis ulcerosa)、微
观结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎、和自身免疫
性炎性肠病)，肠炎，坏疽性脓皮症，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，呼吸窘迫综合征包
括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，整个或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络
膜炎，自身免疫性血液学病症，移植物抗宿主疾病，血管性水肿诸如遗传性血管性水肿，脑
神经损伤像脑膜炎中的，妊娠疱疹，妊娠性类天疱疮，阴囊瘙癣(pruritis scroti)，自身免
疫性早熟性卵巢衰竭，因自身免疫性疾患引起的突发性听觉丧失，IgE介导的疾病诸如过敏
反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen)脑炎和边缘系和/或脑干
脑炎，葡萄膜炎(诸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄
膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和没有肾病综合征
的肾小球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜
性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜增殖性或膜性增殖性GN(MPGN)(包括I型
和II型)、和急进性GN(RPGN)，增殖性肾炎，自身免疫性多腺体内分泌衰竭，龟头炎包括浆
细胞性局限性龟头炎，龟头包皮炎，离心性环状红斑，持久性色素异常性红斑，多形性红斑，
环状肉芽肿，光泽苔藓，硬化萎缩性苔藓，慢性单纯苔藓，小棘苔藓，扁平苔藓，片层状鱼鳞
癣，表皮松解性角化过度，恶变前角化，坏疽性脓皮症，变应性疾患和应答，食物过敏，药物
过敏，昆虫过敏，罕见的过敏性病症诸如肥大细胞增生病，过敏反应，湿疹包括变应性或特
应性湿疹、干性湿疹、汗疱和水泡性掌跖湿疹(vesicular palmoplantar eczema)，哮喘诸
如支气管哮喘(asthma bronchiale，bronchial asthma)和自身免疫性哮喘，涉及T细胞
浸润和慢 性炎性应答的疾患，针对外来抗原诸如妊娠期间胎儿A-B-O血型的免疫反应，慢
性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，狼疮包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科
狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、狼疮脱发、SLE(诸如皮肤SLE或亚急
性皮肤SLE)、新生儿狼疮综合征(NLE)、和播散性红斑狼疮，幼发型(I型)糖尿病包括儿
科IDDM，成人期发作的糖尿病(II型糖尿病)，自身免疫性糖尿病，特发性尿崩症，糖尿病
视网膜病变，糖尿病肾病，糖尿病结肠炎，糖尿病大动脉病症，与细胞因子和T-淋巴细胞介
导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽
肿病、粒细胞缺乏，血管炎病(包括大血管血管炎(诸如风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏
(Takayasu))动脉炎)、中血管血管炎(诸如川崎氏(Kawasaki)病和结节性多动脉炎/结节
性动脉周围炎)、免疫血管炎、CNS血管炎、皮肤性血管炎、超敏感性血管炎、坏死性血管炎
(诸如类纤维蛋白坏死性血管炎和系统性坏死性血管炎)、ANCA阴性血管炎、和ANCA相关血
管炎诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)综合征(CSS)，韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病、和微
观多脉管炎)，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，库姆斯(Coombs)
阳性贫血，戴-布二氏(Diamond Blackfan)贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自
身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血(pernicious anemia，anemia perniciosa)，阿狄
森氏(Addison)病，单纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身
免疫性嗜中性粒细胞减少症，细胞减少症诸如全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞
渗出的疾病，CNS炎性病症，阿耳茨海默氏(Alzheimer)病，帕金森氏(Parkinson)病，多
器官损伤综合征诸如那些脓毒症、外伤或出血继发的，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗
肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，运动神经炎，变应性神经炎，贝切特氏(Behcet)病/
综合征，卡斯尔曼氏(Castleman)综合征，古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征，雷诺氏
(Reynaud)综合征，斯耶格伦氏 综合征，史-约二氏(Stevens-Johnson)综合
征，类天疱疮或天疱疮诸如大疱性类天疱疮、瘢痕性(粘膜)类天疱疮、皮肤类天疱疮、寻
常型天疱疮、副肿瘤性天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮和红斑性天疱疮，获
得性大疱性表皮松解症，眼部炎症(优选变应性眼部炎症，诸如变应性结膜炎、线性IgA大
疱性疾病、自身免疫诱发的结膜炎症)，自身免疫性多内分泌病，莱特氏(Reiter)病或综
合征，由自身免疫性疾患引起的热伤， 先兆子痫，免疫复合物病症诸如免疫复合物肾炎，抗
体介导的肾炎，神经炎性病症，多神经病，慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经
病，血小板减少症(例如心肌梗死患者发生的)包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血
后紫癜(PTP)、肝素诱发的血小板减少症、和自身免疫或免疫介导的血小板减少症(包括
例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP)，巩膜炎诸如特发性角膜-巩
膜炎、巩膜外层炎，睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状
腺功能减退症，甲状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎(诸如自身免疫性
甲状腺炎、桥本氏(Hashimoto)病、慢性甲状腺炎(桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎)或亚
急性甲状腺炎)、自身免疫性甲状腺病、特发性甲状腺功能减退症、格雷夫斯氏(Graves)
病，格雷夫斯氏眼病(Grave′s eye disease)(眼病或甲状腺相关眼病)，多腺性综合征
诸如自身免疫性多腺体综合征例如I型(或多腺性内分泌病综合征)，瘤外综合征包括
神经学瘤外综合征诸如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特
(Lambert-Eaton)综合征，僵体或僵人综合征，脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎(allergic
encephalomyelitis，encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，
重症肌无力诸如胸腺瘤相关重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，视性眼阵挛或视性眼阵
挛肌阵挛综合征(OMS)，和感觉神经病，多病灶运动神经病，席汉氏(Sheehan)综合征，自
身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性
活动性肝炎，肺炎诸如淋巴样间质性肺炎(LIP)，梗阻性细支气管炎(非移植物)对NSIP，
格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征，贝格尔氏(Berger)病(IgA肾病)，特发性IgA肾
病，线性IgA皮肤病，急性热性嗜中性白细胞皮肤病，角质层下脓疱皮肤病，一过性棘层松
解性皮肤病，硬化诸如原发性胆汁性肝硬化和肺硬变，自身免疫性肠病综合征，乳糜泻，腹
腔或腹部疾病，口炎性腹泻(麸质肠病)，顽固性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白
血症诸如混合型冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS)(卢格里克氏(Lou Gehrig)病)，冠
状动脉病，自身免疫性耳病诸如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听觉丧失，多软骨炎
诸如顽固性或复发的或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，角膜炎诸如寇甘氏(Cogan)综
合征/非梅毒性间质性角膜炎，贝耳氏(Bell)麻痹，斯威特氏(Sweet)病/综合征，自身
免疫性酒糟鼻，带状疱疹相关疼痛，淀粉样变，非癌性淋巴细胞增多，原发性 淋巴细胞增多
包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和性质未确定的单克隆
丙种球蛋白病(MGUS))，周围神经病，瘤外综合征，通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌
肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病，孤独症，炎性肌病，局灶性或节段性或局
灶性节段性肾小球硬化(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免
疫性肝脏病学病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特氏(Schmidt)综合征，肾上腺炎，
胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病，德
雷斯勒氏(Dressler)综合征，斑秃，全秃，CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏(Raynaud)
现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细管扩张)，男性和女性自身免疫性不孕不育例
如由于抗精虫抗体的，混合性结缔组织病，恰加斯氏(Chagas)病，风湿热，习惯性流产，农
民肺，多形红斑，心脏切开术后综合征，柯兴氏(Cushing)综合征，养鸟者肺，变应性肉芽
肿性血管炎，良性淋巴细胞性血管炎，阿尔波特氏(Alport)综合征，肺泡炎诸如变应性肺
泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风，疟疾，寄生虫病诸如利什曼病、锥虫病
(kypanosomiasis)、血吸虫病、蛔虫病，曲霉病，Sampter氏综合征，卡普兰氏(Caplan)综
合征，登革，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺纤维化，纤维性
纵隔炎，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑，胎儿成红细胞
增多症，嗜曙红细胞性筋膜炎(faciitis)、舒尔曼氏(Shulman)综合征，费尔提氏(Felty)
综合征，flariasis，睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性
或慢性)、或Fuch氏睫状体炎，亨诺-许兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人免疫缺陷病
毒(HIV)感染，SCID，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，艾柯病毒感染，脓毒症(系统性炎性
应答综合征(SIRS))，内毒素血症，胰腺炎，甲状腺毒症(thyroxicosis)，细小病毒感染，风
疹病毒感染，种痘后综合征，先天性风疹感染，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染，
腮腺炎，埃文斯(Evans)综合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病，链
球菌后肾炎，闭塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络
膜炎，巨细胞性多肌痛，慢性超敏感性肺炎，结膜炎，诸如春季卡他、干燥性角膜结膜炎、和
流行性角膜结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血-再灌注损伤，
移植器官再灌注，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道/肺部 疾病，硅
沉着病，口疮，口疮性口炎，动脉硬化性病症(大脑血管功能不全)诸如动脉硬化性脑病和
动脉硬化性视网膜病，无精子发生(aspermiogenese)，自身免疫性溶血，伯克氏(Boeck)
病，冷球蛋白血症，杜普伊特伦氏(Dupuytren)挛缩，晶体过敏性眼内炎(endophthalmia
phacoanaphylactica)，变应性小肠炎(enteritis allergica)，麻风节结性红斑，特发性
面瘫，慢性疲乏综合征，风湿热(febris rheumatica)，哈-里二氏(Hamman-Rich)病，感
觉神经性听觉丧失，阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)，性腺功能减
退，局限性回肠炎(ileitis regionalis)，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯性
(traverse)脊髓炎，原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmiasymphatica)
(sympathetic ophthalmitis)，新生儿眼炎，视神经炎，肉芽肿性睾丸炎(orchitis
granulomatosa)，胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮症，奎尔万氏(Quervain)甲状腺
炎，获得性脾萎缩，非恶性胸腺瘤，淋巴滤泡性胸腺炎，白癜风，中毒性休克综合征，食物中
毒，涉及T细胞浸润的疾患，白细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟
发性超敏感性有关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复
合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性粘液水肿，
自身免疫性萎缩性胃炎，风湿病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，
自身免疫性多腺性综合征，包括多腺性综合征I型，成人期发作的特发性甲状旁腺功能减
退(AOIH)，心肌病诸如扩张型心肌病，获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosa
acquisita，EBA)，血色素沉着，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化
脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎，上颌窦炎或蝶窦炎，变应性鼻窦炎，嗜曙
红细胞相关病症诸如嗜曙红细胞增多症、肺嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌
痛综合征、吕弗勒氏(Loffler)综合征、慢性嗜曙红细胞性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、
支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含有嗜曙红细胞的肉芽肿，过敏反应，脊椎关节病，血清阴性
脊椎关节炎病，多内分泌自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝
酵母病，布鲁顿氏(Bruton)综合征，婴儿期一过性低丙种球蛋白血症，威斯科特-奥尔德
里齐(Wiskott-Aldrich)综合征，共济失调性毛细管扩张综合征，血管扩张，与以下各项
有关的自身免疫性病症：胶原病、风湿病诸如慢性关节风湿病、淋巴结炎、血压应答降低
(reduction in blood pressure response)、血管功能障 碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉
过敏、肾缺血、脑缺血和伴随血管化的疾病，变应性超敏感性病症，肾小球肾炎病，再灌注损
伤，缺血再灌注病症，心肌或其它组织的再灌注损伤，淋巴瘤气管支气管炎，炎性皮肤病，具
有急性炎性成分的皮肤病，多器官衰竭，大疱病，肾皮质坏死，急性化脓性脑膜炎或其它中
枢神经系统炎性病症，眼和眶炎性病症，粒细胞输血相关综合征，细胞因子诱发的中毒，发
作性睡病，急性重度炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎，和子
宫内膜异位症。此类疾病涵盖在本文中，以通过施用结合B细胞表面标志物(诸如CD22)的
抗体来治疗，包括施用未偶联的抗体(“裸抗体”)或偶联有细胞毒剂的抗体，正如本文中所
公开的。此类疾病还涵盖在本文中，以通过包括本发明的抗CD22抗体或抗CD22抗体-药物
偶联物联合另一抗体或抗体-药物偶联物、另一细胞毒剂、放射或其它治疗的联合疗法(同
时施用或顺次施用)来治疗。
[0335] 在用于本文时，“治疗”(及变化形式，诸如“处理”或“处置”)指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的
期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、
预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方
案中，本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发生，或用于减缓疾病或病症的进展。
期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、
预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方
案中，本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发生，或用于减缓疾病或病症的进展。
[0336] “个体”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物指哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、运动用动物、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。
在某些实施方案中，哺乳动物指人。
在某些实施方案中，哺乳动物指人。
[0337] “有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。
[0338] 本发明的物质/分子的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还涵盖该物
质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和
时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或
在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。
质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和
时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或
在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。
[0339] 术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞死亡211 131 125 90 186 188
或破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At 、I 、I 、 Y 、Re 、Re 、
153 212 32 212
Sm 、Bi 、P 、Pb 和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉
素(adriamycin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱
(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、
丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌
入剂；酶及其片段，诸如核溶酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或
动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；毒素；生长抑制剂；药物模块；及下文披露
的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。
或破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At 、I 、I 、 Y 、Re 、Re 、
153 212 32 212
Sm 、Bi 、P 、Pb 和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉
素(adriamycin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱
(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、
丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌
入剂；酶及其片段，诸如核溶酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或
动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；毒素；生长抑制剂；药物模块；及下文披露
的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。
[0340] “毒素”指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的任何物质。
[0341] “化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸 如 塞 替 派(thiotepa)和 环 磷 酰 胺
(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、
英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸
如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替
派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，
包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺
(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)
和 三 羟 甲 蜜 胺 (trimethylolomelamine)；番 荔 枝 内 酯 类 (acetogenin)(尤 其
是 布 拉 他 辛 (bullatacin)和 布 拉 他 辛 酮(bullatacinone))；δ-9-四 氢 大 麻
酚 (tetrahydrocannabinol)( 屈 大 麻 酚 (dronabinol)， )；β- 拉
帕醌(lapachone)；拉 帕醇(lapachol)；秋 水仙 素类(colchicines)；白 桦脂 酸
(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)
CPT-11(伊立替康(irinotecan)， )、乙酰喜树
碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；
CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)
合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊
苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他
汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素
(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类
(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆
磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯
乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、
美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫
司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚
硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、
福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司
汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素
(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.
Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；
埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋
白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、
氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素
C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色
霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星
(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、 多柔比星(doxorubicin)
(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、
表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉
素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic
acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊
非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比
星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素
(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗
代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、
甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟
达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌
呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、
6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去
氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，
诸如卡鲁睾酮(calusterone)、 丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇
(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁
米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸
如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide
glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖
啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷
酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；
依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；
硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木
素生物碱(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；
米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺
硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星
(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴
肼(procarbazine)； 多糖复合物(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生
(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；
细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙
胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢
菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(
)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；
二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；
gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇
(taxoids)，例如 帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，
TM
Princeton，N.J.)、ABRAXANE 不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕
利他塞(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和
多西 他 塞(docetaxel)( -Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁 酸 氮 芥
(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine) 6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；
巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)
和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine) 铂；依托泊苷(etoposide)
(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)
奥 沙 利 铂 (oxaliplatin)； 亚 叶 酸(leucovorin)；长 春 瑞 滨
(vinorelbine) 能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道
诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶
抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic
acid)；卡培他滨(capecitabine) 任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍
生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼
TM
松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATIN )联合5-FU和亚叶酸的治疗方案
的缩写)。
(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、
英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸
如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替
派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，
包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺
(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)
和 三 羟 甲 蜜 胺 (trimethylolomelamine)；番 荔 枝 内 酯 类 (acetogenin)(尤 其
是 布 拉 他 辛 (bullatacin)和 布 拉 他 辛 酮(bullatacinone))；δ-9-四 氢 大 麻
酚 (tetrahydrocannabinol)( 屈 大 麻 酚 (dronabinol)， )；β- 拉
帕醌(lapachone)；拉 帕醇(lapachol)；秋 水仙 素类(colchicines)；白 桦脂 酸
(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)
CPT-11(伊立替康(irinotecan)， )、乙酰喜树
碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；
CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)
合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊
苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他
汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素
(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类
(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆
磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯
乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、
美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫
司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚
硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、
福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司
汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素
(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.
Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；
埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋
白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、
氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素
C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色
霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星
(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、 多柔比星(doxorubicin)
(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、
表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉
素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic
acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊
非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比
星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素
(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗
代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、
甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟
达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌
呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、
6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去
氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，
诸如卡鲁睾酮(calusterone)、 丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇
(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁
米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸
如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide
glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖
啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷
酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；
依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；
硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木
素生物碱(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；
米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺
硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星
(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴
肼(procarbazine)； 多糖复合物(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生
(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；
细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙
胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢
菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(
)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；
二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；
gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇
(taxoids)，例如 帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，
TM
Princeton，N.J.)、ABRAXANE 不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕
利他塞(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和
多西 他 塞(docetaxel)( -Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁 酸 氮 芥
(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine) 6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；
巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)
和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine) 铂；依托泊苷(etoposide)
(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)
奥 沙 利 铂 (oxaliplatin)； 亚 叶 酸(leucovorin)；长 春 瑞 滨
(vinorelbine) 能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道
诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶
抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic
acid)；卡培他滨(capecitabine) 任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍
生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼
TM
松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATIN )联合5-FU和亚叶酸的治疗方案
的缩写)。
[0342] 该定义还包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。例子包括抗雌激素类和选择
性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括 他
莫昔芬)、 雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔
芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和
托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；起抑制或
关闭卵巢作用的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如 和
醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、
醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；抗雄激素类，诸如
氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑
制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨
鲁米特(aminoglutethimide)、 醋酸 甲地孕酮 (megestrolacetate)、
依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、
伏氯唑(vorozole)、 来曲唑(letrozole)和
阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，
诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如 或 )、 依
替膦酸盐(etidronate)、NE-58095、 唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic
acid/zoledronate)、 阿伦膦酸盐(alendronate)、 帕米膦酸
盐(pamidronate)、 替鲁膦酸盐(tiludronate)或 利塞膦酸盐
(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义
寡核苷酸，特别是那些抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号传导途经中的基因表达
的反义寡 核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如
疫苗和基因疗法疫苗，例如 疫苗、
疫苗和 疫苗； 拓扑异构酶1抑制剂；
rmRH；lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为
GW572016)；及任何上述物质的药学可接受的盐、酸或衍生物。
性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括 他
莫昔芬)、 雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔
芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和
托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；起抑制或
关闭卵巢作用的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如 和
醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、
醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；抗雄激素类，诸如
氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑
制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨
鲁米特(aminoglutethimide)、 醋酸 甲地孕酮 (megestrolacetate)、
依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、
伏氯唑(vorozole)、 来曲唑(letrozole)和
阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，
诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如 或 )、 依
替膦酸盐(etidronate)、NE-58095、 唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic
acid/zoledronate)、 阿伦膦酸盐(alendronate)、 帕米膦酸
盐(pamidronate)、 替鲁膦酸盐(tiludronate)或 利塞膦酸盐
(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义
寡核苷酸，特别是那些抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号传导途经中的基因表达
的反义寡 核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如
疫苗和基因疗法疫苗，例如 疫苗、
疫苗和 疫苗； 拓扑异构酶1抑制剂；
rmRH；lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为
GW572016)；及任何上述物质的药学可接受的盐、酸或衍生物。
[0343] “生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞(诸如表达CD22的细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞(诸如表
达CD22的细胞)百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以
外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药
类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、
和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素
(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也
溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、
达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤
(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见TheMolecular
Basis of Cancer，Mendelsohn和 Israel编，第1章，题 为“Cell cycleregulation，
oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini 等，WB Saunders，Philadelphia，
1995，尤其是第13页。紫杉烷类(帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是
衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛( Rhone-Poulenc
Rorer)是帕利他塞( Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。帕利他塞和多
西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝
分裂的抑制。
达CD22的细胞)百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以
外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药
类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、
和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素
(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也
溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、
达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤
(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见TheMolecular
Basis of Cancer，Mendelsohn和 Israel编，第1章，题 为“Cell cycleregulation，
oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini 等，WB Saunders，Philadelphia，
1995，尤其是第13页。紫杉烷类(帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是
衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛( Rhone-Poulenc
Rorer)是帕利他塞( Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。帕利他塞和多
西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝
分裂的抑制。
[0344] 术语“胞内代谢物”指由细胞内对抗体-药物偶联物(ADC)的代谢过程或反应产生的化合物。所述代谢过程或反应可以是酶促过程，诸如ADC的肽接头的蛋白水解切割、或
官能团诸如腙、酯或酰胺的水解。胞内代谢物包括但不限于在进入、扩散、摄取或转运进入
细胞后经历胞内切割的抗体和游离药物。
官能团诸如腙、酯或酰胺的水解。胞内代谢物包括但不限于在进入、扩散、摄取或转运进入
细胞后经历胞内切割的抗体和游离药物。
[0345] 术语“胞内切割的”和“胞内切割”指细胞内对抗体-药物偶联物(ADC)的代谢过程或反应，由此药物模块(D)与抗体(Ab)之间的共价附着，即接头被 打断，导致细胞内游
离药物与抗体解离。ADC被切割的模块因而是胞内代谢物。
离药物与抗体解离。ADC被切割的模块因而是胞内代谢物。
[0346] 术语“生物利用度”指施用于患者的给定量的药物的系统利用度(即血液/血浆水平)。生物利用度是表明药物从所施用的剂量形式到达大循环的时间(速率)和总量(程
度)二者度量的绝对项。
度)二者度量的绝对项。
[0347] 术语“细胞毒活性”指抗体-药物偶联物或抗体-药物偶联物的胞内代谢物的细胞杀伤、细胞抑制、或生长抑制效果。细胞毒活性可以表述为IC50值，即半数细胞存活时每
单位体积的浓度(摩尔或质量)。
单位体积的浓度(摩尔或质量)。
[0348] “烃基”或“烷基”指含正、仲、叔或环碳原子的C1-C18烃(碳氢化合物)。例子有甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr，
异丙基，-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，异丁
基，-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu，仲丁基，-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，叔丁
基，-C(CH3)3)、1-戊基(n-戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基
(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、
3-甲 基 -1-丁 基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2- 甲 基-1- 丁 基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己 基
(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、
2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲
基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊
基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2，3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3，3-二甲基-2-丁基
(-CH(CH3)C(CH3)3。
异丙基，-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，异丁
基，-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu，仲丁基，-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，叔丁
基，-C(CH3)3)、1-戊基(n-戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基
(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、
3-甲 基 -1-丁 基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2- 甲 基-1- 丁 基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己 基
(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、
2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲
基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊
基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2，3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3，3-二甲基-2-丁基
(-CH(CH3)C(CH3)3。
[0349] 术语“C1-C8烃基”在用于本文时指具有1-8个碳原子的直链或分支的、饱和的或不饱和的烃。代表性的“C1-C8烃基”包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正
戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基和-正癸基；而分支的C1-C8烃基包括但不限
于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、2-甲基丁基，不饱和的C1-C8烃基包
括但不限于-乙烯基、-丙烯基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊
烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2，3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、
2-己烯基、3-己烯基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔
基、-3- 甲基-1-丁炔基。甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊
基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲
基丁基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2，3，4-三甲基戊基、3-甲基
己基、2，2-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、3，5-二甲基己基、2，4-二甲基
戊基、2-甲基庚基、3-甲基庚基、正庚基、异庚基、正辛基、和异辛基。C1-C8烃基基团可以是
未取代的，或者是被一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃
基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)
R’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个
R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基和-正癸基；而分支的C1-C8烃基包括但不限
于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、2-甲基丁基，不饱和的C1-C8烃基包
括但不限于-乙烯基、-丙烯基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊
烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2，3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、
2-己烯基、3-己烯基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔
基、-3- 甲基-1-丁炔基。甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊
基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲
基丁基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2，3，4-三甲基戊基、3-甲基
己基、2，2-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、3，5-二甲基己基、2，4-二甲基
戊基、2-甲基庚基、3-甲基庚基、正庚基、异庚基、正辛基、和异辛基。C1-C8烃基基团可以是
未取代的，或者是被一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃
基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)
R’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个
R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
[0350] “烯基”指有至少一个不饱和位点即碳-碳，sp2双键的含正、仲、叔或环碳原子的C2-C18烃。例子包括但不限于：次乙基或乙烯基(-CH＝CH2)、丙烯基(-CH2CH＝CH2)、环戊
烯基(-C5H7)、和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。
烯基(-C5H7)、和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。
[0351] “炔基”指有至少一个不饱和位点即碳-碳，sp三键的含正、仲、叔或环碳原子的C2-C18烃。例子包括但不限于：乙炔基(-C≡CH)和丙炔基(-CH2C≡CH)。
[0352] “亚烷基(Alkylene)”指1-18个碳原子且具有两个单价基心(radical center)(通过从亲本烷烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的)的饱和的、
分支的或直链的或环状的烃基。典型的亚烃基包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、1，2-乙基
(-CH2CH2-)、1，3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1，4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等等。
分支的或直链的或环状的烃基。典型的亚烃基包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、1，2-乙基
(-CH2CH2-)、1，3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1，4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等等。
[0353] “C1-C10亚烷基”指通式-(CH2)1-10-的直链、饱和烃基。C1-C10亚烷基的例子包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基和亚癸基。
[0354] “亚烯基”指2-18个碳原子且具有两个单价基心(radical center)(通过从亲本烯烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的)的不饱和的、分支的或直
链的或环状的烃基。典型的亚烯基包括但不限于：1，2-亚乙烯基(-CH＝CH-)。
链的或环状的烃基。典型的亚烯基包括但不限于：1，2-亚乙烯基(-CH＝CH-)。
[0355] “亚炔基”指2-18个碳原子且具有两个单价基心(radical center)(通过从亲本炔烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的)的不饱 和的、分支
的或直链的或环状的烃基。典型的亚炔基包括但不限于：亚乙炔基(-C≡C-)、亚丙炔基
(-CH2C≡C-)、和亚4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
的或直链的或环状的烃基。典型的亚炔基包括但不限于：亚乙炔基(-C≡C-)、亚丙炔基
(-CH2C≡C-)、和亚4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
[0356] “芳基”指碳环芳基。芳基的例子包括但不限于苯基、萘基、和蒽基。碳环芳基或杂环芳基可以是未取代的，或者是被一个或多个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃
基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)
N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；
其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)
N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；
其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
[0357] “亚芳基”指具有两个共价键且可以是邻位、间位或对位构型的芳基，如下述结构所示：
[0358]
[0359] 其中苯基可以是未取代的，或者是被至多四个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)
NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
[0360] “芳基烃基”指键合至碳原子(通常是末端或sp3碳原子)的氢原子之一被芳基取代的非环烃基。典型的芳基烃基包括但不限于苄基、2-苯基乙烷-1-基、2-苯基乙
烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙烷-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苄基、2-萘并苯基乙
烷-1-基等等。芳基烃基包含6-20个碳原子，例如芳基烃基的烃基模块(包括烷基、烯基
或炔基)是1-6个碳原子，芳基模块是5-14个碳原子。
烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙烷-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苄基、2-萘并苯基乙
烷-1-基等等。芳基烃基包含6-20个碳原子，例如芳基烃基的烃基模块(包括烷基、烯基
或炔基)是1-6个碳原子，芳基模块是5-14个碳原子。
[0361] “杂芳基烃基”指键合至碳原子(通常是末端或sp3碳原子)的氢原子之一被杂芳基取代的非环烃基。典型的杂芳基烃基包括但不限于2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基等
等。杂芳基烃基包含6-20个碳原子，例如杂芳基烃基的烃基模块(包括烷基、烯基或炔基)
是1-6个碳原子，杂芳基模块是5-14个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子。杂芳
基烃基的杂芳基模块可以是具有3-7个环成员(2-6个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的
杂原子)的单环或具有7-10个环成员(4-9个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)
的 双环，例如双环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]体系。
等。杂芳基烃基包含6-20个碳原子，例如杂芳基烃基的烃基模块(包括烷基、烯基或炔基)
是1-6个碳原子，杂芳基模块是5-14个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子。杂芳
基烃基的杂芳基模块可以是具有3-7个环成员(2-6个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的
杂原子)的单环或具有7-10个环成员(4-9个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)
的 双环，例如双环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]体系。
[0362] “取代的烃基”、“取代的芳基”、和“取代的芳基烃基”分别指其中一个或多个氢原子各自独立被取代基取代的烃基、芳基、和芳基烃基。典型的取代基包括但不限于-X、-R、
- -
-O、-OR、-SR、-S、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝
-
N2、-N3、NC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝
-
O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-PO3、-PO3H2、-C(＝O)R、-C(＝O)
-
X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)
NR2、-C(＝NR)NR2，其中每个X独立为卤素：F、Cl、Br、或I；且每个R独立为-H、C2-C18烃基、
C6-C20芳基、C3-C14杂环、保护基团或前体药物模块。上文所述亚烃基/亚烷基、亚烯基、和
亚炔基也可以被类似的取代。
- -
-O、-OR、-SR、-S、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝
-
N2、-N3、NC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝
-
O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-PO3、-PO3H2、-C(＝O)R、-C(＝O)
-
X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)
NR2、-C(＝NR)NR2，其中每个X独立为卤素：F、Cl、Br、或I；且每个R独立为-H、C2-C18烃基、
C6-C20芳基、C3-C14杂环、保护基团或前体药物模块。上文所述亚烃基/亚烷基、亚烯基、和
亚炔基也可以被类似的取代。
[0363] “杂芳基”和“杂环”指其中一个或多个环原子是杂原子(例如氮、氧和硫)的环体系。杂环基包含1-20个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子。杂环可以是具有3-7
个环成员(2-6个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)的单环或具有7-10个环成员
(4-9个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如双环[4，5]、[5，5]、[5，6]
或[6，6]体系。
个环成员(2-6个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)的单环或具有7-10个环成员
(4-9个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如双环[4，5]、[5，5]、[5，6]
或[6，6]体系。
[0364] 杂 环 记 载 于 Paquette，Leo A.； ″ Principles of ModernHeterocyclicChemistry ″ (W.A.Benjamin，New York，1968)，特 别 是 第 1，3，4，
6，7， 和 9 章； ″ The Chemistry of Heterocyclic Compounds，A series of
Monographs″(JohnWiley & Sons，New York，1950至今)，特别是第13，14，16，19和28卷；
及J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566。
6，7， 和 9 章； ″ The Chemistry of Heterocyclic Compounds，A series of
Monographs″(JohnWiley & Sons，New York，1950至今)，特别是第13，14，16，19和28卷；
及J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566。
[0365] 举例而言，杂环的例子包括但不限于吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氢噻吩基(tetrahydrothiophenyl)、硫氧化的四氢噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻
吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫萘基(thianaphthalenyl)、吲哚基、
indolenyl、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮
基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基、四氢喹啉基、四
氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪
基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、酚噁
噻基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚
基、3H-吲哚基、1H-吲唑 基、嘌呤基(purinyl)、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹
唑啉基、噌啉基、喋啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯
啉基、酚嗪基、酚噻嗪基、呋咱基、酚噁嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷
基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑
基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基、和靛红酰基(isatinoyl)。
吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫萘基(thianaphthalenyl)、吲哚基、
indolenyl、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮
基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基、四氢喹啉基、四
氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪
基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、酚噁
噻基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚
基、3H-吲哚基、1H-吲唑 基、嘌呤基(purinyl)、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹
唑啉基、噌啉基、喋啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯
啉基、酚嗪基、酚噻嗪基、呋咱基、酚噁嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷
基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑
基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基、和靛红酰基(isatinoyl)。
[0366] 举例而言而非限制，碳键合的杂环键合于吡啶的2、3、4、5、或6位，哒嗪的3、4、5、或6位，嘧啶的2、4、5、或6位，吡嗪的2、3、5、或6位，呋喃、四氢呋喃、噻吩(thiofuran)、噻
吩(thiophene)、吡咯或四氢吡咯的2、3、4、或5位，噁唑、咪唑或噻唑的2、4、或5位，异噁
唑、吡唑或异噻唑的3、4、或5位，吖丙啶的2或3位，吖丁啶的2、3、或4位，喹啉的2、3、4、5、
6、7、或8位，或异喹啉的1、3、4、5、6、7、或8位。还要更典型的是，碳键合的杂环包括2-吡
啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪
基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、
2-噻唑基、4-噻唑基、或5-噻唑基。
吩(thiophene)、吡咯或四氢吡咯的2、3、4、或5位，噁唑、咪唑或噻唑的2、4、或5位，异噁
唑、吡唑或异噻唑的3、4、或5位，吖丙啶的2或3位，吖丁啶的2、3、或4位，喹啉的2、3、4、5、
6、7、或8位，或异喹啉的1、3、4、5、6、7、或8位。还要更典型的是，碳键合的杂环包括2-吡
啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪
基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、
2-噻唑基、4-噻唑基、或5-噻唑基。
[0367] 举例而言而非限制，氮键合的杂环键合于吖丙啶、吖丁啶、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啉、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌
啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位，异吲哚或异二氢吲哚的2位，吗啉的4位，及咔唑
或β-咔啉的9位。还要更典型的是，氮键合的杂环包括1-aziridyl、1-azetedyl、1-吡咯
基、1-咪唑基、1-吡唑基、和1-哌啶基。
啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位，异吲哚或异二氢吲哚的2位，吗啉的4位，及咔唑
或β-咔啉的9位。还要更典型的是，氮键合的杂环包括1-aziridyl、1-azetedyl、1-吡咯
基、1-咪唑基、1-吡唑基、和1-哌啶基。
[0368] “C3-C8杂环”指其中1-4个环碳原子独立地被选自O、S和N的杂原子取代的芳香族或非芳香族C3-C8碳环。C3-C8杂环的代表性例子包括但不限于苯并呋喃基、苯并噻
吩(benzothiophene)、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、异喹啉基、吡咯基、硫苯基、呋喃
基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、
异噻唑基、异噁唑基、和四唑基。C3-C8杂环可以是未取代的，或者是被至多7个下述基团
取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)
OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、- 卤
素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’ 独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
吩(benzothiophene)、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、异喹啉基、吡咯基、硫苯基、呋喃
基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、
异噻唑基、异噁唑基、和四唑基。C3-C8杂环可以是未取代的，或者是被至多7个下述基团
取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)
OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、- 卤
素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’ 独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
[0369] “C3-C8杂环基/C3-C8杂环并”指其中杂环基团的氢原子之一被键取代的上文定义的C3-C8杂环基团。C3-C8杂环基可以是未取代的，或者是被至多6个下述基团取
代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)
OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、- 卤
素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)
OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、- 卤
素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
[0370] “碳环”指饱和的或不饱和的环，作为单环具有3-7个碳原子，作为双环具有7-12个碳原子。单环碳环具有3-6个环原子，还要更典型的是5或6个环原子。双环碳环具有
7-12个环原子，例如排列成双环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]体系，或者具有9或10个环
原子，排列成双环[5，6]或[6，6]体系。单环碳环的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环
戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯
基、1-环己-3-烯基、环庚基、和环辛基。
7-12个环原子，例如排列成双环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]体系，或者具有9或10个环
原子，排列成双环[5，6]或[6，6]体系。单环碳环的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环
戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯
基、1-环己-3-烯基、环庚基、和环辛基。
[0371] “C3-C8碳环”指3、4、5、6、7或8个成员的饱和的或不饱和的非芳香族碳环。代表性的C3-C8碳环包括但不限于-环丙基、-环丁基、-环戊基、-环戊二烯基、-环己基、-环
己烯基、-1，3-环己二烯基、-1，4-环己二烯基、-环庚基、-1，3-环庚二烯基、-1，3，5-环
庚三烯基、-环辛基、和-环辛二烯基。C3-C8碳环基团可以是未取代的，或者是被一个或多
个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)
R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤
素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
己烯基、-1，3-环己二烯基、-1，4-环己二烯基、-环庚基、-1，3-环庚二烯基、-1，3，5-环
庚三烯基、-环辛基、和-环辛二烯基。C3-C8碳环基团可以是未取代的，或者是被一个或多
个下述基团取代的，包括但不限于-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)
R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-卤
素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8烃基和芳基。
[0372] “C3-C8碳环基/C3-C8碳环并”指其中碳环基团的氢原子之一被键取代的上文定义的C3-C8碳环基团。
[0373] “接头”指包含使抗体共价附着于药物模块的共价键或原子链的化学模块。在各个实施方案中，接头包括：二价基，诸如亚烃基(alkyldiyl)、亚芳基、亚杂芳基，诸如-(CR2)
nO(CR2)n-、烃氧基重复单元(例如聚亚乙基氧基(polyethyleneoxy)、PEG、聚亚甲基氧基
TM
(polymethyleneoxy))和烃氨基(例如聚乙烯氨基，Jeffamine )等模块；及二酸酯和酰胺
类，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。
nO(CR2)n-、烃氧基重复单元(例如聚亚乙基氧基(polyethyleneoxy)、PEG、聚亚甲基氧基
TM
(polymethyleneoxy))和烃氨基(例如聚乙烯氨基，Jeffamine )等模块；及二酸酯和酰胺
类，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。
[0374] 术语“手性”指分子具有镜像对映体不可重叠的特性，而术语“非手性”指分子可重叠于其镜像对映体上。
[0375] 术语“立体异构体”指具有相同的化学结构，但是在原子或基团的空间排列方面有所不同的化合物。
[0376] “非对映异构体”指具有两个或多个手性中心且其分子彼此不为镜像对映体的空间异构体。非对映体具有不同的物理特性，例如熔点、沸点、光谱特征、和反应性。非对映异
构体的混合物可以在高分辨力的分析规程下分开，诸如电泳和层析。
构体的混合物可以在高分辨力的分析规程下分开，诸如电泳和层析。
[0377] “对映异构体”指化合物的彼此为不可重叠镜像的两种空间异构体。
[0378] 本文中使用的立体化学的定义和规则一般遵循S.P.Parker编，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill BookCompany，New York；及Eliel，
E.和Wilen，S.，Stereochemistry of OrganicCompunds(1994)John Wiley & Sons，Inc.，
New York。许多有机化合物以旋光形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述
旋光化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l
或(+)和(-)用于表示化合物对平面偏振光的旋转的标记，其中(-)或1指化合物是左旋
的。以(+)或d为前缀的化合物是右旋的。对于指定的化学结构，这些立体异构体是相同
的，只是它们互为镜像。特定的立体异构体还可称作对映体，此类异构体的混合物通常称作
对映混合物。对映体的50∶50混合物称作外消旋混合物或外消旋物，它们可以在没有立
体选择性或立体特异性的化学反应或方法中存在。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”指
两种对映体等摩尔混合从而没有旋光性的混合物。
E.和Wilen，S.，Stereochemistry of OrganicCompunds(1994)John Wiley & Sons，Inc.，
New York。许多有机化合物以旋光形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述
旋光化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l
或(+)和(-)用于表示化合物对平面偏振光的旋转的标记，其中(-)或1指化合物是左旋
的。以(+)或d为前缀的化合物是右旋的。对于指定的化学结构，这些立体异构体是相同
的，只是它们互为镜像。特定的立体异构体还可称作对映体，此类异构体的混合物通常称作
对映混合物。对映体的50∶50混合物称作外消旋混合物或外消旋物，它们可以在没有立
体选择性或立体特异性的化学反应或方法中存在。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”指
两种对映体等摩尔混合从而没有旋光性的混合物。
[0379] “离去基团”指可以被另一官能团取代的官能团。某些离去基团是本领域公知的，例子包括但不限于卤化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、甲基磺酰基(甲磺酰基)、对甲
苯磺酰基(甲苯磺酰基)、三氟甲基磺酰基(triflate)、和三氟甲基磺酸根。
苯磺酰基(甲苯磺酰基)、三氟甲基磺酰基(triflate)、和三氟甲基磺酸根。
[0380] 缩写
[0381] 接头组件：
[0382] MC＝6-马来酰亚氨基己酰基
[0383] Val-Cit或“vc”＝缬氨酸-瓜氨酸(蛋白酶可切割接头中的例示二肽)
[0384] 瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸
[0385] PAB＝对氨基苄氧羰基(“自我牺牲”接头组件的例示)
[0386] Me-Val-Cit＝N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(其中接头肽键已经修饰以防止其受到组织蛋白酶B的切割)
[0387] MC(PEG)6-OH＝马来酰亚氨基己酰基-聚乙二醇(可附着于抗体半胱氨酸)
[0388] SPP＝N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯
[0389] SPDP＝N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯
[0390] SMCC＝琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯
[0391] IT＝亚氨基硫烷
[0392] 细胞毒性药物：
[0393] MMAE＝单甲基auristatin E(MW 718)
[0394] MMAF＝auristatin E(MMAE)的变体，其在药物的C-末端处有苯丙氨酸(MW731.5)
[0395] MMAF-DMAEA＝有DMAEA(二甲基氨基乙胺)以酰胺连接至C-末端苯丙氨酸的MMAF(MW 801.5)
[0396] MMAF-TEG＝有四乙二醇酯化至苯丙氨酸的MMAF
[0397] MMAF-NtBu＝N-叔丁基作为酰胺附着于MMAF的C-末端
[0398] DM1＝N(2′)-脱乙酰基-N(2′)-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素
[0399] DM3＝N(2′)-脱乙酰基-N2-(4-巯基-1-氧戊基)-美登素
[0400] DM4＝N(2′)-脱乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧戊基)-美登素
[0401] 别的缩写如下：AE指auristatin E；Boc指N-(叔丁氧羰基)；cit指瓜氨酸；dap指dolaproine；DCC指1，3-二环己基碳二亚胺；DCM指二氯甲烷；DEA指二乙胺；DEAD指偶
氮二羧酸二乙酯；DEPC指氰基磷酸二乙酯；DIAD指偶氮二羧酸二异丙酯；DIEA指N，N-二
异丙基乙胺；dil指dolaisoleucine；DMA指二甲基乙酰胺；DMAP指4-二甲基氨基吡啶；
DME指乙二醇二甲基醚(或1，2-二甲氧基乙烷)；DMF指N，N-二甲基甲酰胺；DMSO指二甲
基亚砜；doe指dolaphenine；dov指N，N-二甲基缬氨酸；DTNB指5，5’-二硫双(2-硝基
苯甲酸)；DTPA指二乙烯三胺五乙酸；DTT指二硫苏糖醇；EDCI指盐酸1-(3-二甲基氨基丙
基)-3-乙基碳二亚胺；EEDQ指2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉；ES-MS指电喷雾质
谱；EtOAc指乙酸乙酯；Fmoc指N-(9-芴基甲氧羰基)；gly指甘氨酸；HATU指O-(7-氮杂
苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯；HOBt指1-羟基苯并三唑；HPLC指
高压液相层析；ile指异亮氨酸；lys指 赖氨酸；MeCN(CH3CN)指乙腈；MeOH指甲醇；Mtr指
4-茴香基联苯基甲基(或4-甲氧基三苯甲基)；nor指(1S；2R)-(+)-去甲麻黄碱；PBS指
磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)；PEG指聚乙二醇；Ph指苯基；Pnp指对硝基苯基；MC指6-马来酰
亚氨基己酰基；phe指L-苯丙氨酸；PyBrop指溴三吡咯烷膦六氟磷酸酯；SEC指大小排阻层
析；Su指琥珀酰亚胺；TFA指三氟乙酸；TLC指薄层层析；UV指紫外线；而val指缬氨酸。
氮二羧酸二乙酯；DEPC指氰基磷酸二乙酯；DIAD指偶氮二羧酸二异丙酯；DIEA指N，N-二
异丙基乙胺；dil指dolaisoleucine；DMA指二甲基乙酰胺；DMAP指4-二甲基氨基吡啶；
DME指乙二醇二甲基醚(或1，2-二甲氧基乙烷)；DMF指N，N-二甲基甲酰胺；DMSO指二甲
基亚砜；doe指dolaphenine；dov指N，N-二甲基缬氨酸；DTNB指5，5’-二硫双(2-硝基
苯甲酸)；DTPA指二乙烯三胺五乙酸；DTT指二硫苏糖醇；EDCI指盐酸1-(3-二甲基氨基丙
基)-3-乙基碳二亚胺；EEDQ指2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉；ES-MS指电喷雾质
谱；EtOAc指乙酸乙酯；Fmoc指N-(9-芴基甲氧羰基)；gly指甘氨酸；HATU指O-(7-氮杂
苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯；HOBt指1-羟基苯并三唑；HPLC指
高压液相层析；ile指异亮氨酸；lys指 赖氨酸；MeCN(CH3CN)指乙腈；MeOH指甲醇；Mtr指
4-茴香基联苯基甲基(或4-甲氧基三苯甲基)；nor指(1S；2R)-(+)-去甲麻黄碱；PBS指
磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)；PEG指聚乙二醇；Ph指苯基；Pnp指对硝基苯基；MC指6-马来酰
亚氨基己酰基；phe指L-苯丙氨酸；PyBrop指溴三吡咯烷膦六氟磷酸酯；SEC指大小排阻层
析；Su指琥珀酰亚胺；TFA指三氟乙酸；TLC指薄层层析；UV指紫外线；而val指缬氨酸。
[0402] 组合物及其制备方法
[0403] 提供了结合CD22的抗体。提供了包含抗CD22抗体的免疫偶联物。本发明的抗体和免疫偶联物对于例如与CD22表达改变(例如升高)有关的病症的诊断或治疗是有用的。
在某些实施方案中，本发明的抗体或免疫偶联物对于细胞增殖性病症(诸如癌症)的诊断
或治疗是有用的。
在某些实施方案中，本发明的抗体或免疫偶联物对于细胞增殖性病症(诸如癌症)的诊断
或治疗是有用的。
[0404] 抗CD22抗体
[0405] 一方面，本发明提供了结合CD22的抗体。在有些实施方案中，提供了结合成熟形式的人和猕猴(cyno)CD22的抗体。在一个此类实施方案中，成熟形式的人CD22具有SEQ
ID NO：27的氨基酸序列。成熟的、主要的人同等型(isoform)具有如下的胞外结构域，其包
含七个Ig样结构域和SEQ ID NO：28的氨基酸序列。在另一个实施方案中，次要的人CD22
同等型缺少胞外结构域3和4，且具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列。次要同等型的胞外结
构域的氨基酸序列为SEQ ID NO：30。猕猴CD22具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在有
些实施方案中，针对CD22的抗体结合在细胞表面上表达的成熟形式的CD22。在有些实施
方案中，结合在细胞表面上表达的成熟形式的CD22的抗体抑制细胞的生长。在有些实施方
案中，抗CD22抗体结合在细胞表面上表达的成熟形式的CD22且抑制细胞增殖。在某些实
施方案中，抗CD22抗体结合在细胞表面上表达的成熟形式的CD22且诱导细胞死亡。在有
些实施方案中，抗CD22抗体结合在癌细胞表面上表达的成熟形式的CD22。在有些实施方
案中，抗CD22抗体结合在癌细胞表面上相对于同一组织起源的正常细胞过表达的成熟形
式的CD22。在有些实施方案中，抗CD22抗体偶联至细胞毒素或可检测标记物且结合细胞
表面上的CD22。在有些实施方案中，抗体-毒素偶联物抑制细胞的生长。在有些实施方案
中，抗体-可检测标记物偶联物使得在其表面上表达CD22的细胞在体外或在体内可检测。
ID NO：27的氨基酸序列。成熟的、主要的人同等型(isoform)具有如下的胞外结构域，其包
含七个Ig样结构域和SEQ ID NO：28的氨基酸序列。在另一个实施方案中，次要的人CD22
同等型缺少胞外结构域3和4，且具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列。次要同等型的胞外结
构域的氨基酸序列为SEQ ID NO：30。猕猴CD22具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在有
些实施方案中，针对CD22的抗体结合在细胞表面上表达的成熟形式的CD22。在有些实施
方案中，结合在细胞表面上表达的成熟形式的CD22的抗体抑制细胞的生长。在有些实施方
案中，抗CD22抗体结合在细胞表面上表达的成熟形式的CD22且抑制细胞增殖。在某些实
施方案中，抗CD22抗体结合在细胞表面上表达的成熟形式的CD22且诱导细胞死亡。在有
些实施方案中，抗CD22抗体结合在癌细胞表面上表达的成熟形式的CD22。在有些实施方
案中，抗CD22抗体结合在癌细胞表面上相对于同一组织起源的正常细胞过表达的成熟形
式的CD22。在有些实施方案中，抗CD22抗体偶联至细胞毒素或可检测标记物且结合细胞
表面上的CD22。在有些实施方案中，抗体-毒素偶联物抑制细胞的生长。在有些实施方案
中，抗体-可检测标记物偶联物使得在其表面上表达CD22的细胞在体外或在体内可检测。
[0406] 一方面，抗CD22抗体是单克隆抗体。一方面，抗CD22抗体是抗体片段，例如Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、或(Fab’)2片段。一方面，抗CD22抗体是嵌合抗体、人源化抗体、或人
抗体。一方面，任何本文所述抗CD22抗体是纯化的。
抗体。一方面，任何本文所述抗CD22抗体是纯化的。
[0407] 本文中提供了例示性的衍生自噬菌体文库的单克隆抗体。用于筛选文库的抗原是具有SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列对应于CD22β
和α的胞外结构域(ECD)。源自文库筛选的抗体是亲和力成熟的。
和α的胞外结构域(ECD)。源自文库筛选的抗体是亲和力成熟的。
[0408] 一方面，提供了与鼠10F4.4.1、人源化10F4v1和v3、及鼠5E8.1.8竞争CD22结合的单克隆抗体。还提供了与鼠10F4.4.1、人源化10F4v1和v3、及鼠5E8.1.8结合相同表位
的单克隆抗体。
的单克隆抗体。
[0409] 在本发明的一个方面，提供了编码抗CD22抗体的多核苷酸。在某些实施方案中，提供了包含编码抗CD22抗体的多核苷酸的载体。在某些实施方案中，提供了包含此类载体
的宿主细胞。在本发明的另一个方面，提供了包含抗CD22抗体或编码抗CD22抗体的多核
苷酸的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物是用于治疗细胞增殖性病症(诸如本
文所列举的那些)的药物配制剂。
的宿主细胞。在本发明的另一个方面，提供了包含抗CD22抗体或编码抗CD22抗体的多核
苷酸的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物是用于治疗细胞增殖性病症(诸如本
文所列举的那些)的药物配制剂。
[0410] 抗体施用和配制剂
[0411] 在一个实施方案中，本发明的抗CD22抗体或抗CD22抗体-药物偶联物(包括但不限于本发明的抗CD22thiomab-药物偶联物)与B细胞表面抗原的拮抗剂联合施用。与
一种或多种别的治疗剂“联合”施用包括同时(并发)和任意次序的序贯施用。在一个实
施方案中，所述施用是序贯的或顺次的。在另一个实施方案中，所述施用是在同一配制剂中
一起的、并发的、或同时的。在一个实施方案中，所述B细胞表面抗原拮抗剂是抗体或其抗
原结合片段。在一个实施方案中，所述B细胞表面拮抗剂是抗体-药物偶联物。
一种或多种别的治疗剂“联合”施用包括同时(并发)和任意次序的序贯施用。在一个实
施方案中，所述施用是序贯的或顺次的。在另一个实施方案中，所述施用是在同一配制剂中
一起的、并发的、或同时的。在一个实施方案中，所述B细胞表面抗原拮抗剂是抗体或其抗
原结合片段。在一个实施方案中，所述B细胞表面拮抗剂是抗体-药物偶联物。
[0412] 本文中的配制剂可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。例如，在抗CD22抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或
CD22结合寡肽之外，可能希望在一种配制剂中包含别的抗体，例如结合CD22多肽上不同表
位的第二抗CD22抗体、或结合不同B细胞表面抗原的第二抗体、或针对一些其它靶物(诸
如影响特定癌症生长的生长因子)的抗体。或者/另外，所述组合物可进一步包含化疗剂、
细胞毒 剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、和/或心脏保护剂。合适的是，此类分子以对
于预定目的有效的量组合存在。
CD22结合寡肽之外，可能希望在一种配制剂中包含别的抗体，例如结合CD22多肽上不同表
位的第二抗CD22抗体、或结合不同B细胞表面抗原的第二抗体、或针对一些其它靶物(诸
如影响特定癌症生长的生长因子)的抗体。或者/另外，所述组合物可进一步包含化疗剂、
细胞毒 剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、和/或心脏保护剂。合适的是，此类分子以对
于预定目的有效的量组合存在。
[0413] 现在，根据癌症的分级，癌症的治疗牵涉下列疗法中的一种或组合：手术去除癌性组织，放疗和化疗。抗CD22抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或寡肽疗法对于不能很好承受
化疗的毒性和副作用的老年患者和放疗具有有限效用的转移性疾病可能是尤其想要的。本
发明的靶向肿瘤的抗CD22抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或寡肽可用于在疾病的最初诊
断时或在复发期间减轻表达CD22的癌症。对于治疗性应用，可单独使用抗CD22抗体、抗
CD22抗体-药物偶联物或寡肽，或者用于与例如激素、抗血管发生原(antiangiogen)或放
射性标记的化合物，或者与手术、冷冻疗法和/或放疗的联合疗法。抗CD22抗体、抗CD22
抗体-药物偶联物或寡肽的治疗可与其它形式的常规疗法联合施用，与常规疗法连续、在
之前或之后。在本发明治疗或减轻癌症的方法中，可给癌症患者施用抗CD22抗体、抗CD22
抗体-药物偶联物或寡肽并联合一种或多种前述化疗剂的治疗。将抗CD22抗体、抗CD22
抗体-药物偶联物或寡肽与治疗有效剂量的化疗剂一起施用。在另一个实施方案中，联
合化疗施用抗CD22抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或寡肽以提高化疗剂的活性和功效。
Physicians′Desk Reference(PDR)公开了已经在多种癌症的治疗中使用的这些药剂的剂
量。这些前述化疗药物在治疗上有效的剂量给药方案和剂量将取决于所治疗的具体癌症、
疾病的程度、及有本领域技术的内科医师所熟悉的其它因素，且可以由内科医师确定。
化疗的毒性和副作用的老年患者和放疗具有有限效用的转移性疾病可能是尤其想要的。本
发明的靶向肿瘤的抗CD22抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或寡肽可用于在疾病的最初诊
断时或在复发期间减轻表达CD22的癌症。对于治疗性应用，可单独使用抗CD22抗体、抗
CD22抗体-药物偶联物或寡肽，或者用于与例如激素、抗血管发生原(antiangiogen)或放
射性标记的化合物，或者与手术、冷冻疗法和/或放疗的联合疗法。抗CD22抗体、抗CD22
抗体-药物偶联物或寡肽的治疗可与其它形式的常规疗法联合施用，与常规疗法连续、在
之前或之后。在本发明治疗或减轻癌症的方法中，可给癌症患者施用抗CD22抗体、抗CD22
抗体-药物偶联物或寡肽并联合一种或多种前述化疗剂的治疗。将抗CD22抗体、抗CD22
抗体-药物偶联物或寡肽与治疗有效剂量的化疗剂一起施用。在另一个实施方案中，联
合化疗施用抗CD22抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或寡肽以提高化疗剂的活性和功效。
Physicians′Desk Reference(PDR)公开了已经在多种癌症的治疗中使用的这些药剂的剂
量。这些前述化疗药物在治疗上有效的剂量给药方案和剂量将取决于所治疗的具体癌症、
疾病的程度、及有本领域技术的内科医师所熟悉的其它因素，且可以由内科医师确定。
[0414] 在一个具体的实施方案中，将包含与细胞毒剂偶联的抗CD22抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或寡肽的偶联物施用于患者。优选的是，与CD22蛋白质结合的免疫偶联
物由细胞内在化，导致免疫偶联物在杀死其所结合的癌细胞方面的治疗功效提高。在一个
实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。细胞毒剂的例子上文已有描述，包括
auristatin、美登木素生物碱、加利车霉素、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶、或其生物学活
性衍生物。
物由细胞内在化，导致免疫偶联物在杀死其所结合的癌细胞方面的治疗功效提高。在一个
实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。细胞毒剂的例子上文已有描述，包括
auristatin、美登木素生物碱、加利车霉素、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶、或其生物学活
性衍生物。
[0415] 将抗CD22抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或寡肽或其毒素偶联物依照已知方法施用给人类患者，诸如静脉内施用，例如作为推注或一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹
膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入路径。优选静脉内或皮下施
用抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或寡肽。
膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入路径。优选静脉内或皮下施
用抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或寡肽。
[0416] 抗CD22抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或寡肽的施用可联合其它治疗方案。联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用，及任意次序的序贯施用，其
中优选有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。优选的是，此类联
合疗法导致协同治疗效果。
中优选有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。优选的是，此类联
合疗法导致协同治疗效果。
[0417] 可能还期望将一种或多种抗CD22抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或寡肽的施用与针对与特定癌症有关的另一种肿瘤抗原或B细胞表面抗原的抗体的施用联合。
[0418] 在另一个实施方案中，本发明的治疗性处理方法牵涉(一种或多种)抗CD22抗体、抗CD22抗体-药物偶联物或寡肽与一种或多种化疗剂或生长抑制剂的联合施
用，包括不同化疗剂的鸡尾酒或混合物(cocktail)的共施用。化疗剂包括磷酸雌莫司
汀(estramustine phosphate)、泼尼莫司汀(prednimustine)、顺铂、5-氟尿嘧啶、美法
仑(melphalan)、环磷酰胺、羟脲和羟脲紫杉烷(hydroxyureataxane)(诸如帕利他塞
(paclitaxel)和多西他塞(doxetaxel))和/或蒽环类(anthracycline)抗生素，以及药
剂组合，诸如但不限于CHOP或FOLFOX。此类化疗剂的制剂和剂量给药方案可依照制造商
的说明书使用或由熟练从业人员凭经验确定。此类化疗的准备和剂量给药方案还可参阅
Chemotherapy Service，M.C.Perry编，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
用，包括不同化疗剂的鸡尾酒或混合物(cocktail)的共施用。化疗剂包括磷酸雌莫司
汀(estramustine phosphate)、泼尼莫司汀(prednimustine)、顺铂、5-氟尿嘧啶、美法
仑(melphalan)、环磷酰胺、羟脲和羟脲紫杉烷(hydroxyureataxane)(诸如帕利他塞
(paclitaxel)和多西他塞(doxetaxel))和/或蒽环类(anthracycline)抗生素，以及药
剂组合，诸如但不限于CHOP或FOLFOX。此类化疗剂的制剂和剂量给药方案可依照制造商
的说明书使用或由熟练从业人员凭经验确定。此类化疗的准备和剂量给药方案还可参阅
Chemotherapy Service，M.C.Perry编，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
[0419] 所述抗体以任何合适方式施用，包括胃肠外、表面、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和/或损伤内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。还涵盖膜内
或鞘内施用(参阅例如美国专利申请No.2002/0009444，Grillo-Lopez，A，关于CD20抗体
的鞘内投递)。优选的是，静脉内或皮下给予剂量给药。
或鞘内施用(参阅例如美国专利申请No.2002/0009444，Grillo-Lopez，A，关于CD20抗体
的鞘内投递)。优选的是，静脉内或皮下给予剂量给药。
[0420] 可以与治疗性抗体或免疫粘附素的初始暴露和/或后续暴露一起施用第二药物，此类联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用，及任意顺序的序贯施
用，其中优选有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。
用，其中优选有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。
[0421] 尽管治疗性抗CD22抗体、抗CD22抗体-药物偶联物、免疫粘附素或其它生物制品可以作为单一药剂施用以治疗自身免疫病，一般而言，所述治疗性抗体或免疫粘附素会
联合一种或多种第二药物。例如，对于RA和其它自身免疫病，所述抗体、免疫粘附素、或
其它生物制品药物优选联合任一种或多 种上文定义部分所列举的免疫抑制剂、化疗剂、
BAFF拮抗剂、整联蛋白拮抗剂或抗体、和/或细胞因子；任一种或多种减轻病情的抗风湿药
(DMARD)，诸如羟氯喹(hydroxycloroquine)、柳氮磺吡啶、甲氨蝶呤、来氟米特、硫唑嘌呤、
D-青霉胺、金(口服)、金(肌肉内)、米诺环素、环孢霉素；葡萄球菌蛋白A免疫吸附；静脉
内免疫球蛋白(IVIG)；非类固醇抗炎药(NSAID)；糖皮质激素(例如经关节注射)；皮质类
固醇(例如甲泼尼龙和/或泼尼松)；叶酸；抗肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂，例如依那西普
TM TM
/ENBREL 、英夫利昔单抗/REMICADE 、D2E7(Knoll)或CDP-870(Celltech)；IL-1R拮抗剂
(例如Kineret)；1L-10拮抗剂(例如伊洛白介素(Ilodecakin))；血液凝结调控物(例如
WinRho)；IL-6拮抗剂/抗TNF(CBP 1011)；CD40拮抗剂(例如IDEC 131)；Ig-Fc受体拮抗
剂(MDX33)；免疫调控物(例如沙利度胺或ImmuDyn)；抗CD5抗体(例如H5g1.1)；巨噬细
胞抑制剂(例如MDX 33)；共刺激性阻断物(costimulatory blocker)(例如BMS 188667或
Tolerimab)；补体抑制剂(例如h5G1.1、3E10或抗衰变加速因子(DAF)抗体)；IL-2拮抗
剂(zxSMART)；EGFR抑制剂(见上文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(见上文定义)；抗血管发
生剂(例如VEGF抗体，诸如贝伐单抗)；CD22抗体，诸如LL2或依帕珠单抗(epratuzumab，
Immunomedics)，包括依帕珠单抗Y-90(Juweid等Cancer Res 55(23
Suppl)：5899s-5907s(1995))、Abiogen的CD22抗体(Abiogen，Italy)、CMC 544(Wyeth/
Celltech)、combotox(UT Soutwestern)、BL22(NIH)、和LympoScan Tc99(Immunomedics)；
EpCAM抗体，诸如17-1A αvβ3抗体(例如 Medimmune)；
CD37抗 体，诸 如TRU 016(Trubion)；IL-21抗 体 (Zymogenetics/Novo Nordisk)；抗
B细 胞 抗 体 (Impheron)；B细 胞 靶 向MAb(Immunogen/Aventis)；1D09C3(Morphosys/
GPC)；LymphoRad 131(HGS)；Lym-1 抗 体 Y-90(USC)；LIF 226(Enhanced Lifesci)；
BAFF抗体(例如WO 03/33658)；BAFF受体抗体(例如WO02/24909)；BR3抗体；Blys
抗 体，诸 如 belimumab；LYMPHOSCD22-BTM；抗 Lym-1 Oncolym(USC/Peregrine)；ISF
154(UCSD/Roche/Tragen)；gomilixima(Idec 152；Biogen Idec)；IL-6 受 体 抗 体，
TM
诸 如atlizumab(ACTEMRA ；Chugai/Roche)；IL-15 抗 体，诸 如 HuMax-Il-15(Genmab/
Amgen)；趋化因子受体抗体，诸如CCR2抗体(例如MLN1202；Millieneum)；抗补体抗
体，诸如C5抗体(例如eculizumab，5G1.1；Alexion)； 人免疫球蛋白的口服配制
剂( 例 如 IgPO；Protein Therapeutics)；IL-12 抗 体，诸 如 ABT-874(CAT/Abbott)；
Teneliximab(BMS-224818)；B 细 胞 疫 苗；DN-BAFF(Xencor)；CRx-119(CombinatoRx)；
Amgen的BAFF拮抗剂；喷司他丁(Pfizer)；IC-485(ICOS)；趋化因子拮抗剂，诸如
T-487(Tularik)或Reticulose(AVR-118)；SCO-323(SCIOS)；整联蛋白拮抗剂683699、
Tanabe、NGD-2001-1(Neurogen)；SCIO-469(SCIOS)；BIRB-796(BoehringerIngelheim)；
VX702，VX850(Vertex)；白三烯B-4拮抗剂(诸如amelubunt，BIIL-284；BI)；微管调控
物(Paxceed；Angiotech)；蛋白酶抑制剂(MBS561392；BMS)；AGIX-4207(Atherogenics)；
ISIS-104838(ISIS/Elan)；MFG-IRAP(Univ.Pitt.)；IL-1Trap(RGN-303；Regeneron/
Novartis)；奥普瑞白介素(oprelvekin，Wyeth)；依维莫司(everolimus，Certican；
Novartis)；Amevive(Biogen Idec)；ORG-39141(Organon)；FK-506(Fujisawa)；及IL-2拮
抗剂(他克莫司(tacrolimus)；Fujisawa)。
联合一种或多种第二药物。例如，对于RA和其它自身免疫病，所述抗体、免疫粘附素、或
其它生物制品药物优选联合任一种或多 种上文定义部分所列举的免疫抑制剂、化疗剂、
BAFF拮抗剂、整联蛋白拮抗剂或抗体、和/或细胞因子；任一种或多种减轻病情的抗风湿药
(DMARD)，诸如羟氯喹(hydroxycloroquine)、柳氮磺吡啶、甲氨蝶呤、来氟米特、硫唑嘌呤、
D-青霉胺、金(口服)、金(肌肉内)、米诺环素、环孢霉素；葡萄球菌蛋白A免疫吸附；静脉
内免疫球蛋白(IVIG)；非类固醇抗炎药(NSAID)；糖皮质激素(例如经关节注射)；皮质类
固醇(例如甲泼尼龙和/或泼尼松)；叶酸；抗肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂，例如依那西普
TM TM
/ENBREL 、英夫利昔单抗/REMICADE 、D2E7(Knoll)或CDP-870(Celltech)；IL-1R拮抗剂
(例如Kineret)；1L-10拮抗剂(例如伊洛白介素(Ilodecakin))；血液凝结调控物(例如
WinRho)；IL-6拮抗剂/抗TNF(CBP 1011)；CD40拮抗剂(例如IDEC 131)；Ig-Fc受体拮抗
剂(MDX33)；免疫调控物(例如沙利度胺或ImmuDyn)；抗CD5抗体(例如H5g1.1)；巨噬细
胞抑制剂(例如MDX 33)；共刺激性阻断物(costimulatory blocker)(例如BMS 188667或
Tolerimab)；补体抑制剂(例如h5G1.1、3E10或抗衰变加速因子(DAF)抗体)；IL-2拮抗
剂(zxSMART)；EGFR抑制剂(见上文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(见上文定义)；抗血管发
生剂(例如VEGF抗体，诸如贝伐单抗)；CD22抗体，诸如LL2或依帕珠单抗(epratuzumab，
Immunomedics)，包括依帕珠单抗Y-90(Juweid等Cancer Res 55(23
Suppl)：5899s-5907s(1995))、Abiogen的CD22抗体(Abiogen，Italy)、CMC 544(Wyeth/
Celltech)、combotox(UT Soutwestern)、BL22(NIH)、和LympoScan Tc99(Immunomedics)；
EpCAM抗体，诸如17-1A αvβ3抗体(例如 Medimmune)；
CD37抗 体，诸 如TRU 016(Trubion)；IL-21抗 体 (Zymogenetics/Novo Nordisk)；抗
B细 胞 抗 体 (Impheron)；B细 胞 靶 向MAb(Immunogen/Aventis)；1D09C3(Morphosys/
GPC)；LymphoRad 131(HGS)；Lym-1 抗 体 Y-90(USC)；LIF 226(Enhanced Lifesci)；
BAFF抗体(例如WO 03/33658)；BAFF受体抗体(例如WO02/24909)；BR3抗体；Blys
抗 体，诸 如 belimumab；LYMPHOSCD22-BTM；抗 Lym-1 Oncolym(USC/Peregrine)；ISF
154(UCSD/Roche/Tragen)；gomilixima(Idec 152；Biogen Idec)；IL-6 受 体 抗 体，
TM
诸 如atlizumab(ACTEMRA ；Chugai/Roche)；IL-15 抗 体，诸 如 HuMax-Il-15(Genmab/
Amgen)；趋化因子受体抗体，诸如CCR2抗体(例如MLN1202；Millieneum)；抗补体抗
体，诸如C5抗体(例如eculizumab，5G1.1；Alexion)； 人免疫球蛋白的口服配制
剂( 例 如 IgPO；Protein Therapeutics)；IL-12 抗 体，诸 如 ABT-874(CAT/Abbott)；
Teneliximab(BMS-224818)；B 细 胞 疫 苗；DN-BAFF(Xencor)；CRx-119(CombinatoRx)；
Amgen的BAFF拮抗剂；喷司他丁(Pfizer)；IC-485(ICOS)；趋化因子拮抗剂，诸如
T-487(Tularik)或Reticulose(AVR-118)；SCO-323(SCIOS)；整联蛋白拮抗剂683699、
Tanabe、NGD-2001-1(Neurogen)；SCIO-469(SCIOS)；BIRB-796(BoehringerIngelheim)；
VX702，VX850(Vertex)；白三烯B-4拮抗剂(诸如amelubunt，BIIL-284；BI)；微管调控
物(Paxceed；Angiotech)；蛋白酶抑制剂(MBS561392；BMS)；AGIX-4207(Atherogenics)；
ISIS-104838(ISIS/Elan)；MFG-IRAP(Univ.Pitt.)；IL-1Trap(RGN-303；Regeneron/
Novartis)；奥普瑞白介素(oprelvekin，Wyeth)；依维莫司(everolimus，Certican；
Novartis)；Amevive(Biogen Idec)；ORG-39141(Organon)；FK-506(Fujisawa)；及IL-2拮
抗剂(他克莫司(tacrolimus)；Fujisawa)。
[0422] 例示性抗CD22抗体的详细描述如下：
[0423] 1.抗CD22抗体的具体实施方案
[0424] 一方面，本发明提供了包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下组的HVR的抗体：(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：4的氨基
酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9、
10、19、20、21、22、23之任一的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列
的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3。
酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9、
10、19、20、21、22、23之任一的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列
的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3。
[0425] 一方面，本发明提供了包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下组的VH HVR序列的抗CD22抗体：(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：4
的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列的HVR-H3。一方面，本发明提
供了所含HVR-H1包含SEQID NO：2的氨基酸序列的抗CD22抗体。一方面，本发明提供了
所含HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的抗CD22抗体。一方面，本发明提供了所含
HVR-H3包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的抗CD22抗体。
的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列的HVR-H3。一方面，本发明提
供了所含HVR-H1包含SEQID NO：2的氨基酸序列的抗CD22抗体。一方面，本发明提供了
所含HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的抗CD22抗体。一方面，本发明提供了所含
HVR-H3包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的抗CD22抗体。
[0426] 一方面，本发明提供了所含HVR-H3包含选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列且所含HVR-H1包含选自SEQ ID NO：2的氨基酸序列的抗CD22抗体。
[0427] 一方面，本发明提供了所含HVR-H3包含选自SEQ ID NO：6的氨基酸序 列且所含HVR-H2包含选自SEQ ID NO：4的氨基酸序列的抗CD22抗体。
[0428] 一方面，本发明提供了所含HVR-H1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列且所含HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的抗CD22抗体。
[0429] 一方面，本发明提供了所含HVR-H1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列、所含HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列、且所含HVR-H3包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列的抗CD22
抗体。
抗体。
[0430] 一方面，本发明提供了包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下组的VL HVR序列的抗CD22抗体：(a)包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含
SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3。
一方面，本发明提供了所含HVR-L1包含选自SEQ ID NO：9的氨基酸序列的抗CD22抗体。
一方面，本发明提供了所含HVR-L1包含选自SEQ ID NO：10的氨基酸序列的抗CD22抗体。
一方面，本发明提供了所含HVR-L1包含选自SEQ ID NO：19-23的氨基酸序列的抗CD22抗
体。一方面，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，其中N28用V替换(N28V氨基
酸变化，生成SEQ ID NO：10)。一方面，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，其中
N28用A替换(N28A氨基酸变化，生成SEQ ID NO：19)。一方面，所述HVR-L1包含SEQ ID
NO：9的氨基酸序列，其中N28用Q替换(N28Q氨基酸变化，生成SEQ ID NO：20)。一方面，
所述HVR-L1包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，其中N28用S替换(N28S氨基酸变化，生成
SEQ ID NO：21)。一方面，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，其中N28用D替换
(N28D氨基酸变化，生成SEQ ID NO：22)。一方面，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：9的氨基酸
序列，其中N28用I替换(N28I氨基酸变化，生成SEQ ID NO：23)。一方面，本发明提供了
所含HVR-L1包含SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、23之任一的氨基酸序列的抗CD22抗体。
一方面，所述HVR-L1是SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、或23之任一，且氨基酸位置N30(第
30位天冬酰胺)用A替换(N30A氨基酸变化)。一方面，所述HVR-L1是SEQ ID NO：9、10、
19、20、21、22、或23之任一，且氨基酸位置N30(第30位天冬酰胺)用Q替换(N30Q氨基酸
变化)。
SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3。
一方面，本发明提供了所含HVR-L1包含选自SEQ ID NO：9的氨基酸序列的抗CD22抗体。
一方面，本发明提供了所含HVR-L1包含选自SEQ ID NO：10的氨基酸序列的抗CD22抗体。
一方面，本发明提供了所含HVR-L1包含选自SEQ ID NO：19-23的氨基酸序列的抗CD22抗
体。一方面，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，其中N28用V替换(N28V氨基
酸变化，生成SEQ ID NO：10)。一方面，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，其中
N28用A替换(N28A氨基酸变化，生成SEQ ID NO：19)。一方面，所述HVR-L1包含SEQ ID
NO：9的氨基酸序列，其中N28用Q替换(N28Q氨基酸变化，生成SEQ ID NO：20)。一方面，
所述HVR-L1包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，其中N28用S替换(N28S氨基酸变化，生成
SEQ ID NO：21)。一方面，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，其中N28用D替换
(N28D氨基酸变化，生成SEQ ID NO：22)。一方面，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：9的氨基酸
序列，其中N28用I替换(N28I氨基酸变化，生成SEQ ID NO：23)。一方面，本发明提供了
所含HVR-L1包含SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、23之任一的氨基酸序列的抗CD22抗体。
一方面，所述HVR-L1是SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、或23之任一，且氨基酸位置N30(第
30位天冬酰胺)用A替换(N30A氨基酸变化)。一方面，所述HVR-L1是SEQ ID NO：9、10、
19、20、21、22、或23之任一，且氨基酸位置N30(第30位天冬酰胺)用Q替换(N30Q氨基酸
变化)。
[0431] 一方面，本发明提供了(a)所含HVR-H3包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列且(b)所含HVR-L3包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的抗CD22抗体。在有些实施方案中，所述CD22
抗体进一步包含(a)包含SEQ ID NO：2的HVR-H1和 包含SEQ ID NO：4的HVR-H2。
抗体进一步包含(a)包含SEQ ID NO：2的HVR-H1和 包含SEQ ID NO：4的HVR-H2。
[0432] 一方面，本发明提供了(a)所含HVR-H3包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列且(b)所含HVR-L2包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的抗CD22抗体。在有些实施方案中，所述CD22
抗体进一步包含(a)包含SEQ ID NO：2的HVR-H1和包含SEQ ID NO：4的HVR-H2。
抗体进一步包含(a)包含SEQ ID NO：2的HVR-H1和包含SEQ ID NO：4的HVR-H2。
[0433] 一方面，本发明提供了(a)所含HVR-H3包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列且(b)所含HVR-L1包含选自SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、和23的氨基酸序列的抗CD22抗体。在
有些实施方案中，所述CD22抗体进一步包含(a)包含SEQ ID NO：2的HVR-H1和包含SEQ
ID NO：4的HVR-H2。在有些实施方案中，SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、或23的氨基酸序
列包含N30A或N30Q氨基酸变化。在有些实施方案中，所述CD22抗体进一步包含包含SEQID
NO：12的氨基酸序列的HVR-L2。在有些实施方案中，所述CD22抗体进一步包含包含SEQ ID
NO：14的氨基酸序列的HVR-L3。
有些实施方案中，所述CD22抗体进一步包含(a)包含SEQ ID NO：2的HVR-H1和包含SEQ
ID NO：4的HVR-H2。在有些实施方案中，SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、或23的氨基酸序
列包含N30A或N30Q氨基酸变化。在有些实施方案中，所述CD22抗体进一步包含包含SEQID
NO：12的氨基酸序列的HVR-L2。在有些实施方案中，所述CD22抗体进一步包含包含SEQ ID
NO：14的氨基酸序列的HVR-L3。
[0434] 一方面，本发明提供了(a)所含HVR-H1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；(b)所含HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；(c)所含HVR-H3包含SEQ ID NO：6的氨基酸
序列；(d)所含HVR-L1包含选自SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、23的氨基酸序列；(e)所
含HVR-L2包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列；和(f)所含HVR-L3包含SEQ ID NO：14的氨
基酸序列的抗CD22抗体。在有些实施方案中，本发明进一步提供了选作HVR-L1的氨基酸
序列SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、或23通过N30A或N30Q氨基酸变化得到修饰。
序列；(d)所含HVR-L1包含选自SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、23的氨基酸序列；(e)所
含HVR-L2包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列；和(f)所含HVR-L3包含SEQ ID NO：14的氨
基酸序列的抗CD22抗体。在有些实施方案中，本发明进一步提供了选作HVR-L1的氨基酸
序列SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、或23通过N30A或N30Q氨基酸变化得到修饰。
[0435] 一方面，本发明提供了所含重链可变域包含SEQ ID NO：16的抗CD22抗体(见图2A，h10F4v1)。一方面，本发明提供了所含轻链可变域包含SEQ IDNO：17的抗CD22抗体(见
图2B，h10F4v1)。一方面，本发明提供了所含轻链可变域包含SEQ ID NO：18的抗CD22抗
体(见图2B，h10F4v3)。
图2B，h10F4v1)。一方面，本发明提供了所含轻链可变域包含SEQ ID NO：18的抗CD22抗
体(见图2B，h10F4v3)。
[0436] 一方面，本发明提供了所含重链包含SEQ ID NO：34的抗CD22抗体(见图2A，m10F4)。一方面，本发明提供了所含轻链包含SEQ ID NO：35的抗CD22抗体(见图2B，
m10F4)。
m10F4)。
[0437] 一方面，本发明提供了包含保藏于ATCC且编号PTA-7621的杂交瘤所生成的抗体10F4.4.1的1、2、3、4、5、或6种HVR序列的抗CD22抗体。
[0438] 一方面，本发明提供了包含保藏于ATCC且编号PTA-7620的杂交瘤所生 成的抗体5E8.1.8的1、2、3、4、5、或6种HVR序列的抗CD22抗体。
[0439] 抗CD22抗体可包含任何合适的框架可变域序列，只要该抗体保留结合CD22的能力。例如，在有些实施方案中，本发明的抗CD22抗体包含人亚组III重链框架共有序
列。在这些抗体的一个实施方案中，所述重链框架共有序列包含第71、73和/或78位的
替代。在这些抗体的一个实施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A。在
一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8的重链可变域框架序列，例如SEQ ID NO：1、3、
5、7(分别是FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)。huMAb4D5-8在商业上称为 抗
HER2抗体(Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)；在美国专利No.6,407,213
& 5,821,337及Lee等，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93中也有提到。在一个此类实
施方案中，这些抗体进一步包含人(κ)I轻链框架共有序列。在一个此类实施方案中，这些
抗体包含huMAb4D5-8的轻链可变域框架序列，例如SEQ ID NO：8、1、13、15(分别是FR-L1、
FR-L2、FR-L3、FR-L4)。
列。在这些抗体的一个实施方案中，所述重链框架共有序列包含第71、73和/或78位的
替代。在这些抗体的一个实施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A。在
一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8的重链可变域框架序列，例如SEQ ID NO：1、3、
5、7(分别是FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)。huMAb4D5-8在商业上称为 抗
HER2抗体(Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)；在美国专利No.6,407,213
& 5,821,337及Lee等，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93中也有提到。在一个此类实
施方案中，这些抗体进一步包含人(κ)I轻链框架共有序列。在一个此类实施方案中，这些
抗体包含huMAb4D5-8的轻链可变域框架序列，例如SEQ ID NO：8、1、13、15(分别是FR-L1、
FR-L2、FR-L3、FR-L4)。
[0440] 在一个实施方案中，抗CD22抗体包含包含框架序列和高变区的重链可变域，其中所述框架序列包含分别为SEQ ID NO：1、3、5、和7的FR-H1至FR-H4序列；所述HVR H1包含
SEQ ID NO：2的氨基酸序列；所述HVR-H2包含SEQID NO：4的氨基酸序列；而所述HVR-H3
包含选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗CD22抗体包含包含框架序列
和高变区的轻链可变域，其中所述框架序列包含分别为SEQ ID NO：8、11、13、和15的FR-L1
至FR-L4；所述HVR-L1包含选自SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、和23的氨基酸序列，其中
SEQ ID NO：9-10或19-23之任一可包含N30A或N30Q氨基酸变化；所述HVR-L2包含SEQ
ID NO：12的氨基酸序列；而所述HVR-L3包含选自SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在这些抗
体的一个实施方案中，所述重链可变域包含SEQ ID NO：16且所述轻链可变域包含SEQ ID
NO：17或18。
SEQ ID NO：2的氨基酸序列；所述HVR-H2包含SEQID NO：4的氨基酸序列；而所述HVR-H3
包含选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗CD22抗体包含包含框架序列
和高变区的轻链可变域，其中所述框架序列包含分别为SEQ ID NO：8、11、13、和15的FR-L1
至FR-L4；所述HVR-L1包含选自SEQ ID NO：9、10、19、20、21、22、和23的氨基酸序列，其中
SEQ ID NO：9-10或19-23之任一可包含N30A或N30Q氨基酸变化；所述HVR-L2包含SEQ
ID NO：12的氨基酸序列；而所述HVR-L3包含选自SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在这些抗
体的一个实施方案中，所述重链可变域包含SEQ ID NO：16且所述轻链可变域包含SEQ ID
NO：17或18。
[0441] 在有些实施方案中，本发明提供了所含重链可变域包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性
的氨基酸序列的抗CD22抗体。在有些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列相对于参比序列包含替代、插入、
或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合CD22的能力。在有些实施方案中，在序列
SEQ ID NO：16中替代、插入、或删除了总共1-10个氨基酸。在有些实施方案 中，所述替代、
插入、或删除存在于HVR以外的区域(即在FR中)。在有些实施方案中，抗CD22抗体包含
包含选自SEQ ID NO：16的氨基酸序列的重链可变域。
的氨基酸序列的抗CD22抗体。在有些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列相对于参比序列包含替代、插入、
或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合CD22的能力。在有些实施方案中，在序列
SEQ ID NO：16中替代、插入、或删除了总共1-10个氨基酸。在有些实施方案 中，所述替代、
插入、或删除存在于HVR以外的区域(即在FR中)。在有些实施方案中，抗CD22抗体包含
包含选自SEQ ID NO：16的氨基酸序列的重链可变域。
[0442] 在有些实施方案中，本发明提供了包含如下所示重链可变域的抗CD22抗体。
[0443] 1Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser LeuArg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Ser Arg Ser Trp Met Asn Trp Val Arg
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp
Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
ArgAsp Gly Ser Ser Trp Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
Val Ser Ser113(SEQ ID NO：16)(HVR残基标有下划线)。
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp
Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
ArgAsp Gly Ser Ser Trp Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
Val Ser Ser113(SEQ ID NO：16)(HVR残基标有下划线)。
[0444] 在有些实施方案中，所述重链HVR和FR序列包含如下序列：
[0445] HVR-H1(Gly Tyr Glu Phe Ser Arg Ser Trp Met Asn，SEQ ID NO：2)
[0446] HVR-H2(Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys PheLys Gly，SEQ ID NO：4)
[0447] HVR-H3(Asp Gly Ser Ser Trp Asp Trp Tyr Phe Asp Val，SEQ ID NO：6)
[0448] FR-H1(Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlySer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser，SEQ ID NO：1)
[0449] FR-H2(Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val，SEQ ID NO：3)
[0450] FR-H3(Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu GlnMet Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg，SEQ ID NO：5)
[0451] FR-H4(Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser，SEQ ID NO：7)。
[0452] 在有些实施方案中，本发明提供了包含如下所示轻链可变域的抗CD22抗体。
[0453] 1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln
Gly Ser Gln Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys107(SEQ ID
NO：17)(HVR残基标有下划线，而且位置N28以粗体标示)
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln
Gly Ser Gln Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys107(SEQ ID
NO：17)(HVR残基标有下划线，而且位置N28以粗体标示)
[0454] 或
[0455] 1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly AspArg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Val Gly Asn Thr Phe
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
Ser Gln Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys107(SEQ ID NO：
18)(HVR残基标有下划线，而且位置N28V以粗体标示)。
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
Ser Gln Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys107(SEQ ID NO：
18)(HVR残基标有下划线，而且位置N28V以粗体标示)。
[0456] 在有些实施方案中，所述轻链HVR序列包含如下序列：
[0457] HVR-L1(Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu，SEQ ID NO：9)
[0458] HVR-L1(Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Val Gly Asn Thr Phe Leu Glu，SEQ ID NO：10)
[0459] HVR-L1(Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ala Gly Asn Thr Phe Leu Glu，SEQ ID NO：19)
[0460] HVR-L1(Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Gln Gly Asn Thr Phe Leu Glu，SEQ ID NO：20)
[0461] HVR-L1(Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Asn Thr Phe Leu Glu，SEQ ID NO：21)
[0462] HVR-L1(Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Phe Leu Glu，SEQ ID NO：22)
[0463] HVR-L1(Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ile Gly Asn Thr Phe Leu Glu，SEQ ID NO：23)
[0464] HVR-L1(Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ile Gly Ala Thr Phe Leu Glu，SEQ ID NO：32)
[0465] HVR-L1(Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ile Gly Gln Thr Phe Leu Glu，SEQ ID NO：33)
[0466] HVR-L2(Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser，SEQ ID NO：12)
[0467] HVR-L3(Phe Gln Gly Ser Gln Phe Pro Tyr Thr，SEQ ID NO：14)。
[0468] 在有些实施方案中，所述轻链FR序列包含如下序列：
[0469] FR-L1(Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys，SEQ ID NO：8)
[0470] FR-L2(Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr，SEQID NO：11)
[0471] FR-L3(Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe ThrLeu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys，SEQ ID NO：13)
[0472] FR-L4(Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys，SEQ ID NO：15)。
[0473] 一方面，本发明提供了所含轻链可变域包含与选自SEQ ID NO：17或18的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的
氨基酸序列的抗CD22抗体。在有些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列相对于参比序列包含替代、添加、
或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合CD22的能力。在有些实施方案中，在选自
SEQ ID NO：17或18的序列中替代、插入、或删除了总共1-10个氨基酸。在有些实施方案
中，所述替代、插入、或删除存在于HVR以外的区域(即在FR中)。在有些实施方案中，抗
CD22抗体包含包含选自SEQ ID NO：17或18的氨基酸序列的轻链可变域。
氨基酸序列的抗CD22抗体。在有些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列相对于参比序列包含替代、添加、
或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合CD22的能力。在有些实施方案中，在选自
SEQ ID NO：17或18的序列中替代、插入、或删除了总共1-10个氨基酸。在有些实施方案
中，所述替代、插入、或删除存在于HVR以外的区域(即在FR中)。在有些实施方案中，抗
CD22抗体包含包含选自SEQ ID NO：17或18的氨基酸序列的轻链可变域。
[0474] 一方面，本发明提供了(a)所含重链可变域包含与选自SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨
基酸序列；且(b)所含轻链可变域包含与选自SEQ ID NO：17或18的氨基酸序列具有至少
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的抗
CD22抗体。在有些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、或99％序列同一性的氨基酸序列相对于参比序列包含替代、添加、或删除，但是包含
该氨基酸序列的抗体保留结合CD22的能力。在有些实施方案中，在参比序列中替代、插入、
或删除了总共1-10个氨基酸。在有些实施方案中，所述替代、插入、或删除存在于HVR以外
的区域(即在FR中)。在有些实施方案中，抗CD22抗体包含包含SEQ ID NO：16的氨基酸
序列的重链可变域和包含选自SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变域。
基酸序列；且(b)所含轻链可变域包含与选自SEQ ID NO：17或18的氨基酸序列具有至少
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的抗
CD22抗体。在有些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、或99％序列同一性的氨基酸序列相对于参比序列包含替代、添加、或删除，但是包含
该氨基酸序列的抗体保留结合CD22的能力。在有些实施方案中，在参比序列中替代、插入、
或删除了总共1-10个氨基酸。在有些实施方案中，所述替代、插入、或删除存在于HVR以外
的区域(即在FR中)。在有些实施方案中，抗CD22抗体包含包含SEQ ID NO：16的氨基酸
序列的重链可变域和包含选自SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变域。
[0475] 一方面，本发明提供了包含(a)一种、两种、或三种选自图2A所示VH VHR的VH HVR和/或(b)一种、两种、或三种选自图2B所示VL VHR的VL HVR的抗CD22抗体。一方面，
本发明提供了包含选自图2A所示重链可变域的重链可变域和选自图2B所示轻链可变域的
轻链可变域的抗CD22抗体。
本发明提供了包含选自图2A所示重链可变域的重链可变域和选自图2B所示轻链可变域的
轻链可变域的抗CD22抗体。
[0476] 一方面，本发明的抗CD22抗体包含保藏于ATCC且编号PTA-7620的杂交瘤所生成的5E8.1.8抗体的1、2、3、4、5、或6种高变区。
[0477] 2.抗体片段
[0478] 本发明涵盖抗体片段。抗体片段可以通过传统手段来生成，诸如酶促消化，或者通过重组技术来生成。在某些情况中，使用抗体片段有优势，而不是完整抗体。片段的较小
尺寸容许快速清除，而且可导致更易于接近实体瘤。某些抗体片段的综述参见Hudson等
(2003)Nat.Med.9：129-134。
尺寸容许快速清除，而且可导致更易于接近实体瘤。某些抗体片段的综述参见Hudson等
(2003)Nat.Med.9：129-134。
[0479] 已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical
Methods 24：107-117(1992)；及Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接
由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大
肠杆菌分泌，如此容许容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离
抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段
(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主
细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的
Fab和F(ab′)2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于
熟练从业人员将是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO
93/16185；美国专利No.5,571,894；及5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点、缺少恒
定区的唯一类型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合
蛋白以生成效应器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering，
Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中
所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
Methods 24：107-117(1992)；及Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接
由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大
肠杆菌分泌，如此容许容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离
抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段
(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主
细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的
Fab和F(ab′)2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于
熟练从业人员将是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO
93/16185；美国专利No.5,571,894；及5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点、缺少恒
定区的唯一类型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合
蛋白以生成效应器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering，
Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中
所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
[0480] 3.人源化抗体
[0481] 本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非 人氨基酸残基常常称为
“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人
源化(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；
Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，即用(非人)高变区序列替代人抗体的对
应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中显著少于完
整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中
有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人
源化(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；
Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，即用(非人)高变区序列替代人抗体的对
应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中显著少于完
整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中
有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
[0482] 用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变域的选择对于降低抗原性可能是重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知人可变域序列
的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims
等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法
使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于数
种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta等，
J.Immunol.151：2623(1993))。
的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims
等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法
使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于数
种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta等，
J.Immunol.151：2623(1993))。
[0483] 一般还希望的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本
序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模
型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能
三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发
挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从
受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲
和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模
型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能
三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发
挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从
受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲
和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
[0484] 4.人抗体
[0485] 本发明的人抗CD22抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发明的
人单克隆抗CD22抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系
已有记载，例如Kozbor，J.Immunol.，133： 3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody
Production Techniques andApplications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，
1987)；及Boerner等，J.Immunol.，147：86(1991).
人单克隆抗CD22抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系
已有记载，例如Kozbor，J.Immunol.，133： 3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody
Production Techniques andApplications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，
1987)；及Boerner等，J.Immunol.，147：86(1991).
[0486] 例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重
链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转
移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551(1993)；Jakobovits 等，Nature 362：255-258(1993)；
Bruggermann等，Year in Immunol.7：33(1993)。
链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转
移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551(1993)；Jakobovits 等，Nature 362：255-258(1993)；
Bruggermann等，Year in Immunol.7：33(1993)。
[0487] 基因改组也可用于自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitope
imprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变域
用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择
导致如下非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相
应的非人链后恢复了抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶的选择。在重
复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公布于1993年4月1
日)。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它
们不含非人起源的FR或CDR残基。
imprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变域
用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择
导致如下非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相
应的非人链后恢复了抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶的选择。在重
复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公布于1993年4月1
日)。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它
们不含非人起源的FR或CDR残基。
[0488] 5.双特异性抗体
[0489] 双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对
CD22，结合特异性之另一针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合CD22
的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达CD22的细胞。这些抗体
拥有CD22结合臂和结合细胞毒剂(诸如例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱
类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全
长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
CD22，结合特异性之另一针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合CD22
的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达CD22的细胞。这些抗体
拥有CD22结合臂和结合细胞毒剂(诸如例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱
类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全
长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
[0490] 用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。在传统上，双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有 不同的特异性
(Millstein和Cuello，Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，
这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一
种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产
物产量低。类似的规程披露于WO 93/08829，公布于1993年5月13日及Traunecker等，
EMBO J.10：3655(1991)。
(Millstein和Cuello，Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，
这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一
种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产
物产量低。类似的规程披露于WO 93/08829，公布于1993年5月13日及Traunecker等，
EMBO J.10：3655(1991)。
[0491] 依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。例如，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋
白重链恒定域进行融合。在某些实施方案中，在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必
需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋
白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多
肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极
大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别
意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
白重链恒定域进行融合。在某些实施方案中，在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必
需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋
白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多
肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极
大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别
意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
[0492] 在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异
性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，
因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分
开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，
Methodsin Enzymology 121：210(1986)。
性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，
因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分
开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，
Methodsin Enzymology 121：210(1986)。
[0493] 依照另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。界面包含至少部分抗体恒定域CH3结构域。在该方法中，将第
一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通
过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界
面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸
如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通
过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界
面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸
如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
[0494] 双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一 种抗体可以与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细
胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO
92/00373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂
是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。
胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO
92/00373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂
是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。
[0495] 文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗
体以生成F(ab′)2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下(用
以稳定邻近的二硫醇和防止分子间二硫键的形成)还原。然后将产生的Fab’片段转变为
硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重
新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗
体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
体以生成F(ab′)2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下(用
以稳定邻近的二硫醇和防止分子间二硫键的形成)还原。然后将产生的Fab’片段转变为
硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重
新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗
体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
[0496] 最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992)记载了完全人源化的双特异
性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化
学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞
和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶物的溶解活性。
性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化
学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞
和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶物的溶解活性。
[0497] 还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5)：
1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体
的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二
聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：
6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段
包含通过接头相连的重链恒定域(VH)和轻链恒定域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的
两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补
VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体
构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。
1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体
的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二
聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：
6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段
包含通过接头相连的重链恒定域(VH)和轻链恒定域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的
两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补
VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体
构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。
[0498] 涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。
[0499] 6.多价抗体
[0500] 多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而
生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。
多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，二聚化结
构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末
端的三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，多价抗体包含(或由其组成)三个至
大约八个抗原结合位点。在一个这样的实施方案中，多价抗体包含(或由其组成)四个抗
原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(例如两条多肽链)，其中所述多肽链包含两
个或更多可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，
VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。
例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本
文中的多价抗体可进一步包含至少两条(例如四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体
可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文所涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变
域，且任选进一步包含CL结构域。
生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。
多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，二聚化结
构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末
端的三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，多价抗体包含(或由其组成)三个至
大约八个抗原结合位点。在一个这样的实施方案中，多价抗体包含(或由其组成)四个抗
原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(例如两条多肽链)，其中所述多肽链包含两
个或更多可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，
VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。
例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本
文中的多价抗体可进一步包含至少两条(例如四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体
可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文所涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变
域，且任选进一步包含CL结构域。
[0501] 7.单域抗体
[0502] 在有些实施方案中，本发明的抗体是单域抗体(single-domain antibody)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或者整个或部分轻链可变域的单一多肽链。在某
些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利
No.6,248,516B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。
些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利
No.6,248,516B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。
[0503] 8.抗体变体
[0504] 在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以是通过将适宜的变化
引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的
残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，
倘若最终的构建物具有期 望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基
酸序列。
引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的
残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，
倘若最终的构建物具有期 望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基
酸序列。
[0505] 可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989)中所述。这里，鉴定一个残
基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg、asp、his、lys、和glu)并用中性或带负电
荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过
在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽
管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例
如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对
所表达的免疫球蛋白筛选期望的活性。
基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg、asp、his、lys、和glu)并用中性或带负电
荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过
在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽
管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例
如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对
所表达的免疫球蛋白筛选期望的活性。
[0506] 氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含一百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括
具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶(例
如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。
具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶(例
如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。
[0507] 在某些实施方案中，本发明的抗体发生了改变以提高或降低抗体糖基化的程度。多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天
冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯
氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，
多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类
N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也
可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯
氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，
多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类
N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也
可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
[0508] 向抗体中添加或删除糖基化位点可通过改变氨基酸序列从而创建或消除一个或多个上述三肽序列而便利地完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始
抗体的序列中添加、删除、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的
糖基化位点)。
抗体的序列中添加、删除、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的
糖基化位点)。
[0509] 若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请号US 2003/0157108(Presta，L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着
于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621(Kyowa Hakko KogyoCo.，Ltd.)。WO
2003/011878(Jean-Mairet等)和美国专利No.6,602,684(Umana 等)中提到了在附着于
抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 1997/30087(Patel
等)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水
化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 1998/58964(Raju，S.)和WO 1999/22764(Raju，
S.)。关于具有改良糖基化的抗原结合分子还可参见US 2005/0123546(Umana等)。
于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621(Kyowa Hakko KogyoCo.，Ltd.)。WO
2003/011878(Jean-Mairet等)和美国专利No.6,602,684(Umana 等)中提到了在附着于
抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 1997/30087(Patel
等)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水
化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 1998/58964(Raju，S.)和WO 1999/22764(Raju，
S.)。关于具有改良糖基化的抗原结合分子还可参见US 2005/0123546(Umana等)。
[0510] 在某些实施方案中，糖基化变体包含Fc区，其中附着于Fc区的碳水化合物结构缺乏岩藻糖。此类变体具有改进的ADCC功能。任选的是，Fc区还包含进一步改
进ADCC的一个或多个氨基酸替代，例如Fc区位置298、333和/或334处的替代(Eu残
基编号方式)。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体的出版物的例子包括：US
2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US
2004/0093621；US2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；
WO2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；
Okazaki 等 J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki 等 Biotech.Bioeng.87：
614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13
CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US
2003/0157108A1，Presta，L；及WO2004/056312A1，Adams等，尤其是实施例11)和敲除细
胞系，诸如α-1，6-岩藻糖转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki等Biotech.
Bioeng.87：614(2004))。
进ADCC的一个或多个氨基酸替代，例如Fc区位置298、333和/或334处的替代(Eu残
基编号方式)。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体的出版物的例子包括：US
2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US
2004/0093621；US2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；
WO2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；
Okazaki 等 J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki 等 Biotech.Bioeng.87：
614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13
CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US
2003/0157108A1，Presta，L；及WO2004/056312A1，Adams等，尤其是实施例11)和敲除细
胞系，诸如α-1，6-岩藻糖转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki等Biotech.
Bioeng.87：614(2004))。
[0511] 在一个实施方案中，抗体进行了改变以改进其血清半衰期。为了延长抗体的血清本申请，可以将补救受体结合位点掺入抗体(尤其是抗体片段)，如例如US 5739277中所
记载的。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3、或
IgG4)Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位(US 2003/0190311；US6821505；US
6165745；US5624821；US 5648260；US 6165745；US 5834597)。
记载的。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3、或
IgG4)Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位(US 2003/0190311；US6821505；US
6165745；US5624821；US 5648260；US 6165745；US 5834597)。
[0512] 另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。进行替代诱变的感兴趣位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。表1中“优
选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致期望的生物学活性变化，那么可导入表1中
称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。
选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致期望的生物学活性变化，那么可导入表1中
称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。
[0513] 表1
[0514]原始残基 例示替代 优选替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
[0515] 对抗体生物学特性的实质性修饰可通过选择对维持以下方面的效果差异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如(折叠)片或螺旋构象，(b)靶位
点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸
如下分组(A.L.Lehninger，于Biochemistry，第2版，pp.73-75，Worth Publishers，New
York(1975))：
点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸
如下分组(A.L.Lehninger，于Biochemistry，第2版，pp.73-75，Worth Publishers，New
York(1975))：
[0516] (1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
[0517] (2)不带电荷的、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn (N)、Gln(Q)
[0518] (3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)
[0519] (4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
[0520] 或者，根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：
[0521] (1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
[0522] (2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
[0523] (3)酸性的：Asp、Glu；
[0524] (4)碱性的：His、Lys、Arg；
[0525] (5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
[0526] (6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
[0527] 非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。此类替代残基还可以导入保守替代位点，或导入剩余(非保守)位点。
[0528] 一类替代变体涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改变的(例
如改进的)生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲
和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可
能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的噬
菌体外壳蛋白(例如M13基因III产物)至少一部分的融合物。然后对噬菌体展示的变体
筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行扫描
诱变(例如丙氨酸扫描)以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分
析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触
残基及邻近残基是依照本领域已知的技术(包括本文详述的技术)进行替代的候选位点。
一旦产生这样的变体，使用本领域已知的技术(包括本文所述的技术)对该组变体进行筛
选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
如改进的)生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲
和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可
能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的噬
菌体外壳蛋白(例如M13基因III产物)至少一部分的融合物。然后对噬菌体展示的变体
筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行扫描
诱变(例如丙氨酸扫描)以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分
析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触
残基及邻近残基是依照本领域已知的技术(包括本文详述的技术)进行替代的候选位点。
一旦产生这样的变体，使用本领域已知的技术(包括本文所述的技术)对该组变体进行筛
选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
[0529] 编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对
较早制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒
式诱变来制备。
较早制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒
式诱变来制备。
[0530] 可能希望在本发明抗体的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成 Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸)包含氨基酸修饰(例
如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
[0531] 依照此描述和本领域的教导，涵盖在有些实施方案中，本发明的抗体与野生型对应抗体相比可在例如Fc区中包含一处或多处改变。与它们的野生型对应物相比，这些抗
体仍将基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可以在Fc区中进行会导致
C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例
如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它例子的Duncan和Winter，Nature
322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351。
WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗
体变体。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields等J.Biol.
Chem.9(2)：6591-6604(2001)。半衰期延长且对新生儿Fc受体(FcRn)(它负责将母体IgG
转移给胎儿)(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))
的结合改良的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)。这些抗体包含具有一处或多处
改进Fc区与FcRn结合的替代的Fc。具有改变的Fc区氨基酸序列且C1q结合能力升高或
降低的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1，WO99/51642。在此明确收入这些专利出
版物的内容作为参考。还可参见Idusogie等J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
体仍将基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可以在Fc区中进行会导致
C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例
如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它例子的Duncan和Winter，Nature
322：738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351。
WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗
体变体。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields等J.Biol.
Chem.9(2)：6591-6604(2001)。半衰期延长且对新生儿Fc受体(FcRn)(它负责将母体IgG
转移给胎儿)(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))
的结合改良的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)。这些抗体包含具有一处或多处
改进Fc区与FcRn结合的替代的Fc。具有改变的Fc区氨基酸序列且C1q结合能力升高或
降低的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1，WO99/51642。在此明确收入这些专利出
版物的内容作为参考。还可参见Idusogie等J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
[0532] 一方面，本发明提供了在包含Fc区的Fc多肽的界面中包含修饰的抗体，其中所述修饰便于和/或促进二聚化。这些修饰包括在第一Fc多肽中导入隆起(protuberance)和
在第二Fc多肽中导入空腔(cavity)，其中所述隆起可位于所述空腔中，从而促进第一与第
二Fc多肽的复合。生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的，例如记载于美国专利
No.5,731,168。
在第二Fc多肽中导入空腔(cavity)，其中所述隆起可位于所述空腔中，从而促进第一与第
二Fc多肽的复合。生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的，例如记载于美国专利
No.5,731,168。
[0533] 9.抗体衍生物
[0534] 可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。优选的是，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例
子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯
醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨
基酸(均聚物或随机共聚物)、右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、
环氧丙烷/ 环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于
其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且
可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个
聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化
的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是
否将用于指定条件下的治疗等。
子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯
醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨
基酸(均聚物或随机共聚物)、右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、
环氧丙烷/ 环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于
其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且
可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个
聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化
的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是
否将用于指定条件下的治疗等。
[0535] 在另一个实施方案中，提供了抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的偶联物。在一个实施方案中，该非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等，Proc.
Natl.Acad.Sci.102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，包括但不限于对普通
细胞无害但将非蛋白质性质模块加热至接近抗体-非蛋白质性质模块的细胞被杀死的温
度的波长。
Natl.Acad.Sci.102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，包括但不限于对普通
细胞无害但将非蛋白质性质模块加热至接近抗体-非蛋白质性质模块的细胞被杀死的温
度的波长。
[0536] 制备抗体的某些方法
[0537] 1.某些基于杂交瘤的方法
[0538] 本发明的抗CD22单克隆抗体可使用最初由Kohler等，Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来制备。
[0539] 在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。针对CD22的抗体一
般通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射CD22和佐剂来生成。CD22可以使用本
领域众所周知的方法来制备，其中有些方法在本文中有进一步描述。例如，CD22可以重组生
产。在一个实施方案中，将动物用包含CD22胞外部分且其融合至免疫球蛋白重链Fc部分的
CD22衍生物免疫。在一个实施方案中，将动物用CD22-IgG1融合蛋白免疫。在一个实施方
案中，将动物用在单磷酰脂质A(MPL)/海藻糖dicrynomycolate(TDM)(Ribi Immunochem.
Research，Inc.，Hamilton，MT)的溶液中的CD22免疫原性衍生物进行免疫，溶液皮内注射
于多个部位。2周后，对动物进行加强免疫。7-14天后，对动物采血，并对血清测定抗CD22
滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateaus)。
般通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射CD22和佐剂来生成。CD22可以使用本
领域众所周知的方法来制备，其中有些方法在本文中有进一步描述。例如，CD22可以重组生
产。在一个实施方案中，将动物用包含CD22胞外部分且其融合至免疫球蛋白重链Fc部分的
CD22衍生物免疫。在一个实施方案中，将动物用CD22-IgG1融合蛋白免疫。在一个实施方
案中，将动物用在单磷酰脂质A(MPL)/海藻糖dicrynomycolate(TDM)(Ribi Immunochem.
Research，Inc.，Hamilton，MT)的溶液中的CD22免疫原性衍生物进行免疫，溶液皮内注射
于多个部位。2周后，对动物进行加强免疫。7-14天后，对动物采血，并对血清测定抗CD22
滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateaus)。
[0540] 或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二 醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles
and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。
and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。
[0541] 将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，例如含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的培养基。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶
次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次
黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次
黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
[0542] 在某些实施方案中，骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。例示性的骨髓瘤细胞包括但
不限于鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell
Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿
瘤及可从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Rockville，
Maryland，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓
瘤细胞系也已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur
等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel
Dekker，Inc.，New York，1987)。
不限于鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell
Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿
瘤及可从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Rockville，
Maryland，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓
瘤细胞系也已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur
等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel
Dekker，Inc.，New York，1987)。
[0543] 可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定结合CD22的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸
附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合
亲和力可通过例如Munson等，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。
附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合
亲和力可通过例如Munson等，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。
[0544] 在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal
Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目
的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹
水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰
石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适
当分开。
Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目
的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹
水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰
石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适
当分开。
[0545] 2.某些文库筛选方法
[0546] 本发明的抗CD22抗体可以通过使用组合库筛选具有期望活性的抗体来 创建。例如，本领域知道用于构建噬菌体展示库及对此类文库筛选具有期望的结合特性的抗体的多
种方法。此类方法一般记载于Hoogenboom等(2001)于：Methods in Molecular Biology
178：1-37(O’Brien等编，Human Press，Totowa，NJ)，在某些实施方案中是Lee等(2004)
J.Mol.Biol.340：1073-1093。
种方法。此类方法一般记载于Hoogenboom等(2001)于：Methods in Molecular Biology
178：1-37(O’Brien等编，Human Press，Totowa，NJ)，在某些实施方案中是Lee等(2004)
J.Mol.Biol.340：1073-1093。
[0547] 在原理上，通过筛选噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区(Fv)片段的噬菌体。通过针对所需抗原的亲和
层析来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而
与文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原
吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗CD22抗体可以如下获得，即设计合适的抗
原筛选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和
Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIHPublication
91-3242，Bethesda MD(1991)，卷1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列来构建全长抗CD22
抗体克隆。
层析来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而
与文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原
吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗CD22抗体可以如下获得，即设计合适的抗
原筛选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和
Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIHPublication
91-3242，Bethesda MD(1991)，卷1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列来构建全长抗CD22
抗体克隆。
[0548] 在某些实施方案中，抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，分别来自轻链(VL)和重链(VH)，都呈现三个高变环(HVR)或互补决定区(CDR)。可变域可
以功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短的、柔性
的接头共价相连)，或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用)，
如Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬
菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
以功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短的、柔性
的接头共价相连)，或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用)，
如Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬
菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
[0549] VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：
433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库能提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构
建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人
抗体来源，无需任何免疫，如Griffiths等，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，未免疫
的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因，并使用包含随机序列
的PCR引物来编码高度可变的CDR3区及用来在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter，
J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。
433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库能提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构
建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人
抗体来源，无需任何免疫，如Griffiths等，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，未免疫
的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因，并使用包含随机序列
的PCR引物来编码高度可变的CDR3区及用来在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter，
J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。
[0550] 在某些实施方案中，通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来 展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过柔性多肽间隔物在同
一多肽链上相连，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或者展示为Fab
片段，其中一条链与pIII融合，另一条链分泌入细菌宿主细胞周质，在此装配Fab-外壳蛋
白结构，其通过替换一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom等，
Nucl.AcidsRes.，19：4133-4137(1991)所述。
一多肽链上相连，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或者展示为Fab
片段，其中一条链与pIII融合，另一条链分泌入细菌宿主细胞周质，在此装配Fab-外壳蛋
白结构，其通过替换一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom等，
Nucl.AcidsRes.，19：4133-4137(1991)所述。
[0551] 一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核酸。如果希望文库偏向抗CD22克隆，那么可以给受试者免疫CD22以产生抗体应答，并回收脾细胞和/
或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个优选的实施方案中，如
下得到了偏向抗CD22克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵
列(且缺乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗CD22抗体应答，使得CD22
免疫产生生成针对CD22的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的生成在下文中有
描述。
或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个优选的实施方案中，如
下得到了偏向抗CD22克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵
列(且缺乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗CD22抗体应答，使得CD22
免疫产生生成针对CD22的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的生成在下文中有
描述。
[0552] 可以如下获得抗CD22反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选规程来分离表达CD22特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过使用CD22亲和层析进行的细胞分离或
者细胞对荧光染料标记的CD22的吸附及后续的荧光激活细胞分选(FACS)。
者细胞对荧光染料标记的CD22的吸附及后续的荧光激活细胞分选(FACS)。
[0553] 或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用CD22在其中没有抗原性的任何动物(人或非人的)物
种构建抗体文库。对于构建体外掺入抗体基因的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未
重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种(诸如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、
猫、猪、牛、马、和禽类等)获得感兴趣的免疫细胞。
种构建抗体文库。对于构建体外掺入抗体基因的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未
重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种(诸如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、
猫、猪、牛、马、和禽类等)获得感兴趣的免疫细胞。
[0554] 从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从淋巴细胞分离基因组DNA
或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5′和3′末端匹配的引物进行聚合酶链式反应
(PCR)，如Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：3833-3837(1989)所述，由此构建多
样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V
结构域的外显子的5′末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward等，
Nature， 341：544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外
显子内，如Jones等，Biotechnol.，9：88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastry
等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中
可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。在某些实施方案中，如下
将文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中
存在的所有可获得的VH和VL重排，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)或
Orum等，Nucleic Acids Res.，21：4491-4498(1993)所述。为了将所扩增的DNA克隆入表达
载体，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如Orlandi等(1989)所述，
或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)
所述。
或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5′和3′末端匹配的引物进行聚合酶链式反应
(PCR)，如Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：3833-3837(1989)所述，由此构建多
样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V
结构域的外显子的5′末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward等，
Nature， 341：544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外
显子内，如Jones等，Biotechnol.，9：88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastry
等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中
可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。在某些实施方案中，如下
将文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中
存在的所有可获得的VH和VL重排，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)或
Orum等，Nucleic Acids Res.，21：4491-4498(1993)所述。为了将所扩增的DNA克隆入表达
载体，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如Orlandi等(1989)所述，
或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)
所述。
[0555] 合成重排的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人VH基因区段已经克隆和测序(Tomlinson等，J.Mol.Biol.，227：776-798(1992))，并定位(Matsuda等，
Nature Genet.，3：88-94(1993))；这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构造)可用
于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom
和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性
集中于单一长度的长H3环，如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457-4461(1992)
所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams和Winter，Eur.J.Immunol.，23：
1456-1461(1993))，而且可用于生成合成轻链全集。基于一系列VH和VL折叠结构及L3和
H3长度的合成V基因全集将编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，
依照Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)的方法，可以在体外重排种
系V基因区段。
Nature Genet.，3：88-94(1993))；这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构造)可用
于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom
和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性
集中于单一长度的长H3环，如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457-4461(1992)
所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams和Winter，Eur.J.Immunol.，23：
1456-1461(1993))，而且可用于生成合成轻链全集。基于一系列VH和VL折叠结构及L3和
H3长度的合成V基因全集将编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，
依照Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)的方法，可以在体外重排种
系V基因区段。
[0556] 抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集联合在一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefe等，Gene，128：
119-126(1993)所述，或者在体外通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse等，Nucl.
Acids Res.，21：2265-2266(1993)中记载的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链
性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分开克隆未免疫的VH和VL全集，一
个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得
12
每个细胞包含一种不同组合来联合两个文库，库容量只受细胞存在数的限制(约10 个克
隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成
-1 -8
噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd 为约10 M)的多样性抗
体。
119-126(1993)所述，或者在体外通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse等，Nucl.
Acids Res.，21：2265-2266(1993)中记载的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链
性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分开克隆未免疫的VH和VL全集，一
个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得
12
每个细胞包含一种不同组合来联合两个文库，库容量只受细胞存在数的限制(约10 个克
隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成
-1 -8
噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd 为约10 M)的多样性抗
体。
[0557] 或者，可以将全集依次克隆入同一载体，例如如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后克隆，如Clackson等，
Nature，352：624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔物
的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR
在淋巴细胞内联合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embleton等，Nucl.Acids
Res.，20：3831-3837(1992)所述。
Nature，352：624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔物
的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR
在淋巴细胞内联合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embleton等，Nucl.Acids
Res.，20：3831-3837(1992)所述。
[0558] 未免疫文库(naive library)(天然的或合成的)生成的抗体可具有中等亲和力-1 6 7 -1
(Kd 为约10-10M )，但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建和再次选择次生文库，
如Winter等(1994)，见上文所述。例如，在Hawkins等，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)
的方法或Gram等，Proc.Natl.Acad.SciUSA，89：3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合
酶在体外随机引入突变(Leung等，Technique，1：11-15(1989))。另外，可以通过随机突变
一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR
的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 9607754(公布于1996年3月14
日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。
另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在
V结构域变体全集组合，并在数轮链改组中筛选更高亲和力，如Marks等，Biotechnol.，10：
-9
779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力约10 M或更低的抗体和抗体片段。
(Kd 为约10-10M )，但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建和再次选择次生文库，
如Winter等(1994)，见上文所述。例如，在Hawkins等，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)
的方法或Gram等，Proc.Natl.Acad.SciUSA，89：3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合
酶在体外随机引入突变(Leung等，Technique，1：11-15(1989))。另外，可以通过随机突变
一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR
的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 9607754(公布于1996年3月14
日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。
另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在
V结构域变体全集组合，并在数轮链改组中筛选更高亲和力，如Marks等，Biotechnol.，10：
-9
779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力约10 M或更低的抗体和抗体片段。
[0559] 文库的筛选可通过本领域已知的多种技术来实现。例如，CD22可用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或者偶联至生物素以用链霉亲
合素包被的珠捕捉，或者用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。
合素包被的珠捕捉，或者用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。
[0560] 在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接触固定化的CD22。正常情况下，选择包括pH、离子强度、温度等等的条件来模拟生理学条
件。结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbas等，Proc.Natl.Acad.
Sci USA，88：7978-7982(1991)所述，或者用碱洗 脱，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：
581-597(1991)所述，或者通过CD22抗原竞争洗脱，例如在与Clackson等，Nature，352：
624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。
此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。
件。结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbas等，Proc.Natl.Acad.
Sci USA，88：7978-7982(1991)所述，或者用碱洗 脱，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：
581-597(1991)所述，或者通过CD22抗原竞争洗脱，例如在与Clackson等，Nature，352：
624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。
此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。
[0561] 选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可以
通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅
通过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离
动力学(和强结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示
(如Bass等，Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如
Marks等，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述)来促进。
通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅
通过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离
动力学(和强结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示
(如Bass等，Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如
Marks等，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述)来促进。
[0562] 有可能在对CD22具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机突变(例如如有些亲和力成熟技术进行)有可能产生许
多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制CD22，罕见的高亲和力噬菌体
能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化CD22一
起温育，但是生物素化CD22的浓度低于CD22的目标摩尔亲和常数。然后用链霉亲合素包
被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依照结合亲和力来选择抗
体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍的突变体克
隆。还可以操作清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。
多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制CD22，罕见的高亲和力噬菌体
能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化CD22一
起温育，但是生物素化CD22的浓度低于CD22的目标摩尔亲和常数。然后用链霉亲合素包
被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依照结合亲和力来选择抗
体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍的突变体克
隆。还可以操作清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。
[0563] 抗CD22克隆可以基于活性进行选择。在某些实施方案中，本发明提供了结合天然表达CD22的活细胞的抗CD22抗体。在一个实施方案中，本发明提供了阻断CD22配体与
CD22之间的结合但不阻断CD22配体与第二蛋白质结合的抗CD22抗体。对应于此类抗CD22
抗体的Fv克隆可以如下选出：(1)如上所述从噬菌体文库分离抗CD22克隆，并任选通过在
合适的细菌宿主中培养来扩增所分离的噬菌体克隆群；(2)选出分别想阻断和不阻断其活
性的CD22和第二蛋白质；(3)使抗CD22噬菌体克隆吸附至固定化的CD22；(4)使用过量的
第二蛋白质来洗脱任何不想要的、识别CD22结合决定簇(其与第二蛋白质的结合决定簇交
叠或共享)的克隆；并(5)洗脱在步骤(4)后仍然吸 附的克隆。任选的是，具有期望的阻
断/不阻断特性的克隆可以通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步富集。
CD22之间的结合但不阻断CD22配体与第二蛋白质结合的抗CD22抗体。对应于此类抗CD22
抗体的Fv克隆可以如下选出：(1)如上所述从噬菌体文库分离抗CD22克隆，并任选通过在
合适的细菌宿主中培养来扩增所分离的噬菌体克隆群；(2)选出分别想阻断和不阻断其活
性的CD22和第二蛋白质；(3)使抗CD22噬菌体克隆吸附至固定化的CD22；(4)使用过量的
第二蛋白质来洗脱任何不想要的、识别CD22结合决定簇(其与第二蛋白质的结合决定簇交
叠或共享)的克隆；并(5)洗脱在步骤(4)后仍然吸 附的克隆。任选的是，具有期望的阻
断/不阻断特性的克隆可以通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步富集。
[0564] 编码本发明杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重
链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达
载体转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合
成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.Opinion
inImmunol.，5：256(1993)及Pluckthun，Immunol.Revs，130：151(1992)。
链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达
载体转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合
成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.Opinion
inImmunol.，5：256(1993)及Pluckthun，Immunol.Revs，130：151(1992)。
[0565] 编码本发明Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如适宜的DNA序列可得自Kabat等，见上文)以形成编码全长或部分重链和/或轻链的
克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒
定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物(诸如人)物种的可
变域DNA，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的
编码序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在某些实施方案中，
衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成全长或部分人重链和/或轻链的
编码序列。
克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒
定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物(诸如人)物种的可
变域DNA，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的
编码序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在某些实施方案中，
衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成全长或部分人重链和/或轻链的
编码序列。
[0566] 还可以修饰编码衍生自本发明杂交瘤的抗CD22抗体的DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定域的编码序列替换衍生自杂交瘤克隆的同源鼠源序列(例如如
Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中的方法)。可以进一步修
饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA，通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免
疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可以以该方式制备具有本发明的Fv克隆或杂交瘤
克隆衍生抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。
Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中的方法)。可以进一步修
饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA，通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免
疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可以以该方式制备具有本发明的Fv克隆或杂交瘤
克隆衍生抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。
[0567] 3.载体、宿主细胞和重组方法
[0568] 为了重组生产本发明的抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规规程容易的分离编码抗体的DNA并测序(例如使
用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载
体的选择部分取决于将要使用的宿 主细胞。一般而言，宿主细胞或是原核或是真核(通常
是哺乳动物)起源的。应当领会，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、
IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。
用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载
体的选择部分取决于将要使用的宿 主细胞。一般而言，宿主细胞或是原核或是真核(通常
是哺乳动物)起源的。应当领会，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、
IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。
[0569] 使用原核宿主细胞生成抗体：
[0570] 载体构建
[0571] 可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可以从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪
或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表
达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明目的，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。
适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主
细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体
宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标
志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物、和转录终止序列。
或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表
达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明目的，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。
适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主
细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体
宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标
志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物、和转录终止序列。
[0572] 一般而言，与宿主细胞一起使用包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列的质粒载体。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序
列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄
青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其
衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达
内源蛋白质的启动子。Carter等，美国专利No.5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体
的pBR322衍生物的例子。
列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄
青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其
衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达
内源蛋白质的启动子。Carter等，美国专利No.5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体
的pBR322衍生物的例子。
[0573] 另外，可以将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用于转化易感宿主细胞
诸如大肠杆菌LE392的重组载体。
诸如大肠杆菌LE392的重组载体。
[0574] 本发明的表达载体可包含两种或更多启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游(5′)的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动
子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的变化(例如营养
物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。
子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的变化(例如营养
物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。
[0575] 众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可以将选择的启动子与编码轻
链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基
因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相
比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。
链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基
因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相
比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。
[0576] 适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的
其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经
发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制性位点的接头或衔接头将它们与编码
靶轻链和重链的顺反子可操作连接(Siebenlist等，Cell 20：269(1980))。
其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经
发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制性位点的接头或衔接头将它们与编码
靶轻链和重链的顺反子可操作连接(Siebenlist等，Cell 20：269(1980))。
[0577] 在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶
多肽DNA的一部分。为了本发明目的而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工
(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿
主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或
热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施
方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
多肽DNA的一部分。为了本发明目的而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工
(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿
主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或
热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施
方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
[0578] 在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可以在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞
质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大肠杆菌trxB-菌
株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装
配。Proba和Pluckthun，Gene 159：203(1995))。
质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大肠杆菌trxB-菌
株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装
配。Proba和Pluckthun，Gene 159：203(1995))。
[0579] 本发明的抗体可使用如下表达系统来生成，其中所表达多肽构件的数量比率可以受到调控，从而将分泌且正确装配的本发明抗体的产量最大化。此类调控是至少部分通过
同时调控多肽构件的翻译强度而实现的。
同时调控多肽构件的翻译强度而实现的。
[0580] Simmons等，美国专利No.5,840,523中公开了用于调控翻译强度的一种 技术。它在顺反子内利用翻译起始区(TIR)的变体。对于指定的TIR，可创建具有一定范围翻译强
度的一系列氨基酸或核酸序列变体，由此提供针对特定链的期望表达水平调节此因素的方
便手段。可通过常规诱变技术导致能改变氨基酸序列的密码子变化来生成TIR变体。在某
些实施方案中，核苷酸序列中的变化是沉默的。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno
序列的数目或间距的改变，及信号序列中的改变。用于生成突变型信号序列的一种方法是
在编码序列的开始端生成不改变信号序列氨基酸序列的“密码子库”(即变化是沉默的)。
这可通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，有些氨基酸，诸如亮氨酸、丝
氨酸、和精氨酸，具有多种第一个和第二个位置，这可在建库中增加复杂性。Yansura等，
METHODS：A Companion toMethods in Enzymol.4：151-158(1992)中详细记载了这种诱变
方法。
度的一系列氨基酸或核酸序列变体，由此提供针对特定链的期望表达水平调节此因素的方
便手段。可通过常规诱变技术导致能改变氨基酸序列的密码子变化来生成TIR变体。在某
些实施方案中，核苷酸序列中的变化是沉默的。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno
序列的数目或间距的改变，及信号序列中的改变。用于生成突变型信号序列的一种方法是
在编码序列的开始端生成不改变信号序列氨基酸序列的“密码子库”(即变化是沉默的)。
这可通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，有些氨基酸，诸如亮氨酸、丝
氨酸、和精氨酸，具有多种第一个和第二个位置，这可在建库中增加复杂性。Yansura等，
METHODS：A Companion toMethods in Enzymol.4：151-158(1992)中详细记载了这种诱变
方法。
[0581] 在一个实施方案中，对于载体中的每个顺反子，生成具有一定范围TIR强度的一组载体。这个有限集合提供了每条链的表达水平以及期望抗体产物的产量在各种TIR强
度组合下的比较。可通过量化报道基因的表达水平来测定TIR强度，Simmons等，美国专利
No.5,840,523中有详细描述。根据翻译强度的比较，选择期望的个别TIR在本发明的表达
载体构建物中进行组合。
度组合下的比较。可通过量化报道基因的表达水平来测定TIR强度，Simmons等，美国专利
No.5,840,523中有详细描述。根据翻译强度的比较，选择期望的个别TIR在本发明的表达
载体构建物中进行组合。
[0582] 适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或阳性生物体。有用细菌的例子包括埃希氏菌
属(Escherichia)(如大肠埃希氏菌E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆
菌B.subtilis)、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)(如铜绿假
单胞菌P.aeruginosa)物种、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏
菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺
氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobium)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、或副球菌属
(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠
杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的例子包括菌株W3110(Bachmann，Cellular
and Molecular Biology，卷2，Washington，D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219
页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac
Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3(美国专利No.5,639,635)。其
它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC
31,537)和大肠杆菌 RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些例子只是例示而非限制。
本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass等，
Proteins 8：309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的
细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制
子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分
泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。
属(Escherichia)(如大肠埃希氏菌E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆
菌B.subtilis)、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)(如铜绿假
单胞菌P.aeruginosa)物种、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏
菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺
氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobium)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、或副球菌属
(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠
杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的例子包括菌株W3110(Bachmann，Cellular
and Molecular Biology，卷2，Washington，D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219
页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac
Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3(美国专利No.5,639,635)。其
它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC
31,537)和大肠杆菌 RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些例子只是例示而非限制。
本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass等，
Proteins 8：309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的
细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制
子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分
泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。
[0583] 抗体生成
[0584] 用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
[0585] 转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于此类细胞的标准技术进行转化。采用氯
化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/
DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。
化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/
DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。
[0586] 在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的例子包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。
在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包
含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基
中添加氨苄青霉素。
在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包
含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基
中添加氨苄青霉素。
[0587] 在碳源、氮源、和无机磷酸盐源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可
含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓
糖醇和二硫苏糖醇。
含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓
糖醇和二硫苏糖醇。
[0588] 在合适的温度培养原核宿主细胞。在某些实施方案中，对于培养大肠杆菌，培养温度的范围为约20℃至约39℃、约25℃至约37℃、或约30℃。主要取决于宿主生物体，培养
基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。在某些实施方案中，对于大肠杆菌，pH是约
6.8至约7.4、或约7.0。
基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。在某些实施方案中，对于大肠杆菌，pH是约
6.8至约7.4、或约7.0。
[0589] 如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱
导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。在某些实施方案中，磷酸盐限制培养
基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons 等，J.Immunol.Methods 263：133-147(2002))。
根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。
导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。在某些实施方案中，磷酸盐限制培养
基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons 等，J.Immunol.Methods 263：133-147(2002))。
根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。
[0590] 在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌入宿主细胞的周质并从中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmoticshock)、超声处理或裂解
等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如
亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可以转运入培养液并从中分离。可以从培
养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍
知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表
达蛋白质。
等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如
亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可以转运入培养液并从中分离。可以从培
养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍
知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表
达蛋白质。
[0591] 在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵规程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，在某些实施方案中是
约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄
糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行
的发酵，范围可以是约1升至约100升。
约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄
糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行
的发酵，范围可以是约1升至约100升。
[0592] 在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(例如OD550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构
建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可以在诱导前将细胞培养更短
的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。
建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可以在诱导前将细胞培养更短
的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。
[0593] 为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、
DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构
酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生
成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen等，J.Biol.Chem.274：19601-19605(1999)；
Georgiou等，美国专利No.6,083,715；Georgiou等，美国专利No.6,027,888；Bothmann和
Pluckthun，J.Biol.Chem.275：17100-17105(2000)；Ramm和Pluckthun，J.Biol.Chem.275：
17106-17113(2000)；Arie等，Mol.Microbiol.39：199-210(2001))。
DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构
酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生
成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen等，J.Biol.Chem.274：19601-19605(1999)；
Georgiou等，美国专利No.6,083,715；Georgiou等，美国专利No.6,027,888；Bothmann和
Pluckthun，J.Biol.Chem.275：17100-17105(2000)；Ramm和Pluckthun，J.Biol.Chem.275：
17106-17113(2000)；Arie等，Mol.Microbiol.39：199-210(2001))。
[0594] 为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋 白水解降至最低，可以将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌
株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白
酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参
见例如Joly等(1998)见上文；Georgiou等，美国专利No.5,264,365；Georgiou等，美国专
利No.5,508,192；Hara等，Microbial Drug Resistance 2：63-72(1996)。
株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白
酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参
见例如Joly等(1998)见上文；Georgiou等，美国专利No.5,264,365；Georgiou等，美国专
利No.5,508,192；Hara等，Microbial Drug Resistance 2：63-72(1996)。
[0595] 在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。
[0596] 抗体纯化
[0597] 在一个实施方案中，进一步纯化本文中生成的抗体蛋白质以获得基本上同质的制品，用于进一步的测定和使用。可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的规程是
合适纯化规程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离
子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex
G-75的凝胶过滤。
合适纯化规程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离
子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex
G-75的凝胶过滤。
[0598] 在一个方面，将固定化在固相上的蛋白A用于本发明抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲
和力结合抗体Fc区。Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白A固定化其上
的固相可以是具有玻璃或石英表面的柱子，或者可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，
柱子以诸如甘油等试剂包被，用以有可能防止污染物的非特异粘附。
和力结合抗体Fc区。Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白A固定化其上
的固相可以是具有玻璃或石英表面的柱子，或者可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，
柱子以诸如甘油等试剂包被，用以有可能防止污染物的非特异粘附。
[0599] 作为纯化的第一步，可以将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得感兴趣抗体特异性结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异性结合
的污染物。最后通过洗脱从固相回收感兴趣抗体。
的污染物。最后通过洗脱从固相回收感兴趣抗体。
[0600] 使用真核宿主细胞生成抗体：
[0601] 在真核宿主细胞中使用的载体通常包含一种或多种下列非限制性构件：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
[0602] 信号序列构件
[0603] 在真核宿主细胞中使用的载体还可在感兴趣成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。可以选择受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽
酶切除)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可 利用哺乳动物信号序列以及病毒分
泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。将此类前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框
中。
酶切除)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可 利用哺乳动物信号序列以及病毒分
泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。将此类前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框
中。
[0604] 复制起点
[0605] 通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。
[0606] 选择基因构件
[0607] 表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；
(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。
(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。
[0608] 选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物
新霉素、霉酚酸和潮霉素。
新霉素、霉酚酸和潮霉素。
[0609] 适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II(优选灵长类金属硫蛋白基因)、
腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
[0610] 例如，在有些实施方案中，可以首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在有些实
施方案中，在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)
细胞系(例如ATCCCRL-9096)。
施方案中，在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)
细胞系(例如ATCCCRL-9096)。
[0611] 或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标
志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包
含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利No.4,965,199。
志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包
含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利No.4,965,199。
[0612] 启动子构件
[0613] 表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与编码感兴趣多肽(例如抗体)的核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。例如，事实上所有真核基因
都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起
点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是 CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大
多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸(polyA)
尾的信号。在某些实施方案中，任何或所有这些序列可以合适的插入真核表达载体。
都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起
点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是 CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大
多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸(polyA)
尾的信号。在某些实施方案中，任何或所有这些序列可以合适的插入真核表达载体。
[0614] 在哺乳动物宿主细胞中由载体转录受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病
毒、和猿病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或
免疫球蛋白启动子)的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞
系统相容的话。
毒、和猿病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或
免疫球蛋白启动子)的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞
系统相容的话。
[0615] 方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立
即早期启动子。美国专利No.4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物
宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种修改。还可参见
Reyes等，Nature 297：598-601(1982)，其记载了在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸
苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序
列作为启动子。
即早期启动子。美国专利No.4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物
宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种修改。还可参见
Reyes等，Nature 297：598-601(1982)，其记载了在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸
苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序
列作为启动子。
[0616] 增强子元件构件
[0617] 常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)
的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点
晚期侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧
的增强子、和腺病毒增强子。还可参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)，其记载了激活真
核启动子的增强子元件。增强子可剪接入载体，位于抗体多肽编码序列的5′或3′位置，
但是一般位于启动子的5′位点。
的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点
晚期侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧
的增强子、和腺病毒增强子。还可参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)，其记载了激活真
核启动子的增强子元件。增强子可剪接入载体，位于抗体多肽编码序列的5′或3′位置，
但是一般位于启动子的5′位点。
[0618] 转录终止构件
[0619] 在真核宿主细胞中使用的表达载体可以还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这
些区域包含编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有
用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。
些区域包含编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有
用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。
[0620] 宿主细胞的选择和转化
[0621] 适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规规程。有用
哺乳动物宿主细胞系的例子有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾
系(293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen.Virol.36：59(1977))、
幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))、小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.
Reprod.23：243-251(1980))、猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，
ATCC CRL 1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、牛鼠
(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细
胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TRI细胞(Mather等，Annals
N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝瘤(hepatoma)系(Hep G2)。
哺乳动物宿主细胞系的例子有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾
系(293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen.Virol.36：59(1977))、
幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))、小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.
Reprod.23：243-251(1980))、猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，
ATCC CRL 1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、牛鼠
(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细
胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TRI细胞(Mather等，Annals
N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝瘤(hepatoma)系(Hep G2)。
[0622] 为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
[0623] 宿主细胞的培养
[0624] 可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改
良Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的
任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.
Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；
5,122,469；WO90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可根据需
要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯
化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如
TM
GENTAMYCIN 药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、
和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它补充物。培养
条件诸如温度、 pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然
的。
良Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的
任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.
Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；
5,122,469；WO90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可根据需
要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯
化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如
TM
GENTAMYCIN 药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、
和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它补充物。培养
条件诸如温度、 pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然
的。
[0625] 抗体的纯化
[0626] 在使用重组技术时，可以在细胞内生成抗体，或者直接分泌入培养基。如果在细胞内生成抗体，那么首先可以通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片
段。如果抗体分泌入培养基，那么可以首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或
Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。可以在任何上述步骤中
包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生
长。
段。如果抗体分泌入培养基，那么可以首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或
Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。可以在任何上述步骤中
包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生
长。
[0627] 可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(亲和层析是一种便利的技术)来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存
在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或
γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Methods62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所
有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质可
以是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙
烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用
TM
Bakerbond ABX 树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可
使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、
TM
肝素SEPHAROSE 上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层
析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或
γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Methods62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所
有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质可
以是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙
烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用
TM
Bakerbond ABX 树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可
使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、
TM
肝素SEPHAROSE 上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层
析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
[0628] 在任何初步纯化步骤之后，可以将含有感兴趣抗体和污染物的混合物进行进一步的纯化，例如低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度
(例如约0-0.25M盐)进行。
(例如约0-0.25M盐)进行。
[0629] 一般而言，用于制备供研究、测试和临床使用的抗体的各种方法是本领域已完善建立的，与上文所述方法是一致的和/或本领域技术人员认为对于特定的感兴趣抗体是适
宜的。
宜的。
[0630] 免疫偶联物
[0631] 本发明还提供了包含偶联有一种或多种细胞毒剂的本发明任何抗CD22 抗体的免疫偶联物(可互换的称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、
生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同
位素(即放射偶联物)。
生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同
位素(即放射偶联物)。
[0632] 在某些实施方案中，免疫偶联物包含抗CD22抗体和化疗剂或其它毒素。本文中(上文)描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。也可使用酶活性毒素及其片段，这些酶活
性毒素及其片段已在说明书中描述。
性毒素及其片段已在说明书中描述。
[0633] 在某些实施方案中，免疫偶联物包含抗CD22抗体和一种或多种小分子毒素，包括但不限于小分子药物，诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱
(maytansinoids)、多拉司他汀(dolastatin)、auristatin、单端孢霉素(trichothecene)
和CC1065及这些药物具有细胞毒活性的片段。此类免疫偶联物的例子在下文中有更为详
细的讨论。
(maytansinoids)、多拉司他汀(dolastatin)、auristatin、单端孢霉素(trichothecene)
和CC1065及这些药物具有细胞毒活性的片段。此类免疫偶联物的例子在下文中有更为详
细的讨论。
[0634] 1.例示性的免疫偶联物-抗体-药物偶联物
[0635] 本发明的免疫偶联物(或“抗体-药物偶联物”(“ADC”))可以是下文通式I，其中抗CD22抗体经任选的接头(L)与一个或多个药物模块(D)偶联(即共价附着)。
[0636] Ab-(L-D)p 通式I
[0637] 因而，抗CD22抗体可直接地或经接头地偶联至药物。在通式I中，p是每个抗体的平均药物模块数，其范围可以是例如每个抗体约1个到约20个药物模块，在某些实施方
案中是每个抗体1个到约8个药物模块。
案中是每个抗体1个到约8个药物模块。
[0638] 例示性的接头
[0639] 本文中披露了例示性的接头和药物模块。接头可以包含一种或多种接头构件。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬
氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基
(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马
来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”)、和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨
基苯甲酸酯(“SIAB”)。本领域知道多种接头构件，下文也描述了一些。
氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基
(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马
来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”)、和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨
基苯甲酸酯(“SIAB”)。本领域知道多种接头构件，下文也描述了一些。
[0640] 接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物
接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
[0641] 在有些实施方案中，接头构件可以包含将抗体连接至另一接头构件或药物模块的“延伸物单元”(stretcher unit)。例示性的延伸物单元显示于下文(其中波形线指示共价
附着至抗体的位点)：
附着至抗体的位点)：
[0642]
[0643] 在有些实施方案中，接头构件可以包含氨基酸单元。在一个这样的实施方案中，氨基酸单元容许蛋白酶切割接头，由此便于在暴露于胞内蛋白酶(诸如溶酶体酶)后从免疫
偶联物释放药物。参见例如Doronina等(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784。例示性的氨
基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽、和五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc
或val-cit)；丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；或
N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。例示性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸
(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可以包含天然存
在的氨基酸残基，以及次要氨基酸和非天然存在氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸单元可
以在它们对特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或血浆蛋白酶)的酶促切
割的选择性方面进行设计和优化。
偶联物释放药物。参见例如Doronina等(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784。例示性的氨
基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽、和五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc
或val-cit)；丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；或
N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。例示性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸
(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可以包含天然存
在的氨基酸残基，以及次要氨基酸和非天然存在氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸单元可
以在它们对特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或血浆蛋白酶)的酶促切
割的选择性方面进行设计和优化。
[0644] 在有些实施方案中，接头构件可以包含将抗体连接(或是直接的或是通 过延伸物单元和/或氨基酸单元)至药物模块的“间隔物”单元。间隔物单元可以是“自我牺牲
的”(self-immolative)或“非自我牺牲的”。“非自我牺牲的”间隔物单元指间隔物单元的
部分或整体在ADC的酶促(蛋白水解)切割后保持结合于药物模块的间隔物单元。非自我
牺牲的间隔物单元的例子包括但不限于甘氨酸间隔物单元和甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。
还涵盖对序列特异性酶促切割易感的肽间隔物的其它组合。例如，肿瘤细胞相关蛋白酶对
含甘氨酸-甘氨酸间隔物单元的ADC的酶促切割将导致甘氨酸-甘氨酸-药物模块从ADC
的剩余部分释放。在一个这样的实施方案中，甘氨酸-甘氨酸-药物模块然后在肿瘤细胞
中进行分开的水解步骤，如此从药物模块切割甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。
的”(self-immolative)或“非自我牺牲的”。“非自我牺牲的”间隔物单元指间隔物单元的
部分或整体在ADC的酶促(蛋白水解)切割后保持结合于药物模块的间隔物单元。非自我
牺牲的间隔物单元的例子包括但不限于甘氨酸间隔物单元和甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。
还涵盖对序列特异性酶促切割易感的肽间隔物的其它组合。例如，肿瘤细胞相关蛋白酶对
含甘氨酸-甘氨酸间隔物单元的ADC的酶促切割将导致甘氨酸-甘氨酸-药物模块从ADC
的剩余部分释放。在一个这样的实施方案中，甘氨酸-甘氨酸-药物模块然后在肿瘤细胞
中进行分开的水解步骤，如此从药物模块切割甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。
[0645] “自我牺牲的”间隔物单元容许释放药物模块而没有分开的水解步骤。在某些实施方案中，接头的间隔物单元包含对氨基苄基单元。在一个这样的实施方案中，将对氨基
苯甲醇经酰胺键附着至氨基酸单元，并且在苯甲醇与细胞毒剂之间生成氨基甲酸酯、甲基
氨基甲酸酯、或碳酸酯。参见例如Hamann等(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：
1087-1103。在一个实施方案中，间隔物单元是对氨基苄氧羰基(PAB)。在某些实施方案中，
对氨基苄基单元的亚苯基部分是用Qm取代的，其中Q是-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-卤
素、-硝基、或-氰基；而m是范围为0-4的整数。自我牺牲的间隔物单元的例子进一步包括
但不限于在电子上与对氨基苯甲醇相似的芳香族化合物(参见例如US 2005/0256030A1)，
诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)和邻位
或对位氨基苄基乙缩醛。可以使用在酰胺键水解后发生环化的间隔物，诸如取代的和未取
代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等，Chemistry Biology，1995，2，223)；适当取代的双环
[2.2.1]和双环[2.2.2]环体系(Storm，等，J.Amer.Chem.Soc.，1972，94，5815)；及2-氨基
苯基丙酸酰胺(Amsberry等，J.Org.Chem.，1990，55，5867)。消除在甘氨酸a位取代的含胺
药物(Kingsbury等，J.Med.Chem.，1984，27，1447)也是可用于ADC的自我牺牲的间隔物的
例子。
苯甲醇经酰胺键附着至氨基酸单元，并且在苯甲醇与细胞毒剂之间生成氨基甲酸酯、甲基
氨基甲酸酯、或碳酸酯。参见例如Hamann等(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：
1087-1103。在一个实施方案中，间隔物单元是对氨基苄氧羰基(PAB)。在某些实施方案中，
对氨基苄基单元的亚苯基部分是用Qm取代的，其中Q是-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-卤
素、-硝基、或-氰基；而m是范围为0-4的整数。自我牺牲的间隔物单元的例子进一步包括
但不限于在电子上与对氨基苯甲醇相似的芳香族化合物(参见例如US 2005/0256030A1)，
诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)和邻位
或对位氨基苄基乙缩醛。可以使用在酰胺键水解后发生环化的间隔物，诸如取代的和未取
代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等，Chemistry Biology，1995，2，223)；适当取代的双环
[2.2.1]和双环[2.2.2]环体系(Storm，等，J.Amer.Chem.Soc.，1972，94，5815)；及2-氨基
苯基丙酸酰胺(Amsberry等，J.Org.Chem.，1990，55，5867)。消除在甘氨酸a位取代的含胺
药物(Kingsbury等，J.Med.Chem.，1984，27，1447)也是可用于ADC的自我牺牲的间隔物的
例子。
[0646] 在一个实施方案中，间隔物单元是下文所示分支的双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)单元，其可用于掺入和释放多个药物。
[0647]
[0648] 其中Q是-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-卤素、硝基、或氰基；m是范围为0-4的整数；n是0或1；而p的范围是1到约20。
[0649] 接头可以包含任何一种或多种上述接头化合物。在某些实施方案中，接头在下述ADC通式II中显示在方括号内
[0650] Ab-([Aa-Ww-Yy]-D)p 通式II
[0651] 其中A是延伸物单元，而a是0到1的整数；W是氨基酸单元，而w是0到12的整数；Y是间隔物单元，而y是0、1、或2；且Ab、D、和p如上文通式I的定义。此类接头的例
示性实施方案记载于US 2005-0238649A1，明确收入本文作为参考。
示性实施方案记载于US 2005-0238649A1，明确收入本文作为参考。
[0652] 显示了下文通式II的ADC背景中的例示性接头构件及其组合：
[0653]
[0654]
[0655] 接头构件，包括延伸物、间隔物、和氨基酸单元，可以通过本领域已知方法合成，诸如US 2005-0238649A1中所记载的。
[0656] 例示性的药物模块
[0657] 美登素和美登木素生物碱
[0658] 在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的本发明抗体。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑
制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利
No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，诸如美登醇和C-3美登醇
酯(美国专利No.4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似
物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；
4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；
4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。
制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利
No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，诸如美登醇和C-3美登醇
酯(美国专利No.4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似
物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；
4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；
4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。
[0659] 美登木素生物碱药物模块在抗体-药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰或衍生化来制备；(ii)易于用适于通过
非二硫化物接头偶联至抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种
肿瘤细胞系。
非二硫化物接头偶联至抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种
肿瘤细胞系。
[0660] 适于用作美登木素生物碱药物模块的美登素化合物是本领域公知的，而 且可以依照已知方法从天然来源分离，或是使用遗传工程技术生产(参见Yu等(2002)PNAS 99：
7968-7973)。美登醇和美登醇类似物也可以依照已知方法合成制备。
7968-7973)。美登醇和美登醇类似物也可以依照已知方法合成制备。
[0661] 美登木素生物碱药物模块的例示性实施方案包括：DM1；DM3；和DM4，正如本文中所公开的。
[0662] Auristatin和多拉司他汀
[0663] 在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀(dolastatin)或多拉司他汀肽类似物或衍生物(例如auristatin)(美国专利No.5,635,483；5,780,588)偶联的本发
明抗体。多拉司他汀和auristatin已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂
(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(美
国专利No.5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：
2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或
C(羧基)末端附着于抗体(WO02/088172)。
明抗体。多拉司他汀和auristatin已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂
(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(美
国专利No.5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：
2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或
C(羧基)末端附着于抗体(WO02/088172)。
[0664] 例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块DE和DF，披露于 Senter等，Proceedings of the American Association for
CancerResearch，卷45，摘要号623，2004年3月28日，明确将其公开内容完整收入本文作
为参考。
CancerResearch，卷45，摘要号623，2004年3月28日，明确将其公开内容完整收入本文作
为参考。
[0665] 肽药物模块可以选自下文通式DE和DF：
[0666]
[0667] 其中DE和DF的波形线指示抗体或抗体-接头构件的共价附着位点，且每个位置是独立的
[0668] R2选自H和C1-C8烃基；
[0669] R3选自H、C1-C8烃基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烃基-芳基、C1-C8烃基-(C3-C8 碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
[0670] R4选自H、C1-C8烃基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烃基-芳基、C1-C8烃基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
[0671] R5选自H和甲基；
[0672] 或者R4与R5一起形成碳环且具有通式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb独立地选自H、C1-C8烃基和C3-C8碳环，而n选自2、3、4、5和6；
[0673] R6选自H和C1-C8烃基；
[0674] R7选自H、C1-C8烃基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烃基-芳基、C1-C8烃基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烃基-(C3-C8杂环)；
[0675] 每个R8独立地选自H、OH、C1-C8烃基、C3-C8碳环和O-(C1-C8烃基)；
[0676] R9选自H和C1-C8烃基；
[0677] R10选自芳基或C3-C8杂环；
[0678] Z为O、S、NH或NR12，其中R12为C1-C8烃基；
[0679] R11选自H、C1-C20烃基、芳基、C3-C8杂环、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；
[0680] m是范围为1-1000的整数；
[0681] R13为C2-C8烃基；
[0682] R14为H或C1-C8烃基；
[0683] R15每次出现独立为H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烃基；
[0684] R16每次出现独立为H、C1-C8烃基或-(CH2)n-COOH；
[0685] R18 选 自 -C(R8)2-C(R8)2- 芳 基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 杂 环 )8 8
和-C(R)2-C(R)2-(C3-C8碳环)；且
和-C(R)2-C(R)2-(C3-C8碳环)；且
[0686] n是范围为0到6的整数。
[0687] 在一个实施方案中，R3、R4和R7独立为异丙基或仲丁基，而R5为-H或甲基。在一3 4 5 7
个例示性的实施方案中，R 和R 各自为异丙基，R 为-H，而R 为仲丁基。
个例示性的实施方案中，R 和R 各自为异丙基，R 为-H，而R 为仲丁基。
[0688] 在又一个实施方案中，R2和R6各自为甲基，而R9为-H。
[0689] 在又一个实施方案中，R8每次出现为-OCH3。
[0690] 在一个例示性的实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R2和R6各自为甲基，R5为-H，7 8 9
R 为仲丁基，R 每次出现为-OCH3，而R 为-H。
R 为仲丁基，R 每次出现为-OCH3，而R 为-H。
[0691] 在一个实施方案中，Z为-O-或-NH-。
[0692] 在一个实施方案中，R10为芳基。
[0693] 在一个例示性的实施方案中，R10为-苯基。
[0694] 在一个例示性的实施方案中，若Z为-O-，则R11为-H、甲基或叔丁基。
[0695] 在一个实施方案中，若Z为-NH，则R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-N(R16)2，而16
R 为-C1-C8烃基或-(CH2)n-COOH。
R 为-C1-C8烃基或-(CH2)n-COOH。
[0696] 在另一个实施方案中，若Z为-NH，则R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-SO3H。
[0697] 通式DE的一种例示性auristatin实施方案是MMAE，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)：
[0698]
[0699] 通式DF的一种例示性auristatin实施方案是MMAF，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)(参见US 2005/0238649及Doronina等(2006)Bioconjugate
Chem.17：114-124)：
Chem.17：114-124)：
[0700]
[0701] 其它药物模块包括以下MMAF衍生物，其中波形线指示共价附着至抗体-药物偶联物的接头(L)：
[0702]
[0703]
[0704]11
[0705] 一方面，可以将亲水性基团在R 处附着于药物模块，所述亲水性基团包括但不限于三乙二醇酯(triethylene glycol ester，TEG)，如上所述。不限于任何特定理论，所述
亲水性基团有助于药物模块的内在化和不聚集(non-agglomeration)。
亲水性基团有助于药物模块的内在化和不聚集(non-agglomeration)。
[0706] 包含auristatin/多拉司他汀或其衍生物的通式I ADC的例示性实施方案记载于US 2005-0238649A1及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124，明确收入本文
作为参考。包含MMAE或MMAF及各种接头构件的通式I ADC的例示性实施方案具有如下结
构和缩写(其中“Ab”是抗体；p是1到约8；“Val-Cit”是缬氨酸-瓜氨酸二肽；而“S”是
硫原子)：
作为参考。包含MMAE或MMAF及各种接头构件的通式I ADC的例示性实施方案具有如下结
构和缩写(其中“Ab”是抗体；p是1到约8；“Val-Cit”是缬氨酸-瓜氨酸二肽；而“S”是
硫原子)：
[0707]
[0708]
[0709] 包含MMAF及各种接头构件的通式I ADC的例示性实施方案进一步包括Ab-MC-PAB-MMAF和Ab-PAB-MMAF。有趣的是，包含经不可蛋白水解切割的接头附着于抗体
的MMAF的免疫偶联物显示出具有与包含经可蛋白水解切割的接头附着于抗体的MMAF的免
疫偶联物相当的活性。参见Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124。在这种
情况中，认为药物释放是由细胞中的抗体降解来实现的。同上。
的MMAF的免疫偶联物显示出具有与包含经可蛋白水解切割的接头附着于抗体的MMAF的免
疫偶联物相当的活性。参见Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124。在这种
情况中，认为药物释放是由细胞中的抗体降解来实现的。同上。
[0710] 典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参
见E. 和K.Lübke，“The Peptides”，卷1，pp 76-136，1965，Academic Press)。
auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US 2005-0238649A1；
美国专利No.5635483；美国专利No.5780588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111：
5463-5465；Pettit 等 (1998)Anti-CancerDrug Design 13：243-277；Pettit，G.R. 等，
Synthesis，1996，719-725；Pettit等(1996)J.Chem，Soc.Perkin Trans.15：859-863；及
Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：778-784。
见E. 和K.Lübke，“The Peptides”，卷1，pp 76-136，1965，Academic Press)。
auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US 2005-0238649A1；
美国专利No.5635483；美国专利No.5780588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111：
5463-5465；Pettit 等 (1998)Anti-CancerDrug Design 13：243-277；Pettit，G.R. 等，
Synthesis，1996，719-725；Pettit等(1996)J.Chem，Soc.Perkin Trans.15：859-863；及
Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：778-784。
[0711] 具体而言，通式DF的auristatin/多拉司他汀药物模块诸如MMAF及其衍生物可以使用US 2005-0238649A1及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124中记载的
方法来制备。通式DE的auristatin/多拉司他汀药物模块诸如MMAE及其衍生物可以使用
Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784中记载的方法来制备。可以通过常规方法方
便地合成药物-接头模块MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF、和MC-vc-PAB-MMAE，例 如
Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784及美国专利申请公开号US2005/0238649A1
中所记载的，然后将它们偶联至感兴趣的抗体。
方法来制备。通式DE的auristatin/多拉司他汀药物模块诸如MMAE及其衍生物可以使用
Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784中记载的方法来制备。可以通过常规方法方
便地合成药物-接头模块MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF、和MC-vc-PAB-MMAE，例 如
Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784及美国专利申请公开号US2005/0238649A1
中所记载的，然后将它们偶联至感兴趣的抗体。
[0712] 药物载荷
[0713] 药物载荷(loading)由p表示，即通式I的分子中每个抗体的平均药物模块数。药物载荷的范围可以为每个抗体1-20个药物模块(D)。通式I的ADC包括偶联有一定范围
(1-20个)药物模块的抗体的集合。来自偶联反应的ADC制备物中每个抗体的平均药物模
块数可以通过常规手段来表征，诸如质谱、ELISA测定法、和HPLC。还可以测定ADC在p方
面的定量分布。在有些情况中，将p为某数值的同质ADC从具有其它药物载荷的ADC中分
离、纯化、和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳的手段来实现。
(1-20个)药物模块的抗体的集合。来自偶联反应的ADC制备物中每个抗体的平均药物模
块数可以通过常规手段来表征，诸如质谱、ELISA测定法、和HPLC。还可以测定ADC在p方
面的定量分布。在有些情况中，将p为某数值的同质ADC从具有其它药物载荷的ADC中分
离、纯化、和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳的手段来实现。
[0714] 对于有些抗体-药物偶联物，p可能受到抗体上附着位点数目的限制。例如，若附着是半胱氨酸硫醇，正如上文例示性实施方案中的那样，则抗体可能只有一个或数个半胱
氨酸硫醇基，或者可能只有一个或数个有足够反应性的硫醇基，可附着接头。在某些实施方
案中，较高的药物载荷，例如p＞5，可引起某些抗体-药物偶联物的聚集、不溶性、毒性、或
丧失细胞通透性。在某些实施方案中，本发明ADC的药物载荷的范围为1到约8；约2到约
6；约3到约5；约3到约4；约3.1到约3.9；约3.2到约3.8；约3.2到约3.7；约3.2到约
3.6；约3.3到约3.8；或约3.3到约3.7。事实上，对于某些ADC已经显示了每个抗体药物
模块的最佳比率可以为小于8，可以为约2到约5。参见US2005-0238649A1(完整收入本文
作为参考)。
氨酸硫醇基，或者可能只有一个或数个有足够反应性的硫醇基，可附着接头。在某些实施方
案中，较高的药物载荷，例如p＞5，可引起某些抗体-药物偶联物的聚集、不溶性、毒性、或
丧失细胞通透性。在某些实施方案中，本发明ADC的药物载荷的范围为1到约8；约2到约
6；约3到约5；约3到约4；约3.1到约3.9；约3.2到约3.8；约3.2到约3.7；约3.2到约
3.6；约3.3到约3.8；或约3.3到约3.7。事实上，对于某些ADC已经显示了每个抗体药物
模块的最佳比率可以为小于8，可以为约2到约5。参见US2005-0238649A1(完整收入本文
作为参考)。
[0715] 在某些实施方案中，在偶联反应中将少于理论最大值的药物模块偶联至抗体。抗体可包含例如赖氨酸残基，其不与药物-接头中间物或接头试剂起反应，如下文所讨论的。
只有最具反应性的赖氨酸基团可以与胺反应性接头试剂起反应。一般而言，抗体不包含许
多游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基，其可连接药物模块；事实上，抗体中的大多数半胱氨
酸硫醇基以二硫桥形式存在。在某些实施方案中，可以在部分或完全还原性条件下用还原
剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还原抗体以产生反应性半胱氨酸硫醇基。
在某些实施方案中，将抗体置于变性条件以暴露反应性亲核基团，诸如赖氨酸或半胱氨酸。
只有最具反应性的赖氨酸基团可以与胺反应性接头试剂起反应。一般而言，抗体不包含许
多游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基，其可连接药物模块；事实上，抗体中的大多数半胱氨
酸硫醇基以二硫桥形式存在。在某些实施方案中，可以在部分或完全还原性条件下用还原
剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还原抗体以产生反应性半胱氨酸硫醇基。
在某些实施方案中，将抗体置于变性条件以暴露反应性亲核基团，诸如赖氨酸或半胱氨酸。
[0716] ADC的载荷(药物/抗体比率)可以以不同方式来控制，例如通过：(i)限制药物-接头中间物或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制偶联反应的 时间或温度，
(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原性条件，(iv)通过重组技术对抗体的氨基酸序
列进行工程改造，使得半胱氨酸残基的数目和位置为了控制接头-药物附着的数目和/或
位置而进行改变(诸如如本文中和WO2006/034488(完整收入本文作为参考)中所述而制
备的thioMab或thioFab)。
(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原性条件，(iv)通过重组技术对抗体的氨基酸序
列进行工程改造，使得半胱氨酸残基的数目和位置为了控制接头-药物附着的数目和/或
位置而进行改变(诸如如本文中和WO2006/034488(完整收入本文作为参考)中所述而制
备的thioMab或thioFab)。
[0717] 应当理解，若超过一个亲核基团与药物-接头中间物或者与接头试剂和接下来的药物模块试剂起反应，则所得产物是具有一个或多个药物模块附着于抗体之分布的ADC
化合物混合物。可以通过对抗体特异性的和对药物特异性的双重ELISA抗体测定法自混
合物计算每个抗体的平均药物数。混合物中的各种ADC分子可以通过质谱来鉴定，并通
过HPLC来分离，例如疏水相互作用层析(参见例如Hamblett，K.J.等，“Effect of drug
loading on thepharmacology，pharmacokinetics，and toxicity of an anti-CD30 anti
body-drugconjugate，”Abstract No.624，American Association for Cancer Research，
2004Annual Meeting，March 27-31，2004，Proceedings of the AACR，卷45，March2004；
Alley，S.C. 等，“Controlling the location of drug attachment inantibody-drug
conjugates，”Abstract No.627，American Association for CancerResearch，2004
Annual Meeting，March 27-31，2004，Proceedings of the AACR，卷45，March 2004)。在
某些实施方案中，可以通过电泳或层析从偶联混合物中分离具有单一载荷值的同质ADC。
化合物混合物。可以通过对抗体特异性的和对药物特异性的双重ELISA抗体测定法自混
合物计算每个抗体的平均药物数。混合物中的各种ADC分子可以通过质谱来鉴定，并通
过HPLC来分离，例如疏水相互作用层析(参见例如Hamblett，K.J.等，“Effect of drug
loading on thepharmacology，pharmacokinetics，and toxicity of an anti-CD30 anti
body-drugconjugate，”Abstract No.624，American Association for Cancer Research，
2004Annual Meeting，March 27-31，2004，Proceedings of the AACR，卷45，March2004；
Alley，S.C. 等，“Controlling the location of drug attachment inantibody-drug
conjugates，”Abstract No.627，American Association for CancerResearch，2004
Annual Meeting，March 27-31，2004，Proceedings of the AACR，卷45，March 2004)。在
某些实施方案中，可以通过电泳或层析从偶联混合物中分离具有单一载荷值的同质ADC。
[0718] 制备免疫偶联物的某些方法
[0719] 可以采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成Ab-L，接着
与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成D-L，
接着与抗体的亲核基团反应。经后一种路径制备通式I的ADC的例示性方法记载于US
2005-0238649A1，明确收入本文作为参考。
与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成D-L，
接着与抗体的亲核基团反应。经后一种路径制备通式I的ADC的例示性方法记载于US
2005-0238649A1，明确收入本文作为参考。
[0720] 抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。胺、硫醇、和羟
基是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活
性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤
代乙酰胺；(iii)醛、 酮、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫化物，
即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)处理使抗体
完全或部分还原，从而具有与接头试剂偶联的反应性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个
反应性硫醇亲核体。或者，可经由赖氨酸残基的修饰将硫氢基引入抗体，例如通过使赖氨酸
残基与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)起反应，导致胺转变为硫醇。可以通过导入一个、两
个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨
基酸残基的变体抗体)而将反应性硫醇基导入抗体。
基是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活
性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤
代乙酰胺；(iii)醛、 酮、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫化物，
即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)处理使抗体
完全或部分还原，从而具有与接头试剂偶联的反应性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个
反应性硫醇亲核体。或者，可经由赖氨酸残基的修饰将硫氢基引入抗体，例如通过使赖氨酸
残基与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)起反应，导致胺转变为硫醇。可以通过导入一个、两
个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨
基酸残基的变体抗体)而将反应性硫醇基导入抗体。
[0721] 还可通过抗体上的亲电子基团(诸如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上的亲核基团之间的反应来生成本发明的抗体-药物偶联物。接头试剂上的有用亲核基
团包括但不限于酰肼(hydrazide)、肟(oxime)、氨基(amino)、肼(hydrazine)、缩
氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯(hydrazine carboxylate)、和芳基酰肼
(arylhydrazide)。在一个实施方案中，修饰抗体以导入能够与接头试剂或药物上的亲核
取代基起反应的亲电子模块。在另一个实施方案中，可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖
基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚
胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连
接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的
反应可以在抗体中生成羰基(醛基和酮基)，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，
Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的
抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan和Stroh，(1992)
Bioconjugate Chem.3：138-146；US 5362852)。这样的醛可与药物模块或接头亲核体反应。
团包括但不限于酰肼(hydrazide)、肟(oxime)、氨基(amino)、肼(hydrazine)、缩
氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯(hydrazine carboxylate)、和芳基酰肼
(arylhydrazide)。在一个实施方案中，修饰抗体以导入能够与接头试剂或药物上的亲核
取代基起反应的亲电子模块。在另一个实施方案中，可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖
基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚
胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连
接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的
反应可以在抗体中生成羰基(醛基和酮基)，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，
Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的
抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan和Stroh，(1992)
Bioconjugate Chem.3：138-146；US 5362852)。这样的醛可与药物模块或接头亲核体反应。
[0722] 药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接
头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和
苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基、和马来酰亚胺基团。
头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和
苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基、和马来酰亚胺基团。
[0723] 本发明的化合物明确涵盖但不限于用如下交联试剂制备的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、
sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、 sulfo-SIAB、sulfo-SMCC 和 sulfo-SMPB、 及
SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们可通过商业途径获得(例如Pierce
Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A；参见2003-2004年度应用手册和产品目录
(2003-2004Applications Handbook and Catalog)第467-498页)。
sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、 sulfo-SIAB、sulfo-SMCC 和 sulfo-SMPB、 及
SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们可通过商业途径获得(例如Pierce
Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A；参见2003-2004年度应用手册和产品目录
(2003-2004Applications Handbook and Catalog)第467-498页)。
[0724] 还可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备包含抗体和细胞毒剂的免疫偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨
基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二
甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸
如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二
胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，
4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所
述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙
酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。
基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二
甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸
如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二
胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，
4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所
述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙
酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。
[0725] 或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。重组DNA分子可以包含各自编码偶联物的抗体和细胞毒部分的区域，彼此或是毗邻或是由编
码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
[0726] 在又一个实施方案中，可以将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的
偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。
偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。
[0727] 2.例示性的偶联物-硫醇抗体-药物偶联物
[0728] 半胱氨酸改造抗CD22抗体的制备
[0729] 可通过多种方法制备编码本发明的亲本抗CD22抗体和半胱氨酸改造抗CD22抗体的氨基酸序列变体的DNA，包括但不限于自天然来源分离(在天然存在的氨基酸序
列变体的情况中)、通过定点诱变(或寡核苷酸介导的诱变)(Carter等(1985)Nucleic
Acids Res.13：4431-4443；Ho 等 (1989)Gene(Amst.)77：51-59；Kunkel 等 (1987)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 82：488；Liu 等 (1998)J.Biol.Chem.273：20252-20260)、PCR 诱
变 (Higuchi，(1990) 于 PCR Protocols，pp.177-183，Academic Press；Ito 等 (1991)
Gene 102：67-70；Bernhard 等 (1994)Bioconjugate Chem.5：126-132；及 Vallette 等
(1989)Nuc.Acids Res.17：723-733)和对较早制备的编码多肽的DNA的盒式诱变(Wells
等(1985)Gene 34：315-323)来制备。诱变方案、试剂盒和试剂可通过商业途径获得，
例如 多重定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)。还可以使用
双链质粒DNA作为模板通过基于PCR的诱变通过寡核苷酸介导的诱变来生成单一诱变
(Sambrook和Russel，(2001)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第3版；Zoller
等 (1983)Methods Enzymol.100：468-500；Zoller，M.J. 和 Smith，M.(1982)Nucl.Acids
Res.10：6487-6500)。还可以通过限制性片段操作或通过使用合成寡核苷酸的交叠延
伸PCR构建重组抗体的变体。诱变引物编码半胱氨酸密码子替换物。标准诱变技术可以
用于产生编码此类突变型半胱氨酸改造抗体的DNA(Sambrook等，Molecular Cloning，A
LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，
1989；及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing
andWiley-Interscience，New York，N.Y.，1993)。
列变体的情况中)、通过定点诱变(或寡核苷酸介导的诱变)(Carter等(1985)Nucleic
Acids Res.13：4431-4443；Ho 等 (1989)Gene(Amst.)77：51-59；Kunkel 等 (1987)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 82：488；Liu 等 (1998)J.Biol.Chem.273：20252-20260)、PCR 诱
变 (Higuchi，(1990) 于 PCR Protocols，pp.177-183，Academic Press；Ito 等 (1991)
Gene 102：67-70；Bernhard 等 (1994)Bioconjugate Chem.5：126-132；及 Vallette 等
(1989)Nuc.Acids Res.17：723-733)和对较早制备的编码多肽的DNA的盒式诱变(Wells
等(1985)Gene 34：315-323)来制备。诱变方案、试剂盒和试剂可通过商业途径获得，
例如 多重定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)。还可以使用
双链质粒DNA作为模板通过基于PCR的诱变通过寡核苷酸介导的诱变来生成单一诱变
(Sambrook和Russel，(2001)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第3版；Zoller
等 (1983)Methods Enzymol.100：468-500；Zoller，M.J. 和 Smith，M.(1982)Nucl.Acids
Res.10：6487-6500)。还可以通过限制性片段操作或通过使用合成寡核苷酸的交叠延
伸PCR构建重组抗体的变体。诱变引物编码半胱氨酸密码子替换物。标准诱变技术可以
用于产生编码此类突变型半胱氨酸改造抗体的DNA(Sambrook等，Molecular Cloning，A
LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，
1989；及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing
andWiley-Interscience，New York，N.Y.，1993)。
[0730] 噬菌体展示技术(McCafferty等，(1990)Nature 348：552-553)可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变域(V)基因全集生成抗CD22人抗体和抗体片段。依照
这种技术，将抗体可变域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体诸如M13或fd的主
要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体
颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码
展示那些特性的抗体的基因得到选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性(Johnson等
(1993)Current Opinion in Structural Biology 3：564-571；Clackson等(1991)Nature，
352：624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；Griffith等(1993)EMBO J.12：
725-734；US 5565332；US 5573905；US 5567610；US 5229275)。
这种技术，将抗体可变域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体诸如M13或fd的主
要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体
颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码
展示那些特性的抗体的基因得到选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性(Johnson等
(1993)Current Opinion in Structural Biology 3：564-571；Clackson等(1991)Nature，
352：624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；Griffith等(1993)EMBO J.12：
725-734；US 5565332；US 5573905；US 5567610；US 5229275)。
[0731] 抗CD22抗体可以使用已知的寡肽合成方法来化学合成，或者可以使用重组技术来制备和纯化。适宜的氨基酸序列或其部分可以使用固相技术通过直接肽合成来生成
(Stewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis，(1969)W.H.Freeman Co.，San Francisco，
CA；Merrifield，(1963)J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154)。体外蛋白质合成可以使用手动
技术或通过自动化来进行。自动化固相合成可以例如采用受t-BOC或Fmoc保护的氨基酸
并使用Applied Biosystems肽合成仪(Foster City，CA)依照制造商的说明书来进行。抗
CD22抗体或CD22多肽的各个部分可以分开地化学合成，并使用化学或酶促方法联合以生
成期望的抗CD22抗体或CD22多肽。
(Stewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis，(1969)W.H.Freeman Co.，San Francisco，
CA；Merrifield，(1963)J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154)。体外蛋白质合成可以使用手动
技术或通过自动化来进行。自动化固相合成可以例如采用受t-BOC或Fmoc保护的氨基酸
并使用Applied Biosystems肽合成仪(Foster City，CA)依照制造商的说明书来进行。抗
CD22抗体或CD22多肽的各个部分可以分开地化学合成，并使用化学或酶促方法联合以生
成期望的抗CD22抗体或CD22多肽。
[0732] 已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(Morimoto等(1992)Journal of Biochemical andBiophysical Methods
24：107-117；及Brennan等(1985)Science，229：81)，或者直接由重组宿主细胞生成这些
片段。Fab、Fv和scFv抗CD22抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容
许容易的生成大量的这些片段。可以从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可
以直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等(1992)
Bio/Technology 10：163-167)，或者，直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。抗
CD22抗体可以是单链Fv片段(scFv)(WO 93/16185；US 5571894；US5587458)。抗CD22抗
体片段还可以是“线性抗体”(US 5,641,870)。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双
特异性的。
24：107-117；及Brennan等(1985)Science，229：81)，或者直接由重组宿主细胞生成这些
片段。Fab、Fv和scFv抗CD22抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容
许容易的生成大量的这些片段。可以从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可
以直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等(1992)
Bio/Technology 10：163-167)，或者，直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。抗
CD22抗体可以是单链Fv片段(scFv)(WO 93/16185；US 5571894；US5587458)。抗CD22抗
体片段还可以是“线性抗体”(US 5,641,870)。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双
特异性的。
[0733] 下文描述主要涉及通过培养经包含抗CD22抗体编码核酸的载体转化或转染的细胞来生成抗CD22抗体。编码抗CD22抗体的DNA可以得自自认为具有抗CD22抗体mRNA且
以可检测水平表达之的组织制备的cDNA文库。因而，人抗CD22抗体或CD22多肽DNA可以
方便地得自自人组织制备地cDNA文库。抗CD22抗体编码基因还可以得自基因组文库或已
知的合成规程(例如自动化核酸合成)。
以可检测水平表达之的组织制备的cDNA文库。因而，人抗CD22抗体或CD22多肽DNA可以
方便地得自自人组织制备地cDNA文库。抗CD22抗体编码基因还可以得自基因组文库或已
知的合成规程(例如自动化核酸合成)。
[0734] 本发明的设计、选择和制备方法能够得到具有亲电子官能度反应性的半胱氨酸改造抗CD22抗体。这些方法进一步能够获得抗体偶联物化合物，诸如在指定的、设计的、选择
性的位点上具有药物分子的抗体-药物偶联物(ADC)化合物。抗体表面上的反应性半胱氨
酸残基容许通过硫醇反应性基团，诸如马来酰亚胺或卤代乙酰基特异性地偶联药物模块。
Cys残基的硫醇官能度与马来酰亚胺基团的亲核反应性高于蛋白质中任何其它氨基酸官能
度，诸如赖氨酸残基的氨基或N-末端氨基约1000倍。碘乙酰和马来酰亚胺试剂中的硫醇
特异性官能度可以与胺基团反应，但需要更高的pH(＞9.0)和更长的反应时间(Garman，
1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach，AcademicPress，London)。可
以通过标准Ellman测定法来估计蛋白质中游离硫醇的量。免疫球蛋白M为二硫化物连接
的五聚体的例子，而免疫球蛋白G为内部二硫 桥将各亚基键合在一起的蛋白质的例子。在
诸如这种蛋白质中，用诸如二硫苏糖醇(DTT)或硒醇还原二硫键(Singh等(2002)Anal.
Biochem.304：147-156)是产生反应性游离硫醇所需的。这种方法可以导致抗体的三级结
构和抗原结合特异性丧失。
性的位点上具有药物分子的抗体-药物偶联物(ADC)化合物。抗体表面上的反应性半胱氨
酸残基容许通过硫醇反应性基团，诸如马来酰亚胺或卤代乙酰基特异性地偶联药物模块。
Cys残基的硫醇官能度与马来酰亚胺基团的亲核反应性高于蛋白质中任何其它氨基酸官能
度，诸如赖氨酸残基的氨基或N-末端氨基约1000倍。碘乙酰和马来酰亚胺试剂中的硫醇
特异性官能度可以与胺基团反应，但需要更高的pH(＞9.0)和更长的反应时间(Garman，
1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach，AcademicPress，London)。可
以通过标准Ellman测定法来估计蛋白质中游离硫醇的量。免疫球蛋白M为二硫化物连接
的五聚体的例子，而免疫球蛋白G为内部二硫 桥将各亚基键合在一起的蛋白质的例子。在
诸如这种蛋白质中，用诸如二硫苏糖醇(DTT)或硒醇还原二硫键(Singh等(2002)Anal.
Biochem.304：147-156)是产生反应性游离硫醇所需的。这种方法可以导致抗体的三级结
构和抗原结合特异性丧失。
[0735] PHESELECTOR(用于选择反应性硫醇的噬菌体ELISA)测定法任选以ELISA噬菌体形式检测抗体中反应性半胱氨酸基团，由此辅助半胱氨酸改造抗体的设计(WO
2006/034488)。在孔表面上包被半胱氨酸改造抗体，随后与噬菌体颗粒一起温育，添加HRP
标记的二抗，并检测吸光度。可以以快速、有力和高流通量方式筛选噬菌体上展示的突变蛋
白。可以使用与从抗体或其它蛋白的随机蛋白质-噬菌体文库鉴定游离Cys掺入的适当反
应性位点相同的方法生成半胱氨酸改造抗体的文库并且进行结合选择。这项技术包括使噬
菌体上展示的半胱氨酸突变蛋白与也为硫醇反应性的亲和试剂或报告基团反应。
2006/034488)。在孔表面上包被半胱氨酸改造抗体，随后与噬菌体颗粒一起温育，添加HRP
标记的二抗，并检测吸光度。可以以快速、有力和高流通量方式筛选噬菌体上展示的突变蛋
白。可以使用与从抗体或其它蛋白的随机蛋白质-噬菌体文库鉴定游离Cys掺入的适当反
应性位点相同的方法生成半胱氨酸改造抗体的文库并且进行结合选择。这项技术包括使噬
菌体上展示的半胱氨酸突变蛋白与也为硫醇反应性的亲和试剂或报告基团反应。
[0736] PHESELECTOR测定法任选筛选抗体中的反应性硫醇基团。通过该方法鉴定A121C变体是例示性的。可以高效地搜索整个Fab分子以鉴定更多的带有反应性硫醇基团的
ThioFab变体。采用参数，表面可及分数(fractional surfaceaccessibility)来鉴定和定
量溶剂与多肽中的氨基酸残基的可及性。将表面可及性表述为可以由溶剂分子，例如水接
触的表面积( )。水占据的空间近似为1.4 半径球体。软件为自由可获得的或可许可
的(Secretary to CCP4，Daresbury Laboratory，Warrington，WA4 4AD，United Kingdom，
Fax：(+44)1925603825，或通过因特网：www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html)，如使用
计算具有已知X射线晶体学衍生坐标的蛋白质的每个氨基酸的表面可及性的算法的晶体
学程序CCP4 Suite(“The CCP4 Suite：Programs for ProteinCrystallography”(1994)
Acta.Cryst.D50：760-763)。执行表面可及性计算的两种例示性软件模块为“AREAIMOL”
和“SURFACE”，其基于B.Lee和F.M.Richards(1971)J.Mol.Biol.55：379-400的算法。
AREAIMOL将蛋白质的溶剂可及表面定义为探针球(probe sphere)(代表溶剂分子)在蛋白
质的Van derWaals表面上翻转时其中心的位置。AREAIMOL如下计算溶剂可及表面积，即
在关于每个原子的扩充球体上产生表面点(距原子中心的距离等于原子和探针半径的总
和)，并且消除那些属于位于与相邻原子相关的等同球体内的点。AREAIMOL找到了PDB坐
标文件中原子的溶剂可及面积并概括了残基、 链和整个分子的可及面积。可以将各原子的
可及面积(或面积差)存储成假拟-PDB输出文件。AREAIMOL假设了每个成分的单一半径
并仅识别有限数量的不同成分。
ThioFab变体。采用参数，表面可及分数(fractional surfaceaccessibility)来鉴定和定
量溶剂与多肽中的氨基酸残基的可及性。将表面可及性表述为可以由溶剂分子，例如水接
触的表面积( )。水占据的空间近似为1.4 半径球体。软件为自由可获得的或可许可
的(Secretary to CCP4，Daresbury Laboratory，Warrington，WA4 4AD，United Kingdom，
Fax：(+44)1925603825，或通过因特网：www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html)，如使用
计算具有已知X射线晶体学衍生坐标的蛋白质的每个氨基酸的表面可及性的算法的晶体
学程序CCP4 Suite(“The CCP4 Suite：Programs for ProteinCrystallography”(1994)
Acta.Cryst.D50：760-763)。执行表面可及性计算的两种例示性软件模块为“AREAIMOL”
和“SURFACE”，其基于B.Lee和F.M.Richards(1971)J.Mol.Biol.55：379-400的算法。
AREAIMOL将蛋白质的溶剂可及表面定义为探针球(probe sphere)(代表溶剂分子)在蛋白
质的Van derWaals表面上翻转时其中心的位置。AREAIMOL如下计算溶剂可及表面积，即
在关于每个原子的扩充球体上产生表面点(距原子中心的距离等于原子和探针半径的总
和)，并且消除那些属于位于与相邻原子相关的等同球体内的点。AREAIMOL找到了PDB坐
标文件中原子的溶剂可及面积并概括了残基、 链和整个分子的可及面积。可以将各原子的
可及面积(或面积差)存储成假拟-PDB输出文件。AREAIMOL假设了每个成分的单一半径
并仅识别有限数量的不同成分。
[0737] AREAIMOL和SURFACE报导了绝对可及性，即平方埃 数。通过参比多肽内氨基酸相关标准状态来计算表面可及分数。参比状态为三肽Gly-X-Gly，其中X为感兴趣的氨基
酸，且参比状态应为“扩展的”构象，即像那些在β链中的构象。扩展的构象使X的可及性
达到最大值。用计算的可及面积除以Gly-X-Gly三肽参比状态中的可及面积并报告商数，
其为可及性分数。可及性百分比为可及性分数乘以100。计算表面可及性的另一种例示性
算法基于程序xsae的SOLV模块(Broger，C.，F.Hoffman-LaRoche，Basel)，它基于多肽的
X射线坐标计算氨基酸残基与水球体的可及性分数。可以使用可得到的晶体结构信息来计
算抗体中每个氨基酸的表面可及性分数(Eigenbrot等(1993)J Mol Biol.229：969-995)。
酸，且参比状态应为“扩展的”构象，即像那些在β链中的构象。扩展的构象使X的可及性
达到最大值。用计算的可及面积除以Gly-X-Gly三肽参比状态中的可及面积并报告商数，
其为可及性分数。可及性百分比为可及性分数乘以100。计算表面可及性的另一种例示性
算法基于程序xsae的SOLV模块(Broger，C.，F.Hoffman-LaRoche，Basel)，它基于多肽的
X射线坐标计算氨基酸残基与水球体的可及性分数。可以使用可得到的晶体结构信息来计
算抗体中每个氨基酸的表面可及性分数(Eigenbrot等(1993)J Mol Biol.229：969-995)。
[0738] 编码半胱氨酸改造抗体的DNA易于使用常规规程来分离和测序(例如通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当此类
DNA的来源。一旦分离，可以将DNA置入表达载体，然后转染入原本不生成抗体蛋白的宿主
细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或其它哺乳动物宿主细
胞，诸如骨髓瘤细胞(US 5807715；US 2005/0048572；US 2004/0229310)，以获得单克隆抗
体在重组宿主细胞中的合成。
DNA的来源。一旦分离，可以将DNA置入表达载体，然后转染入原本不生成抗体蛋白的宿主
细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或其它哺乳动物宿主细
胞，诸如骨髓瘤细胞(US 5807715；US 2005/0048572；US 2004/0229310)，以获得单克隆抗
体在重组宿主细胞中的合成。
[0739] 在设计和选择后，可如下生成具有改造的、高度反应性的未配对的Cys残基的半胱氨酸改造抗体，例如ThioFab：(i)在细菌例如大肠杆菌系统(Skerra等(1993)Curr.
Opinion in Immunol.5：256-262；Plückthun(1992)Immunol.Revs.130：151-188)或哺乳
动物细胞培养物系统(WO 01/00245)例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达；和(ii)使用常
用的蛋白质纯化技术纯化(Lowman等(1991)J.Biol.Chem.266(17)：10982-10988)。
Opinion in Immunol.5：256-262；Plückthun(1992)Immunol.Revs.130：151-188)或哺乳
动物细胞培养物系统(WO 01/00245)例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达；和(ii)使用常
用的蛋白质纯化技术纯化(Lowman等(1991)J.Biol.Chem.266(17)：10982-10988)。
[0740] 改造的Cys硫醇基团与亲电子的接头试剂和药物-接头中间体起反应而形成半胱氨酸改造抗体-药物偶联物和其它经标记的半胱氨酸改造抗体。半胱氨酸改造抗体的和
存在于亲本抗体中的、配对并形成链间和链内二硫键的Cys残基不具有任何反应性硫醇基
团(除非用还原剂处理)且不与亲电子的接头试剂或药物-接头中间体起反应。新近改造
的Cys残基可以保持不配对， 而且能够与亲电子的接头试剂或药物-接头中间体(诸如药
物-马来酰亚胺)起反应(即偶联)。例示性的药物-接头中间体包括：MC-MMAE、MC-MMAF、
MC-vc-PAB-MMAE、和MC-vc-PAB-MMAF。重链和轻链中经改造的Cys残基的结构位置依照连
续编号系统来编号。此连续编号系统与自N末端起始的Kabat编号系统(Kabat等(1991)
Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，
National Institutes of Health，Bethesda，MD)有关，与Kabat编号方案(底行)的区别
在于标示为a、b、c的插入。使用Kabat编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含更多或更
少的氨基酸，对应于可变域FR或CDR中的缩短或插入。经半胱氨酸改造的重链变体位点通
过连续编号方式和Kabat编号方案来标示。
存在于亲本抗体中的、配对并形成链间和链内二硫键的Cys残基不具有任何反应性硫醇基
团(除非用还原剂处理)且不与亲电子的接头试剂或药物-接头中间体起反应。新近改造
的Cys残基可以保持不配对， 而且能够与亲电子的接头试剂或药物-接头中间体(诸如药
物-马来酰亚胺)起反应(即偶联)。例示性的药物-接头中间体包括：MC-MMAE、MC-MMAF、
MC-vc-PAB-MMAE、和MC-vc-PAB-MMAF。重链和轻链中经改造的Cys残基的结构位置依照连
续编号系统来编号。此连续编号系统与自N末端起始的Kabat编号系统(Kabat等(1991)
Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，
National Institutes of Health，Bethesda，MD)有关，与Kabat编号方案(底行)的区别
在于标示为a、b、c的插入。使用Kabat编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含更多或更
少的氨基酸，对应于可变域FR或CDR中的缩短或插入。经半胱氨酸改造的重链变体位点通
过连续编号方式和Kabat编号方案来标示。
[0741] 在一个实施方案中，通过包括下列步骤的方法来制备半胱氨酸改造抗CD22抗体：
[0742] (a)用半胱氨酸替换亲本抗CD22抗体的一个或多个氨基酸残基；并
[0743] (b)通过使半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性试剂起反应来测定半胱氨酸改造抗CD22抗体的硫醇反应性。
[0744] 半胱氨酸改造抗体可以比亲代抗体更具与硫醇反应性试剂的反应性。
[0745] 游离半胱氨酸氨基酸残基可以位于重链或轻链中或者恒定域或可变域中。还可以通过用一个或多个半胱氨酸氨基酸替换抗体片段的氨基酸来改造抗体片段，例如Fab，以形
成半胱氨酸改造抗体片段。
成半胱氨酸改造抗体片段。
[0746] 本发明的另一个实施方案提供了制备(生成)半胱氨酸改造抗CD22抗体的方法，包括：
[0747] (a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸引入亲本抗CD22抗体以生成半胱氨酸改造抗CD22抗体；并
[0748] (b)测定半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性试剂的硫醇反应性；
[0749] 其中半胱氨酸改造抗体比亲代抗体更具与硫醇反应性试剂的反应性。
[0750] 制备半胱氨酸改造抗体的方法的步骤(a)可以包括：
[0751] (i)诱变编码半胱氨酸改造抗体的核酸序列；
[0752] (ii)表达半胱氨酸改造抗体；和
[0753] (iii)分离和纯化半胱氨酸改造抗体。
[0754] 制备半胱氨酸改造抗体的方法的步骤(b)可以包括在选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上表达半胱氨酸改造抗体。
[0755] 制备半胱氨酸改造抗体的方法的步骤(b)还可以包括：
[0756] (i)使半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性亲和试剂反应以生成亲和标记的半胱氨酸改造抗体；和
[0757] (ii)测量亲和标记的半胱氨酸改造抗体与俘获介质的结合。
[0758] 本发明的另一个实施方案是对带有高反应性的未配对的半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造抗体筛选硫醇反应性的方法，包括：
[0759] (a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸引入亲本抗体以生成半胱氨酸改造抗体；
[0760] (b)使半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性亲和试剂反应以生成亲和标记的半胱氨酸改造抗体；和
[0761] (c)测量亲和标记的半胱氨酸改造抗体与俘获介质的结合；和
[0762] (d)测定半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性试剂的硫醇反应性。
[0763] 筛选半胱氨酸改造抗体的方法的步骤(a)可以包括：
[0764] (i)诱变编码半胱氨酸改造抗体的核酸序列；
[0765] (ii)表达半胱氨酸改造抗体；和
[0766] (iii)分离和纯化半胱氨酸改造抗体。
[0767] 筛选半胱氨酸改造抗体的方法的步骤(b)可以包括在选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上表达半胱氨酸改造抗体。
[0768] 筛选半胱氨酸改造抗体的方法的步骤(b)还可以包括：
[0769] (i)使半胱氨酸改造抗体与硫醇反应性亲和试剂反应以生成亲和标记的半胱氨酸改造抗体；和
[0770] (ii)测量亲和标记的半胱氨酸改造抗体与俘获介质的结合。
[0771] 抗CD22 10F4 IgG变体的半胱氨酸改造
[0772] 通过本文所述半胱氨酸改造方法，将半胱氨酸引入全长嵌合亲本单克隆抗CD22抗体，在重链118(EU编号方式)(相当于重链第121位，连续编号方式)位点。
[0773] 将亲本抗体，即“std抗CD22 Hu 10F4v3 Fc”(重链序列：SEQ ID NO：88，轻链序列：SEQ ID NO：87，图5B)进行半胱氨酸改造以产生“A118C thio hu抗CD22 10F4v3”(重
链序列：SEQ ID NO：92，轻链序列：SEQ ID NO：87，图17和5B)、“S400C thio hu抗
CD2210F4v3”(重链序列：SEQ ID NO：93，轻链序列：SEQ ID NO：87，图17和5B)、或“V205C
thio抗CD22 10F4v3”(重 链序列：SEQ ID NO：88，轻链序列：SEQ ID NO：91，图5B和17)。
链序列：SEQ ID NO：92，轻链序列：SEQ ID NO：87，图17和5B)、“S400C thio hu抗
CD2210F4v3”(重链序列：SEQ ID NO：93，轻链序列：SEQ ID NO：87，图17和5B)、或“V205C
thio抗CD22 10F4v3”(重 链序列：SEQ ID NO：88，轻链序列：SEQ ID NO：91，图5B和17)。
[0774] 通过在含有1mM半胱氨酸的培养基中瞬时发酵在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中表达这些半胱氨酸改造的单克隆抗体。
[0775] 经过标记的半胱氨酸改造抗CD22抗体
[0776] 半胱氨酸改造抗CD22抗体可以位点特异性地和高效地与硫醇反应性试剂偶联。硫醇反应性试剂可以为多功能接头试剂；俘获物，即亲和、标记物试剂(例如生物素-接头
TM
试剂)；检测标记物(例如荧光团试剂)；固相固定化试剂(例如SEPHAROSE 、聚苯乙烯或玻
璃)或药物-接头中间体。硫醇反应性试剂的一个例子为N-乙基马来酰亚胺(NEM)。在一
个例示性的实施方案中，ThioFab与生物素-接头试剂的反应得到了生物素化的ThioFab，
由此可以检测和测量改造的半胱氨酸残基的存在和反应性。ThioFab与多功能接头试剂
反应得到了带有可以与药物模块试剂或其它标记物进一步反应的官能化接头的ThioFab。
ThioFab与药物-接头中间体的反应得到了ThioFab-药物偶联物。
TM
试剂)；检测标记物(例如荧光团试剂)；固相固定化试剂(例如SEPHAROSE 、聚苯乙烯或玻
璃)或药物-接头中间体。硫醇反应性试剂的一个例子为N-乙基马来酰亚胺(NEM)。在一
个例示性的实施方案中，ThioFab与生物素-接头试剂的反应得到了生物素化的ThioFab，
由此可以检测和测量改造的半胱氨酸残基的存在和反应性。ThioFab与多功能接头试剂
反应得到了带有可以与药物模块试剂或其它标记物进一步反应的官能化接头的ThioFab。
ThioFab与药物-接头中间体的反应得到了ThioFab-药物偶联物。
[0777] 本文所述的例示性方法一般可以应用于鉴定和生产抗体，并且更一般地通过应用本文所述的设计和筛选步骤用于其它蛋白质。
[0778] 此类方法可以应用于其它硫醇反应性试剂的偶联，其中反应性基团为例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物或其它硫醇反应性偶联配偶(Haugland，2003，Molecular
Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular Probes，
Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.3 ∶ 2；Garman，1997，Non-Radioactive
Labelling：A Practical Approach，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate
Chem.1 ∶ 2；Hermanson，G.，于 Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press，San
Diego，pp.40-55，643-671)。硫醇反应性试剂可以为药物模块；荧光团，诸如荧光染料，像荧
光素或罗丹明；用于成像或放射性治疗金属的螯合剂；肽基或非肽基标记物或检测标签；
或清除改性剂(clearance-modifying agent)，诸如聚乙二醇的各种异构体；结合第三组分
的肽；或另一种碳水化合物或亲脂剂。
Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular Probes，
Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.3 ∶ 2；Garman，1997，Non-Radioactive
Labelling：A Practical Approach，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate
Chem.1 ∶ 2；Hermanson，G.，于 Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press，San
Diego，pp.40-55，643-671)。硫醇反应性试剂可以为药物模块；荧光团，诸如荧光染料，像荧
光素或罗丹明；用于成像或放射性治疗金属的螯合剂；肽基或非肽基标记物或检测标签；
或清除改性剂(clearance-modifying agent)，诸如聚乙二醇的各种异构体；结合第三组分
的肽；或另一种碳水化合物或亲脂剂。
[0779] 半胱氨酸改造抗CD22抗体的用途
[0780] 半胱氨酸改造抗CD22抗体及其偶联物可用作治疗剂和/或诊断剂。本发明还提供了预防、控制、治疗或改善一种或多种与B细胞相关病症有关的症状的方法。具体而言，
本发明提供了预防、控制、治疗或改善一种或多种与细胞增殖性病症有关的症状的方法，所
述细胞增殖性病症诸如癌症，例如淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻
击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、
小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细
胞淋巴瘤。本发明还提供了用于诊断CD22相关病症或发生此类病症的素因的方法，以及用
于鉴定优先结合B细胞相关CD22多肽的抗体及其抗原结合片段的方法。
本发明提供了预防、控制、治疗或改善一种或多种与细胞增殖性病症有关的症状的方法，所
述细胞增殖性病症诸如癌症，例如淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻
击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、
小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细
胞淋巴瘤。本发明还提供了用于诊断CD22相关病症或发生此类病症的素因的方法，以及用
于鉴定优先结合B细胞相关CD22多肽的抗体及其抗原结合片段的方法。
[0781] 本发明的另一个实施方案致力于半胱氨酸改造抗CD22抗体用于制备药物的用途，所述药物可用于治疗对于B细胞相关病症是响应性的疾患。
[0782] 半胱氨酸改造抗体-药物偶联物(硫醇抗体-药物偶联物)
[0783] 本发明的另一方面是包含半胱氨酸改造抗CD22抗体(Ab)和auristatin药物模块(D)的抗体-药物偶联物化合物，其中所述半胱氨酸改造抗体通过接头模块(L)经由一
个或多个游离半胱氨酸氨基酸附着至D；该化合物具有通式I：
个或多个游离半胱氨酸氨基酸附着至D；该化合物具有通式I：
[0784] Ab-(L-D)p I
[0785] 其中p为1、2、3或4；且其中半胱氨酸改造抗体通过如下过程来制备，所述过程包括将亲本抗CD22多肽的一个或多个氨基酸残基用一个或多个游离半胱氨酸替换。
[0786] 图10显示了半胱氨酸改造抗CD22抗体-药物偶联物(ADC)的实施方案，其中auristatin药物模块附着至轻链(LC-ADC)、重链(HC-ADC)、和Fc区(Fc-ADC)中经改造的
半胱氨酸基团。
半胱氨酸基团。
[0787] 半胱氨酸改造抗CD22抗体-药物偶联物的潜在优点包括安全性改善(治疗指数更大)、PK参数改进、抗体的链间二硫键保留(其可稳定偶联物并保持其活性结合构象)、
药物偶联位点确定、和自半胱氨酸改造抗体与药物-接头试剂的偶联而制备半胱氨酸改造
抗体-药物偶联物导致更均一的产物。
药物偶联位点确定、和自半胱氨酸改造抗体与药物-接头试剂的偶联而制备半胱氨酸改造
抗体-药物偶联物导致更均一的产物。
[0788] 接头
[0789] “接头”、“接头单元”、或“连接”指包含使抗体共价附着于药物模块的共价键或原子链的化学模块。在各个实施方案中，接头以L表示。“接头”(L)为可用于连接一个或多个
药物模块(D)和抗体单元(Ab)而形成通式I的抗体-药物偶联物(ADC)的双功能或多功
能模块。可以使用具有供结合药物和抗体用的反应性官能度的接头而便利地制备抗体-药
物偶联物(ADC)。半胱氨酸改造抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头试剂、药物模块或药
物-接头中间体的 亲电子官能团形成键。
药物模块(D)和抗体单元(Ab)而形成通式I的抗体-药物偶联物(ADC)的双功能或多功
能模块。可以使用具有供结合药物和抗体用的反应性官能度的接头而便利地制备抗体-药
物偶联物(ADC)。半胱氨酸改造抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头试剂、药物模块或药
物-接头中间体的 亲电子官能团形成键。
[0790] 一方面，接头具有反应性位点，该位点具有与存在于抗体上的亲核半胱氨酸具有反应性的亲电子基团。抗体的半胱氨酸硫醇与接头上的亲电子基团具有反应性并且与接头
形成共价键。有用的亲电子基团包括但不限于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。
形成共价键。有用的亲电子基团包括但不限于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。
[0791] 接头包括：二价基，诸如亚烃基(alkyldiyl)、亚芳基、亚杂芳基；模块，诸如-(CR2)nO(CR2)n-、烃氧基重复单元(例如聚亚乙基氧基(polyethylenoxy)、PEG、聚亚甲基
TM
氧基(polymethyleneoxy))和烃氨基(例如聚乙烯氨基，Jeffamine )；及二酸酯和酰胺，
包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。
TM
氧基(polymethyleneoxy))和烃氨基(例如聚乙烯氨基，Jeffamine )；及二酸酯和酰胺，
包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。
[0792] 半胱氨酸改造抗体与接头试剂或药物-接头中间体，与亲电子官能团诸如马来酰亚胺或α-卤代羰基依照Klussman等(2004)Bioconjugate Chemistry15(4)：765-773，766
页上的偶联方法和依照实施例x的方案起反应。
页上的偶联方法和依照实施例x的方案起反应。
[0793] 接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、
丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”或“af”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基
4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己
烷-1羧酸酯(“SMCC”)、和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)、
亚乙基氧基-CH2CH2O-作为一个或多个重复单元(“EO”或“PEO”)。本领域知道别的接头
构件，本文中也描述了一些。
丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”或“af”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基
4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己
烷-1羧酸酯(“SMCC”)、和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)、
亚乙基氧基-CH2CH2O-作为一个或多个重复单元(“EO”或“PEO”)。本领域知道别的接头
构件，本文中也描述了一些。
[0794] 在一个实施方案中，ADC的接头L具有通式：
[0795] -Aa-Ww-Yy-
[0796] 其中：
[0797] -A-为共价附着于抗体(Ab)半胱氨酸硫醇的延伸物单元；
[0798] a为0或1；
[0799] 每个-W-独立为氨基酸单元；
[0800] w独立为0-12的整数；
[0801] -Y-为共价附着于药物模块的间隔基单元；且
[0802] y为0、1或2。
[0803] 延伸物单元
[0804] 当存在时，延伸物单元(-A-)能够连接抗体单元与氨基酸单元(-W-)。在这 方面，抗体(Ab)具有可以与延伸物的官能团形成键的官能团。抗体中可以存在的有用官能团(或
是天然的或是经化学操作的)包括但不限于硫氢基(-SH)、氨基、羟基、羰基(carboxy)、碳
水化合物的异头(anomeric)羟基、和羧基。一方面，抗体官能团是硫氢基或氨基。硫氢基可
以通过还原抗体上的分子内二硫键来生成。或者，硫氢基可以通过抗体赖氨酸模块的氨基
使用2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)或另一种硫氢基生成试剂的反应来生成。在一个实施
方案中，抗体(Ab)具有能与延伸物单元的亲电子官能团形成键的游离半胱氨酸硫醇基团。
式II和III描绘了式I中的例示性延伸物单元，其中Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定
17
义且R 为选自下列的二价基：(CH2)r、C3-C8碳环基、O-(CH2)r、亚芳基、(CH2)r-亚芳基、-亚
芳基-(CH2)r-、(CH2)r-(C3-C8碳环基)、(C3-C8碳环基)-(CH2)r、C3-C8杂环基、(CH2)r-(C3-C8
b
杂 环基 )、-(C3-C8杂 环基 )-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NR(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)
b b
r-CH2-、-(CH2)rC(O)NR(CH2CH2O)r-、-(CH2)rC(O)NR(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2CH2O)rC(O)
b b b b
NR(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)rC(O)NR(CH2CH2O)r-CH2-和-(CH2CH2O)rC(O)NR(CH2)r-；其中R 为
H、C1-C6烃基、苯基或苄基；且r独立为1-10的整数。
是天然的或是经化学操作的)包括但不限于硫氢基(-SH)、氨基、羟基、羰基(carboxy)、碳
水化合物的异头(anomeric)羟基、和羧基。一方面，抗体官能团是硫氢基或氨基。硫氢基可
以通过还原抗体上的分子内二硫键来生成。或者，硫氢基可以通过抗体赖氨酸模块的氨基
使用2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)或另一种硫氢基生成试剂的反应来生成。在一个实施
方案中，抗体(Ab)具有能与延伸物单元的亲电子官能团形成键的游离半胱氨酸硫醇基团。
式II和III描绘了式I中的例示性延伸物单元，其中Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定
17
义且R 为选自下列的二价基：(CH2)r、C3-C8碳环基、O-(CH2)r、亚芳基、(CH2)r-亚芳基、-亚
芳基-(CH2)r-、(CH2)r-(C3-C8碳环基)、(C3-C8碳环基)-(CH2)r、C3-C8杂环基、(CH2)r-(C3-C8
b
杂 环基 )、-(C3-C8杂 环基 )-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NR(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)
b b
r-CH2-、-(CH2)rC(O)NR(CH2CH2O)r-、-(CH2)rC(O)NR(CH2CH2O)r-CH2-、-(CH2CH2O)rC(O)
b b b b
NR(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)rC(O)NR(CH2CH2O)r-CH2-和-(CH2CH2O)rC(O)NR(CH2)r-；其中R 为
H、C1-C6烃基、苯基或苄基；且r独立为1-10的整数。
[0805] 亚芳基包括通过从芳族环体系中除去两个氢原子而衍生的6-20个碳原子的二价芳族烃基。典型的亚芳基包括但不限于衍生自苯、取代的苯、萘、蒽、联苯等的基团。
[0806] 杂环基包括一个或多个环原子为杂原子(例如氮、氧和硫)的环体系。杂环基包含1-20个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子。杂环可以为具有3-7个环成员
的单环(2-6个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)或具有7-10个环成员的双
环(4-9个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)，例如：双环[4，5]，[5，5]，[5，6]
或[6，6]体系。杂环记载于Paquette，Leo A.；“Principles of Modern Heterocyclic
Chemistry”，W.A.Benjamin，New York，1968，特别是1，3，4，6，7，和9章；“The Chemistry of
Heterocyclic Compound，Aseries of Monographs”，John Wiley & Sons，New York，1950
至今，特别是卷13，14，16，19，和28；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566。
的单环(2-6个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)或具有7-10个环成员的双
环(4-9个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)，例如：双环[4，5]，[5，5]，[5，6]
或[6，6]体系。杂环记载于Paquette，Leo A.；“Principles of Modern Heterocyclic
Chemistry”，W.A.Benjamin，New York，1968，特别是1，3，4，6，7，和9章；“The Chemistry of
Heterocyclic Compound，Aseries of Monographs”，John Wiley & Sons，New York，1950
至今，特别是卷13，14，16，19，和28；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566。
[0807] 举例而言而非限制，杂环的例子包括：吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氢噻吩基(tetrahydrothiophenyl)、硫氧化的四氢噻吩基、嘧啶
基、呋喃基、噻吩基(thienyl)、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、 苯并呋喃基、硫杂
萘基(thianaphthalenyl)、吲哚基、indolenyl、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶
基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基
(bis-tetrahydrofuranyl)、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基(bis-tetrahydropyranyl)、四
氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-1，
2，5-噻二嗪基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、
呫吨基、酚噁噻基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲
嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、
喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4Ah-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯
啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩噁嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷
基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑
基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基和靛红酰基(isatinoyl)。
基、呋喃基、噻吩基(thienyl)、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、 苯并呋喃基、硫杂
萘基(thianaphthalenyl)、吲哚基、indolenyl、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶
基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基
(bis-tetrahydrofuranyl)、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基(bis-tetrahydropyranyl)、四
氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-1，
2，5-噻二嗪基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、
呫吨基、酚噁噻基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲
嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、
喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4Ah-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯
啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩噁嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷
基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑
基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基和靛红酰基(isatinoyl)。
[0808] 碳环基包括具有3-7个碳原子(作为单环)或7-12个碳原子(作为双环)的饱和或不饱和环。单环碳环具有3-6个环原子，更通常地为5或6个环原子。双环碳环具有
7-12个环原子，例如排列成双环[4，5]，[5，5]，[5，6]或[6，6]体系，或者9或10个环原
子，排列成双环[5，6]或[6，6]体系。单环碳环的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环
戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯
基、1-环己-3-烯基、环庚基和环辛基。
7-12个环原子，例如排列成双环[4，5]，[5，5]，[5，6]或[6，6]体系，或者9或10个环原
子，排列成双环[5，6]或[6，6]体系。单环碳环的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环
戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯
基、1-环己-3-烯基、环庚基和环辛基。
[0809] 根据式I ADC的所有例示性实施方案诸如II-VI应当理解，即使在未明确表述的情况中，有1-4个药物模块与抗体连接(p＝1-4)，这取决于改造的半胱氨酸残基的数目。
[0810]
[0811] 例示性式II延伸物单元衍生自马来酰亚氨基-己酰基(MC)，其中R17为 -(CH2)5-：
[0812]
[0813] 例示性式II延伸物单元衍生自马来酰亚氨基-丙酰基(MP)，其中R17为-(CH2)2-：
[0814]
[0815] 另一种例示性式II延伸物单元，其中R17为-(CH2CH2O)r-CH2-且r为2：
[0816]
[0817] 另一种例示性式II延伸物单元，其中R17为-(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-，其中b
R 为H和每个r为2：
R 为H和每个r为2：
[0818]
[0819] 另一种例示性式III延伸物单元，其中R17为-(CH2)5-：
[0820]
[0821] 在另一个实施方案中，延伸物单元通过抗体的改造半胱氨酸的硫原子与延伸物单元的硫原子之间的二硫键与半胱氨酸改造抗CD22抗体连接。该实施方案的代表性延伸物
单元以式IV描绘，其中R17、Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定义。
单元以式IV描绘，其中R17、Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定义。
[0822]
[0823] 在又一个实施方案中，延伸物的反应性基团含有可以与抗体的游离半胱 氨酸硫醇形成键的硫醇反应性官能团。硫醇反应性官能团的例子包括但不限于：马来酰亚胺；
α-卤代乙酰基；活化的酯类，诸如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基
酯；酸酐类；酸性氯化物或酰基氯类(acidchloride)；磺酰氯类；异氰酸酯类和异硫氰酸酯
类。该实施方案的代表性延伸物单元以式Va和Vb描绘，其中-R17-、Ab-、-W-、-Y-、-D、w和
y如上文所定义。
α-卤代乙酰基；活化的酯类，诸如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基
酯；酸酐类；酸性氯化物或酰基氯类(acidchloride)；磺酰氯类；异氰酸酯类和异硫氰酸酯
类。该实施方案的代表性延伸物单元以式Va和Vb描绘，其中-R17-、Ab-、-W-、-Y-、-D、w和
y如上文所定义。
[0824]
[0825] 在另一个实施方案中，接头可以为树状类型接头(dendritic type linker)，其用于通过分支的多功能接头模块将超过一个药物模块共价附着于抗体(Sun等(2002)
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic &
Medicinal Chemistry 11：1761-1768；King(2002)Tetrahedron Letters 43：1987-1990)。
树状接头可以增加药物与抗体的摩尔比，即载荷，它与ADC的效能相关。如此，如果半胱氨
酸改造抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基团，那么可以通过树状接头附着众多药物模
块。
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic &
Medicinal Chemistry 11：1761-1768；King(2002)Tetrahedron Letters 43：1987-1990)。
树状接头可以增加药物与抗体的摩尔比，即载荷，它与ADC的效能相关。如此，如果半胱氨
酸改造抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基团，那么可以通过树状接头附着众多药物模
块。
[0826] 氨基酸单元
[0827] 接头可以包含氨基酸残基。如果存在，那么氨基酸单元(-Ww-)使本发明的半胱氨酸改造抗体-药物偶联物(ADC)的抗体(Ab)与药物模块(D)连接。
[0828] -Ww-为二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。包含氨基酸单元的氨基酸残基包括那些天然存在的以及次要的氨基酸和非天然存在的
氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。各个-W-单元独立地具有如下所示的方括号内的通式，且w为
0-12的整数：
氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。各个-W-单元独立地具有如下所示的方括号内的通式，且w为
0-12的整数：
[0829]
[0830] 其中R19为氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC( ＝ NH)
NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、 -(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NH
COCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、
3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基、
NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、 -(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NH
COCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、
3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基、
[0831]19 19 19
[0832] 当R 不为氢时，R 所附着的碳原子为手性的。R 所附着的各个碳原子独立地以(S)或(R)构型或外消旋混合物附着。氨基酸单元如此可以为对映体方面纯的、外消旋的或
非对映异构体的。
非对映异构体的。
[0833] 例示性的-Ww-氨基酸单元包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性的三肽包括：甘
氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成
氨基酸接头构件的氨基酸残基包括天然存在的氨基酸，以及次要氨基酸和非天然存在的氨
基酸类似物，诸如瓜氨酸。
氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成
氨基酸接头构件的氨基酸残基包括天然存在的氨基酸，以及次要氨基酸和非天然存在的氨
基酸类似物，诸如瓜氨酸。
[0834] 可以用一种或多种酶(包括肿瘤相关蛋白酶)酶促切割氨基酸单元，以释放药物模块(-D)，其在一个实施方案中在体内释放时被质子化以提供药物(D)。可以在特定酶(例
如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶)的酶促切割的选择性方面设计
和优化氨基酸接头构件。
如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶)的酶促切割的选择性方面设计
和优化氨基酸接头构件。
[0835] 间隔物单元
[0836] 在氨基酸单元存在时(w＝1-12)，间隔物单元(-Yy-)(在存在时，y＝1或2)使氨基酸单元(-Ww-)与药物模块(D)连接。或者，在氨基酸单元不存在时，间隔物单元使延
伸物单元与药物模块连接。在氨基酸单元和延伸物单元 都不存在时(w，y＝0)，间隔物单
元还使药物模块与抗体单元连接。间隔物单元有两大类：自我牺牲(self-immolative)和
非自我牺牲的。非自我牺牲的间隔物单元为部分或所有间隔物单元在从抗体-药物偶联物
或药物模块-接头切割(特别是酶促切割)氨基酸单元后保持与药物模块结合的间隔物单
元。当含有甘氨酸-甘氨酸间隔物单元或甘氨酸间隔物单元的ADC通过肿瘤细胞相关蛋白
酶、癌细胞相关蛋白酶或淋巴细胞相关蛋白酶进行酶促切割时，甘氨酸-甘氨酸-药物模块
或甘氨酸-药物模块从Ab-Aa-Ww-上切割下来。在一个实施方案中，在靶细胞内发生独立
的水解反应，其切割甘氨酸-药物模块的键并释放药物。
伸物单元与药物模块连接。在氨基酸单元和延伸物单元 都不存在时(w，y＝0)，间隔物单
元还使药物模块与抗体单元连接。间隔物单元有两大类：自我牺牲(self-immolative)和
非自我牺牲的。非自我牺牲的间隔物单元为部分或所有间隔物单元在从抗体-药物偶联物
或药物模块-接头切割(特别是酶促切割)氨基酸单元后保持与药物模块结合的间隔物单
元。当含有甘氨酸-甘氨酸间隔物单元或甘氨酸间隔物单元的ADC通过肿瘤细胞相关蛋白
酶、癌细胞相关蛋白酶或淋巴细胞相关蛋白酶进行酶促切割时，甘氨酸-甘氨酸-药物模块
或甘氨酸-药物模块从Ab-Aa-Ww-上切割下来。在一个实施方案中，在靶细胞内发生独立
的水解反应，其切割甘氨酸-药物模块的键并释放药物。
[0837] 在另一个实施方案中，-Yy-为对氨基苄基氨基甲酰基(PAB)单元，其亚苯基部分被Qm取代，其中Q为-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-卤素、-硝基或-氰基；且m为0-4的整
数。
数。
[0838] 非自我牺牲的间隔物单元(-Y-)的例示性实施方案为：-Gly-Gly-；-Gly-；-Ala-Phe-；-Val-Cit-。
[0839] 在一个实施方案中，提供了药物模块-接头或ADC或其药学可接受的盐或溶剂化物，其中间隔物单元不存在(y＝0)。
[0840] 或者，含有自我牺牲的间隔物单元的ADC可以释放-D。在一个实施方案中，-Y-为通过PAB基团的氨基氮原子连接至-Ww-且通过碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基团直接连接至-D
的PAB基团，其中ADC具有如下例示性结构：
的PAB基团，其中ADC具有如下例示性结构：
[0841]
[0842] 其中Q为-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-卤素、-硝基或-氰基；m为0-4的整数；且p为1-4。
[0843] 自我牺牲的间隔物的其它例子包括但不限于在电子方面与PAB基团类似的芳族化合物，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)、
杂环PAB类似物(US 2005/0256030)、β-葡糖苷酸(WO2007/011968)、和邻位或对位氨基苄
基乙缩醛。可以使用在酰胺键水解时进行环化的间隔物，诸如取代和未取代的4-氨基丁酸
酰胺类(Rodrigues等(1995)Chemistry Biology 2：223)、适当取代的双环[2.2.1]和双环
[2.2.2]环体系(Storm等(1972)J.Amer.Chem.Soc.94：5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺类
(Amsberry等 (1990)J.Org.Chem.55：5867)。消去在甘氨酸上取代的含胺药物(Kingsbury
等(1984)J.Med.Chem.27：1447)也是可用于ADC的自我牺牲的间隔物的例子。
杂环PAB类似物(US 2005/0256030)、β-葡糖苷酸(WO2007/011968)、和邻位或对位氨基苄
基乙缩醛。可以使用在酰胺键水解时进行环化的间隔物，诸如取代和未取代的4-氨基丁酸
酰胺类(Rodrigues等(1995)Chemistry Biology 2：223)、适当取代的双环[2.2.1]和双环
[2.2.2]环体系(Storm等(1972)J.Amer.Chem.Soc.94：5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺类
(Amsberry等 (1990)J.Org.Chem.55：5867)。消去在甘氨酸上取代的含胺药物(Kingsbury
等(1984)J.Med.Chem.27：1447)也是可用于ADC的自我牺牲的间隔物的例子。
[0844] 例示性的间隔物单元(-Yy-)以式X-XII表示：
[0845]
[0846] 树状接头
[0847] 在另一个实施方案中，接头L可以为树状类型接头(dendritic type linker)，其用于通过分支的多功能接头模块将超过一个药物模块共价附着于抗体(Sun等(2002)
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic
& Medicinal Chemistry 11：1761-1768)。树状接头可以增加药物与抗体的摩尔比，即载
荷，它与ADC的效能相关。如此，如果半胱氨酸改造抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基
团，那么可以通过树状接头附着众多药物模块。分支的树状接头的例示性实施方案包括2，
6-双(羟甲基)-对甲酚和2，4，6-三(羟甲基)-酚树状聚物单元(WO 2004/01993；Szalai
等 (2003)J.Amer.Chem.Soc.125：15688-15689；Shamis 等 (2004)J.Amer.Chem.Soc.126：
1726-1731；Amir等(2003)Angew.Chem.Iht.Ed.42：4494-4499)。
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic
& Medicinal Chemistry 11：1761-1768)。树状接头可以增加药物与抗体的摩尔比，即载
荷，它与ADC的效能相关。如此，如果半胱氨酸改造抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基
团，那么可以通过树状接头附着众多药物模块。分支的树状接头的例示性实施方案包括2，
6-双(羟甲基)-对甲酚和2，4，6-三(羟甲基)-酚树状聚物单元(WO 2004/01993；Szalai
等 (2003)J.Amer.Chem.Soc.125：15688-15689；Shamis 等 (2004)J.Amer.Chem.Soc.126：
1726-1731；Amir等(2003)Angew.Chem.Iht.Ed.42：4494-4499)。
[0848] 在一个实施方案中，间隔物单元为分支的双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)，它可以用于掺入和释放众多药物，其具有如下结构：
[0849]
[0850] 其包含2-(4-氨基亚苄基)丙烷-1，3-二醇树状聚物单元(WO 2004/043493；deGroot等(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42：4490-4494)，其中Q为-C1-C8烃基，-O-(C1-C8烃
基)、-卤素、-硝基或-氰基；m为0-4的整数；n为0或1；且p为1-4。
基)、-卤素、-硝基或-氰基；m为0-4的整数；n为0或1；且p为1-4。
[0851] 式I抗体-药物偶联物化合物的例示性实施方案包 括XIIIa(MC)、XIIIb(val-cit)、XIIIc(MC-val-cit)、和XIIId(MC-val-cit-PAB)：
[0852]
[0853] 式Ia抗体-药物偶联物化合物的其它例示性实施方案包括XIVa-e：
[0854]
[0855]
[0856] 其中X为：
[0857] -(CH2)n-，-(CH2CH2O)n-
[0858]
[0859] Y为：
[0860]
[0861] 且R独立为H或C1-C6烃基；且n为1-12。
[0862] 在另一个实施方案中，接头具有反应性官能团，该反应性官能团具有与存在于抗体上的亲电子基团具有反应性的亲核基团。抗体上有用的亲电子基团包括但不限于
醛和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电子基团反应并且与抗体单
元形成共价键。接头上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲
(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯和芳基酰肼。抗体上的亲电子基团提供了用于附着接头的
便利位点。
醛和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电子基团反应并且与抗体单
元形成共价键。接头上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲
(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯和芳基酰肼。抗体上的亲电子基团提供了用于附着接头的
便利位点。
[0863] 典型地，可以通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备肽类型的接头。例如，可以按照肽化学领域众所周知的液相合成法(E. 和
K.Lübke(1965)“The Peptides”，卷1，pp 76-136，Academic Press)来制备此类肽键。可
以通过包括间隔物、延伸物和氨基酸单元的反应的任意组合或顺序来装配接头中间体。间
隔物、延伸物和氨基酸单元可以采用本质上为亲电子、亲核或游离基的反应性官能团。反应
性官能团包括但不限于羧基、羟基、对硝基苯基碳酸根、异硫氰酸根和离去基团，诸如O-甲
磺酰基、O-甲苯磺酰基、-Cl、-Br、-I；或马来酰亚胺。
K.Lübke(1965)“The Peptides”，卷1，pp 76-136，Academic Press)来制备此类肽键。可
以通过包括间隔物、延伸物和氨基酸单元的反应的任意组合或顺序来装配接头中间体。间
隔物、延伸物和氨基酸单元可以采用本质上为亲电子、亲核或游离基的反应性官能团。反应
性官能团包括但不限于羧基、羟基、对硝基苯基碳酸根、异硫氰酸根和离去基团，诸如O-甲
磺酰基、O-甲苯磺酰基、-Cl、-Br、-I；或马来酰亚胺。
[0864] 在另一个实施方案中，接头可以用调节溶解性或反应性的基团取代。例如，带电-
荷的取代基，诸如磺酸根(-SO3)或铵可以增加试剂的水溶性并且有利于接头试剂与抗体
或药物模块的偶联反应，或有利于Ab-L(抗体-接头中 间体)与D的偶联反应或D-L(药
物-接头中间体)与Ab的偶联反应，这取决于用于制备ADC的合成途径。
荷的取代基，诸如磺酸根(-SO3)或铵可以增加试剂的水溶性并且有利于接头试剂与抗体
或药物模块的偶联反应，或有利于Ab-L(抗体-接头中 间体)与D的偶联反应或D-L(药
物-接头中间体)与Ab的偶联反应，这取决于用于制备ADC的合成途径。
[0865] 接头试剂
[0866] 可以使用多种双功能接头试剂来制备包含抗体和auristatin的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基
甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲
酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸
如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二
胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，
4-二硝基苯)的双功能衍生物。
甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲
酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸
如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二
胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，
4-二硝基苯)的双功能衍生物。
[0867] 也可以用如下接头试剂来制备抗体-药物偶联物：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、
sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC 和 sulfo-SMPB、及 SVSB( 琥 珀 酰
亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)；并且包括双马来酰亚胺试剂：DTME、BMB、BMDB、
BMH、BMOE、BM(PEO)3和BM(PEO)4，它们可购自Pierce Biotechnology，Inc.，Customer
Service Department，P.O.Box 117，Rockford，IL.61105U.S.A，U.S.A1-800-874-3723，
International+815-968-0747。双马来酰亚胺试剂任选将半胱氨酸改造抗体的硫醇基团
按照依次或同时的方式附着至含硫醇药物模块、标记物或接头中间体。除马来酰亚胺外的
其它与半胱氨酸改造抗体、药物模块、标记物或接头中间体的硫醇基团具有反应性的官能
团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸根和异硫氰酸
根。
sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC 和 sulfo-SMPB、及 SVSB( 琥 珀 酰
亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)；并且包括双马来酰亚胺试剂：DTME、BMB、BMDB、
BMH、BMOE、BM(PEO)3和BM(PEO)4，它们可购自Pierce Biotechnology，Inc.，Customer
Service Department，P.O.Box 117，Rockford，IL.61105U.S.A，U.S.A1-800-874-3723，
International+815-968-0747。双马来酰亚胺试剂任选将半胱氨酸改造抗体的硫醇基团
按照依次或同时的方式附着至含硫醇药物模块、标记物或接头中间体。除马来酰亚胺外的
其它与半胱氨酸改造抗体、药物模块、标记物或接头中间体的硫醇基团具有反应性的官能
团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸根和异硫氰酸
根。
[0868]
[0869] 还可以通过其它商业来源，诸如Molecular Biosciences Inc.(Boulder，CO)获得或按照下列文献中所述的规程合成有用的接头试剂：Toki等(2002)J.Org.
Chem.67：1866-1872；Walker，M.A.(1995)J.Org.Chem.60：5352-5355； Frisch 等
(1996)Bioconjugate Chem.7：180-186；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；
US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；和WO04/032828。
Chem.67：1866-1872；Walker，M.A.(1995)J.Org.Chem.60：5352-5355； Frisch 等
(1996)Bioconjugate Chem.7：180-186；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；
US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；和WO04/032828。
[0870] 可以通过使下列接头试剂与氨基酸单元的N-末端反应将式(IIIa)的延伸物引入接头：
[0871]
[0872] 其中n为1-10的整数且T为-H或-SO3Na；
[0873]
[0874] 其中n为0-3的整数；
[0875]
[0876] 可以通过使下列双功能试剂与氨基酸单元的N-末端反应将延伸物单元引入接头：
[0877]
[0878] 其中X为Br或I。
[0879] 还可以通过使下列双功能试剂与氨基酸单元的N-末端反应将式中的延伸物单元引入接头：
[0880]
[0881] 具有马来酰亚胺延伸物和对氨基苄基氨基甲酰基(PAB)自我牺牲间隔物的例示性缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂具有如下结构：
[0882]
[0883] 具有马来酰亚胺延伸物单元和PAB自我牺牲间隔物单元的例示性phe-lys(Mtr，单-4-甲氧基三苯甲基)二肽接头试剂可以按照Dubowchik等(1997)Tetrahedron
Letters，38：5257-60所述制备且具有如下结构：
Letters，38：5257-60所述制备且具有如下结构：
[0884]
[0885] 本发明的例示性抗体-药物偶联物化合物包括：
[0886]
[0887] Ab-MC-MMAF
[0888] 其中Val为缬氨酸；Cit为瓜氨酸；p为1、2、3或4；且Ab为半胱氨酸改造抗CD22抗体。
[0889] 半胱氨酸改造抗CD22抗体-药物偶联物的制备
[0890] 可以通过数种途径，采用本领域技术人员公知的有机化学反应、条件和试剂来制备式I的ADC，包括：(1)使半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸基团与接头试剂反应，从而通过共
价键形成抗体-接头中间体Ab-L，随后与活化的药 物模块D反应；和(2)使药物模块的亲
核基团与接头试剂反应，从而通过共价键形成药物-接头中间体D-L，随后与半胱氨酸改造
抗体的半胱氨酸基团反应。偶联方法(1)和(2)可以与各种半胱氨酸改造抗体、药物模块
和接头一起使用以制备式I的抗体-药物偶联物。
价键形成抗体-接头中间体Ab-L，随后与活化的药 物模块D反应；和(2)使药物模块的亲
核基团与接头试剂反应，从而通过共价键形成药物-接头中间体D-L，随后与半胱氨酸改造
抗体的半胱氨酸基团反应。偶联方法(1)和(2)可以与各种半胱氨酸改造抗体、药物模块
和接头一起使用以制备式I的抗体-药物偶联物。
[0891] 抗体半胱氨酸硫醇基团为亲核性的并且能够与接头试剂和药物-接头中间体上的亲电子基团反应而形成共价键，所述亲电子基团包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯类、HOBt
酯类、卤代甲酸酯类和酸性氯化物类；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺类；(iii)
醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团；和(iv)通过硫化物交换的二硫化物，包括吡啶基二硫
化物。药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼
羧酸酯和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块和接头试剂上的亲电子基团反应而形成共价
键。
酯类、卤代甲酸酯类和酸性氯化物类；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺类；(iii)
醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团；和(iv)通过硫化物交换的二硫化物，包括吡啶基二硫
化物。药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼
羧酸酯和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块和接头试剂上的亲电子基团反应而形成共价
键。
[0892] 可以如下使半胱氨酸改造抗体变成反应性的以便偶联接头试剂，即用还原剂，诸如DTT(Cleland氏试剂，二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)处理(Getz等
(1999)Anal.Biochem.273：73-80；Soltec Ventures，Beverly，MA)，接着再氧化以再形成链
间和链内二硫键(实施例x)。例如，在37℃用约50倍过量的TCEP将在CHO细胞中表达的
全长半胱氨酸改造的单克隆抗体(ThioMab)还原3小时以还原的半胱氨酸加合物的二硫
键，其可以在新引入的半胱氨酸残基与存在于培养基中的半胱氨酸之间形成。用10mM乙酸
钠，pH5稀释还原后的ThioMab并且加载至10mM乙酸钠，pH 5中的HiTrap S柱上并且用
含有0.3M氯化钠的PBS洗脱。在室温用稀(200nM)硫酸铜(CuSO4)水溶液重新建立亲本
Mab中存在的半胱氨酸残基之间的二硫键过夜。或者，脱氢抗坏血酸(DHAA)是有效的氧化
剂，用于在半胱氨酸加合物的还原性切割之后重新建立半胱氨酸改造抗体的链内二硫化物
基团。可以使用本领域公知的其它氧化剂，即氧化性试剂和氧化性条件。环境空气氧化也
是有效的。这种温和的部分再氧化步骤有效地高保真度地形成链内二硫键并保护新引入的
半胱氨酸残基的硫醇基团。加入约10倍过量的药物-接头中间体，例如MC-vc-PAB-MMAE，
混合并且在室温放置约1小时，以进行偶联并形成10F4v3抗CD22抗体-药物偶联物。将
偶联混合物进行凝胶过滤、加载和通过HiTrap S柱洗脱以除去过量的药物-接头中间体和
其它杂质。
(1999)Anal.Biochem.273：73-80；Soltec Ventures，Beverly，MA)，接着再氧化以再形成链
间和链内二硫键(实施例x)。例如，在37℃用约50倍过量的TCEP将在CHO细胞中表达的
全长半胱氨酸改造的单克隆抗体(ThioMab)还原3小时以还原的半胱氨酸加合物的二硫
键，其可以在新引入的半胱氨酸残基与存在于培养基中的半胱氨酸之间形成。用10mM乙酸
钠，pH5稀释还原后的ThioMab并且加载至10mM乙酸钠，pH 5中的HiTrap S柱上并且用
含有0.3M氯化钠的PBS洗脱。在室温用稀(200nM)硫酸铜(CuSO4)水溶液重新建立亲本
Mab中存在的半胱氨酸残基之间的二硫键过夜。或者，脱氢抗坏血酸(DHAA)是有效的氧化
剂，用于在半胱氨酸加合物的还原性切割之后重新建立半胱氨酸改造抗体的链内二硫化物
基团。可以使用本领域公知的其它氧化剂，即氧化性试剂和氧化性条件。环境空气氧化也
是有效的。这种温和的部分再氧化步骤有效地高保真度地形成链内二硫键并保护新引入的
半胱氨酸残基的硫醇基团。加入约10倍过量的药物-接头中间体，例如MC-vc-PAB-MMAE，
混合并且在室温放置约1小时，以进行偶联并形成10F4v3抗CD22抗体-药物偶联物。将
偶联混合物进行凝胶过滤、加载和通过HiTrap S柱洗脱以除去过量的药物-接头中间体和
其它杂质。
[0893] 附图12显示了制备由细胞培养物表达的用于偶联的半胱氨酸改造抗体 的一般方法。当细胞培养基含有半胱氨酸时，可以在新引入的半胱氨酸氨基酸和培养基中的半
胱氨酸之间形成二硫化物加合物。必须将这些半胱氨酸加合物(描绘为图12中的例示性
ThioMab(左)中的环)还原以生成具有偶联反应性的半胱氨酸改造抗体。将半胱氨酸加合
物和可能的各个链间二硫键用还原剂诸如TCEP还原性切割以产生还原形式的抗体。在部
分氧化条件下，用硫酸铜、DHAA、或暴露于环境氧而重新形成配对半胱氨酸残基之间的链间
二硫键。新引入的、改造的和未配对的半胱氨酸残基仍然可用于与接头试剂或药物-接头
中间体反应而形成本发明的抗体偶联物。哺乳动物细胞系中表达的ThioMabs通过-S-S-键
形成产生外部偶联至改造的Cys的Cys加合物。因此，纯化的ThioMabs如实施例x所述通
过还原和再氧化规程处理以产生反应性ThioMabs。这些ThioMabs用于偶联含有马来酰亚
胺的细胞毒性药物、荧光团和其它标记物。
胱氨酸之间形成二硫化物加合物。必须将这些半胱氨酸加合物(描绘为图12中的例示性
ThioMab(左)中的环)还原以生成具有偶联反应性的半胱氨酸改造抗体。将半胱氨酸加合
物和可能的各个链间二硫键用还原剂诸如TCEP还原性切割以产生还原形式的抗体。在部
分氧化条件下，用硫酸铜、DHAA、或暴露于环境氧而重新形成配对半胱氨酸残基之间的链间
二硫键。新引入的、改造的和未配对的半胱氨酸残基仍然可用于与接头试剂或药物-接头
中间体反应而形成本发明的抗体偶联物。哺乳动物细胞系中表达的ThioMabs通过-S-S-键
形成产生外部偶联至改造的Cys的Cys加合物。因此，纯化的ThioMabs如实施例x所述通
过还原和再氧化规程处理以产生反应性ThioMabs。这些ThioMabs用于偶联含有马来酰亚
胺的细胞毒性药物、荧光团和其它标记物。
[0894] 筛选方法
[0895] 本发明的又一个实施方案致力于测定怀疑含有CD22多肽的样品中CD22多肽的存在的方法，其中该方法包括使所述样品暴露于结合CD22多肽的半胱氨酸改造抗CD22抗体
或其抗体-药物偶联物，并测定半胱氨酸改造抗CD22抗体或其抗体-药物偶联物与样品中
CD22多肽的结合，其中存在有所述结合表明样品中存在CD22多肽。任选地，所述样品可包
含怀疑表达CD22多肽的细胞(其可以是癌细胞)。所述方法中所采用的半胱氨酸改造抗
CD22抗体或其抗体-药物偶联物可任选地可检测地标记、附着至固体支持物、等等。
或其抗体-药物偶联物，并测定半胱氨酸改造抗CD22抗体或其抗体-药物偶联物与样品中
CD22多肽的结合，其中存在有所述结合表明样品中存在CD22多肽。任选地，所述样品可包
含怀疑表达CD22多肽的细胞(其可以是癌细胞)。所述方法中所采用的半胱氨酸改造抗
CD22抗体或其抗体-药物偶联物可任选地可检测地标记、附着至固体支持物、等等。
[0896] 本发明的另一个实施方案致力于诊断哺乳动物中肿瘤的存在的方法，其中该方法包括：(a)使包含得自哺乳动物的组织细胞的测试样品接触结合CD22多肽的半胱氨酸改造
抗CD22抗体或其抗体-药物偶联物，并(b)检测半胱氨酸改造抗CD22抗体或其抗体-药物
偶联物与测试样品中的CD22多肽之间复合物的形成，其中形成了复合物表明哺乳动物中
存在肿瘤。任选地，半胱氨酸改造抗CD22抗体或其抗体-药物偶联物是可检测地标记的、
附着至固体支持物的、等等，和/或组织细胞的测试样品得自怀疑具有癌性肿瘤的个体。
抗CD22抗体或其抗体-药物偶联物，并(b)检测半胱氨酸改造抗CD22抗体或其抗体-药物
偶联物与测试样品中的CD22多肽之间复合物的形成，其中形成了复合物表明哺乳动物中
存在肿瘤。任选地，半胱氨酸改造抗CD22抗体或其抗体-药物偶联物是可检测地标记的、
附着至固体支持物的、等等，和/或组织细胞的测试样品得自怀疑具有癌性肿瘤的个体。
[0897] 抗体-药物偶联物的代谢物
[0898] 本文所述ADC化合物的体内代谢产物也落在本发明的范围内，就此类产 物相对于现有技术为新的且非显而易见的而言。此类产物可能源自例如所施用化合物的氧化、还
原、水解、酰胺化、酯化、酶促切割、等等。因而，本发明包括通过如下方法产生的新的和非显
而易见的化合物，所述方法包括使本发明的化合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的
一段时间。
原、水解、酰胺化、酯化、酶促切割、等等。因而，本发明包括通过如下方法产生的新的和非显
而易见的化合物，所述方法包括使本发明的化合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的
一段时间。
[0899] 一般如下鉴定代谢产物，即制备放射性标记的(例如14C或3H)ADC，将其以可检测剂量(例如大于约0.5mg/kg)胃肠外施用于动物(诸如大鼠、小鼠、豚鼠、猪、猴)或人，允
许足够时间让代谢发生(通常约30秒到30小时)，及从尿液、血液或其它生物学样品分离
其转化产物。这些产物易于分离，因为它们是经过标记的(其它的通过使用能够结合在代
谢物中幸存的结合表位的抗体来分离)。按照常规方式，例如通过MS、LC/MS或NMR分析来
测定代谢物结构。一般而言，按照与本领域技术人员众所周知的常规药物代谢研究相同的
方式对代谢物进行分析。转化产物，只要没在其它情况中在体内发现它们，即可用于诊断测
定法以用于本发明ADC化合物的治疗性剂量给药。
许足够时间让代谢发生(通常约30秒到30小时)，及从尿液、血液或其它生物学样品分离
其转化产物。这些产物易于分离，因为它们是经过标记的(其它的通过使用能够结合在代
谢物中幸存的结合表位的抗体来分离)。按照常规方式，例如通过MS、LC/MS或NMR分析来
测定代谢物结构。一般而言，按照与本领域技术人员众所周知的常规药物代谢研究相同的
方式对代谢物进行分析。转化产物，只要没在其它情况中在体内发现它们，即可用于诊断测
定法以用于本发明ADC化合物的治疗性剂量给药。
[0900] 药物组合物
[0901] 抗体-药物偶联物(包括硫醇抗体-药物偶联物)的施用
[0902] 可以通过适合于待治疗疾患的任何途径来施用本发明的抗体-药物偶联物(ADC)，包括硫醇抗体-药物偶联物(TDC)。典型地，胃肠外施用ADC，即输注、皮下、肌肉内、
静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外。
静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外。
[0903] 为了治疗这些癌症，在一个实施方案中，抗体-药物偶联物经静脉内输注来施用。2 2
经输注而施用的剂量范围为大约1μg/m 至大约10,000μg/m 每剂，一般是每周一剂，总
2 2
共一剂、两剂、三剂或四剂。或者，剂量范围是大约1μg/m 至大约1000μg/m、大约1μg/
2 2 2 2 2 2
m 至大约800μg/m、大约1μg/m 至大约600μg/m、大约1μg/m 至大约400μg/m、大约
2 2 2 2 2
10μg/m 至大约500μg/m、大约10μg/m 至大约300μg/m、大约10μg/m 至大约200μg/
2 2 2
m、和大约1μg/m 至大约200μg/m。剂量给药可以每天一次、每周一次、每周多次但少于
每天一次、每月多次但少于每天一次、每月多次但少于每周一次、每月一次或间歇地施用以
减轻或缓和疾病的症状。施用可以以任何已公开的间隔持续进行，直至所治疗的白血病、淋
巴瘤的症状或肿瘤消退。施用可以在实现症状消退或减轻后继续进行，其中所述消退或减
轻因所述继续施用而延长。
经输注而施用的剂量范围为大约1μg/m 至大约10,000μg/m 每剂，一般是每周一剂，总
2 2
共一剂、两剂、三剂或四剂。或者，剂量范围是大约1μg/m 至大约1000μg/m、大约1μg/
2 2 2 2 2 2
m 至大约800μg/m、大约1μg/m 至大约600μg/m、大约1μg/m 至大约400μg/m、大约
2 2 2 2 2
10μg/m 至大约500μg/m、大约10μg/m 至大约300μg/m、大约10μg/m 至大约200μg/
2 2 2
m、和大约1μg/m 至大约200μg/m。剂量给药可以每天一次、每周一次、每周多次但少于
每天一次、每月多次但少于每天一次、每月多次但少于每周一次、每月一次或间歇地施用以
减轻或缓和疾病的症状。施用可以以任何已公开的间隔持续进行，直至所治疗的白血病、淋
巴瘤的症状或肿瘤消退。施用可以在实现症状消退或减轻后继续进行，其中所述消退或减
轻因所述继续施用而延长。
[0904] 本发明还提供了减轻自身免疫性疾病的方法，包括给患有自身免疫性疾病的患者施用治疗有效量的任一前述实施方案的人源化10F4抗体-药物偶联物。在优选的实施方
2
案中，所述抗体静脉内或皮下施用。所述抗体-药物偶联物以大约1μg/m 至大约100mg/
2 2
m 每剂的剂量范围静脉内施用，在一个具体的实施方案中，剂量是1μg/m 至大约500μg/
2
m。剂量给药可以每天一次、每周一次、每周多次但少于每天一次、每月多次但少于每天一
次、每月多次但少于每周一次、每月一次或间歇地施用以减轻或缓和疾病的症状。施用可以
以任何已公开的间隔持续进行，直至所治疗的自身免疫性疾病的症状减轻或缓和。施用可
以在实现症状减轻或缓和后继续进行，其中所述减轻或缓和因所述继续施用而延长。
2
案中，所述抗体静脉内或皮下施用。所述抗体-药物偶联物以大约1μg/m 至大约100mg/
2 2
m 每剂的剂量范围静脉内施用，在一个具体的实施方案中，剂量是1μg/m 至大约500μg/
2
m。剂量给药可以每天一次、每周一次、每周多次但少于每天一次、每月多次但少于每天一
次、每月多次但少于每周一次、每月一次或间歇地施用以减轻或缓和疾病的症状。施用可以
以任何已公开的间隔持续进行，直至所治疗的自身免疫性疾病的症状减轻或缓和。施用可
以在实现症状减轻或缓和后继续进行，其中所述减轻或缓和因所述继续施用而延长。
[0905] 本发明还提供了治疗B细胞病症的方法，包括给患有B细胞病症(诸如B细胞增殖性病症，包括但不限于淋巴瘤和白血病)或自身免疫性疾病的患者施用治疗有效量的任
一前述实施方案的人源化10F4抗体，该抗体未偶联至细胞毒性分子或可检测分子。该抗体
2 2
通常在大约1μg/m 至大约1000mg/m 的剂量范围内施用。
一前述实施方案的人源化10F4抗体，该抗体未偶联至细胞毒性分子或可检测分子。该抗体
2 2
通常在大约1μg/m 至大约1000mg/m 的剂量范围内施用。
[0906] 一方面，本发明还提供了包含至少一种本发明抗CD22抗体和/或至少一种其免疫偶联物和/或至少一种本发明抗CD22抗体-药物偶联物的药物配制剂。在有些实施方案
中，药物配制剂包含：1)抗CD22抗体和/或抗CD22抗体-药物偶联物和/或其免疫偶联
物，和2)药学可接受载体。在有些实施方案中，药物配制剂包含：1)抗CD22抗体和/或其
免疫偶联物，和任选的2)至少一种别的治疗剂。
中，药物配制剂包含：1)抗CD22抗体和/或抗CD22抗体-药物偶联物和/或其免疫偶联
物，和2)药学可接受载体。在有些实施方案中，药物配制剂包含：1)抗CD22抗体和/或其
免疫偶联物，和任选的2)至少一种别的治疗剂。
[0907] 包含本发明抗体或免疫偶联物或本发明抗体-药物偶联物的药物配制剂通过将具有期望纯度的抗体或抗体-药物偶联物与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂
(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)混合来制备
成水溶液或冻干剂型或其它干燥剂型的形式供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所
采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和
其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基
铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯
甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子
量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血 清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合
物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨
酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸
如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复
TM TM
合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。用于体内
施用的药物配制剂一般是无菌的。这易于通过无菌滤膜过滤来实现。
(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)混合来制备
成水溶液或冻干剂型或其它干燥剂型的形式供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所
采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和
其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基
铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯
甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子
量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血 清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合
物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨
酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸
如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复
TM TM
合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。用于体内
施用的药物配制剂一般是无菌的。这易于通过无菌滤膜过滤来实现。
[0908] 活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统
中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类
技术公开于Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.编(1980)。
中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类
技术公开于Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.编(1980)。
[0909] 可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明抗体或免疫偶联物的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续
释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、
聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的
TM
乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚
物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸
乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的
时间较短。当所封装的抗体或免疫偶联物在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃
的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制
来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换的分子间
S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、自酸性溶液冻干、控制含水量、采用适宜添加剂和开
发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、
聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的
TM
乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚
物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸
乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的
时间较短。当所封装的抗体或免疫偶联物在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃
的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制
来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换的分子间
S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、自酸性溶液冻干、控制含水量、采用适宜添加剂和开
发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
[0910] 抗体-药物偶联物治疗
[0911] 涵盖本发明的抗体-药物偶联物(ADC)可以用于治疗各种疾病或病症，例如其特征在于肿瘤抗原过表达的疾病或病症。例示性的疾患或过度增殖性病症包括良性或恶性肿
瘤；白血病和淋巴样恶性肿瘤。其它病症包括神经元、 神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑、腺
体、巨噬细胞、上皮、基质(stromal)、囊胚腔、炎性、血管发生性和免疫学病症，包括自身免
疫性病症。
瘤；白血病和淋巴样恶性肿瘤。其它病症包括神经元、 神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑、腺
体、巨噬细胞、上皮、基质(stromal)、囊胚腔、炎性、血管发生性和免疫学病症，包括自身免
疫性病症。
[0912] 可以在携带肿瘤的高级灵长类和人体临床试验中进一步测试在动物模型和基于细胞的测定法中鉴定的ADC化合物。可以设计人体临床试验以测试本发明的抗CD22单克
隆抗体或免疫偶联物在发生B细胞增殖性病症的患者中的功效，所述B细胞增殖性病症包
括但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛
性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴
瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细胞淋巴瘤。可以设
计临床试验以评价ADC与已知治疗方案的组合的功效，所述的已知治疗方案诸如牵涉已知
化疗剂和/或细胞毒性剂的化疗和/或放疗。
隆抗体或免疫偶联物在发生B细胞增殖性病症的患者中的功效，所述B细胞增殖性病症包
括但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛
性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴
瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细胞淋巴瘤。可以设
计临床试验以评价ADC与已知治疗方案的组合的功效，所述的已知治疗方案诸如牵涉已知
化疗剂和/或细胞毒性剂的化疗和/或放疗。
[0913] 一般地，待治疗的疾病或病症为过度增殖性疾病，诸如B细胞增殖性病症和/或B细胞癌症。本文中待治疗的癌症的例子包括但不限于选自下组的B细胞增殖性病症：淋
巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性
NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细
胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细胞淋巴瘤。
巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性
NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细
胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细胞淋巴瘤。
[0914] 癌症可以包含表达CD22的细胞，使得本发明的ADC能够结合癌细胞。为了测定癌症中的CD22表达，可以利用各种诊断/预后测定法。在一个实施方案中，可以通过IHC来
分析CD22过表达。可以对来自肿瘤活检的石蜡包埋的组织切片进行IHC测定法并根据染
色程度和所检查肿瘤细胞中的比例而给予(accord)CD22蛋白质染色强度标准。
分析CD22过表达。可以对来自肿瘤活检的石蜡包埋的组织切片进行IHC测定法并根据染
色程度和所检查肿瘤细胞中的比例而给予(accord)CD22蛋白质染色强度标准。
[0915] 为了预防或治疗疾病，ADC的适当剂量取决于上文所定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、施用所述分子是为了预防还是为了治疗目的、先前的疗法、患者的
陆床史和对抗体的应答、及主治医师的判定。一次性地或在一系列治疗中将所述分子适当
施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，对患者施用的初始候选剂量为大约1μg/kg至
15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的分子，例如，或是通过一次或多次分开的施用，或是通过连
续输注。典型的每日剂量范围可以为大约1μg/kg至100mg/kg或更大，这取决于上文所述
因素。对患者施用的例示性ADC剂量范围为大约0.1至大约10mg/kg患者体重。
陆床史和对抗体的应答、及主治医师的判定。一次性地或在一系列治疗中将所述分子适当
施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，对患者施用的初始候选剂量为大约1μg/kg至
15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的分子，例如，或是通过一次或多次分开的施用，或是通过连
续输注。典型的每日剂量范围可以为大约1μg/kg至100mg/kg或更大，这取决于上文所述
因素。对患者施用的例示性ADC剂量范围为大约0.1至大约10mg/kg患者体重。
[0916] 对于持续数天或更长时间的反复施用，根据状况，持续治疗，直至发生对疾病症状的期望抑制。例示性的剂量给药方案包括施用大约4mg/kg的初始加载剂量，随后施用大约
2mg/kg抗ErbB2抗体的每周维持剂量。其它剂量方案也是有用的。该疗法的进展易于通过
常规技术和测定法来监测。
2mg/kg抗ErbB2抗体的每周维持剂量。其它剂量方案也是有用的。该疗法的进展易于通过
常规技术和测定法来监测。
[0917] 联合疗法
[0918] 可以将本发明的抗体-药物偶联物(ADC)与具有抗癌特性的第二种化合物在药物组合配制剂中联合或作为联合疗法的给药方案。药物组合配制剂或给药方案中的第二种化
合物优选具有对组合中的ADC的补充活性，使得它们彼此不会产生不利影响。
合物优选具有对组合中的ADC的补充活性，使得它们彼此不会产生不利影响。
[0919] 第二种化合物可以为化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。此类分子以对指定目的有效的量适当地联合存在。含有本发明ADC的药物组
合物还可以具有治疗有效量的化疗剂，诸如微管蛋白形成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA
结合剂。
合物还可以具有治疗有效量的化疗剂，诸如微管蛋白形成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA
结合剂。
[0920] 一方面，所述第一化合物是本发明的抗CD22 ADC，而所述第二化合物是抗CD20抗体(或是裸抗体或是ADC)。在一个实施方案中，所述第二化合物是抗CD20抗体利妥昔单
抗(rituximab， )或2H7(Genentech，Inc.，South San Francisco，CA)。可以
与本发明的抗CD22ADC一起用于联合免疫疗法的另一种抗体包括但不限于抗VEGF(例如
)。
抗(rituximab， )或2H7(Genentech，Inc.，South San Francisco，CA)。可以
与本发明的抗CD22ADC一起用于联合免疫疗法的另一种抗体包括但不限于抗VEGF(例如
)。
[0921] 可以将其它治疗方案与依照本发明所鉴定的抗癌药联合施用，包括但不限于放疗和/或骨髓和外周血移植、和/或细胞毒剂、化疗剂、或生长抑制剂。在这样的一个实施方
案中，化疗剂是诸如例如下列药剂或药剂组合：环磷酰胺、羟基柔红霉素、阿霉素、多柔比星
TM
(doxorubincin)、长春新碱(Oncovin )、泼尼松龙、CHOP、CVP、或COP、或免疫治疗剂诸如抗
CD20(例如 )或抗VEGF(例如 )。联合疗法可以作为同时或序贯方
案施用。当序贯施用时，可以以两次或多次施用来施用所述组合。联合施用包括使用分开
的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和任意次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有
活性剂同时发挥其生物学活性。
案中，化疗剂是诸如例如下列药剂或药剂组合：环磷酰胺、羟基柔红霉素、阿霉素、多柔比星
TM
(doxorubincin)、长春新碱(Oncovin )、泼尼松龙、CHOP、CVP、或COP、或免疫治疗剂诸如抗
CD20(例如 )或抗VEGF(例如 )。联合疗法可以作为同时或序贯方
案施用。当序贯施用时，可以以两次或多次施用来施用所述组合。联合施用包括使用分开
的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和任意次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有
活性剂同时发挥其生物学活性。
[0922] 在一个实施方案中，使用ADC的治疗牵涉联合施用本文中所鉴定的抗癌药和一种或多种化疗剂或生长抑制剂，包括共施用不同化疗剂鸡尾酒或混合物。化疗剂包括紫杉烷
类(诸如帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)) 和/或蒽环类抗生素。本领
域技术人员可以按照制造商的说明书或凭经验确定的使用此类化疗剂的制备物和剂量给
药方案。此类化疗剂的制备物和剂量给药方案还记载于“Chemotherapy Service”，(1992)
M.C.Perry编，Williams &Wilkins，Baltimore，Md。
类(诸如帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)) 和/或蒽环类抗生素。本领
域技术人员可以按照制造商的说明书或凭经验确定的使用此类化疗剂的制备物和剂量给
药方案。此类化疗剂的制备物和剂量给药方案还记载于“Chemotherapy Service”，(1992)
M.C.Perry编，Williams &Wilkins，Baltimore，Md。
[0923] 任何上述共施用的药剂的合适剂量就是那些当前使用的剂量，而且可以由于新鉴定的药剂和其它化疗剂或治疗的联合作用(协同作用)而降低。
[0924] 联合疗法可以提供“协同作用”并且证实是“协同性”的，即当一起使用活性组分时所实现的效果大于分开使用所述化合物时所产生的效应之和。当活性组分为如下情况时
可以获得协同效应：(1)共同配制和施用或在合并的单位剂量配制剂中同时投递；(2)作为
分开的配制剂交替或平行投递；或(3)通过一些其它方案。当在交替疗法中投递时，在序贯
施用或投递所述化合物时，例如通过不同注射器中的不同注射，可以获得协同效应。一般而
言，在交替疗法中，序贯地，即依序地施用每种活性组分的有效剂量，而在联合疗法中，一起
施用两种或更多活性组分的有效剂量。
可以获得协同效应：(1)共同配制和施用或在合并的单位剂量配制剂中同时投递；(2)作为
分开的配制剂交替或平行投递；或(3)通过一些其它方案。当在交替疗法中投递时，在序贯
施用或投递所述化合物时，例如通过不同注射器中的不同注射，可以获得协同效应。一般而
言，在交替疗法中，序贯地，即依序地施用每种活性组分的有效剂量，而在联合疗法中，一起
施用两种或更多活性组分的有效剂量。
[0925] 抗体-药物偶联物的代谢物
[0926] 本文所述ADC化合物的体内代谢产物也落在本发明的范围内，就此类产物相对于现有技术为新的且非显而易见的而言。此类产物可能源自例如所施用化合物的氧化、还原、
水解、酰胺化、酯化、酶促切割、等等。因而，本发明包括通过如下方法产生的新的和非显而
易见的化合物，所述方法包括使本发明的化合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的一
段时间。
水解、酰胺化、酯化、酶促切割、等等。因而，本发明包括通过如下方法产生的新的和非显而
易见的化合物，所述方法包括使本发明的化合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的一
段时间。
[0927] 一般如下鉴定代谢产物，即制备放射性标记的(例如14C或3H)ADC，将其以可检测剂量(例如大于约0.5mg/kg)胃肠外施用于动物(诸如大鼠、小鼠、豚鼠、猪、猴)或人，允
许足够时间让代谢发生(通常约30秒到30小时)，及从尿液、血液或其它生物学样品分离
其转化产物。这些产物易于分离，因为它们是经过标记的(其它的通过使用能够结合在代
谢物中幸存的结合表位的抗体来分离)。按照常规方式，例如通过MS、LC/MS或NMR分析来
测定代谢物结构。一般而言，按照与本领域技术人员众所周知的常规药物代谢研究相同的
方式对代谢物进行分析。转化产物，只要没在其它情况中在体内发现它们，即可用于诊断测
定法以用于本发明ADC化合物的治疗性剂量给药。
许足够时间让代谢发生(通常约30秒到30小时)，及从尿液、血液或其它生物学样品分离
其转化产物。这些产物易于分离，因为它们是经过标记的(其它的通过使用能够结合在代
谢物中幸存的结合表位的抗体来分离)。按照常规方式，例如通过MS、LC/MS或NMR分析来
测定代谢物结构。一般而言，按照与本领域技术人员众所周知的常规药物代谢研究相同的
方式对代谢物进行分析。转化产物，只要没在其它情况中在体内发现它们，即可用于诊断测
定法以用于本发明ADC化合物的治疗性剂量给药。
[0928] 使用抗CD22抗体和免疫偶联物的其它方法
[0929] 诊断方法和检测方法
[0930] 一方面，本发明的抗CD22抗体和免疫偶联物可用于检测生物学样品中CD22的存在。术语“检测”在用于本文时涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包含
细胞或组织。在某些实施方案中，此类组织包括相对于其它组织以更高水平表达CD22的正
常的和/或癌性的组织，例如B细胞和/或B细胞相关组织。
细胞或组织。在某些实施方案中，此类组织包括相对于其它组织以更高水平表达CD22的正
常的和/或癌性的组织，例如B细胞和/或B细胞相关组织。
[0931] 一方面，本发明提供了检测生物学样品中CD22的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括在容许抗CD22抗体结合CD22的条件下使生物学样品接触抗CD22抗体，
并检测在抗CD22抗体与CD22之间是否形成复合物。
并检测在抗CD22抗体与CD22之间是否形成复合物。
[0932] 一方面，本发明提供了诊断与CD22表达升高有关的病症的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使测试细胞接触抗CD22抗体；通过检测抗CD22抗体对CD22的结合来测
定测试细胞的CD22表达水平(或是定量的或是定性的)；并比较测试细胞的CD22表达水平
与对照细胞(例如与测试细胞相同组织起源的正常细胞或以与这样的正常细胞相当的水
平表达CD22的细胞)的CD22表达水平，其中测试细胞的CD22表达水平比对照细胞高指示
存在与CD22表达升高有关的病症。在某些实施方案中，测试细胞得自怀疑患有与CD22表
达升高有关的病症的患者。在某些实施方案中，所述病症是细胞增殖性病症，诸如癌症或肿
瘤。
定测试细胞的CD22表达水平(或是定量的或是定性的)；并比较测试细胞的CD22表达水平
与对照细胞(例如与测试细胞相同组织起源的正常细胞或以与这样的正常细胞相当的水
平表达CD22的细胞)的CD22表达水平，其中测试细胞的CD22表达水平比对照细胞高指示
存在与CD22表达升高有关的病症。在某些实施方案中，测试细胞得自怀疑患有与CD22表
达升高有关的病症的患者。在某些实施方案中，所述病症是细胞增殖性病症，诸如癌症或肿
瘤。
[0933] 可以使用本发明的抗体诊断的例示性细胞增殖性病症包括B细胞病症和/或B细胞增殖性病症，包括但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性
NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋
巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细胞淋
巴瘤。
NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋
巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细胞淋
巴瘤。
[0934] 在某些实施方案中，诊断或检测方法，诸如上文所述，包括检测抗CD22抗体对在细胞表面上表达的CD22或在得自在其表面上表达CD22的细胞的膜制备物中的CD22的结
合。在某些实施方案中，所述方法包括在容许抗CD22抗体结合CD22的条件下使细胞接触
抗CD22抗体，并检测在抗CD22抗体与细胞表面上的CD22之间是否形成复合物。用于检测
抗CD22抗体对在细胞表面上表达的CD22的结合的例示性测定法是“FACS”测定法。
合。在某些实施方案中，所述方法包括在容许抗CD22抗体结合CD22的条件下使细胞接触
抗CD22抗体，并检测在抗CD22抗体与细胞表面上的CD22之间是否形成复合物。用于检测
抗CD22抗体对在细胞表面上表达的CD22的结合的例示性测定法是“FACS”测定法。
[0935] 可以使用某些其它方法来检测抗CD22抗体对CD22的结合。此类方法包括但不限于本领域公知的抗原结合测定法，诸如Western印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸
附测定法)、“三明治/夹心式”免疫测定法、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫
测定法、和免疫组化(IHC)。
附测定法)、“三明治/夹心式”免疫测定法、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫
测定法、和免疫组化(IHC)。
[0936] 在某些实施方案中，抗CD22抗体是经过标记的。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光、显色、电子密度、化学发光、和放射性标记物)，以及间接检测
的模块，诸如酶或配体，例如通过酶促反应或分子相互作用。例示性的标记物包括但不限
32 14 125 3 131
于放射性同位素 P、C、 I、H、和 I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹
明及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利
No.4,737,456)，萤光素，2，3-二氢萘嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳
糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷
酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，偶联利用过氧化氢氧化染料前体的酶
诸如HRP、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳
定自由基等等。
的模块，诸如酶或配体，例如通过酶促反应或分子相互作用。例示性的标记物包括但不限
32 14 125 3 131
于放射性同位素 P、C、 I、H、和 I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹
明及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利
No.4,737,456)，萤光素，2，3-二氢萘嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳
糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷
酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，偶联利用过氧化氢氧化染料前体的酶
诸如HRP、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳
定自由基等等。
[0937] 在某些实施方案中，抗CD22抗体是固定化在不溶性基质上的。固定化能够将抗CD22抗体与仍然在溶液中游离的任何CD22分开。这可以如下常规进行：或是通过在
测定规程之前使抗CD22抗体不溶解，即通过吸附至水不溶性基质或表面(Bennich等，
U.S.3,720,760)或通过共价偶联(例如使用戊二醛交联)；或者通过在抗CD22抗体与CD22
之间形成复合物之后使抗CD22抗体不溶解，即例如通过免疫沉淀。
测定规程之前使抗CD22抗体不溶解，即通过吸附至水不溶性基质或表面(Bennich等，
U.S.3,720,760)或通过共价偶联(例如使用戊二醛交联)；或者通过在抗CD22抗体与CD22
之间形成复合物之后使抗CD22抗体不溶解，即例如通过免疫沉淀。
[0938] 可以使用本发明的免疫偶联物来实施诊断或检测的任何上述实施方案，或是用所述免疫偶联物替换抗CD22抗体或是所述免疫偶联物与抗CD22抗体一起使用。
[0939] 治疗方法
[0940] 本发明的抗体或免疫偶联物可用于例如体外、回体(ex vivo)、和体内治疗方法。一方面，本发明提供了在体内或在体外抑制细胞生长或增殖的方法，所述方法包括在容许
免疫偶联物结合CD22的条件下使细胞暴露于抗CD22抗体或其免疫偶联物。“抑制细胞生
长或增殖”意味着将细胞的生长或增殖降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、
80％、90％、95％、或 100％，而且包括诱导细胞死亡。在某些实施方案中，所述细胞是肿瘤
细胞。在某些实施方案中，所述细胞是B细胞。在某些实施方案中，所述细胞是异种移植物，
例如本文中所例示的。
免疫偶联物结合CD22的条件下使细胞暴露于抗CD22抗体或其免疫偶联物。“抑制细胞生
长或增殖”意味着将细胞的生长或增殖降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、
80％、90％、95％、或 100％，而且包括诱导细胞死亡。在某些实施方案中，所述细胞是肿瘤
细胞。在某些实施方案中，所述细胞是B细胞。在某些实施方案中，所述细胞是异种移植物，
例如本文中所例示的。
[0941] 一方面，本发明的抗体或免疫偶联物可用于治疗或预防B细胞增殖性病症。在某些实施方案中，所述细胞增殖性病症与CD22的表达和/或活性升高有关。例如，在某些实
施方案中，所述B细胞增殖性病症与B细胞表面上的CD22表达升高有关。在某些实施方案
中，所述B细胞增殖性病症是肿瘤或癌症。有待用本发明的抗体或免疫偶联物治疗的B细胞
增殖性病症的例子包括但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻
击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、
小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细
胞淋巴瘤。
施方案中，所述B细胞增殖性病症与B细胞表面上的CD22表达升高有关。在某些实施方案
中，所述B细胞增殖性病症是肿瘤或癌症。有待用本发明的抗体或免疫偶联物治疗的B细胞
增殖性病症的例子包括但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻
击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、
小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和套细
胞淋巴瘤。
[0942] 一方面，本发明提供了治疗B细胞增殖性病症的方法，包括给个体施用有效量的抗CD22抗体或其免疫偶联物。在某些实施方案中，用于治疗B细胞增殖性病症的方法包括
给个体施用有效量的药物配制剂，其包含抗CD22抗体或抗CD22免疫偶联物和任选的至少
一种别的治疗剂，诸如下文所提供的。在某些实施方案中，用于治疗细胞增殖性病症的方法
包括给个体施用有效量的药物配制剂，其包含1)包含抗CD22抗体与细胞毒剂的免疫偶联
物；和任选地2)至少一种别的治疗剂，诸如下文所提供的。
给个体施用有效量的药物配制剂，其包含抗CD22抗体或抗CD22免疫偶联物和任选的至少
一种别的治疗剂，诸如下文所提供的。在某些实施方案中，用于治疗细胞增殖性病症的方法
包括给个体施用有效量的药物配制剂，其包含1)包含抗CD22抗体与细胞毒剂的免疫偶联
物；和任选地2)至少一种别的治疗剂，诸如下文所提供的。
[0943] 一方面，本发明的至少有些抗体或免疫偶联物可结合来自人以外物种的CD22。因而，本发明的抗体或免疫偶联物可用于结合例如包含CD22的细胞培养物中的、人中的、或
具有本发明抗体或免疫偶联物与其交叉反应的CD22的其它哺乳动物(例如黑猩猩、狒狒、
狨、猕猴和恒河猴，猪或小鼠)中的CD22。在一个实施方案中，抗CD22抗体或免疫偶联物可
用于靶向B细胞上的CD22，其通过使所述抗体或免疫偶联物接触CD22以形成抗体或免疫偶
联物-抗原复合物使得免疫偶联物中所偶联的细胞毒素到达细胞内部来实现。在一个实施
方案中，所述CD22是人CD22。
具有本发明抗体或免疫偶联物与其交叉反应的CD22的其它哺乳动物(例如黑猩猩、狒狒、
狨、猕猴和恒河猴，猪或小鼠)中的CD22。在一个实施方案中，抗CD22抗体或免疫偶联物可
用于靶向B细胞上的CD22，其通过使所述抗体或免疫偶联物接触CD22以形成抗体或免疫偶
联物-抗原复合物使得免疫偶联物中所偶联的细胞毒素到达细胞内部来实现。在一个实施
方案中，所述CD22是人CD22。
[0944] 在一个实施方案中，抗CD22抗体或免疫偶联物可用于结合患有与CD22表达和/或活性升高有关的病症的个体中的CD22的方法，所述方法包括给个体施用抗体或免疫偶
联物使得个体中的CD22得到结合。在一个实施方案中，所结合的抗体或免疫偶联物内在化
入表达CD22的B细胞。在一个实施方案 中，所述CD22是人CD22，所述个体是人个体。或
者，所述个体可以是表达抗CD22抗体与其结合的CD22的哺乳动物。还有，所述个体可以是
导入了CD22的个体(例如通过施用CD22或通过表达编码CD22的转基因)。
联物使得个体中的CD22得到结合。在一个实施方案中，所结合的抗体或免疫偶联物内在化
入表达CD22的B细胞。在一个实施方案 中，所述CD22是人CD22，所述个体是人个体。或
者，所述个体可以是表达抗CD22抗体与其结合的CD22的哺乳动物。还有，所述个体可以是
导入了CD22的个体(例如通过施用CD22或通过表达编码CD22的转基因)。
[0945] 可以出于治疗目的将抗CD22抗体或免疫偶联物施用于人。此外，可以出于兽医目的或作为人类疾病的动物模型将抗CD22抗体或免疫偶联物施用于表达抗体与其交叉反应
的CD22的非人哺乳动物(例如灵长类动物、猪、大鼠、或小鼠)。关于后者，此类动物模型可
用于评估本发明抗体或免疫偶联物的治疗功效(例如测试施用的剂量和时间进程)。
的CD22的非人哺乳动物(例如灵长类动物、猪、大鼠、或小鼠)。关于后者，此类动物模型可
用于评估本发明抗体或免疫偶联物的治疗功效(例如测试施用的剂量和时间进程)。
[0946] 本发明的抗体或免疫偶联物可以在治疗中单独使用或联合其它组合物使用。例如，本发明的抗体或免疫偶联物可以与至少一种别的治疗剂和/或佐剂共施用。在某
些实施方案中，别的治疗剂是细胞毒剂、化疗剂、或生长抑制剂。在这样一个实施方案
中，化疗剂是诸如例如下列药剂或药剂组合，环磷酰胺、羟基柔红霉素、阿霉素、多柔比星
TM
(doxorubincin)、长春新碱(Oncovin )、泼尼松龙、CHOP、CVP、或COP、或免疫治疗剂诸如抗
CD20(例如 )或抗VEGF(例如 )，其中所述联合疗法可用于治疗癌症
和/或B细胞病症，诸如B细胞增殖性病症，包括淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性
NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性
白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病
(ALL)、和套细胞淋巴瘤。
些实施方案中，别的治疗剂是细胞毒剂、化疗剂、或生长抑制剂。在这样一个实施方案
中，化疗剂是诸如例如下列药剂或药剂组合，环磷酰胺、羟基柔红霉素、阿霉素、多柔比星
TM
(doxorubincin)、长春新碱(Oncovin )、泼尼松龙、CHOP、CVP、或COP、或免疫治疗剂诸如抗
CD20(例如 )或抗VEGF(例如 )，其中所述联合疗法可用于治疗癌症
和/或B细胞病症，诸如B细胞增殖性病症，包括淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性
NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性
白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病
(ALL)、和套细胞淋巴瘤。
[0947] 上文所述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多治疗剂包含在同一配制剂中或分开的配制剂中)和分开施用，其中本发明抗体或免疫偶联物的施用可以在别的治
疗剂和/或佐剂的施用之前、同时、和/或之后进行。本发明的抗体或免疫偶联物还可以与
放疗联合。
疗剂和/或佐剂的施用之前、同时、和/或之后进行。本发明的抗体或免疫偶联物还可以与
放疗联合。
[0948] 本发明的抗体或免疫偶联物(及任何别的治疗剂或佐剂)可以通过任何合适的手段来施用，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内，及损伤内施用(如果希望局部治疗的
话)。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。另外，通过脉冲输注来
施用抗体或免疫偶联物是合适的，特别是使用递减剂量的抗体或免疫偶联物。剂量给药可
以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂
的还是长时间的。
话)。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。另外，通过脉冲输注来
施用抗体或免疫偶联物是合适的，特别是使用递减剂量的抗体或免疫偶联物。剂量给药可
以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂
的还是长时间的。
[0949] 可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明的抗体或免疫偶联物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临
床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道
的其它因素。不是必需而是任选将抗体或免疫偶联物与目前用于预防或治疗所讨论病症的
一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体或免疫偶联
物的量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常是以与本文所用相同的剂量
和施用路径使用，或是本文所述剂量的大约1-99％，或是凭经验/在临床上确定为适宜的
任何剂量和任何路径。
床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道
的其它因素。不是必需而是任选将抗体或免疫偶联物与目前用于预防或治疗所讨论病症的
一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体或免疫偶联
物的量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常是以与本文所用相同的剂量
和施用路径使用，或是本文所述剂量的大约1-99％，或是凭经验/在临床上确定为适宜的
任何剂量和任何路径。
[0950] 对于疾病的预防或治疗，本发明抗体或免疫偶联物的适宜剂量(在单独使用或联合一种或多种其它别的治疗剂诸如化疗剂时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体或免疫偶
联物的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体或免疫偶联物是出于预防还是治疗目的、先
前的疗法、患者的临床史和对抗体或免疫偶联物的响应、及主治医师的判断。合适的是，一
次性或通过一系列治疗将抗体或免疫偶联物施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，施
用于患者的初始候选剂量可以是约1μg/kg至100mg/kg(例如0.1mg/kg-20mg/kg)抗体或
免疫偶联物，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素，典
型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药，
根据状况，通常持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。抗体或免疫偶联物的例示剂量的
范围可以是约0.05mg/kg至约10mg/kg。如此，可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg、
2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的抗体或免疫偶联物。此类剂量可间歇施
用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，例如约6剂抗体或免疫偶联
物)。可施用一剂较高的初始加载剂量，后续一剂或多剂较低剂量。例示性剂量给药方案包
括施用一剂约4mg/kg抗体的初始加载剂量，后续每周一剂约2mg/kg抗体的维持剂量。然
而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。
联物的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体或免疫偶联物是出于预防还是治疗目的、先
前的疗法、患者的临床史和对抗体或免疫偶联物的响应、及主治医师的判断。合适的是，一
次性或通过一系列治疗将抗体或免疫偶联物施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，施
用于患者的初始候选剂量可以是约1μg/kg至100mg/kg(例如0.1mg/kg-20mg/kg)抗体或
免疫偶联物，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素，典
型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药，
根据状况，通常持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。抗体或免疫偶联物的例示剂量的
范围可以是约0.05mg/kg至约10mg/kg。如此，可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg、
2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的抗体或免疫偶联物。此类剂量可间歇施
用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，例如约6剂抗体或免疫偶联
物)。可施用一剂较高的初始加载剂量，后续一剂或多剂较低剂量。例示性剂量给药方案包
括施用一剂约4mg/kg抗体的初始加载剂量，后续每周一剂约2mg/kg抗体的维持剂量。然
而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。
[0951] 测定法
[0952] 本发明的抗CD22抗体和免疫偶联物可以通过本领域知道的各种测定法来表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
[0953] 活性测定法
[0954] 一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗CD22抗体或其免疫偶联物的方法。生物学活性可以包括例如抑制细胞生长或增殖的能力(例如“细胞杀伤”活性)、或诱导细
胞死亡(包括程序性细胞死亡(凋亡))的能力。还提供了在体内和/或在体外具有此类
生物学活性的抗体或免疫偶联物。
胞死亡(包括程序性细胞死亡(凋亡))的能力。还提供了在体内和/或在体外具有此类
生物学活性的抗体或免疫偶联物。
[0955] 在某些实施方案中，测试抗CD22抗体或其免疫偶联物在体外抑制细胞生长或增殖的能力。抑制细胞生长或增殖的测定法是本领域公知的。细胞增殖的某些测定法，以
本文所述“细胞杀伤”测定法为例，测量细胞存活力(viability)。这样的一种测定法是
TM
CellTiter-Glo 发光细胞存活力测定法，其可购自Promega(Madison，WI)。该测定法基于
存在的ATP(有代谢活性的细胞的一项指标)的定量来测定培养物中的可存活细胞数。参见
Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160：81-88；美国专利No.6602677。该测定法可以以96
孔或384孔形式进行，使之适应自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree等(1995)AntiCancer
Drugs 6：398-404。该测定法规程牵涉直接向培养细胞添加单一试剂(CellTiter-
试剂)。这导致细胞溶解和通过萤光素酶反应产生的发光信号的生成。发光信号与存在的
ATP的量成正比，后者直接与培养物中存在的可存活细胞数成正比。可以通过光度计或CCD
照相机成像装置来记录数据。发光输出表述成相对光单位(RLU)。
本文所述“细胞杀伤”测定法为例，测量细胞存活力(viability)。这样的一种测定法是
TM
CellTiter-Glo 发光细胞存活力测定法，其可购自Promega(Madison，WI)。该测定法基于
存在的ATP(有代谢活性的细胞的一项指标)的定量来测定培养物中的可存活细胞数。参见
Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160：81-88；美国专利No.6602677。该测定法可以以96
孔或384孔形式进行，使之适应自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree等(1995)AntiCancer
Drugs 6：398-404。该测定法规程牵涉直接向培养细胞添加单一试剂(CellTiter-
试剂)。这导致细胞溶解和通过萤光素酶反应产生的发光信号的生成。发光信号与存在的
ATP的量成正比，后者直接与培养物中存在的可存活细胞数成正比。可以通过光度计或CCD
照相机成像装置来记录数据。发光输出表述成相对光单位(RLU)。
[0956] 细胞增殖的另一种测定法是“MTT”测定法，一种测量3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑氮溴化物被线粒体还原酶氧化成甲 (formazan)的比色测
TM
定法。像CellTiter-Glo 测定法一样，此测定法指示细胞培养物中存在的有代谢活性的细
胞的数目。参见例如Mosmann(1983)J.Immunol.Meth.65：55-63；及Zhang等(2005)Cancer
Res.65：3877-3882。
TM
定法。像CellTiter-Glo 测定法一样，此测定法指示细胞培养物中存在的有代谢活性的细
胞的数目。参见例如Mosmann(1983)J.Immunol.Meth.65：55-63；及Zhang等(2005)Cancer
Res.65：3877-3882。
[0957] 一方面，测试抗CD22抗体在体外诱导细胞死亡的能力。诱导细胞死亡的测定法是本领域公知的。在有些实施方案中，此类测定法测量例如膜完整性的丧失，其通过碘化丙啶
(PI)、锥虫蓝(参见Moore等(1995)Cytotechnology，17：1-11)、或7AAD的摄取来指示。在
一种例示性PI摄取测定法中，将细胞在补充有10％热灭活FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰
胺的Dulbecco氏改良Eagle培养基(D-MEM)∶Ham氏F-12(50∶50)中培养。如此，该测
6
定法在缺乏补体和免疫效应细胞时进行。将细胞以3×10 个/盘的密度接种入100×20mm
盘，并容许附着过夜。除去培养基，并用单独的新鲜培养基或含有各种浓度抗体或免 疫偶
联物的培养基更换。将细胞温育3天时间段。处理后，将细胞单层用PBS清洗，并通过胰
蛋白酶处理而脱离。然后将细胞于4℃以1200rpm离心5分钟，将沉淀物重悬于3ml冷的
2+
Ca 结合缓冲液(10mM Hepes，pH 7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)，并等分入35mm盖有滤
网(strainer-capped)的12×75mm管(1ml/管，3管/处理组)以除去细胞团块。然后
TM TM
向管中加入PI(10μg/ml)。使用FACSCAN 流式细胞仪和FACSCONVERT CellQuest软件
(BectonDickinson)分析样品。根据PI摄取的测定诱导统计学显著水平的细胞死亡的抗体
或免疫偶联物如此得到鉴定。
(PI)、锥虫蓝(参见Moore等(1995)Cytotechnology，17：1-11)、或7AAD的摄取来指示。在
一种例示性PI摄取测定法中，将细胞在补充有10％热灭活FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰
胺的Dulbecco氏改良Eagle培养基(D-MEM)∶Ham氏F-12(50∶50)中培养。如此，该测
6
定法在缺乏补体和免疫效应细胞时进行。将细胞以3×10 个/盘的密度接种入100×20mm
盘，并容许附着过夜。除去培养基，并用单独的新鲜培养基或含有各种浓度抗体或免 疫偶
联物的培养基更换。将细胞温育3天时间段。处理后，将细胞单层用PBS清洗，并通过胰
蛋白酶处理而脱离。然后将细胞于4℃以1200rpm离心5分钟，将沉淀物重悬于3ml冷的
2+
Ca 结合缓冲液(10mM Hepes，pH 7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)，并等分入35mm盖有滤
网(strainer-capped)的12×75mm管(1ml/管，3管/处理组)以除去细胞团块。然后
TM TM
向管中加入PI(10μg/ml)。使用FACSCAN 流式细胞仪和FACSCONVERT CellQuest软件
(BectonDickinson)分析样品。根据PI摄取的测定诱导统计学显著水平的细胞死亡的抗体
或免疫偶联物如此得到鉴定。
[0958] 一方面，测试抗CD22抗体或免疫偶联物在体外诱导凋亡(程序性细胞死亡)的能力。诱导凋亡的抗体或免疫偶联物的一种例示性测定法是膜联蛋白结合测定法。在一种例
示性的膜联蛋白结合测定法中，将细胞如上一段所述培养并接种入盘。除去培养基，并用
单独的新鲜培养基或含有0.001-10μg/ml抗体或免疫偶联物的培养基更换。3天温育期
后，将细胞单层用PBS清洗，并通过胰蛋白酶处理脱离。然后将细胞如上一段所述离心，重
2+
悬于Ca 结合缓冲液，并等分入管。然后向管中加入经过标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白
TM TM
V-FITC)(1μg/ml)。使用FACSCAN 流式细胞仪和FACSCONVERT CellQuest软件(Becton
Dickinson)分析样品。相对于对照诱导统计学显著水平的膜联蛋白结合的抗体或免疫偶
联物如此得到鉴定。诱导凋亡的抗体或免疫偶联物的另一种例示性测定法是组蛋白DNA
ELISA比色测定法，其用于检测基因组DNA的核小体间降解。此类测定法可使用例如细胞死
亡检测ELISA试剂盒(Roche，Palo Alto，CA)来进行。
示性的膜联蛋白结合测定法中，将细胞如上一段所述培养并接种入盘。除去培养基，并用
单独的新鲜培养基或含有0.001-10μg/ml抗体或免疫偶联物的培养基更换。3天温育期
后，将细胞单层用PBS清洗，并通过胰蛋白酶处理脱离。然后将细胞如上一段所述离心，重
2+
悬于Ca 结合缓冲液，并等分入管。然后向管中加入经过标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白
TM TM
V-FITC)(1μg/ml)。使用FACSCAN 流式细胞仪和FACSCONVERT CellQuest软件(Becton
Dickinson)分析样品。相对于对照诱导统计学显著水平的膜联蛋白结合的抗体或免疫偶
联物如此得到鉴定。诱导凋亡的抗体或免疫偶联物的另一种例示性测定法是组蛋白DNA
ELISA比色测定法，其用于检测基因组DNA的核小体间降解。此类测定法可使用例如细胞死
亡检测ELISA试剂盒(Roche，Palo Alto，CA)来进行。
[0959] 可用于任何上述体外测定法的细胞包括天然表达CD22或经改造而表达CD22的细胞或细胞系。此类细胞包括相对于同一组织起源的正常细胞过表达CD22的肿瘤细胞。此类
细胞还包括表达CD22的细胞系(包括肿瘤细胞系)和在正常情况下不表达CD22但经CD22
编码核酸转染的细胞系。
细胞还包括表达CD22的细胞系(包括肿瘤细胞系)和在正常情况下不表达CD22但经CD22
编码核酸转染的细胞系。
[0960] 一方面，测试抗CD22抗体或其免疫偶联物在体内抑制细胞生长或增殖的能力。在某些实施方案中，测试抗CD22抗体或其免疫偶联物在体内抑制肿瘤生长的能力。体内模
型系统，诸如异种移植物模型，可用于此类测试。在一种例示性异种移植物系统中，将人肿
瘤细胞导入适当免疫受损的非人动物，例如SCID小鼠。将本发明的抗体或免疫偶联物施
用于所述动物。测量抗体或免疫偶联物抑制或降低肿瘤生长的能力。在上述异种移植物
系统的某些 实施方案中，所述人肿瘤细胞是来自人类患者的肿瘤细胞。可用于制备异种移
植物模型的此类细胞包括人白血病和淋巴瘤细胞系，包括但不限于BJAB-luc细胞(经萤
光素酶报告基因转染的EBV阴性伯基特氏淋巴瘤细胞系、Ramos细胞(ATCC，Manassas，VA，
CRL-1923)、Raji细胞(ATCC，Manassas，VA，CCL-86)、SuDHL-4细胞(DSMZ，Braunschweig，
Germany，AAC 495)、DoHH2 细 胞 ( 参 见 Kluin-Neilemans，H.C. 等，Leukemia 5：
221-224(1991)及Kluin-Neilemans，H.C.等，Leukemia 8：1385-1391(1994))、Granta-519
细胞(参见Jadayel，D.M.等，Leukemia 11(1)：64-72(1997))。在某些实施方案中，通过
皮下注射或通过移植入合适的位点(诸如乳房脂肪垫)，将人肿瘤细胞导入适当免疫受损
的非人动物。
型系统，诸如异种移植物模型，可用于此类测试。在一种例示性异种移植物系统中，将人肿
瘤细胞导入适当免疫受损的非人动物，例如SCID小鼠。将本发明的抗体或免疫偶联物施
用于所述动物。测量抗体或免疫偶联物抑制或降低肿瘤生长的能力。在上述异种移植物
系统的某些 实施方案中，所述人肿瘤细胞是来自人类患者的肿瘤细胞。可用于制备异种移
植物模型的此类细胞包括人白血病和淋巴瘤细胞系，包括但不限于BJAB-luc细胞(经萤
光素酶报告基因转染的EBV阴性伯基特氏淋巴瘤细胞系、Ramos细胞(ATCC，Manassas，VA，
CRL-1923)、Raji细胞(ATCC，Manassas，VA，CCL-86)、SuDHL-4细胞(DSMZ，Braunschweig，
Germany，AAC 495)、DoHH2 细 胞 ( 参 见 Kluin-Neilemans，H.C. 等，Leukemia 5：
221-224(1991)及Kluin-Neilemans，H.C.等，Leukemia 8：1385-1391(1994))、Granta-519
细胞(参见Jadayel，D.M.等，Leukemia 11(1)：64-72(1997))。在某些实施方案中，通过
皮下注射或通过移植入合适的位点(诸如乳房脂肪垫)，将人肿瘤细胞导入适当免疫受损
的非人动物。
[0961] 结合测定法和其它测定法
[0962] 一方面，对抗CD22抗体测试其抗原结合活性。例如，在某些实施方案中，对抗CD22抗体测试其结合在细胞表面上表达的CD22的能力。可以将FACS测定法用于此类测试。
[0963] 一方面，可以将竞争测定法用于鉴定与鼠10F4.4.1抗体、人源化10F4v1抗体、人源化10F4v3抗体和/或鼠5E8.1.8抗体竞争结合CD22的单克隆抗体。在某些实施方案
中，此类竞争性抗体与鼠10F4.4.1抗体、人源化10F4v1抗体、人源化10F4v3抗体和/或鼠
5E8.1.8抗体结合相同的表位(例如线性表位或构象表位)。例示性的竞争测定法包括但
不限于常规测定法，诸如Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，14章
(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)中所提供的。定位抗体所结
合表位的详细的例示性方法见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols，”于Methods
in MolecularBiology卷66(Humana Press，Totowa，NJ)。若两种抗体各自阻断彼此50％
或更多的结合，则说这两种抗体结合相同表位。
中，此类竞争性抗体与鼠10F4.4.1抗体、人源化10F4v1抗体、人源化10F4v3抗体和/或鼠
5E8.1.8抗体结合相同的表位(例如线性表位或构象表位)。例示性的竞争测定法包括但
不限于常规测定法，诸如Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，14章
(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)中所提供的。定位抗体所结
合表位的详细的例示性方法见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols，”于Methods
in MolecularBiology卷66(Humana Press，Totowa，NJ)。若两种抗体各自阻断彼此50％
或更多的结合，则说这两种抗体结合相同表位。
[0964] 在一种例示性的竞争测定法中，将固定化的CD22在包含结合CD22的第一经标记抗体(例如鼠10F4.4.1抗体、人源化10F4v1抗体、人源化10F4v3抗体和/或鼠5E8.1.8抗
体)和要测试其与第一抗体竞争结合CD22的第二未标记抗体的溶液中温育。所述第二抗
体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的CD22在包含第一经标记抗体但没有
第二未标记抗体的溶液中温育。在容许第一抗体结合CD22的条件下温育后，除去过量的未
结合抗体，并测量与固定化的CD22结合的标记物的量。如果测试样品中与固定化CD22 结
合的标记物的量相对于对照样品有实质性降低，那么这指示所述第二抗体与所述第一抗体
竞争结合CD22。在某些实施方案中，固定化的CD22存在于细胞表面上或得自在其表面上表
达CD22的细胞的膜制备物中。
体)和要测试其与第一抗体竞争结合CD22的第二未标记抗体的溶液中温育。所述第二抗
体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的CD22在包含第一经标记抗体但没有
第二未标记抗体的溶液中温育。在容许第一抗体结合CD22的条件下温育后，除去过量的未
结合抗体，并测量与固定化的CD22结合的标记物的量。如果测试样品中与固定化CD22 结
合的标记物的量相对于对照样品有实质性降低，那么这指示所述第二抗体与所述第一抗体
竞争结合CD22。在某些实施方案中，固定化的CD22存在于细胞表面上或得自在其表面上表
达CD22的细胞的膜制备物中。
[0965] 一方面，纯化的抗CD22抗体可以通过一系列测定法进一步表征，包括但不限于N-末端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻、高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析、和
木瓜蛋白酶消化。
木瓜蛋白酶消化。
[0966] 在一个实施方案中，本发明涵盖改良的抗体，其具有一些但非所有效应器功能，这使之成为如下许多应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应器功
能(诸如补体和ADCC)不是必需的或有害的。在某些实施方案中，测量抗体的Fc活性以确
保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法来证实CDC和/或ADCC
活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法来确认抗体缺乏FcγR结
合(从此有可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细
胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，
Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国
专利No.5,500,362或5,821,337中记载了评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法
的例子。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)
细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如
Clynes等PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。还可以进行C1q结合测定法来证实
抗体不能结合C1q及从此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如
Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。还可以使用本领域
知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。
能(诸如补体和ADCC)不是必需的或有害的。在某些实施方案中，测量抗体的Fc活性以确
保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法来证实CDC和/或ADCC
活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法来确认抗体缺乏FcγR结
合(从此有可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细
胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，
Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国
专利No.5,500,362或5,821,337中记载了评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法
的例子。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)
细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如
Clynes等PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。还可以进行C1q结合测定法来证实
抗体不能结合C1q及从此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如
Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。还可以使用本领域
知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。
[0967] 实施例
[0968] 下文是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的全面描述，可以实施各种其它的实施方案。
[0969] 实施例1：鼠抗人CD22单克隆抗体的制备
[0970] 制备了能够特异性结合人CD22的鼠单克隆抗体。对六周龄BALB/c雌性小鼠在它们的爪垫中免疫接种Ribi氏佐剂中纯化后的缺乏结构域3和4的人 CD22加his-8标签
的胞外结构域(SEQ ID NO：30(ECD)在C末端加序列GRAHHHHHHHH)或者包含结构域1-7的
CD22加his-8标签的胞外结构域(SEQ ID NO：28(ECD)加上述His序列标签)。在初始免
疫接种后一周和三周，以同样的方式实施后续的注射。在最终注射后三天，将腹股沟和腘淋
巴结去除并合并，并通过将组织经过钢丝网(steel gauze)来制备单细胞悬液。将该细胞
与小鼠骨髓瘤，诸如P3X63-Ag8.653(ATCC CRL 1580)以4∶1比率在含50％w/v聚乙二
5
醇4000的高葡萄糖(DMEM)中融合。然后以2×10 每孔的密度将融合后的细胞铺于96孔
组织培养板中。24小时后，添加HAT选择性培养基(次黄嘌呤/氨基喋呤/胸苷，Sigma，
#H0262)。融合后14天，使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对正在生长的细胞的上清液测
试人CD22特异性抗体的存在。
的胞外结构域(SEQ ID NO：30(ECD)在C末端加序列GRAHHHHHHHH)或者包含结构域1-7的
CD22加his-8标签的胞外结构域(SEQ ID NO：28(ECD)加上述His序列标签)。在初始免
疫接种后一周和三周，以同样的方式实施后续的注射。在最终注射后三天，将腹股沟和腘淋
巴结去除并合并，并通过将组织经过钢丝网(steel gauze)来制备单细胞悬液。将该细胞
与小鼠骨髓瘤，诸如P3X63-Ag8.653(ATCC CRL 1580)以4∶1比率在含50％w/v聚乙二
5
醇4000的高葡萄糖(DMEM)中融合。然后以2×10 每孔的密度将融合后的细胞铺于96孔
组织培养板中。24小时后，添加HAT选择性培养基(次黄嘌呤/氨基喋呤/胸苷，Sigma，
#H0262)。融合后14天，使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对正在生长的细胞的上清液测
试人CD22特异性抗体的存在。
[0971] 根据显示抗体特异性结合人CD22的基于细胞的测定法和平板测定法，选择鼠抗人CD2210F4.4.1(mu 10F4)和5E8.1.8(mu 5E8)单克隆抗体，用于进一步研究。所述测定
法在后续段落中有描述。
法在后续段落中有描述。
[0972] 基于ELISA的测定法：如下实施通过ELISA的抗CD22抗体筛选，且于室温完成所有温育。将测试平板(Nunc Immunoplate)用50nM碳酸钠缓冲液(pH9.6)中纯化后的CD22
包被2小时，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中0.5％牛血清清蛋白封闭30分钟，然后用含
0.05％Tween 20的PBS(PBST)清洗4次。添加测试抗体上清液，并以摇动方式温育2小时，
然后用PBST清洗4次。通过添加100μl/孔溶液(在25ml磷酸盐柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)
中含有10mg二盐酸邻苯二胺(Sigma，#P8287)和10μl 30％过氧化氢溶液)并温育15分
钟来对所述平板显色。通过添加100μl/孔2.5M硫酸停止该反应。通过用自动化ELISA
读板仪在490nm吸光度读取该平板来获得数据。
包被2小时，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中0.5％牛血清清蛋白封闭30分钟，然后用含
0.05％Tween 20的PBS(PBST)清洗4次。添加测试抗体上清液，并以摇动方式温育2小时，
然后用PBST清洗4次。通过添加100μl/孔溶液(在25ml磷酸盐柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)
中含有10mg二盐酸邻苯二胺(Sigma，#P8287)和10μl 30％过氧化氢溶液)并温育15分
钟来对所述平板显色。通过添加100μl/孔2.5M硫酸停止该反应。通过用自动化ELISA
读板仪在490nm吸光度读取该平板来获得数据。
[0973] 实施例2：用于分析抗人CD22单克隆抗体(MAb)的基于FACS的测定法
[0974] 将在其表面上表达人CD22的CHO细胞与100μl FACS缓冲液(PBS，pH7.4中的0.1％BSA，10mM叠氮化钠)中抗CD22杂交瘤上清液在4℃温育30分钟，接着用FACS缓冲
液清洗一次。如下测定抗CD22结合的量：将抗体/细胞混合物的等分试样与多克隆的FITC
偶联的山羊或家兔抗小鼠IgG(AccurateChem.Co.，Westbury，NY)(用于鼠测试抗体)或者
山羊或家兔抗人IgG(用于人源化抗体)在4℃温育30分钟，接着用FACS缓冲液清洗三次。
液清洗一次。如下测定抗CD22结合的量：将抗体/细胞混合物的等分试样与多克隆的FITC
偶联的山羊或家兔抗小鼠IgG(AccurateChem.Co.，Westbury，NY)(用于鼠测试抗体)或者
山羊或家兔抗人IgG(用于人源化抗体)在4℃温育30分钟，接着用FACS缓冲液清洗三次。
[0975] 实施例3：人源化抗CD22抗体的制备
[0976] 产生了人源化10F4抗体，其中通过定点诱变(Kunkel等，Methods Enzymol.(1987)，154：367-382)修饰高变区(HVR)氨基酸残基(可互换地称为互补性决定区或
CDR)以得到两种变体，即人源化10F4v1和人源化10F4v2(本文中还分别称为“10F4v1”或
“hu10F4v1”或者“10F4v2”或“hu10F4v2”)。本文中所披露的一些研究中所使用的第三种
型式，即人源化10F4v3(“10F4v3”或“hu10Fv3”)具有与hu10F4v2相同的成熟蛋白质轻链
和重链氨基酸序列，但在用于蛋白质表达的载体中包含不同的信号序列。
CDR)以得到两种变体，即人源化10F4v1和人源化10F4v2(本文中还分别称为“10F4v1”或
“hu10F4v1”或者“10F4v2”或“hu10F4v2”)。本文中所披露的一些研究中所使用的第三种
型式，即人源化10F4v3(“10F4v3”或“hu10Fv3”)具有与hu10F4v2相同的成熟蛋白质轻链
和重链氨基酸序列，但在用于蛋白质表达的载体中包含不同的信号序列。
[0977] 如本文中所公开的实施鼠10F4抗体的人源化。简言之，将鼠10F4的轻链和重链高变区克隆入修饰后的共有框架序列，以产生图2A和2B中所示的轻链和重链可变区氨基
酸序列。图3和图4中显示了可用作本发明抗体的框架序列的备选轻链和重链框架序列。
酸序列。图3和图4中显示了可用作本发明抗体的框架序列的备选轻链和重链框架序列。
[0978] 将基本上如Lee等，J.Mol.Biol.340：1073-93(2004)所述，具有两个在phoA启动子控制下的可读框的单价Fab-g3展示载体(pV0350-2B)噬菌粒用于10F4抗体的人源
化。第一个可读框包含用于蛋白质分泌的大肠杆菌热稳定STII信号序列，其与受体轻链序
列的VL和CH1结构域融合。第二个可读框包含STII信号序列，其与受体重链序列的VH和
CH1结构域接着截短的次要噬菌体外壳蛋白P3融合。
化。第一个可读框包含用于蛋白质分泌的大肠杆菌热稳定STII信号序列，其与受体轻链序
列的VL和CH1结构域融合。第二个可读框包含STII信号序列，其与受体重链序列的VH和
CH1结构域接着截短的次要噬菌体外壳蛋白P3融合。
[0979] 将来自鼠10F4的VH和VL结构域(分别为SEQ ID NO：89和90)分别与人亚组III共有VH(huIII)结构域(SEQ ID NO：24)和人共有κI(huK1)结构域(SEQID NO：25)
比对。将鼠抗人CD22单抗10F4的高变区(HVR，可互换地称为互补性决定区(CDR))氨基
酸序列如下插入共有框架序列。将mu10F4抗体的轻链HVR (HVR-L1(Kabat位置24-34)、
HVR-L2(Kabat位置50-56)和HVR-L3(Kabat位置89-97))改造入人κI(huK1)共有序
列抗体框架，以生成人源化10F4v1轻链(SEQ ID NO：17，图2B)。将mu10F4抗体的重链
HVR(HVR-H1(Kabat位置26-35)、HVR-H2(Kabat位置49-65)和HVR-H3(Kabat位置95-102))
改造入修饰后的人亚组III(humIII)共有VH结构域(其在三个位置上不同于humIII序列：
使用了R71A、N73T和L78A(参见Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992))，
以生成人源化10F4v1重链可变区(SEQ ID NO：16，图2A)。通过使用针对各个高变区的分
开的寡核苷酸的Kunkel诱变来实施HVR 进入受体框架的遗传工程。通过标准DNA测序技
术来测定每个克隆的序列。依照Kabat编号方式(Kabat等(1991)，见上文)对图2A和2B
中所示高变区和框架区编号。对轻链和重链测序，并在图2A和2B中显示了huKI、humIII、
鼠10F4、人源化10F4v1和人源化10F4v2的可变域(包括HVR和框架区(FR))氨基酸序列。
人源化10F4v3抗体具有与10F4v2同样的氨基酸序列。
比对。将鼠抗人CD22单抗10F4的高变区(HVR，可互换地称为互补性决定区(CDR))氨基
酸序列如下插入共有框架序列。将mu10F4抗体的轻链HVR (HVR-L1(Kabat位置24-34)、
HVR-L2(Kabat位置50-56)和HVR-L3(Kabat位置89-97))改造入人κI(huK1)共有序
列抗体框架，以生成人源化10F4v1轻链(SEQ ID NO：17，图2B)。将mu10F4抗体的重链
HVR(HVR-H1(Kabat位置26-35)、HVR-H2(Kabat位置49-65)和HVR-H3(Kabat位置95-102))
改造入修饰后的人亚组III(humIII)共有VH结构域(其在三个位置上不同于humIII序列：
使用了R71A、N73T和L78A(参见Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992))，
以生成人源化10F4v1重链可变区(SEQ ID NO：16，图2A)。通过使用针对各个高变区的分
开的寡核苷酸的Kunkel诱变来实施HVR 进入受体框架的遗传工程。通过标准DNA测序技
术来测定每个克隆的序列。依照Kabat编号方式(Kabat等(1991)，见上文)对图2A和2B
中所示高变区和框架区编号。对轻链和重链测序，并在图2A和2B中显示了huKI、humIII、
鼠10F4、人源化10F4v1和人源化10F4v2的可变域(包括HVR和框架区(FR))氨基酸序列。
人源化10F4v3抗体具有与10F4v2同样的氨基酸序列。
[0980] 通过本领域已知的多种方法制备了编码抗体、抗体片段、VL结构域或VH结构域的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源(在天然存在的氨基酸序
列变体的情况中)分离或通过对早期制备的变体或非变体型式的抗体、抗体片段、VL结构
域或VH结构域进行寡核苷酸介导的诱变(或定点诱变)、PCR诱变和盒式诱变来制备。例
如，可以使用Kunkel的方法通过寻找(targeting)VH中和任选的一个或多个CDR中VL可
及氨基酸位置并用变体氨基酸进行氨基酸替代来创建文库。参见例如Kunkel等，Methods
Enzymol.(1987)，154：367-382和本文中的实施例。下文实施例中还描述了随机化序列的
产生。
列变体的情况中)分离或通过对早期制备的变体或非变体型式的抗体、抗体片段、VL结构
域或VH结构域进行寡核苷酸介导的诱变(或定点诱变)、PCR诱变和盒式诱变来制备。例
如，可以使用Kunkel的方法通过寻找(targeting)VH中和任选的一个或多个CDR中VL可
及氨基酸位置并用变体氨基酸进行氨基酸替代来创建文库。参见例如Kunkel等，Methods
Enzymol.(1987)，154：367-382和本文中的实施例。下文实施例中还描述了随机化序列的
产生。
[0981] 寡核苷酸的序列对于本发明多肽的CDR(HVR)或FR区中的特定位置包括一种或多种经设计的密码子集合(codon set)。密码子集合是用于编码期望变体氨基酸的一套不同
的核苷酸三联体序列。依照IUB代码，可使用符号来代表密码子集合以指明特定核苷酸或
核苷酸等摩尔混合物，正如下文所示。
的核苷酸三联体序列。依照IUB代码，可使用符号来代表密码子集合以指明特定核苷酸或
核苷酸等摩尔混合物，正如下文所示。
[0982] IUB代码
[0983] G 鸟嘌呤
[0984] A 腺嘌呤
[0985] T 胸腺嘧啶
[0986] C 胞嘧啶
[0987] R (A或G)
[0988] Y (C或T)
[0989] M (A或C)
[0990] K (G或T)
[0991] S (C或G)
[0992] W (A或T)
[0993] H (A或C或T)
[0994] B (C或G或T)
[0995] V (A或C或G)
[0996] D (A或G或T)
[0997] N (A或C或G或T)
[0998] 例如，在密码子集合DVK中，D可以是核苷酸A或G或T；V可以是A或G或C；而K可以是G或T。该密码子集合可以表示18种不同的密码子，且可以编码氨基酸Ala、Trp、
Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。
Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。
[0999] 可以使用标准方法来合成寡核苷酸或引物集合。可以合成(例如通过固相合成)含下列序列的一套寡核苷酸，所述序列代表由该密码子集合所提供的核苷酸三联体的所有
可能组合，且其会编码期望的一组氨基酸。在某些位置上具有选定核苷酸“简并性”的寡核
苷酸的合成是那一领域中公知的。具有某些密码子集合的此类核苷酸集合可以使用商品化
的核酸合成仪(可购自例如Applied Biosystems，Foster City，CA)合成，或者可以商购
(例如购自Life Technologies，Rockville，MD)。因此，具有特定密码子集合的一套合成寡
核苷酸会典型地包括具有不同序列的多个寡核苷酸，其差异由全序列内的密码子集合来确
立。在依照本发明使用时，寡核苷酸具有容许杂交至可变域核酸模板的序列，且还可以包括
用于克隆目的的限制酶位点。
可能组合，且其会编码期望的一组氨基酸。在某些位置上具有选定核苷酸“简并性”的寡核
苷酸的合成是那一领域中公知的。具有某些密码子集合的此类核苷酸集合可以使用商品化
的核酸合成仪(可购自例如Applied Biosystems，Foster City，CA)合成，或者可以商购
(例如购自Life Technologies，Rockville，MD)。因此，具有特定密码子集合的一套合成寡
核苷酸会典型地包括具有不同序列的多个寡核苷酸，其差异由全序列内的密码子集合来确
立。在依照本发明使用时，寡核苷酸具有容许杂交至可变域核酸模板的序列，且还可以包括
用于克隆目的的限制酶位点。
[1000] 在一种方法中，可通过寡核苷酸介导的诱变产生编码变体氨基酸的核酸序列。该技术是本领域公知的，如Zoller等，1987，Nucleic Acids Res.10：6487-6504所记载。简
言之，通过将编码期望密码子集合的寡核苷酸集合杂交至DNA模板来产生编码变体氨基酸
的核酸序列，其中该模板是含有可变区核酸模板序列的单链形式质粒。杂交后，使用DNA聚
合酶合成该模板的整个第二条互补链，因而其会掺入寡核苷酸引物，并会含有寡核苷酸集
合所提供的密码子集合。
言之，通过将编码期望密码子集合的寡核苷酸集合杂交至DNA模板来产生编码变体氨基酸
的核酸序列，其中该模板是含有可变区核酸模板序列的单链形式质粒。杂交后，使用DNA聚
合酶合成该模板的整个第二条互补链，因而其会掺入寡核苷酸引物，并会含有寡核苷酸集
合所提供的密码子集合。
[1001] 一般地，使用长度至少为25个核苷酸的寡核苷酸。最优的寡核苷酸会具有12至15个核苷酸，其与编码一个或多个突变的一个或多个核苷酸的任一侧上的模板完全互补。
这确保该寡核苷酸会正确杂交至单链DNA模板分子。使用本领域已知的技术，诸如Crea等，
Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，75：5765(1978)所记载的，轻易地合成该寡核苷酸。
这确保该寡核苷酸会正确杂交至单链DNA模板分子。使用本领域已知的技术，诸如Crea等，
Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，75：5765(1978)所记载的，轻易地合成该寡核苷酸。
[1002] 通过载体产生DNA模板，所述载体或是那些衍生自噬菌体M13载体的(商品化的M13mp18和M13mp19载体是适合的)，或是那些含有单链噬菌体复 制起点的，如Viera等，
Meth.Enzymol.，153：3(1987)所述。如此，可将待突变的DNA插入这些载体之一以产生单
链模板。单链模板的生成记载于Sambrook等(见上文)第4.21-4.41节。
Meth.Enzymol.，153：3(1987)所述。如此，可将待突变的DNA插入这些载体之一以产生单
链模板。单链模板的生成记载于Sambrook等(见上文)第4.21-4.41节。
[1003] 为了改变天然DNA序列，将寡核苷酸在合适的杂交条件下杂交至单链模板。然后添加DNA聚合酶(通常是T7DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow片段)以合成该模板的
互补链，其中使用该寡核苷酸作为用于合成的引物。如此，形成异源双链体分子，使得DNA
的一条链编码基因1的突变形式，而另一条链(原始模板)编码基因1的天然的、未改变的
序列。然后将该异源双链体分子转化入合适的宿主细胞，通常是原核细胞，诸如大肠杆菌
JM101。在培养该细胞后，将它们铺在琼脂糖平板上，并使用经32-磷酸盐放射性标记的寡
核苷酸引物来筛选以鉴定含突变型DNA的细菌菌落。
互补链，其中使用该寡核苷酸作为用于合成的引物。如此，形成异源双链体分子，使得DNA
的一条链编码基因1的突变形式，而另一条链(原始模板)编码基因1的天然的、未改变的
序列。然后将该异源双链体分子转化入合适的宿主细胞，通常是原核细胞，诸如大肠杆菌
JM101。在培养该细胞后，将它们铺在琼脂糖平板上，并使用经32-磷酸盐放射性标记的寡
核苷酸引物来筛选以鉴定含突变型DNA的细菌菌落。
[1004] 可以修改上文刚刚描述的方法，使得产生同源双链体分子，其中质粒的两条链都含有一个或多个突变。所述修改如下：将单链寡核苷酸退火至上文所述单链模板。将
三种脱氧核糖核苷酸即脱氧核糖腺苷酸(deoxyriboadenosine)(dATP)、脱氧核糖鸟苷酸
(deoxyriboguanosine)(dGTP)和脱氧核糖胸苷酸(deoxyribothymidine)(dTT))的混合
物与称为dCTP-(aS)的经修饰硫醇脱氧核糖胞苷酸(thiodeoxyribocytosine)(其可获自
Amersham)混合。将该混合物添加至模板-寡核苷酸复合物。在将DNA聚合酶添加至该混
合物后，产生在突变碱基之外与模板同样的DNA链。另外，该DNA新链会含有替代dCTP的
dCTP-(aS)，其发挥保护该DNA新链免受限制性内切核酸酶消化的作用。在用合适的限制酶
使双链异源双链体的模板链产生缺刻后，可以用ExoIII核酸酶或另一种合适的核酸酶消
化该模板链，越过含有待诱变位点的区域。然后停止该反应以使分子仅是部分为单链。然
后在存在所有四种脱氧核糖核苷酸三磷酸、ATP和DNA连接酶时，使用DNA聚合酶来形成完
整的双链DNA同源双链体。然后可以将该同源双链体分子转化入合适的宿主细胞。
三种脱氧核糖核苷酸即脱氧核糖腺苷酸(deoxyriboadenosine)(dATP)、脱氧核糖鸟苷酸
(deoxyriboguanosine)(dGTP)和脱氧核糖胸苷酸(deoxyribothymidine)(dTT))的混合
物与称为dCTP-(aS)的经修饰硫醇脱氧核糖胞苷酸(thiodeoxyribocytosine)(其可获自
Amersham)混合。将该混合物添加至模板-寡核苷酸复合物。在将DNA聚合酶添加至该混
合物后，产生在突变碱基之外与模板同样的DNA链。另外，该DNA新链会含有替代dCTP的
dCTP-(aS)，其发挥保护该DNA新链免受限制性内切核酸酶消化的作用。在用合适的限制酶
使双链异源双链体的模板链产生缺刻后，可以用ExoIII核酸酶或另一种合适的核酸酶消
化该模板链，越过含有待诱变位点的区域。然后停止该反应以使分子仅是部分为单链。然
后在存在所有四种脱氧核糖核苷酸三磷酸、ATP和DNA连接酶时，使用DNA聚合酶来形成完
整的双链DNA同源双链体。然后可以将该同源双链体分子转化入合适的宿主细胞。
[1005] 如之前所指出，寡核苷酸集合的序列长度对于杂交至模板核酸是足够的，但不是必需含有限制性位点。通过载体产生DNA模板，所述载体或是那些衍生自噬菌体M13载体
的，或是含有单链噬菌体复制起点的，如Viera等Meth.Enzymol.，153：3(1987)所述。如此，
必须将待突变的DNA插入这些载体之一以产生单链模板。单链模板的产生记载于Sambrook
等(见上文)第4.21-4.41节。
的，或是含有单链噬菌体复制起点的，如Viera等Meth.Enzymol.，153：3(1987)所述。如此，
必须将待突变的DNA插入这些载体之一以产生单链模板。单链模板的产生记载于Sambrook
等(见上文)第4.21-4.41节。
[1006] 依照另一种方法，可以如下产生文库，即提供上游和下游寡核苷酸集合，每个集合具有众多寡核苷酸，其具有不同的序列，所述不同序列由寡核苷酸序列内提供的密码子集
合所确立。可以在聚合酶链式反应中使用上游和下游寡核苷酸集合，以及可变域模板核酸
序列以产生PCR产物“文库”。该PCR产物可以称为“核酸盒”，因为它们可以与其它有关的
或无关的核酸序列(例如病毒外壳蛋白和二聚化结构域)融合，其使用已确立的分子生物
学技术。
合所确立。可以在聚合酶链式反应中使用上游和下游寡核苷酸集合，以及可变域模板核酸
序列以产生PCR产物“文库”。该PCR产物可以称为“核酸盒”，因为它们可以与其它有关的
或无关的核酸序列(例如病毒外壳蛋白和二聚化结构域)融合，其使用已确立的分子生物
学技术。
[1007] 可以在使用可变域核酸模板序列作为模板的聚合酶链式反应中使用寡核苷酸集合以产生核酸盒。该可变域核酸模板序列可以是含有靶核酸序列(即编码有待替代的氨基
酸的核酸序列)的免疫球蛋白重链任何部分。该可变区核酸模板序列是具有第一条核酸链
和互补的第二条核酸链的双链DNA分子的一部分。该可变域核酸模板序列含有可变域的至
少一部分，并具有至少一个CDR。在有些情况中，该可变域核酸模板序列含有超过一个CDR。
上游寡核苷酸集合和下游寡核苷酸集合的成员的杂交可以以可变域核酸模板序列的上游
部分和下游部分为靶物。
酸的核酸序列)的免疫球蛋白重链任何部分。该可变区核酸模板序列是具有第一条核酸链
和互补的第二条核酸链的双链DNA分子的一部分。该可变域核酸模板序列含有可变域的至
少一部分，并具有至少一个CDR。在有些情况中，该可变域核酸模板序列含有超过一个CDR。
上游寡核苷酸集合和下游寡核苷酸集合的成员的杂交可以以可变域核酸模板序列的上游
部分和下游部分为靶物。
[1008] 上游引物集合的第一个寡核苷酸可以杂交至第一条核酸链，而下游引物集合的第二个寡核苷酸可以杂交至第二条核酸链。寡核苷酸引物可包括一个或多个密码子集合，并
设计成杂交至可变区核酸模板序列的一部分。在PCR之后，这些寡核苷酸的使用可以将两
个或更多个密码子集合引入PCR产物(即核酸盒)。杂交至核酸序列中编码抗体可变域的
区域的寡核苷酸引物包括编码CDR残基(其作为氨基酸替代的靶物)的部分。
设计成杂交至可变区核酸模板序列的一部分。在PCR之后，这些寡核苷酸的使用可以将两
个或更多个密码子集合引入PCR产物(即核酸盒)。杂交至核酸序列中编码抗体可变域的
区域的寡核苷酸引物包括编码CDR残基(其作为氨基酸替代的靶物)的部分。
[1009] 还可以合成上游和下游寡核苷酸集合以包括寡核苷酸序列内的限制性位点。这些限制性位点可以便于核酸盒(即PCR反应产物)插入具有别的抗体序列的表达载体。在一
个实施方案中，将限制性位点设计成便于核酸盒的克隆，而不导入额外核酸序列或消除最
初的CDR或框架核酸序列。
个实施方案中，将限制性位点设计成便于核酸盒的克隆，而不导入额外核酸序列或消除最
初的CDR或框架核酸序列。
[1010] 可以将核酸盒克隆入任何适于表达部分或完整的轻链或重链序列的载体，其含有经PCR反应产生的目标氨基酸替代。依照本发明中详述的方法，将该核酸盒克隆入容许生
成与整个或部分病毒外壳蛋白融合的部分或完整轻链或重链序列(即产生融合蛋白)的载
体并展示在颗粒或细胞的表面上。虽然数种类型的载体是可获得的，并可用于实施本发明，
但噬菌粒载体是用于此处的优选载体，因为它们可以相对容易地构建，而且可以轻易地扩
增。一般地，噬菌粒载体含有多种构件，包括启动子、信号序列、表型选择基因、 复制起点、
和本领域普通技术人员知道的其它必需构件。
成与整个或部分病毒外壳蛋白融合的部分或完整轻链或重链序列(即产生融合蛋白)的载
体并展示在颗粒或细胞的表面上。虽然数种类型的载体是可获得的，并可用于实施本发明，
但噬菌粒载体是用于此处的优选载体，因为它们可以相对容易地构建，而且可以轻易地扩
增。一般地，噬菌粒载体含有多种构件，包括启动子、信号序列、表型选择基因、 复制起点、
和本领域普通技术人员知道的其它必需构件。
[1011] 在要表达特定变体氨基酸组合时，核酸盒含有能够编码整个或部分重链或轻链可变域且能够编码变体氨基酸组合的序列。为了生成含有这些变体氨基酸或变体氨基酸组合
的抗体，像在文库中，可以将核酸盒插入含有别的抗体序列(例如轻链和重链可变区的整
个或部分可变域或恒定域)的表达载体。还可以将这些别的抗体序列与其它核酸序列(诸
如编码病毒外壳蛋白的序列)融合，并因此容许生成融合蛋白。
的抗体，像在文库中，可以将核酸盒插入含有别的抗体序列(例如轻链和重链可变区的整
个或部分可变域或恒定域)的表达载体。还可以将这些别的抗体序列与其它核酸序列(诸
如编码病毒外壳蛋白的序列)融合，并因此容许生成融合蛋白。
[1012] 实施例4：可变区序列测定
[1013] 通过标准规程测定了鼠的和人源化的10F4单克隆抗体的核酸和氨基酸序列。使用 迷你试剂盒(Qiagen，德国)，从产生小鼠抗人CD2210F4.4.1单克隆抗体的杂
交瘤细胞中提取总RNA。使用RT-PCR以简并引物扩增轻链可变域(VL)和重链可变域(VH)。
正向引物对该抗体的VL区和VH区的N末端氨基酸序列是特异性的。分别地，将该轻链和
重链反向引物设计成退火至轻链恒定域(CL)和重链恒定域1(CH1)中的区域，其在种间是
高度保守的。将扩增的VH和VL克隆入pRK哺乳动物细胞表达载体(Shields等，J.Biol.
Chem.276：659-04(2000))。使用常规测序方法测定插入片段的多核苷酸序列。在图2A和
2B中显示了鼠嵌合10F4和人源化10F4v1和人源化10F4v2的轻链和重链可变区的氨基酸
序列。
交瘤细胞中提取总RNA。使用RT-PCR以简并引物扩增轻链可变域(VL)和重链可变域(VH)。
正向引物对该抗体的VL区和VH区的N末端氨基酸序列是特异性的。分别地，将该轻链和
重链反向引物设计成退火至轻链恒定域(CL)和重链恒定域1(CH1)中的区域，其在种间是
高度保守的。将扩增的VH和VL克隆入pRK哺乳动物细胞表达载体(Shields等，J.Biol.
Chem.276：659-04(2000))。使用常规测序方法测定插入片段的多核苷酸序列。在图2A和
2B中显示了鼠嵌合10F4和人源化10F4v1和人源化10F4v2的轻链和重链可变区的氨基酸
序列。
[1014] 在HVR-L1的第28位处进一步修饰人源化10F4v1(SEQ ID NO：9)(参见图2B)。用缬氨酸残基替代那个位置上的天冬酰胺残基(N28V)以产生HVR-L1(SEQ ID NO：10)，用于
hu10F4v2和hu10F4v3变体，其显示了改进的结合亲和力。这些变体包含与成熟抗体相同的
可变域和恒定域序列，而仅在本发明成熟抗体中没有找到的信号序列上不同。
hu10F4v2和hu10F4v3变体，其显示了改进的结合亲和力。这些变体包含与成熟抗体相同的
可变域和恒定域序列，而仅在本发明成熟抗体中没有找到的信号序列上不同。
[1015] 在hu10F4v1HVR-L1高变区(参见图2B)的氨基酸Asn28(N28)和/或Asn30(N30)之一或两者上产生别的氨基酸序列修饰。因为N28和N30是可能用于脱氨基作用的位点，
因此测试了在这些位点上的氨基酸改变。例如，择一地用A、Q、S、D、V或I替代第28位天
冬酰胺(N28)，且择一地用A或Q替代第30位天冬酰胺(N30)。表2中提供了依照本发明
的HVR-L1结构域中的氨基酸序列改变以及它们的结合亲和力，其使用标准规程以噬菌体
ELISA测定法形式的竞争分析(IC50)来测试。
因此测试了在这些位点上的氨基酸改变。例如，择一地用A、Q、S、D、V或I替代第28位天
冬酰胺(N28)，且择一地用A或Q替代第30位天冬酰胺(N30)。表2中提供了依照本发明
的HVR-L1结构域中的氨基酸序列改变以及它们的结合亲和力，其使用标准规程以噬菌体
ELISA测定法形式的竞争分析(IC50)来测试。
[1016] 表2：hu10F4v1抗体的替代变体
[1017]HVR-L1中的氨基酸改变 图2B HVR-L1SEQ ID NO 结合亲和力(nM)
没有改变 (N28，N30) 9 8
N28A，N30 19 8
N28Q，N30 20 7.3
N28S，N30 21 12
N28D，N30 22 12
N28V，N30 10 7.3
N28I，N30 23 9.8
N28，N30A 32 7.7
N28，N30Q 33 10
没有改变 (N28，N30) 9 8
N28A，N30 19 8
N28Q，N30 20 7.3
N28S，N30 21 12
N28D，N30 22 12
N28V，N30 10 7.3
N28I，N30 23 9.8
N28，N30A 32 7.7
N28，N30Q 33 10
[1018] 为了产生人源化10F4抗体的全长人IgG1型式，将重链和轻链分开地亚克隆入先前所述的pRK粒(Gorman，C.M.等(1990)，DNA Protein Eng.Tech.2：3)。使用高效规程
(Graham等，见上文和Gorman，C.M.，Science 221：551)，将合适的重链和轻链质粒(依赖
于期望的序列改变)共转染入经腺病毒转化的人胚肾细胞系(称为293(Graham，F.L等
(1977)，J.Gen.Virol.36：59))。将培养基更换成无血清的，并每天收获，多至5天。使用蛋
白A-Sepharose CL-4B(Pharmacia)从合并的上清液中纯化抗体。将洗脱的抗体通过G25
凝胶过滤更换缓冲液入PB S，使用Centriprep-30或Centricon-100(Millipore)通过超滤
作用浓缩，并存储在4℃。使用总IgG结合ELISA测定抗体浓度。
(Graham等，见上文和Gorman，C.M.，Science 221：551)，将合适的重链和轻链质粒(依赖
于期望的序列改变)共转染入经腺病毒转化的人胚肾细胞系(称为293(Graham，F.L等
(1977)，J.Gen.Virol.36：59))。将培养基更换成无血清的，并每天收获，多至5天。使用蛋
白A-Sepharose CL-4B(Pharmacia)从合并的上清液中纯化抗体。将洗脱的抗体通过G25
凝胶过滤更换缓冲液入PB S，使用Centriprep-30或Centricon-100(Millipore)通过超滤
作用浓缩，并存储在4℃。使用总IgG结合ELISA测定抗体浓度。
[1019] 依照本发明的例示性重链IgG1恒定域在图5A中有描述。例示性人轻链κ恒定域包含例如
[1020] RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHDVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：37)。h10F4v2的全长氨基酸序
列显示在图5B中，其中通过划下划线指出轻链和重链的恒定区。h10F4v1、v2和v3抗体是
IgG1同种性。
列显示在图5B中，其中通过划下划线指出轻链和重链的恒定区。h10F4v1、v2和v3抗体是
IgG1同种性。
[1021] 抗CD22抗体的表征
[1022] 实施例5：表位作图
[1023] 依照如下规程确定了10F4.4.1和5E8.1.8抗体结合的CD22表位。将缺乏CD22主要同等型(CD22β)的7个免疫球蛋白样结构域之任一个或多个的CD22序列克隆并转化
入细胞，用于稳定表达。例如，将缺乏结构域1(Δ1)、结构域2(Δ2)、或结构域3和4(Δ3，
4)的CD22变体克隆、转化入CHO细胞，并在该细胞上表达。对照细胞表达CD22β。使用
Stratagene QuikChange XLTM试剂盒实施删除。通过删除第22-138位氨基酸来实施结构域
1的删除；通过删除第139-242位氨基酸来实施结构域2的删除；且删除的结构域3和4可
用作次要同等型CD22α(删除第241-417位氨基酸)。所有的氨基酸数值指Wilson，G.L.等
(参见Wilson，G.L.等，J.Exp.Med.173：137-146(1991)中的图1)的全长前体CD22β的编
号方式。图14是删除的结构域的图示。使用同种型对照通过流式细胞术测定结合。使用山
羊抗小鼠IgG Alexa 488检测10F4.4.1的结合。使用生物素化山羊抗小鼠IgG加链霉亲
合素PE来检测5E8.1.8的结合。在不存在特定ECD结构域时对鼠10F4.4.1或鼠5E8.1.8
抗体结合的不利影响表明该抗体结合那些结构域。鼠10F4.4.1和5E8.1.8在这些条件下
显示相同的结合特征。两者都不结合缺乏结构域1或结构域2的CD22，而都结合包含结构
域1和2但缺乏结构域3和4的CD22。使用该方法，确定了10F4.4.1和5E8.1.8结合人
CD22的结构域1和2，在SEQ ID NO：27第22位氨基酸至第240位氨基酸的序列内(参见
Wilson，G.L.等(1991)见上文)。
入细胞，用于稳定表达。例如，将缺乏结构域1(Δ1)、结构域2(Δ2)、或结构域3和4(Δ3，
4)的CD22变体克隆、转化入CHO细胞，并在该细胞上表达。对照细胞表达CD22β。使用
Stratagene QuikChange XLTM试剂盒实施删除。通过删除第22-138位氨基酸来实施结构域
1的删除；通过删除第139-242位氨基酸来实施结构域2的删除；且删除的结构域3和4可
用作次要同等型CD22α(删除第241-417位氨基酸)。所有的氨基酸数值指Wilson，G.L.等
(参见Wilson，G.L.等，J.Exp.Med.173：137-146(1991)中的图1)的全长前体CD22β的编
号方式。图14是删除的结构域的图示。使用同种型对照通过流式细胞术测定结合。使用山
羊抗小鼠IgG Alexa 488检测10F4.4.1的结合。使用生物素化山羊抗小鼠IgG加链霉亲
合素PE来检测5E8.1.8的结合。在不存在特定ECD结构域时对鼠10F4.4.1或鼠5E8.1.8
抗体结合的不利影响表明该抗体结合那些结构域。鼠10F4.4.1和5E8.1.8在这些条件下
显示相同的结合特征。两者都不结合缺乏结构域1或结构域2的CD22，而都结合包含结构
域1和2但缺乏结构域3和4的CD22。使用该方法，确定了10F4.4.1和5E8.1.8结合人
CD22的结构域1和2，在SEQ ID NO：27第22位氨基酸至第240位氨基酸的序列内(参见
Wilson，G.L.等(1991)见上文)。
[1024] 实施例6：对可溶性抗原的结合亲和力的表征
[1025] 使用 3000系统(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)通过表面等离振子共振测量测定了鼠和人源化10F4抗体对可溶性CD22胞外结构域(ECD)的结合亲和
力。简言之，将羧甲基化的右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BiacoreInc.)用盐酸N-乙
基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)依照供应商的
说明书来活化。用以10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml的抗CD22IgG1抗体10F4(鼠的
或人源化的)包被这些经活化的芯片，之后，以5μl/分钟的流速注射偶联抗体以达到大约
500应答单位(RU)。继而，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以
30μl/分钟的流速注射人CD22β-ECD-His标签的可溶性抗原在含0.05％Tween 20的PBS
中的二倍连续稀释物(大约500nM至大约7.8nM)。使用简单一对一朗格缪尔 (Langmuir)
结合模型(BIAevaluation软件3.2版)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/
kon计算平衡解离常数(Kd)。使用抗CD22抗体RFB4作为对照(Chemicon International，
Inc.，Temecula，CA，产品目录No.CBL147)。该实验结果显示在下文表2中。
力。简言之，将羧甲基化的右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BiacoreInc.)用盐酸N-乙
基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)依照供应商的
说明书来活化。用以10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml的抗CD22IgG1抗体10F4(鼠的
或人源化的)包被这些经活化的芯片，之后，以5μl/分钟的流速注射偶联抗体以达到大约
500应答单位(RU)。继而，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以
30μl/分钟的流速注射人CD22β-ECD-His标签的可溶性抗原在含0.05％Tween 20的PBS
中的二倍连续稀释物(大约500nM至大约7.8nM)。使用简单一对一朗格缪尔 (Langmuir)
结合模型(BIAevaluation软件3.2版)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/
kon计算平衡解离常数(Kd)。使用抗CD22抗体RFB4作为对照(Chemicon International，
Inc.，Temecula，CA，产品目录No.CBL147)。该实验结果显示在下文表2中。
[1026] 表2：抗CD22对可溶性人CD22的结合亲和力( 分析)
[1027]克隆 kon/105 koff/10-4 Kd(nM)
鼠10F4 0.19 2.8 15
嵌合10F4 0.26 4.2 16
人源化10F4v1 0.18 3.5 19
人源化10F4v2 0.32 2.5 7.8
对照RFB4 0.33 1.4 4.2
鼠10F4 0.19 2.8 15
嵌合10F4 0.26 4.2 16
人源化10F4v1 0.18 3.5 19
人源化10F4v2 0.32 2.5 7.8
对照RFB4 0.33 1.4 4.2
[1028] 实施例7：对细胞表面抗原的结合亲和力的表征
[1029] 使用竞争测定法检查了鼠10F4.4.1和人源化10F4v1和10F4v2对CHO细胞表面上表达的人和猕猴(cyno)CD22的结合亲和力。简言之，CHO细胞稳定地表达全长人CD22(SEQ
ID NO：27)或猕猴(cyno)CD22(SEQ ID NO：31)。将抗CD22抗体(鼠或人源化10F4v1或
125
v2)用 [ I]试剂碘化至大约10μCi/μg的比活。使用连续稀释的、未标记的
抗CD22抗体实施基于细胞的竞争性结合测定法。容许抗体在4℃结合细胞4小时。依照利
用非线性曲线拟合程序(参见例如Munson等，Anal Biochem，107：220-239，1980)实施的
标准Scatchard分析来测定抗体的结合亲和力，即KD。该实验结果显示于下文表3。
ID NO：27)或猕猴(cyno)CD22(SEQ ID NO：31)。将抗CD22抗体(鼠或人源化10F4v1或
125
v2)用 [ I]试剂碘化至大约10μCi/μg的比活。使用连续稀释的、未标记的
抗CD22抗体实施基于细胞的竞争性结合测定法。容许抗体在4℃结合细胞4小时。依照利
用非线性曲线拟合程序(参见例如Munson等，Anal Biochem，107：220-239，1980)实施的
标准Scatchard分析来测定抗体的结合亲和力，即KD。该实验结果显示于下文表3。
[1030] 表3：对人和猕猴CD22的10F4单抗结合亲和力
[1031]
[1032] 该结果表明鼠和人源化10F4以近似相等的亲和力结合CHO细胞表面上表达的人和猕猴CD22。
[1033] 实施例8：抗CD22抗体-药物偶联物的生成
[1034] 如下生成抗CD22ADC，即将抗CD22抗体RFB4、鼠5E8、鼠10F4、人源化10F4v1、人源化thioMab 10F4v1(thio-10F4v1)、人源化10F4v2和人源化10F4v3与下列药物-接头
模块偶联：spp-DM1、smcc-DM1、MC-vc-PAB-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF、MC-MMAE和MC-MMAF，这
些药物和接头模块披露于本文以及2004年2月5日公布的WO2004/010957和2005年9月
9日公布的WO2006/034488(将每一篇专利申请都完整收入本文作为参考)。在偶联前，使
用依照WO 2004/010957中记载的方法学的标准方法，用TCEP部分地还原该抗体。使用依
照在Doronina等(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784和US 2005/0238649A1中记载的方
法学的标准方法，将部分还原的抗体与上述药物-接头模块偶联。简言之，将部分还原的抗
体与药物接头模块结合以容许该模块与半胱氨酸残基偶联。淬灭该偶联反应，并纯化ADC。
通过HPLC测定每种ADC的药物载荷(每个抗体的药物模块平均数)。用于制备ADC的其它
有用的接头包括但不限于BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、
SIAB、SMPB、SMPH、thio-EMCS、thio-GMBS、thio-KMUS、thio-MBS、thio-SIAB、thio-SMCC、和
thio-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，并包括双马来酰亚胺试剂：
DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)3和BM(PEO)4。
模块偶联：spp-DM1、smcc-DM1、MC-vc-PAB-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF、MC-MMAE和MC-MMAF，这
些药物和接头模块披露于本文以及2004年2月5日公布的WO2004/010957和2005年9月
9日公布的WO2006/034488(将每一篇专利申请都完整收入本文作为参考)。在偶联前，使
用依照WO 2004/010957中记载的方法学的标准方法，用TCEP部分地还原该抗体。使用依
照在Doronina等(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784和US 2005/0238649A1中记载的方
法学的标准方法，将部分还原的抗体与上述药物-接头模块偶联。简言之，将部分还原的抗
体与药物接头模块结合以容许该模块与半胱氨酸残基偶联。淬灭该偶联反应，并纯化ADC。
通过HPLC测定每种ADC的药物载荷(每个抗体的药物模块平均数)。用于制备ADC的其它
有用的接头包括但不限于BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、
SIAB、SMPB、SMPH、thio-EMCS、thio-GMBS、thio-KMUS、thio-MBS、thio-SIAB、thio-SMCC、和
thio-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，并包括双马来酰亚胺试剂：
DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)3和BM(PEO)4。
[1035] 还通过与抗体的赖氨酸残基偶联来生成抗CD22ADC。将抗体的赖氨酸转化成硫氢基团，使用例如如本文中所公开的Traut氏试剂(Pierce ChemicalCo.)。所得硫氢基团具
有与用于制备ADC的接头或接头药物分子的反应性。或者，如下生成ADC，即将抗CD22抗体
上的赖氨酸与接头SPP(N-琥珀酰亚氨基4-(2’-吡啶基硫代)戊酸酯)起反应，所述接头
可以是已经附着至药物分子的或者可以随后与药物分子(诸如美登木素生物碱)起反应。
例如，如下修饰抗体，即与SPP起反应，接着与f偶联，如Wang，L.等，Protein Science14：
2436-2446(2005)中所披露的(完整收入本文作为参考)。还可以将抗CD22抗体上的赖氨
酸残基与接头SMCC(Pierce Chemical Co.)在pH7-9起反应，使得SMCC的胺反应性N-羟基
琥珀酰亚胺(NHS酯)与该抗体形成稳定的酰胺键。将SMCC的硫氢基反应性马来酰亚胺基
团与DM1的硫氢基团在pH 6.5-7.5 起反应(参见Pierce Chemical Co.，piercenet.com)
以形成ADC。将赖氨酸或半胱氨酸残基与接头-药物起反应以生成ADC，其包含大约1-8个
接头药物分子每个抗体，或者1-6、1-4、1-3或1-2个接头药物分子每个抗体的平均药物载
荷。
有与用于制备ADC的接头或接头药物分子的反应性。或者，如下生成ADC，即将抗CD22抗体
上的赖氨酸与接头SPP(N-琥珀酰亚氨基4-(2’-吡啶基硫代)戊酸酯)起反应，所述接头
可以是已经附着至药物分子的或者可以随后与药物分子(诸如美登木素生物碱)起反应。
例如，如下修饰抗体，即与SPP起反应，接着与f偶联，如Wang，L.等，Protein Science14：
2436-2446(2005)中所披露的(完整收入本文作为参考)。还可以将抗CD22抗体上的赖氨
酸残基与接头SMCC(Pierce Chemical Co.)在pH7-9起反应，使得SMCC的胺反应性N-羟基
琥珀酰亚胺(NHS酯)与该抗体形成稳定的酰胺键。将SMCC的硫氢基反应性马来酰亚胺基
团与DM1的硫氢基团在pH 6.5-7.5 起反应(参见Pierce Chemical Co.，piercenet.com)
以形成ADC。将赖氨酸或半胱氨酸残基与接头-药物起反应以生成ADC，其包含大约1-8个
接头药物分子每个抗体，或者1-6、1-4、1-3或1-2个接头药物分子每个抗体的平均药物载
荷。
[1036] 依照该方法制备ADC抗CD22(RFB4)-SMCC-DM1和抗GP120-SMCC-DM1，其中制备了低(1.95)、中等(3.7)、高(6.75)药物载荷的RFB4-smcc-DM1。制备了高(6.1)药物载荷的
抗GP120-smcc-DM1。显示了这些ADC在体内是有效的，正如下文实施例9和表9中所显示
的。÷
抗GP120-smcc-DM1。显示了这些ADC在体内是有效的，正如下文实施例9和表9中所显示
的。÷
[1037] 实施例9：抗CD22抗体-药物偶联物的功效
[1038] 功效决定因素的体外研究
[1039] 确定了淋巴瘤细胞系中抗CD22ADC(或TDC)功效的决定因素。已知在B细胞表面上表达的CD22在结合其配体或抗体后被内在化(Sato，S.等，Immunity 5：
551-562(1996))。为了测试CD22的B细胞表面表达水平和/或CD22的内在化水平是否和
如何影响功效，实施了下列体外研究。
551-562(1996))。为了测试CD22的B细胞表面表达水平和/或CD22的内在化水平是否和
如何影响功效，实施了下列体外研究。
[1040] 人CD22在多种淋巴瘤细胞系上的表面表达
[1041] 将19种在其表面上表达不同量的CD22的淋巴瘤细胞系培养，并在对数生长期收获。将细胞在含有100μg/ml各种正常小鼠IgG和正常人IgG的FACS洗涤缓冲液(PBS；
0.5％牛血清清蛋白；0.1％叠氮化钠)中重悬，并保持在冰上。用抗huCD22APC(mIgG1，克
隆RFB4，Southern Biotech#9361-11)或鼠IgG1APC同种型(BD Pharmingen#555751)对大
6
约1×10 个细胞/100μl在冰上染色30分钟。用7-AAD(BD Pharmingen#559925)对死亡
TM TM
的细胞染色。在BDFacsCalibur 流式细胞仪上获得数据，并用FlowJo 软件分析数据。如
下测定hu10F4v3-SMCC-DM1或每种游离药物(DM1、MMAF或MMAE)的IC50测定，即如上培养
淋巴瘤细胞，在对数期收获培养的细胞，并在96孔板中每孔90μl培养基中接种5,000个
细胞。在检测范围内连续稀释ADC和游离药物(对于ADC从300μg/ml开始或对于游离药
物从90nM开始，并稀释至基本上没有测定靶物)。将10μl稀释的ADC或游离药物的等分
TM
试样添加至含有细胞的重复孔，并在37℃温育3天。将100μl CellTiter Glo 添加至每
TM
个孔，并温育30分钟。检测化学发光，并使用Prism 软件分析数据。该结果显示在图6A
中，其中高的表面CD22水平与hu10F4v3-SMCC-DM1的低IC50(更高的功效)相 关。图6C
表明细胞对游离药物的内在敏感性和ADC的IC50之间存在更强的相关性。
0.5％牛血清清蛋白；0.1％叠氮化钠)中重悬，并保持在冰上。用抗huCD22APC(mIgG1，克
隆RFB4，Southern Biotech#9361-11)或鼠IgG1APC同种型(BD Pharmingen#555751)对大
6
约1×10 个细胞/100μl在冰上染色30分钟。用7-AAD(BD Pharmingen#559925)对死亡
TM TM
的细胞染色。在BDFacsCalibur 流式细胞仪上获得数据，并用FlowJo 软件分析数据。如
下测定hu10F4v3-SMCC-DM1或每种游离药物(DM1、MMAF或MMAE)的IC50测定，即如上培养
淋巴瘤细胞，在对数期收获培养的细胞，并在96孔板中每孔90μl培养基中接种5,000个
细胞。在检测范围内连续稀释ADC和游离药物(对于ADC从300μg/ml开始或对于游离药
物从90nM开始，并稀释至基本上没有测定靶物)。将10μl稀释的ADC或游离药物的等分
TM
试样添加至含有细胞的重复孔，并在37℃温育3天。将100μl CellTiter Glo 添加至每
TM
个孔，并温育30分钟。检测化学发光，并使用Prism 软件分析数据。该结果显示在图6A
中，其中高的表面CD22水平与hu10F4v3-SMCC-DM1的低IC50(更高的功效)相 关。图6C
表明细胞对游离药物的内在敏感性和ADC的IC50之间存在更强的相关性。
[1042] 通过FACS测定法测定hu10F4v3-SMCC-DM1的内在化。
[1043] 简言之，通过标准FACS技术，在存在hu10F4v3-SMCC-DM1时用CD22-FITC(RFB4)对淋巴瘤细胞染色，并在冰上温育20-30分钟。为了在初始染色后测定细胞表面上的CD22
水平，将细胞在冷RPMI/10％FBS培养基中清洗，并添加200μl预热的RPMI/10％FBS，且
在37℃温育15分钟。添加80μl染色缓冲液和20μl热灭活的正常小鼠血清(HI NMS)，
接着在冰上温育15分钟。添加抗DM1-Alexa-647，在冰上温育20-30分钟并清洗细胞，并用
200μlPBS/1％低聚甲醇固定，之后进行FACS分析。为了在初始染色后测定CD22的表面和
内部染色，用冷RPMI/10％FBS清洗细胞，添加预热的RPMI/10％FBS，并将细胞在37℃温育
TM
15分钟。然后将细胞用FACS洗液清洗，并用固定剂A(Dako #k2311)在室温固定15分钟，
TM
并用固定剂B(Dako )重复该步骤。添加染色缓冲液和HI NMS，并将细胞混合物在冰上温
育15分钟。添加固定剂B，接着添加抗DM1-Alexa-647，并在室温温育20-30分钟。将细胞
TM
在FACS洗液中清洗，并在PBS/1％低聚甲醇中固定。使用BD FacsCalibur 流式细胞仪对
TM
每个细胞混合物实施FACS分析(表面染色、内在化后表面染色和内部染色)，并用FlowJo
软件分析结果。该结果显示于图6B(其中大量的内在化DM1与低IC50(高功效)相关)和
图6D(其中通过荧光显微术使内在化的DM1显现)。
水平，将细胞在冷RPMI/10％FBS培养基中清洗，并添加200μl预热的RPMI/10％FBS，且
在37℃温育15分钟。添加80μl染色缓冲液和20μl热灭活的正常小鼠血清(HI NMS)，
接着在冰上温育15分钟。添加抗DM1-Alexa-647，在冰上温育20-30分钟并清洗细胞，并用
200μlPBS/1％低聚甲醇固定，之后进行FACS分析。为了在初始染色后测定CD22的表面和
内部染色，用冷RPMI/10％FBS清洗细胞，添加预热的RPMI/10％FBS，并将细胞在37℃温育
TM
15分钟。然后将细胞用FACS洗液清洗，并用固定剂A(Dako #k2311)在室温固定15分钟，
TM
并用固定剂B(Dako )重复该步骤。添加染色缓冲液和HI NMS，并将细胞混合物在冰上温
育15分钟。添加固定剂B，接着添加抗DM1-Alexa-647，并在室温温育20-30分钟。将细胞
TM
在FACS洗液中清洗，并在PBS/1％低聚甲醇中固定。使用BD FacsCalibur 流式细胞仪对
TM
每个细胞混合物实施FACS分析(表面染色、内在化后表面染色和内部染色)，并用FlowJo
软件分析结果。该结果显示于图6B(其中大量的内在化DM1与低IC50(高功效)相关)和
图6D(其中通过荧光显微术使内在化的DM1显现)。
[1044] 体内功效研究
[1045] 为了测试偶联或未偶联毒素的抗CD22单克隆抗体在体内降低肿瘤体积能力方面的功效，采用了如下方案。
[1046] 给每只SCID小鼠在体侧皮下接种2×107个人B细胞淋巴瘤细胞系。人细胞系包括人伯基特氏淋巴瘤细胞系Daudi、Ramos和Raji细胞(可获自美国典型培养物保藏
中心，Manassas，VA，USA)，和其它B细胞系，包括U-698-M细胞和Su-DHL-4细胞(可获自
DSMZ，Braunschweig，Germany；Su-DHL-4细胞是经过萤光素酶报告基因转染的)、DoHH2细
胞(Kluin-Neilemans，H.C.(1991)，见上文)、和Granta-519(套细胞淋巴瘤细胞，Jadayel，
D.M.等，Leukemia 11(1)：64-72(1997))、和BJAB-luc细胞(表达报告基因萤光素酶的
3
BJAB人B细胞成淋巴细胞样细胞系)。在肿瘤达到介于100-200mm 之间的平 均肿瘤体积
时，将小鼠分组，并在第0天通过静脉内注射偶联或未偶联毒素的抗体处理(如下表4-16
中所显示的)。
中心，Manassas，VA，USA)，和其它B细胞系，包括U-698-M细胞和Su-DHL-4细胞(可获自
DSMZ，Braunschweig，Germany；Su-DHL-4细胞是经过萤光素酶报告基因转染的)、DoHH2细
胞(Kluin-Neilemans，H.C.(1991)，见上文)、和Granta-519(套细胞淋巴瘤细胞，Jadayel，
D.M.等，Leukemia 11(1)：64-72(1997))、和BJAB-luc细胞(表达报告基因萤光素酶的
3
BJAB人B细胞成淋巴细胞样细胞系)。在肿瘤达到介于100-200mm 之间的平 均肿瘤体积
时，将小鼠分组，并在第0天通过静脉内注射偶联或未偶联毒素的抗体处理(如下表4-16
中所显示的)。
[1047] 抗CD22-美登素药物偶联物降低B细胞肿瘤体积
[1048] 给65只SCID小鼠在体侧皮下注射0.2ml体积每只小鼠中的2×107个BJAB-luc3
细胞。在HBSS中悬浮细胞。在平均肿瘤大小达到100-200mm 时，将小鼠随机分成各9只小
鼠的4组，并给予下文表4中指明的抗CD22或对照抗体的单一I.V.处理(通过尾静脉)。
细胞。在HBSS中悬浮细胞。在平均肿瘤大小达到100-200mm 时，将小鼠随机分成各9只小
鼠的4组，并给予下文表4中指明的抗CD22或对照抗体的单一I.V.处理(通过尾静脉)。
[1049] 表4
[1050] 体内肿瘤体积缩小抗体施用
[1051]
[1052] 在注射抗体后，对每个处理组中的平均肿瘤体积监测32天。用游标卡尺量取肿瘤的测量值。通过与对照和未偶联抗体比较来测定偶联毒素的抗CD22抗体的功效。结果显示
于图7A。相对于未偶联的抗CD22抗体和非特异性对照抗体，鼠和人源化10F4v1-smcc-DM1
单克隆抗体显著地减缓了肿瘤生长。
于图7A。相对于未偶联的抗CD22抗体和非特异性对照抗体，鼠和人源化10F4v1-smcc-DM1
单克隆抗体显著地减缓了肿瘤生长。
[1053] 使用与上文相同的方案，实施测定法来比较偶联毒素的人源化10F4v2与下文表5中所指出的偶联毒素的鼠抗体和裸人源化抗体。
[1054] 表5
[1055] 体内肿瘤体积缩小抗体施用
[1056]
[1057]
[1058] 在注射抗体后，对每个处理组中的平均肿瘤体积监测32天。用游标卡尺量取肿瘤的测量值。通过与对照和未偶联抗体比较来测定偶联毒素的抗CD22抗体的功效。结构显
示于图7B。相对于未偶联的抗CD22抗体和非特异性对照抗体，鼠10F4-smcc-DM1和人源化
10F4v2-smcc-DM1单克隆抗体显著地减缓了肿瘤生长。
示于图7B。相对于未偶联的抗CD22抗体和非特异性对照抗体，鼠10F4-smcc-DM1和人源化
10F4v2-smcc-DM1单克隆抗体显著地减缓了肿瘤生长。
[1059] 依照本文中所公开的偶联方法，将抗CD22抗体通过spp接头或smcc接头偶联至DM1。将裸抗CD20抗体用作阳性对照，而将毒素偶联物抗HER2-spp-DM1和抗HER2-smcc-DM1
用作阴性对照。给80只SCID小鼠在体侧皮下注射0.2ml体积每只小鼠中的2×107个
BJAB-luc细胞。在HBSS中悬浮细胞。在平均肿瘤大小达到100-200mm3时，将小鼠随机分
成各10只小鼠的6组，并实施测试抗体或对照抗体的静脉内注射。每周一次重复剂量给药，
共3剂。参见表6。
用作阴性对照。给80只SCID小鼠在体侧皮下注射0.2ml体积每只小鼠中的2×107个
BJAB-luc细胞。在HBSS中悬浮细胞。在平均肿瘤大小达到100-200mm3时，将小鼠随机分
成各10只小鼠的6组，并实施测试抗体或对照抗体的静脉内注射。每周一次重复剂量给药，
共3剂。参见表6。
[1060] 表6
[1061] 体内肿瘤体积缩小抗体施用
[1062]
[1063]
[1064] 对平均肿瘤体积每周两次地监测3周，然后每周一次地监测共8周。肿瘤体积随时间的改变(图7C)显示，以214和107μg/m2DM1服用的抗CD22-spp-DM1和以405μg/m2
服用的抗CD22-smcc-DM1在BJAB-luc异种移植物肿瘤中显示了强的且相当的抗肿瘤活性。
所有抗CD22ADC组显示完全应答。
服用的抗CD22-smcc-DM1在BJAB-luc异种移植物肿瘤中显示了强的且相当的抗肿瘤活性。
所有抗CD22ADC组显示完全应答。
[1065] 依照本文中所公开的偶联方法，将抗CD22抗体RFB4、5E8和7A2经smcc接头偶联至DM1。使用毒素偶联物抗HER2-smcc-DM1(其在本文中可互换地称为HER-smcc-DM1或
HER2-smcc-DM1)作为阴性对照。
HER2-smcc-DM1)作为阴性对照。
[1066] 检查了这些抗体降低SCID小鼠中各种异种移植物中的肿瘤体积的能力。用于在小鼠中产生异种移植物肿瘤的人B细胞淋巴瘤细胞系是Ramos细胞和BJAB-luc细胞。对
于每种异种移植物，给SCID小鼠在体侧皮下注射0.1ml体积/小鼠中的5×106个B细胞淋
巴瘤Ramos细胞(或0.2ml中的2×107个BJAB-luc细胞)。在HBSS中悬浮细胞。在平均
肿瘤大小达到100-200mm3时，将小鼠随机分成各8-10只小鼠的组，并给每只小鼠测试抗体
或对照抗体的单一静脉内注射。使每组的DM1药物加载标准化至200μg/m2以提供所施用
DM1的剂量。每周两次地监测平均肿瘤体积4周。结果分别显示于下文表7和8并绘图于
图8A和8B。
于每种异种移植物，给SCID小鼠在体侧皮下注射0.1ml体积/小鼠中的5×106个B细胞淋
巴瘤Ramos细胞(或0.2ml中的2×107个BJAB-luc细胞)。在HBSS中悬浮细胞。在平均
肿瘤大小达到100-200mm3时，将小鼠随机分成各8-10只小鼠的组，并给每只小鼠测试抗体
或对照抗体的单一静脉内注射。使每组的DM1药物加载标准化至200μg/m2以提供所施用
DM1的剂量。每周两次地监测平均肿瘤体积4周。结果分别显示于下文表7和8并绘图于
图8A和8B。
[1067] 表7
[1068] 体内肿瘤体积缩小，Ramos异种移植物抗体施用
[1069]施用的抗体 Ab剂量 (mg/kg) DM1剂量 (μg/m2)
抗HER2-smcc-DM1 4.2 200
抗CD22(7A2)-smcc-DM1 3.8 200
抗CD22(5E8)-smcc-DM1 3.8 200
抗CD22(RFB4)-smcc-DM1 3.2 200
抗HER2-smcc-DM1 4.2 200
抗CD22(7A2)-smcc-DM1 3.8 200
抗CD22(5E8)-smcc-DM1 3.8 200
抗CD22(RFB4)-smcc-DM1 3.2 200
[1070] 表8
[1071] 体内肿瘤体积缩小，BJAB-luc异种移植物抗体施用
[1072])b
A/
块
模
物
药
(
率
比物 2 6 6 52
药 .3 .3 .3 .4
2 )m
/g
μ
(
量
剂
1M 00 00 00 00
D 2 2 2 2
)gk
/gm(
量
剂 2 8 8 2
bA .4 .3 .3 .3
1 1 1M
MD-c MD-c D-cc
1MD- cms- cms- ms-)
体 ccms )2A7 )8E5 4BFR
抗的 -2RE (22D (22D (22D
用 H C C C
施 抗 抗 抗 抗
A/
块
模
物
药
(
率
比物 2 6 6 52
药 .3 .3 .3 .4
2 )m
/g
μ
(
量
剂
1M 00 00 00 00
D 2 2 2 2
)gk
/gm(
量
剂 2 8 8 2
bA .4 .3 .3 .3
1 1 1M
MD-c MD-c D-cc
1MD- cms- cms- ms-)
体 ccms )2A7 )8E5 4BFR
抗的 -2RE (22D (22D (22D
用 H C C C
施 抗 抗 抗 抗
[1073] 这些结果显示，抗CD22-smcc-DM1抗体-药物偶联物相对于对照抗体或裸抗CD22抗体显著地降低了BJAB-luc异种移植物和Ramos中的B细胞肿瘤体积。
[1074] 检查了抗体药物载荷(一群抗体中每个抗体所偶联的药物分子的平均数)对抗CD22-smcc-DM1抗体-药物偶联物降低BJAB-luc SCID小鼠异种移植物中肿瘤体积的能力
7
的影响。给140只SCID小鼠在体侧皮下注射0.2ml体积每只小鼠中的2×10 个BJAB-luc
3
细胞。在HBSS中悬浮细胞。在平均肿瘤大小达到100-200mm 时，将小鼠随机分成各8-10
只小鼠的组，并给每只小鼠测试抗体或对照抗体的单一静脉内注射。施用具有相对低的、中
等的或高的药物负载的抗CD22(RFB4)-smcc-DM1群(平均药物心载荷分别为每个抗体偶联
了1.95、3.7或6.75个DM1分子)作为测试抗体。裸RFB4抗体和抗GP120-smcc-DM1(高
的药物载荷)是对照。将抗体-药物偶联物(测试和对照)的剂量标准化至5mg/kg蛋白
质水平的剂量。接头偶联物附着至抗体是通过赖氨酸残基实现的。参见表9。
7
的影响。给140只SCID小鼠在体侧皮下注射0.2ml体积每只小鼠中的2×10 个BJAB-luc
3
细胞。在HBSS中悬浮细胞。在平均肿瘤大小达到100-200mm 时，将小鼠随机分成各8-10
只小鼠的组，并给每只小鼠测试抗体或对照抗体的单一静脉内注射。施用具有相对低的、中
等的或高的药物负载的抗CD22(RFB4)-smcc-DM1群(平均药物心载荷分别为每个抗体偶联
了1.95、3.7或6.75个DM1分子)作为测试抗体。裸RFB4抗体和抗GP120-smcc-DM1(高
的药物载荷)是对照。将抗体-药物偶联物(测试和对照)的剂量标准化至5mg/kg蛋白
质水平的剂量。接头偶联物附着至抗体是通过赖氨酸残基实现的。参见表9。
[1075] 表9
[1076] 体内肿瘤体积缩小，BJAB-luc异种移植物抗CD22(RFB4)-smcc-DM1施用
[1077])bA
/
块
模
物
药
(
率
比物 - 59. 7. 57. 1.
药 - 1 3 6 6
2 )
m/g
μ(
量
剂
1M - 44 37 79 94
D - 1 2 4 4
)gk
/gm(
量
剂
bA 01 5 5 5 5
)
) 的 )
的 等 的
低( 中( 高( )
)体 1MD- 1MD- 1MD- 的高
抗裸 ccms ccms ccms (1MD
()4B -)4B -)4B -)4B -ccm
体抗 FR(2 FR(2 FR(2 FR(2 s-02
的用 2DC 2DC 2DC 2DC 1PG
施 抗 抗 抗 抗 抗
/
块
模
物
药
(
率
比物 - 59. 7. 57. 1.
药 - 1 3 6 6
2 )
m/g
μ(
量
剂
1M - 44 37 79 94
D - 1 2 4 4
)gk
/gm(
量
剂
bA 01 5 5 5 5
)
) 的 )
的 等 的
低( 中( 高( )
)体 1MD- 1MD- 1MD- 的高
抗裸 ccms ccms ccms (1MD
()4B -)4B -)4B -)4B -ccm
体抗 FR(2 FR(2 FR(2 FR(2 s-02
的用 2DC 2DC 2DC 2DC 1PG
施 抗 抗 抗 抗 抗
[1078] 在以匹配的蛋白质水平(5mg/kg)服用时，以高药物载荷(6.75个DM1分 子每个抗体分子)加载的抗CD22(RFB4)-smcc-DM1比具有3.7中等载荷的抗体-药物偶联物略微
更多地缩小了肿瘤体积，然而具有低药物载荷的抗体-药物偶联物的影响与对照偶联物或
裸抗体没有差异。结果绘制于图9。
更多地缩小了肿瘤体积，然而具有低药物载荷的抗体-药物偶联物的影响与对照偶联物或
裸抗体没有差异。结果绘制于图9。
[1079] 抗CD22-auristatin药物偶联物缩小B细胞肿瘤体积
[1080] 检查了抗CD22-auristatin MMAF药物偶联物对小鼠异种移植物中肿瘤体积的影响。依照本文中所公开的方法，将抗CD22(RFB4)和对照抗体抗GP120通过MC-vcPAB接头
6
或MC接头偶联至MMAF。给SCID小鼠在体侧皮下注射0.2ml体积每只小鼠中的5×10 个
3
Ramos细胞。在HBSS中悬浮细胞。在平均肿瘤大小达到100-200mm 时，将小鼠随机分成各
8-10只小鼠的组，并给每只小鼠测试抗体或对照抗体的单一静脉内注射。给小鼠施用的药
物剂量、药物载荷(药物比率)和抗体剂量显示于表10。
6
或MC接头偶联至MMAF。给SCID小鼠在体侧皮下注射0.2ml体积每只小鼠中的5×10 个
3
Ramos细胞。在HBSS中悬浮细胞。在平均肿瘤大小达到100-200mm 时，将小鼠随机分成各
8-10只小鼠的组，并给每只小鼠测试抗体或对照抗体的单一静脉内注射。给小鼠施用的药
物剂量、药物载荷(药物比率)和抗体剂量显示于表10。
[1081] 表10
[1082] 体内肿瘤体积缩小，Ramos异种移植物抗CD22(RFB4)-MMAF偶联物施用
[1083])bA
/
块
模
物
药
(
率
比
物 2. 0. 8. 7.
药 4 4 4 4
)gk
/gm(
量
剂bA 6.6 9.6 8.5 9.5
2 )m
/g
μ
(
量
剂
FAM 50 50 50 50
M 4 4 4 4
FA
MM-B F F
APcv AMM- AMM-
CM-) CM-) BAPc FAMM
体 4BFR 4BFR vCM- -CM-
抗的 (22D (22D 021P 021P
用 C C G G
施 抗 抗 抗 抗
/
块
模
物
药
(
率
比
物 2. 0. 8. 7.
药 4 4 4 4
)gk
/gm(
量
剂bA 6.6 9.6 8.5 9.5
2 )m
/g
μ
(
量
剂
FAM 50 50 50 50
M 4 4 4 4
FA
MM-B F F
APcv AMM- AMM-
CM-) CM-) BAPc FAMM
体 4BFR 4BFR vCM- -CM-
抗的 (22D (22D 021P 021P
用 C C G G
施 抗 抗 抗 抗
[1084] 在Ramos RA1异种移植物中，抗CD22-MC-MMAF与抗CD22-MC-vc-PAB-MMAF相比显示了相当的活性。结果绘制于图10。
[1085] 检查了抗CD22-auristatin MMAE和DM1药物偶联物对小鼠异种移植物中肿瘤体积的影响。依照本文中所公开的方法，将抗CD22(RFB4)和对照抗体抗GP120通过MC-vcPAB
接头或MC接头偶联至MMAE，或通过smcc接头偶联至DM1。给SCID小鼠在体侧皮下注射
6
0.1ml体积每只小鼠中的5×10 个Ramos细胞。在HBSS中悬浮细胞。施用PBS作为对照。
3
在平均肿瘤大小达到100-200mm 时，将小鼠随机分成各8-10只小鼠的组，并给每只小鼠测
试抗体或对照抗体的单一静脉内注射。给小鼠施用的药物剂量、药物载荷(药物比率)和
抗体剂量显示于表11。
接头或MC接头偶联至MMAE，或通过smcc接头偶联至DM1。给SCID小鼠在体侧皮下注射
6
0.1ml体积每只小鼠中的5×10 个Ramos细胞。在HBSS中悬浮细胞。施用PBS作为对照。
3
在平均肿瘤大小达到100-200mm 时，将小鼠随机分成各8-10只小鼠的组，并给每只小鼠测
试抗体或对照抗体的单一静脉内注射。给小鼠施用的药物剂量、药物载荷(药物比率)和
抗体剂量显示于表11。
[1086] 表11
[1087] 体内肿瘤体积缩小，Ramos异种移植物抗CD22(RFB4)-MMAE和DM1偶联物施用
[1088])bA/
块
模
量
剂
(
率
比
物药 1.4 52.4 7.4 5.4 --
)gk/
gm(
量
剂b 7. 5. 0. 3. -
A 6 6 6 6 -
2 )
m/g
μ(
量
剂
1M
D
或
EAMM 504 504 504 504 --
EAMM
1MD- EAM -BAP
1MD ccms M-BA cvCM
-ccm -)4B PcvC -)4B
体抗 s-02 FR(2 M-02 FR(2
的用施 1PG抗 2DC抗 1PG抗 2DC抗 SBP
块
模
量
剂
(
率
比
物药 1.4 52.4 7.4 5.4 --
)gk/
gm(
量
剂b 7. 5. 0. 3. -
A 6 6 6 6 -
2 )
m/g
μ(
量
剂
1M
D
或
EAMM 504 504 504 504 --
EAMM
1MD- EAM -BAP
1MD ccms M-BA cvCM
-ccm -)4B PcvC -)4B
体抗 s-02 FR(2 M-02 FR(2
的用施 1PG抗 2DC抗 1PG抗 2DC抗 SBP
[1089] 抗CD22-MCvcPAB-MMAE在Ramos RA1异种移植物中显示了有力的抗肿瘤活性。与抗CD22-smcc-DM1相比，抗CD22-MCvcPAB-MMAE显示了优越的活性。结果绘制于图11。
[1090] 检查了抗CD22-auristatin MMAF和DM1药物偶联物对小鼠异种移植物中肿瘤体积的影响。施用抗CD22hu10F4v2-MC-MMAF、hu10F4v2-smcc-DM1和thio-10F4v1-MC-MMAF，
并关于对肿瘤体积的影响进行比较。对照抗体是抗Her2-MC-MMAF和抗Her2-smcc-DM1。给
7
SCID小鼠在体侧皮下注射0.2ml体积每只小鼠中的2×10 个BJAB-luc细胞。在HBSS中悬
3
浮细胞。在平均肿瘤大小达到100-200mm 时，将小鼠随机分成各8-10只小鼠的组，并给每
只小鼠测试抗体或对照抗体的单一静脉内注射。“Thio”指thioMab，如本文中所公开，其中
将接头-药物模块通过抗体上的半胱氨酸改造位点偶联至抗体。给小鼠施用的药物剂量、
药物负载(药物比率)和抗体剂量显示于表12。
并关于对肿瘤体积的影响进行比较。对照抗体是抗Her2-MC-MMAF和抗Her2-smcc-DM1。给
7
SCID小鼠在体侧皮下注射0.2ml体积每只小鼠中的2×10 个BJAB-luc细胞。在HBSS中悬
3
浮细胞。在平均肿瘤大小达到100-200mm 时，将小鼠随机分成各8-10只小鼠的组，并给每
只小鼠测试抗体或对照抗体的单一静脉内注射。“Thio”指thioMab，如本文中所公开，其中
将接头-药物模块通过抗体上的半胱氨酸改造位点偶联至抗体。给小鼠施用的药物剂量、
药物负载(药物比率)和抗体剂量显示于表12。
[1091] 表12
[1092] 体内肿瘤体积缩小，BJAB-luc异种移植物Hu10F4MMAF和DM1偶联物施用
[1093])bA
/
块
模
物
药
(
率
比
物 3. 4. 4. 5.
药 6 3 3 1
)g
k/gm
(
量
剂bA 1.1 0.2 0.1 6.4
2 )
m/g
μ(
量
剂
1M
D
或
FAMM 001 001 05 001
FA
F F MM-C
体抗的用施 FAMM-CM-2reH抗 AMM-CM-2v4F01uH AMM-CM-2v4F01uH M-1v4F01uh-oihT
/
块
模
物
药
(
率
比
物 3. 4. 4. 5.
药 6 3 3 1
)g
k/gm
(
量
剂bA 1.1 0.2 0.1 6.4
2 )
m/g
μ(
量
剂
1M
D
或
FAMM 001 001 05 001
FA
F F MM-C
体抗的用施 FAMM-CM-2reH抗 AMM-CM-2v4F01uH AMM-CM-2v4F01uH M-1v4F01uh-oihT
[1094]Thio-hu10F4v1-MC-MMAF 50 2.3 1.5
抗Her2-smcc-DM1 200 4.2 3.2
Hu10F4v2-smcc-DM1 200 4.5 3.0
Hu10F4v2-smcc-DM1 100 2.3 3.0
抗Her2-smcc-DM1 200 4.2 3.2
Hu10F4v2-smcc-DM1 200 4.5 3.0
Hu10F4v2-smcc-DM1 100 2.3 3.0
[1095] Hu10F4v2 ADC在BJAB-luc异种移植物中显示了有力的抗肿瘤活性。结果绘制于图12。
[1096] 使用上文实验中所公开的规程，检查了不同剂量的hu10F4v3-smcc-DM1和-MC-MMAF ADC在不同异种移植物中的功效。如上文所公开的那样制备SuDHL4-luc的异
3
种移植物、DoHH2和Granta-519异种移植物。在平均肿瘤大小达到100-200mm 时，将小鼠
随机分成各8-10只小鼠的组，并给每只小鼠测试抗体或对照抗体的单一静脉内注射。给小
鼠施用的药物剂量、药物载荷(药物比率)和抗体剂量显示于表13A-13C，且结果显示于图
13A-13C。
3
种移植物、DoHH2和Granta-519异种移植物。在平均肿瘤大小达到100-200mm 时，将小鼠
随机分成各8-10只小鼠的组，并给每只小鼠测试抗体或对照抗体的单一静脉内注射。给小
鼠施用的药物剂量、药物载荷(药物比率)和抗体剂量显示于表13A-13C，且结果显示于图
13A-13C。
[1097] 表13A
[1098] 体内肿瘤体积缩小，Hu10F4v3-MMAF和DM1偶联物施用在SuDHL-4-luc异种移植物中
[1099]施用的抗体 MMAF或DM1剂量 (μg/m2) Ab剂量 (mg/kg) 药物比率 (药物/Ab)
抗Her2-smcc-DM1 600 11.9 3.3
Hu10F4v3-smcc-DM1 600 13.6 2.9
Hu10F4v3-smcc-DM1 300 6.8 2.9
抗Her2-MC-MMAF 600 9.9 4.0
Hu10F4v3-MC-MMAF 600 13.3 3.0
Hu10F4v3-MC-MMAF 300 6.6 3.0
抗Her2-smcc-DM1 600 11.9 3.3
Hu10F4v3-smcc-DM1 600 13.6 2.9
Hu10F4v3-smcc-DM1 300 6.8 2.9
抗Her2-MC-MMAF 600 9.9 4.0
Hu10F4v3-MC-MMAF 600 13.3 3.0
Hu10F4v3-MC-MMAF 300 6.6 3.0
[1100] 表13B
[1101] 体内肿瘤体积缩小，Hu10F4v3-MMAF和DM1偶联物施用在DoHH2异种移植物中
[1102]施用的抗体 MMAF或DM1剂量 (μg/m2) Ab剂量 (mg/kg) 药物比率 (药物/Ab)
[1103]抗Her2-smcc-DM1 600 11.9 3.3
Hu10F4v3-smcc-DM1 600 11.8 3.35
Hu10F4v3-smcc-DM1 300 5.9 3.35
抗Her2-MC-MMAF 600 9.9 4.0
Hu10F4v3-MC-MMAF 600 13.1 3.04
Hu10F4v3-MC-MMAF 300 6.6 3.04
裸hu10F4v3 -- 13.1 --
Hu10F4v3-smcc-DM1 600 11.8 3.35
Hu10F4v3-smcc-DM1 300 5.9 3.35
抗Her2-MC-MMAF 600 9.9 4.0
Hu10F4v3-MC-MMAF 600 13.1 3.04
Hu10F4v3-MC-MMAF 300 6.6 3.04
裸hu10F4v3 -- 13.1 --
[1104] 表13C
[1105] 体内肿瘤体积缩小，Hu10F4v3-MMAF和DM1偶联物施用在Granta-519异种移植物中
[1106])
bA/
物
药
(
率
比 5 5 4 4
物药 3.3 3.3 3.3 0.4 0.3 0.3 --
)
gk/g
m(
量
剂b 9. 9. 9. 9. 6. 3. 6.
A 5 5 2 4 6 3 6
2 )m
/g
μ
(
量
剂
1M
D
或
FAMM 003 003 051 003 003 051 --
1 1
体抗的用施 1MD-ccms-2reH抗 MD-ccms-3v4F01uH MD-ccms-3v4F01uH FAMM-CM-2reH抗 FAMM-CM-3v4F01uH FAMM-CM-3v4F01uH 3v4F01uh裸
bA/
物
药
(
率
比 5 5 4 4
物药 3.3 3.3 3.3 0.4 0.3 0.3 --
)
gk/g
m(
量
剂b 9. 9. 9. 9. 6. 3. 6.
A 5 5 2 4 6 3 6
2 )m
/g
μ
(
量
剂
1M
D
或
FAMM 003 003 051 003 003 051 --
1 1
体抗的用施 1MD-ccms-2reH抗 MD-ccms-3v4F01uH MD-ccms-3v4F01uH FAMM-CM-2reH抗 FAMM-CM-3v4F01uH FAMM-CM-3v4F01uH 3v4F01uh裸
[1107] 抗CD22hu10F4v3-smcc-DM1和-MC-MMAF ADC在所有测试的异种移植物模型中显示了有力的肿瘤缩小。
[1108] 实施例10：半胱氨酸改造抗CD22抗体的制备
[1109] 如本文中所公开的那样实施半胱氨酸改造抗CD22抗体的制备。通过本文中所公开的方法对编码10F4v3抗体(其具有与10F4v2(轻链，SEQ IDNO：87；和重链，SEQ ID NO：
88，图5B)相同的可变区和恒定区序列)的DNA进行诱变以修饰轻链、重链或重链Fc区。对
编码轻链的DNA进行诱变以用半胱氨酸替代如图17A中所显示的轻链(人源化抗体10F4v3
thiomab的轻链SEQ ID NO：91)中的Kabat第205位(顺序第210位)缬氨酸。对编码重链
的DNA进行诱变以用半胱氨酸替代如图17B中所显示的重链(人源化抗体10F4v3thiomab
的重链SEQ ID NO：92)中的EU第118位(顺序第121位)丙氨酸。对Fc区进行诱变以用
半胱氨酸替代如图17C中所显示的重链Fc区(重链SEQ IDNO：93)中的EU第400位(顺
序第403位)丝氨酸。
88，图5B)相同的可变区和恒定区序列)的DNA进行诱变以修饰轻链、重链或重链Fc区。对
编码轻链的DNA进行诱变以用半胱氨酸替代如图17A中所显示的轻链(人源化抗体10F4v3
thiomab的轻链SEQ ID NO：91)中的Kabat第205位(顺序第210位)缬氨酸。对编码重链
的DNA进行诱变以用半胱氨酸替代如图17B中所显示的重链(人源化抗体10F4v3thiomab
的重链SEQ ID NO：92)中的EU第118位(顺序第121位)丙氨酸。对Fc区进行诱变以用
半胱氨酸替代如图17C中所显示的重链Fc区(重链SEQ IDNO：93)中的EU第400位(顺
序第403位)丝氨酸。
[1110] 制备半胱氨酸改造抗CD22抗体，用于通过还原和再氧化进行的偶联
[1111] 将CHO细胞中所表达的全长的、半胱氨酸改造的抗CD22单克隆抗体(ThioMab)溶解于约pH8.0的500mM硼酸钠和500mM氯化钠，并用约50-100倍过量的1mM TCEP(盐酸
三(2-羧乙基)膦；Getz等(1999)Anal.Biochem.273：73-80；Soltec Ventures，Beverly，
MA)在37℃还原大约1-2小时。将还原后的ThioMab稀释并加载到10mM乙酸钠pH 5中的
HiTrap S柱上，并用含0.3M氯化钠的PBS洗脱。将洗脱的还原后ThioMab用2mM脱氢抗坏
血酸(dhAA)在pH7处理3小时，或用2mM硫酸铜(CuSO4)水溶液在室温处理过夜。环境空
气氧化作用也可能是有效的。通过Sephadex G25树脂上的洗脱来更换缓冲液，并用含1mM
DTPA的PBS洗脱。如下检查硫醇/Ab值，即根据溶液在280nm的吸光度测定还原抗体浓度，
并通过与DTNB(Aldrich，Milwaukee，WI)的反应并测定412nm吸光度来测定硫醇浓度。
三(2-羧乙基)膦；Getz等(1999)Anal.Biochem.273：73-80；Soltec Ventures，Beverly，
MA)在37℃还原大约1-2小时。将还原后的ThioMab稀释并加载到10mM乙酸钠pH 5中的
HiTrap S柱上，并用含0.3M氯化钠的PBS洗脱。将洗脱的还原后ThioMab用2mM脱氢抗坏
血酸(dhAA)在pH7处理3小时，或用2mM硫酸铜(CuSO4)水溶液在室温处理过夜。环境空
气氧化作用也可能是有效的。通过Sephadex G25树脂上的洗脱来更换缓冲液，并用含1mM
DTPA的PBS洗脱。如下检查硫醇/Ab值，即根据溶液在280nm的吸光度测定还原抗体浓度，
并通过与DTNB(Aldrich，Milwaukee，WI)的反应并测定412nm吸光度来测定硫醇浓度。
[1112] 实施例11：通过半胱氨酸改造抗CD22抗体和药物-接头中间体的偶联来制备半胱氨酸改造抗CD22抗体-药物偶联物
[1113] 在实施例10的还原和再氧化规程后，将半胱氨酸改造抗CD22抗体溶解于PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液，并在冰上冷却。将相对于改造的半胱氨酸每个抗体大约1.5摩
尔当量的auristatin药物-接头中间体(诸如MC-MMAE(马来酰亚氨基乙酰基-单甲基
auristatin E)、MC-MMAF、MC-val-cit-PAB-MMAE或MC-val-cit-PAB-MMAF)(其具有硫醇反
应性官能团(诸如马来酰亚胺))溶解于DMSO，在乙腈和水中稀释，并添加至PBS中冷却的、
还原的、再氧化的抗体。在大约1小时后，添加过量的马来酰亚胺以淬灭反应，并给任何未
反应的抗体硫醇基团加帽。通过离心超滤来浓缩反应混合物，并将半胱氨酸改造抗CD22抗
体-药物偶联物纯化，并通过经过PBS中G25树脂的洗脱来脱盐，在无菌条件下通过0.2μm
滤器过滤，并冷冻用于贮存。
尔当量的auristatin药物-接头中间体(诸如MC-MMAE(马来酰亚氨基乙酰基-单甲基
auristatin E)、MC-MMAF、MC-val-cit-PAB-MMAE或MC-val-cit-PAB-MMAF)(其具有硫醇反
应性官能团(诸如马来酰亚胺))溶解于DMSO，在乙腈和水中稀释，并添加至PBS中冷却的、
还原的、再氧化的抗体。在大约1小时后，添加过量的马来酰亚胺以淬灭反应，并给任何未
反应的抗体硫醇基团加帽。通过离心超滤来浓缩反应混合物，并将半胱氨酸改造抗CD22抗
体-药物偶联物纯化，并通过经过PBS中G25树脂的洗脱来脱盐，在无菌条件下通过0.2μm
滤器过滤，并冷冻用于贮存。
[1114] 如下实施hu10F4v3HC(A118C)thiomab-BMPEO-DM1的制备。通过双马来酰亚胺试剂BM(PEO)4(Pierce Chemical)修饰hu 10F4v3HC(A118C)thiomab上的游离半胱氨酸，在
抗体表面上留下未反应的马来酰亚胺基团。这是如下实现的，即将BM(PEO)4溶解于50％
乙醇/水混合物中至10mM浓度，并将10倍摩尔过量的BM(PEO)4添加至在磷酸盐缓冲盐水
中含大约1.6mg/ml(10微摩尔)浓度的hu4D5Fabv8-(V110C)ThioFab的溶液，并容许其反
应1小时。通过含150mM NaCl的30mM柠檬酸盐pH 6缓冲液中的凝胶过滤(HiTrap柱，
Pharmacia)除去过量的BM(PEO)4。将溶解于二甲基乙酰胺(DMA)的大约10倍摩尔过量的
DM1添加至hu4D5Fabv8-(V110C)ThioFab-BMPEO中间体。还可以采用二甲基甲酰胺(DMF)
来溶解药物模块试剂。容许反应混合物反应过夜，之后凝胶过滤或透析入PBS以除去未反
应的药物。使用PBS中S200柱上的凝胶过滤来除去高分子量聚集体，并提供纯化后的hu
10F4v3HC(A118C)thiomab-BMPEO-DM1。
抗体表面上留下未反应的马来酰亚胺基团。这是如下实现的，即将BM(PEO)4溶解于50％
乙醇/水混合物中至10mM浓度，并将10倍摩尔过量的BM(PEO)4添加至在磷酸盐缓冲盐水
中含大约1.6mg/ml(10微摩尔)浓度的hu4D5Fabv8-(V110C)ThioFab的溶液，并容许其反
应1小时。通过含150mM NaCl的30mM柠檬酸盐pH 6缓冲液中的凝胶过滤(HiTrap柱，
Pharmacia)除去过量的BM(PEO)4。将溶解于二甲基乙酰胺(DMA)的大约10倍摩尔过量的
DM1添加至hu4D5Fabv8-(V110C)ThioFab-BMPEO中间体。还可以采用二甲基甲酰胺(DMF)
来溶解药物模块试剂。容许反应混合物反应过夜，之后凝胶过滤或透析入PBS以除去未反
应的药物。使用PBS中S200柱上的凝胶过滤来除去高分子量聚集体，并提供纯化后的hu
10F4v3HC(A118C)thiomab-BMPEO-DM1。
[1115] 通过相同的方案，制备了对照HC(A118C)MAb-MC-MMAF、对照HCThioMab-MC-MMAF、对照HC ThioMab-MCvcPAB-MMAE和对照HCThioMab-BMPEO-DM1。
[1116] 通过上文规程，制备并测试了下列半胱氨酸改造抗CD22抗体-药物偶联物：
[1117] 通 过 A118C thio hu10F4v3 和 MC-MMAF 的 偶 联 而 获 得 的 thiohuthio-HC-10F4v3-MC-MMAF；
[1118] 通过A118C thio hu 10F4v3和MC-val-cit-PAB-MMAE的偶联而获得的thio huthio-HC-10F4v3-MC-val-cit-PAB-MMAE；
[1119] 通 过 A118C thio hu HC-10F4v3 和bmpeo-DM1 的 偶 联 而 获 得 的 thiohuHC-10F4v3-bmpeo-DM1；
[1120] 通过V205C thio hu LC-10F4v3和MC-val-cit-PAB-MMAE的偶联而获得的thiohuLC-10F4v3-MC-val-cit-PAB-MMAE；和
[1121] 通过S400C thio hu Fc-10F4v3和MC-val-cit-PAB-MMAE的偶联而获得的thiohuFc-10F4v3-MC-val-cit-PAB-MMAE。
[1122] 实施例12：半胱氨酸改造的ThioMab-药物偶联物对细胞表面抗原的结合亲和力的表征
[1123] 通过FACS分析测定了thio hu 10F4v3-药物偶联物对BJAB-lucs细胞上所6
表达的CD22的结合亲和力。简言之，使100μl中大约1×10 个细胞与不同量的下列
抗CD22ThioMab-药物偶联物之一接触：thio hu LC(V205C)10F4v3-MCvcPAB-MMAE、thio
hu Fc(S400C)10F4v3-MCvcPAB-MMAE、thiohu HC(A118C)10F4v3-MCvcPAB-MMAE、thio
hu HC(A118C)10F4v3-MC-MMAF或thio hu HC(A118C)10F4v3-BMPEO-DM1(分别参见图
18A-18E)。使用生物素化的山羊抗huFc加链霉亲合素-PE检测结合至细胞表面的抗CD22
抗体。图18A-18E的图示表明抗原结合对所有测试的thiomab-药物偶联物是近似相同的。
表达的CD22的结合亲和力。简言之，使100μl中大约1×10 个细胞与不同量的下列
抗CD22ThioMab-药物偶联物之一接触：thio hu LC(V205C)10F4v3-MCvcPAB-MMAE、thio
hu Fc(S400C)10F4v3-MCvcPAB-MMAE、thiohu HC(A118C)10F4v3-MCvcPAB-MMAE、thio
hu HC(A118C)10F4v3-MC-MMAF或thio hu HC(A118C)10F4v3-BMPEO-DM1(分别参见图
18A-18E)。使用生物素化的山羊抗huFc加链霉亲合素-PE检测结合至细胞表面的抗CD22
抗体。图18A-18E的图示表明抗原结合对所有测试的thiomab-药物偶联物是近似相同的。
[1124] 实施例13：抗CD22ThioMab-药物偶联物的体内肿瘤体积缩小的测定法
[1125] 依照本文实施例9中所公开的规程，测试了依照实施例11制备的thiomab-药物偶联物缩小异种移植物模型中B细胞肿瘤体积的能力。对具有Granta-519细胞异种
移植物肿瘤的SCID小鼠在第0天以下文表14中所示剂量施用对照和抗CD22人源化
10F4v3thiomab-药物偶联物。对照HC(A118C)thiomab是抗HER24D5抗体。
移植物肿瘤的SCID小鼠在第0天以下文表14中所示剂量施用对照和抗CD22人源化
10F4v3thiomab-药物偶联物。对照HC(A118C)thiomab是抗HER24D5抗体。
[1126] 表14
[1127] 体内肿瘤体积缩小，Thio Hu10F4v3MMAE和MMAF偶联物施用在Granta-519异种移植物中
[1128])
bA/
物
药
(
率
比 5 5 5
物药 6.1 5.1 9.1 6.1 8.1 6.1
)
gk/g
m(
量
剂bA 99.3 33.4 14.3 32.4 67.3 32.4
2 )m
/g
μ
(
量
剂
1MD
或
FA 00 00 00 00 00 00
MM 1 1 1 1 1 1
E E E
EA AMM- AMM- AMM-
F MM-B FAMM BAPc BAPc BAPc
AMM- APcv -CM- vCM- vCM- vCM-
CM-) CM-) )C81 )C50 )C81 )C00
C811 C811 1A(C 2V(C 1A(C 4S(c
A(CH A(CH H-3v L-3v H-3v F-3v
体抗的用 照对oih 照对oih 4F01 oih 4F01 oih 4F01 oih 4F01 oih
施 T T T T T T
bA/
物
药
(
率
比 5 5 5
物药 6.1 5.1 9.1 6.1 8.1 6.1
)
gk/g
m(
量
剂bA 99.3 33.4 14.3 32.4 67.3 32.4
2 )m
/g
μ
(
量
剂
1MD
或
FA 00 00 00 00 00 00
MM 1 1 1 1 1 1
E E E
EA AMM- AMM- AMM-
F MM-B FAMM BAPc BAPc BAPc
AMM- APcv -CM- vCM- vCM- vCM-
CM-) CM-) )C81 )C50 )C81 )C00
C811 C811 1A(C 2V(C 1A(C 4S(c
A(CH A(CH H-3v L-3v H-3v F-3v
体抗的用 照对oih 照对oih 4F01 oih 4F01 oih 4F01 oih 4F01 oih
施 T T T T T T
[1129] 该实验的结果显示于图19。施用表14中所示剂量的thio10F4v3-LC-(V205C)-MCvcPAB-MMAE和thio10F4v3-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE thiomab-药物偶联物引起平均肿瘤
体积在研究期间缩小。
体积在研究期间缩小。
[1130] 使用相同的方案，在CB 17SCID小鼠中的Granta-519异种移植物中测试了别的thiomab-药物偶联物，只是测试了不同的药物剂量。对照抗体或对照thiomab是抗HER24D5
抗体或HC(A118C)thiomab。结果显示于下文表15。
抗体或HC(A118C)thiomab。结果显示于下文表15。
[1131] 表15
[1132] 体内肿瘤体积缩小，Thio Hu10F4v3-MMAE、MMAF和DM1偶联物施用在Granta-519异种移植物中
[1133])bA/
物
药
(
率
比
物药 1.3 9.1 9.1 9.1 55.1 9.1 9.1 9.1 59.1 59.1
)g
k/gm
(
量
剂bA 2.3 3.01 2.5 4.01 5.6 3.5 7.2 2.5 1.5 6.2
2 )m/
g
μ(
量
剂
1MD
或
F
AMM 051 003 051 003 051 051 57 051 051 57
1 1 E EAM EAMM
1M MD-O MD-O AMM- M-BA -BAP F AM FAM
D-OE EPMB EPMB BAPc PcvC cvCM FAMM M-CM M-CM
PMB- -)C8 -)C8 vCM- M-)C -)C8 -CM- -)C8 -)C8
)C81 11A( 11A( )C81 811A 11A( )C81 11A( 11A(
FAMM 1A(C CH-3 CH-3 1A(C (CH- CH-3 1A(C CH-3 CH-3
体抗 -CM- H照 v4F0 v4F0 H照 3v4F v4F0 H照 v4F0 v4F0
的用 3v4F 对oi 1 oi 1 oi 对oi 01oi 1 oi 对oi 1 oi 1 oi
施 01 hT hT hT hT hT hT hT hT hT
物
药
(
率
比
物药 1.3 9.1 9.1 9.1 55.1 9.1 9.1 9.1 59.1 59.1
)g
k/gm
(
量
剂bA 2.3 3.01 2.5 4.01 5.6 3.5 7.2 2.5 1.5 6.2
2 )m/
g
μ(
量
剂
1MD
或
F
AMM 051 003 051 003 051 051 57 051 051 57
1 1 E EAM EAMM
1M MD-O MD-O AMM- M-BA -BAP F AM FAM
D-OE EPMB EPMB BAPc PcvC cvCM FAMM M-CM M-CM
PMB- -)C8 -)C8 vCM- M-)C -)C8 -CM- -)C8 -)C8
)C81 11A( 11A( )C81 811A 11A( )C81 11A( 11A(
FAMM 1A(C CH-3 CH-3 1A(C (CH- CH-3 1A(C CH-3 CH-3
体抗 -CM- H照 v4F0 v4F0 H照 3v4F v4F0 H照 v4F0 v4F0
的用 3v4F 对oi 1 oi 1 oi 对oi 01oi 1 oi 对oi 1 oi 1 oi
施 01 hT hT hT hT hT hT hT hT hT
[1134] 该实验的结果显示于图20A。施用150和75μg/m2的thio10F4v3-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE thiomab-药物偶联物引起平均肿瘤体积在研究期间缩小。在相同的研究中，在
各剂量组中测定了前7天的百分比体重变化。绘制于图20B的结果表明这些thiomab-药
物偶联物的施用在此期间没有引起重量减轻。
各剂量组中测定了前7天的百分比体重变化。绘制于图20B的结果表明这些thiomab-药
物偶联物的施用在此期间没有引起重量减轻。
[1135] 在类似的研究中，使用与上文实施例中所公开的相同的异种移植物研究方案，改变施用的TDC和剂量，研究了TDC在CB17SCID小鼠中的滤泡性淋巴瘤DOHH2异种移植物中
的功效。TDC和剂量显示于下文表16。
的功效。TDC和剂量显示于下文表16。
[1136] 表16
[1137] 体内肿瘤体积缩小，Thio Hu10F4v3-MMAE、MMAF和DM1偶联物施用在DOHH2异种移植物中
[1138])
bA/
物
药
(
率
比 9 5 5 5
物药 1.3 7.1 9.1 9.1 5.1 9.1 9.1 9.1 9.1 9.1
)
gk/g
m(
量
剂bA 4.6 9.12 8.02 4.01 0.62 4.12 7.01 8.02 4.02 2.01
2 )m
/g
μ
(
量
剂
1MD
或
FA 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
MM 3 6 6 3 6 6 3 6 6 3
E E
1M 1M EA AMM- AMM-
1MD D-OE D-OE MM-B BAPc BAPc F FAMM FAMM
-OEP PMB- PMB- APcv vCM- vCM- AMM- -CM- -CM-
MB-) )C81 )C81 CM-) )C81 )C81 CM-) )C81 )C81
F C811 1A(C 1A(C C811 1A(C 1A(C C811 1A(C 1A(C
AMM- A(CH H-3v H-3v A(CH H-3v H-3v A(CH H-3v H-3v
体抗的用 CM-3v4F0 照对oih 4F01 oih 4F01 oih 照对oih 4F01 oih 4F01 oih 照对oih 4F01 oih 4F01 oih施 1 T T T T T T T T T
bA/
物
药
(
率
比 9 5 5 5
物药 1.3 7.1 9.1 9.1 5.1 9.1 9.1 9.1 9.1 9.1
)
gk/g
m(
量
剂bA 4.6 9.12 8.02 4.01 0.62 4.12 7.01 8.02 4.02 2.01
2 )m
/g
μ
(
量
剂
1MD
或
FA 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
MM 3 6 6 3 6 6 3 6 6 3
E E
1M 1M EA AMM- AMM-
1MD D-OE D-OE MM-B BAPc BAPc F FAMM FAMM
-OEP PMB- PMB- APcv vCM- vCM- AMM- -CM- -CM-
MB-) )C81 )C81 CM-) )C81 )C81 CM-) )C81 )C81
F C811 1A(C 1A(C C811 1A(C 1A(C C811 1A(C 1A(C
AMM- A(CH H-3v H-3v A(CH H-3v H-3v A(CH H-3v H-3v
体抗的用 CM-3v4F0 照对oih 4F01 oih 4F01 oih 照对oih 4F01 oih 4F01 oih 照对oih 4F01 oih 4F01 oih施 1 T T T T T T T T T
[1139] 图20C的曲线图绘制了用相同的重链A118C抗CD22TDC，但以如图16所示的更高剂量处理的CB17 SCID小鼠中的滤泡性淋巴瘤DOHH2异种移植物中平均肿瘤体积随时间的
变化。抗CD2210F4v3-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE TDC似乎是该研究中的测试药剂中最有效
的。然而，在该实验中升高的剂量水平，注意到抗HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE对照有一
些功效。该活性可能归因于药物自循环中ADC的释放。抗CD22hu10F4-HC(A118C)-MC-MMAF
和-BMPEO-DM1测试剂显示了中等的功效，而且与这些接头升高的稳定性一致，非结合性抗
HER2对照显示出很小的活性。图20D是来自DOHH2异种移植物研究的小鼠中百分比重量变
化的曲线图，其显示了在本研究的前14天期间重量没有显著变化。
变化。抗CD2210F4v3-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE TDC似乎是该研究中的测试药剂中最有效
的。然而，在该实验中升高的剂量水平，注意到抗HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE对照有一
些功效。该活性可能归因于药物自循环中ADC的释放。抗CD22hu10F4-HC(A118C)-MC-MMAF
和-BMPEO-DM1测试剂显示了中等的功效，而且与这些接头升高的稳定性一致，非结合性抗
HER2对照显示出很小的活性。图20D是来自DOHH2异种移植物研究的小鼠中百分比重量变
化的曲线图，其显示了在本研究的前14天期间重量没有显著变化。
[1140] 实施例14：抗CD22-药物偶联物在大鼠和猕猴中的安全性
[1141] hu10F4抗CD22抗体与猕猴(cyno)CD22交叉反应，其亲和力等同于人CD22。hu10F4抗CD22抗体不与大鼠CD22交叉反应。结果，分别在大鼠和猕猴中评估了抗CD22-药
物偶联物的靶物不依赖性和靶物依赖性的安全性和毒性。
物偶联物的靶物不依赖性和靶物依赖性的安全性和毒性。
[1142] 在大鼠中的安全性和毒性
[1143] 对于大鼠中的安全性和毒性研究，实施了两项研究。在一项研究中，第 1天给大鼠静脉内剂量给药hu10F4v3-SMCC-DM1、-SPP-DM1、-MC-vc-PAB-MMAE或-MC-MMAF偶联物，
其中经可切割的(-vc-或-spp-)或不可切割的(MC或SMCC(也称为MCC))接头连接药物。
施用媒介作为对照。在第5天(供药动学分析用)和第12天(在尸检时)收集血液样品。
每周至少三次地进行临床观察和体重记录。监测血清AST(天冬氨酸氨基转移酶)，作为
毒性的指示。在服用20mg/kg包含可切割接头的hu10F4v3-vcMMAE和hu10F4v3-SPP-DM1
的大鼠中，血清AST水平在第5天相对于第0天升高了(图21A)。在服用20mg/kg
hu10F4v3-MC-MMAF或hu10F4v3-MCC-DM1(不可切割的接头，图21B)的大鼠中，嗜中性粒细
胞水平在第5天相对于第0天升高了。在服用hu10F4v3-vc-MMAE或hu10F4v3-SPP-DM1的
大鼠中，嗜中性粒细胞水平在第5天相对于第0天降低了。在服用包含可切割接头的ADC
的大鼠中，升高的血清AST和降低的嗜中性粒细胞表明此类ADC的毒性升高。
其中经可切割的(-vc-或-spp-)或不可切割的(MC或SMCC(也称为MCC))接头连接药物。
施用媒介作为对照。在第5天(供药动学分析用)和第12天(在尸检时)收集血液样品。
每周至少三次地进行临床观察和体重记录。监测血清AST(天冬氨酸氨基转移酶)，作为
毒性的指示。在服用20mg/kg包含可切割接头的hu10F4v3-vcMMAE和hu10F4v3-SPP-DM1
的大鼠中，血清AST水平在第5天相对于第0天升高了(图21A)。在服用20mg/kg
hu10F4v3-MC-MMAF或hu10F4v3-MCC-DM1(不可切割的接头，图21B)的大鼠中，嗜中性粒细
胞水平在第5天相对于第0天升高了。在服用hu10F4v3-vc-MMAE或hu10F4v3-SPP-DM1的
大鼠中，嗜中性粒细胞水平在第5天相对于第0天降低了。在服用包含可切割接头的ADC
的大鼠中，升高的血清AST和降低的嗜中性粒细胞表明此类ADC的毒性升高。
[1144] 在相同的大鼠研究中，第一天给每组六只动物服用20、40或60mg/kghu10F4v3-MC-MMAF或hu10F4v3-SMCC-DM1，并监测12天。在服用hu10F4v3-MC-MMAF的动
物中，没有观察到下列指标：体重减轻、血清肝酶升高、血小板减少、或嗜中性粒细胞减少。
在服用hu10F4v3-SMCC-DM1的大鼠中，在40和60mg/kg的剂量水平观察到体重的可逆减轻
和血清肝酶的可逆升高，而在60mg/kg剂量观察到嗜中性粒细胞的可逆减少和血小板的瞬
时减少。
物中，没有观察到下列指标：体重减轻、血清肝酶升高、血小板减少、或嗜中性粒细胞减少。
在服用hu10F4v3-SMCC-DM1的大鼠中，在40和60mg/kg的剂量水平观察到体重的可逆减轻
和血清肝酶的可逆升高，而在60mg/kg剂量观察到嗜中性粒细胞的可逆减少和血小板的瞬
时减少。
[1145] 在猕猴中的安全性和毒性。
[1146] 为了评估抗CD22ADC在灵长类模型中的安全性和毒性，将30只猕猴分配至下列处2
理组：媒介对照(6只动物)，2、4和6mg/m 药物剂量的hu10F4v3-SMCC-DM1(等同于0、10、
2
20和30mg/kg抗体剂量；4只动物每剂量组)，和2、4、6mg/m 剂量的hu10F4v3-MC-MMAF(4
只动物每剂量组)。第1天和第22天给动物静脉内剂量服药。在体重变化、食物消耗和病
理学指标方面评价动物。收集并测定血液样品以评估毒理学效应、药效学效应和抗药物抗
体效应。每组中半数动物在第25天和第43天中的一天实施安乐死，并收集组织样品。
理组：媒介对照(6只动物)，2、4和6mg/m 药物剂量的hu10F4v3-SMCC-DM1(等同于0、10、
2
20和30mg/kg抗体剂量；4只动物每剂量组)，和2、4、6mg/m 剂量的hu10F4v3-MC-MMAF(4
只动物每剂量组)。第1天和第22天给动物静脉内剂量服药。在体重变化、食物消耗和病
理学指标方面评价动物。收集并测定血液样品以评估毒理学效应、药效学效应和抗药物抗
体效应。每组中半数动物在第25天和第43天中的一天实施安乐死，并收集组织样品。
[1147] 在任一ADC组中，没有发现明显的体重变化。依照相关领域中公知的标准方法测定血清肝酶AST(天冬氨酸氨基转移酶)、ALT(氨基转移酶)和GGT(γ-谷氨酰转肽酶)的
水平。在服用30mg/kg任一ADC的动物中观察到 血清肝酶的可逆升高，尽管ALT在DM1组
中升高了，而AST和GGT在MMAF组中升高了。在DM1组中，在服用20mg/kg剂量的4只动
物中的2只和服用30mg/kg剂量的4只动物中的4只中坐骨神经变性是最低限度的至中等
的。在MMAF组中，在服用30mg/kg剂量的4只动物中的1只中坐骨神经变性是最低限度的。
显微镜检查来自各种器官的组织。30mg/kg MMAF组4只动物中的2只具有意义不明的肺损
害，而在DM1组中没有观察到。
水平。在服用30mg/kg任一ADC的动物中观察到 血清肝酶的可逆升高，尽管ALT在DM1组
中升高了，而AST和GGT在MMAF组中升高了。在DM1组中，在服用20mg/kg剂量的4只动
物中的2只和服用30mg/kg剂量的4只动物中的4只中坐骨神经变性是最低限度的至中等
的。在MMAF组中，在服用30mg/kg剂量的4只动物中的1只中坐骨神经变性是最低限度的。
显微镜检查来自各种器官的组织。30mg/kg MMAF组4只动物中的2只具有意义不明的肺损
害，而在DM1组中没有观察到。
[1148] 通过测量第0天和第22天服药的猕猴中43天里血液CD20+细胞水平，测定了hu10F4v3-MC-MMAF和-SMCC-DM1ADC对外周B细胞的消减。使用荧光标记的抗CD20抗体通
过FACS测定了研究期间定期收集的血液。抗CD22MMAF和DM1ADC消减猕猴外周B细胞，正
如图22A(MMAF组)和图22B(DM1组)所示。观察到MMAF或DM1ADC对其它淋巴细胞群没
+
有显著影响，如图23A和23B所示，其中显示了相同时间段里没有显著消减CD4 细胞。
过FACS测定了研究期间定期收集的血液。抗CD22MMAF和DM1ADC消减猕猴外周B细胞，正
如图22A(MMAF组)和图22B(DM1组)所示。观察到MMAF或DM1ADC对其它淋巴细胞群没
+
有显著影响，如图23A和23B所示，其中显示了相同时间段里没有显著消减CD4 细胞。
[1149] Hu10F4v3-SMCC-DM1相对于对照消减了猕猴扁导体样品中的生发中心B细胞，正如图24A和24B中的显微照片所示。在图24A中圈出了例示性的生发中心。在10mg/
kg剂量水平观察到生发中心B细胞的完全消除，正如图24B所示。在相同条件下施用
hu10F4v3-MC-MMAF ADC后获得了相同的结果。
kg剂量水平观察到生发中心B细胞的完全消除，正如图24B所示。在相同条件下施用
hu10F4v3-MC-MMAF ADC后获得了相同的结果。
[1150] 服用10mg/kg Hu10F4v3-MC-MMAF自猕猴的脾滤泡性生发中心消减了正在分裂的B细胞。参见图25A中的示图及图25B和25C中的组织显微照片。在相同条件下测试
hu10F4v3-SMCC-DM1ADC时获得了相同的结果。生发中心在使用Ki-67染色的图25B中为暗
区域，而在图25D中用可检测标记的抗IgD染色时为由暗区域围绕的未染色区域。图25C
和25E中显示了生发中心的丢失，这是由于抗10F4v3-MC-MMAF消减了生发中心B细胞。如
此，这些抗有丝分裂药物对正在增殖的B细胞群体有影响。
hu10F4v3-SMCC-DM1ADC时获得了相同的结果。生发中心在使用Ki-67染色的图25B中为暗
区域，而在图25D中用可检测标记的抗IgD染色时为由暗区域围绕的未染色区域。图25C
和25E中显示了生发中心的丢失，这是由于抗10F4v3-MC-MMAF消减了生发中心B细胞。如
此，这些抗有丝分裂药物对正在增殖的B细胞群体有影响。
[1151] 下列杂交瘤已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American TypeCultureCollection，PO Box 1549，Manassas，VA，20108，USA(ATCC))：
[1152] 细胞系 ATCC编号 保藏日期
[1153] 杂交瘤10F4.4.1 PTA-7621 2006年5月26日
[1154] 杂交瘤5E8.1.8 PTA-7620 2006年5月26日
[1155] 这些保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约 (BudapestTreaty)及其(布达佩斯条约)实施细则的规定进行的。这保证了自保藏之日起保存存活
保藏物30年。这些细胞系可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得，并服从Genentech
公司与ATCC之间的协议，它保证了在有关美国专利授权后或者在任何美国或外国专利申
请向公众公开后，以两者中居先者为准，公众可永久且不受限制的获得所述细胞系，而且保
证了依据35USC§122及依照它的管理章程(包括37CFR§1.14，特别要提及886OG 638)由
美国专利和商标局长批准的个人将有资格获得所述细胞系。
保藏物30年。这些细胞系可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得，并服从Genentech
公司与ATCC之间的协议，它保证了在有关美国专利授权后或者在任何美国或外国专利申
请向公众公开后，以两者中居先者为准，公众可永久且不受限制的获得所述细胞系，而且保
证了依据35USC§122及依照它的管理章程(包括37CFR§1.14，特别要提及886OG 638)由
美国专利和商标局长批准的个人将有资格获得所述细胞系。
[1156] 本申请的受让人已同意，若保藏的细胞系在合适条件下培养时丢失或遭到破坏，则他将在接到通知后迅速用同一细胞系的存活样本更换。所保藏细胞系的可获得性并不解
释为对违反任何政府的机构依据其专利法所授予的权利实施本发明的许可。
释为对违反任何政府的机构依据其专利法所授予的权利实施本发明的许可。
[1157] 尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细的描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。明确将本申请中所引用的所有专利和科学文献
的公开内容完整收入本文作为参考。
的公开内容完整收入本文作为参考。