一种植物核酸酶及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种植物核酸酶及其编码基因与应用。该植物核酸酶，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有核酸酶活性的由序列3衍生的蛋白质。本发明的核酸酶可用于降解DNA，如超螺旋DNA、双链DNA和单链DNA中的任意一种，没有切割特异性，可以作为去除DNA的广谱酶。本发明的核酸酶耐热，在较高温度下具有酶活性。

权利要求

1.一种蛋白质，是由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列2。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pET28a(+)的BamHI和NotI酶切位点间插入序列表中序列2所示的核苷酸序列得到的重组表达载体pET28a-CsCaN。

6.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在表达载体Pmal载体的XmnI和SalI酶切位点间插入序列表中序列2所示的核苷酸序列得到的重组表达载体Pmal-CsCaN。

7.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。

8.权利要求1所述蛋白质在降解DNA中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述DNA为超螺旋DNA，双链DNA和单链DNA中的任意一种。

说明书

一种植物核酸酶及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种核酸酶及其编码基因与应用。 [0002] 背景技术

[0003] 核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶(RNase)，有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶(DNase)，有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此统称为核酸酶(nuclease)。

[0004] 植物中DNase参与衰老、发育过程中的程序性死亡(PCD)、超敏反应等，很多与DNA的修复相关。在植物PCD过程中有DNA的损伤和降解，已经陆续检测到和克隆出了该过程有关的DNase。在西红柿的叶衰老过程中检测到了两个nuclease。百日草中克隆到ZEN1，认为ZEN1是直接参与管状分子PCD的DNase。在小麦的糊粉层细胞凋亡中发现了定位在核内的GA诱导的nuclease。从拟南芥中克隆到DNaseBFN1，可能和叶的衰老过程有关。DNase可以根据依赖离子的不同分类，也可以根据对底物的偏好分类。

[0005] 拟南芥的CAN基因在2000年被克隆，已证明CAN有依赖钙离子的DNase活性，但是缺乏深入的功能分析。CAN与葡萄球菌细胞外核酸酶类似，有一个SNc结构域，它的酶活性可被锌离子抑制，在细菌中已经发现很多与葡萄球菌细胞外核酸酶同源的基因，例如，Shigella flexneri中pSa质粒上的nuc基因，大肠杆菌中RP4质粒上的parB基因。高等植物中第一个与葡萄球菌同源的DNase基因在紫堇属(Corydalis sempervirens)中发现，植物中其他同源的基因陆续被克隆，现已经从烟草、杨树、水稻等多种植物中找到该类基因。 [0006] 虽然已克隆到很多DNase，但它们在植物PCD过程中所起的作用，所处的地位尚不明确，与动物相比，植物PCD过程的研究仍然处于起步阶段。

[0007] 发明内容

[0008] 本发明的一个目的是提供一种核酸酶及其编码基因。

[0009] 本发明所提供的核酸酶，名称为CsCaN，来源于黄瓜，是如下(a)或(b)的蛋白质： [0010] (a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0011] (b)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有核酸酶活性的由序列3衍生的蛋白质。

[0012] 序列表中的序列3由334个氨基酸残基组成，自序列3的氨基末端第220-330位氨基酸残基是保守的SNc结构域。

[0013] 所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列3的SNc结构域外进行取代和/或缺失和/或添加。

[0014] 为了使(a)中的CsCaN便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0015] 表1标签的序列

[0016]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagII 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0017] 上述(b)中的CsCaN可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的CsCaN的编码基因可通过将序列表中序列2自5′端第1至1005位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。 [0018] 上述核酸酶的编码基因也属于本发明的保护范围。

[0019] 所述核酸酶的编码基因具体可为如下1)或2)或3)的基因：

[0020] 1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

[0021] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； [0022] 3)与序列表中序列2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

[0023] 上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0024] 序列表中的序列2由1005个脱氧核糖核苷酸组成，自5’末端的第1至1005位脱氧核糖核苷酸为CsCaN的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第1至3位脱氧核糖核苷酸为CsCaN的起始密码子ATG，自5’端的第1003至1005位脱氧核糖核苷酸为CsCaN的终止密码子TAA。

[0025] 含有CsCaN的上述任一种编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

[0026] 所述重组表达载体可为在pET28a(+)的BamHI和NotI酶切位点间插入序列表中序列2所示的核苷酸序列得到的重组表达载体pET28a-CsCaN。

[0027] 所述重组表达载体还可为在表达载体Pmal载体的XmnI和SalI酶切位点间插入序列表中序列2所示的核苷酸序列得到的重组表达载体Pmal-CsCaN。

[0028] 本发明提供的核酸酶可用于降解DNA，如超螺旋DNA、双链DNA和单链DNA中的任意一种，没有切割特异性，可以作为去除DNA的广谱酶。本发明提供的核酸酶耐热，在较高温度下具有酶活性。

[0029] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

[0030] 图1为CsCaN胶内酶活检测的电泳图

[0031] 图2为CsCaN试管内酶活检测的电泳图

[0032] 图3为CsCaN钙离子依赖酶活检测的电泳图

[0033] 图4为CsCaN耐热酶活检测的电泳图

具体实施方式

[0034] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0035] 实施例1、黄瓜核酸酶CsCaN的筛选及其cDNA的克隆

[0036] 因为黄瓜雌花雄蕊在特定的时期开始出现花药特异的DNA损伤，并且检测到该过程中有DNase活性物质存在，推测可能DNase导致DNA的损伤的发生，从而引起雄蕊原基的滞育，产生单性花，那么这个导致DNA损伤的DNase基因就是一个关键的执行分子，很值得研究。在黄瓜雌花雄蕊的发育过程中，一定有很多基因参与这个发育调控的过程，所以通过克隆发育调控的基因，解析这一过程。

[0037] 通过抑制消减杂交找到差异表达的基因，得到一系列基因，然后再筛选符合预期的基因，找到DNase的EST，EST序列如序列表中的序列1所示。

[0038] 根据EST序列设计引物如下：

[0039] 3’RACE引物

[0040] Nuclease3’race1 5’GCTGAGGCTTGGAAGACGGAGAA 3’

[0041] Nuclease3’race2 5’CAGACGCTGCCAGTTGATGCC 3’

[0042] Nuclease3’race3 5’AAGACAATCACGGATGCTGGTTACA 3’

[0043] 5’Race引物

[0044] Nuclease 5’race3 3’AACCGACTCCGAACCTTCTGCCTC 5’

[0045] Nuclease 5’race2 3’CTGCGACGGTCAACTACGGTTTCG 5’

[0046] Nuclease 5’race1 3’TCGTGTAGTGTGGGCTCTCTCAGGAG 5’

[0047] 反转录引物Nuclease 5’raceRT 3’TTACTCCTCCAAGAA 5’

[0048] 利用带oligo dT的反转录引物反转录合成第一链cDNA，用通用引物和上面的三个PCR引物顺序进行嵌套PCR，对最终得到的产物进行测序，得到全长的CsCaNcDNA序列。PCR流程见CLONTHCH公司SMART-RACE试剂盒。

[0049] 用Trizol(invitrogen)提取中农五号(中国农科院蔬菜花卉研究所)黄瓜花的总RNA，用superscriptII(invitrogene)反转录酶反转录获得到cDNA。根据全长的CsCaN cDNA序列，设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

[0050] P1：5’-ct-gaaggatttc-ATGGGAAACGCACTCAGGT-3’，

[0051] P2：5’-ca-gtcgac-TTATTTCCCCTCACGCTTTC-3’。

[0052] 对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1kb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega)连接，参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的CsCaN基因由1005个脱氧核糖核苷酸组成，其开放阅读框(ORF)为序列表中序列2的自5′末端第1至1005位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质。将含有序列表中序列2的自5′末端第1-1005位脱氧核糖核苷酸的CsCaN基因的重组载体命名为pTE-CsCaN。

[0053] 利用软件分析CsCaN的等电点和分子量，结果表明pI＝9.55；Mw＝37454.75。自序列3的氨基末端第220位-330位为SNc结构域。

[0054] 然后根据CDS序列，设计基因两端的序列进行PCR得到基因组DNA序列(序列表中序列4)。该序列含有9个外显子，8个内含子。

[0055] 实施例2、CsCaN的核酸酶活性验证

[0056] 一、胶内检测酶活

[0057] 以中农五号(中国农科院蔬菜花卉研究所)黄瓜花的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有BamHI和NotI接头序列的特异引物PCR扩增CsCaN(序列表中的序列2)。引物序列如下：

[0058] P3：5’-ct-ggatcc-ATGGGAAACGCACTCAGGT-3’，

[0059] P4：5’-at-gcggccgc-TTTCCCCTCACGCTTTCCC-3’。

[0060] 用BamHI和NotI双酶切PCR产物，回收，将CsCaN正向插入pET28a(+)(Novagen公司)载体的BamHI和NotI酶切位点之间，得到重组载体pET28a-CsCaN。将重组载体pET28a-CsCaN转化大肠杆菌BL21(DE3)，用引物P3和P4进行PCR鉴定，得到转入pET28a-CsCaN的重组大肠杆菌pET28a-CsCaN/大肠杆菌BL21(DE3)。LB培养至OD600nm＝0.5-0.8，用0.5m M IPTG诱导，使CsCaN蛋白表达。以pET28a(+)转化大肠杆菌BL21，LB培养至OD600nm＝0.5-0.8，用0.5m M IPTG诱导，作为对照。

[0061] 用胶内检测酶活的方法检测CsCaN的DNase活性，结果如图1所示。 [0062] 胶内检测酶活的方法具体如下：

[0063] 1)按照常规方法配12％SDS-PAGE胶，配制时，向下层胶中添加500uL 2.5mg/mL鲑鱼精DNA。用以检测双链DNA酶活性。

[0064] 2)将上述IPTG诱导3小时的转pET28a-CsCaN大肠杆菌和转pET28a空载体的大肠杆菌对照分别破碎菌体细胞，点样，进行SDS-PAGE电泳。

[0065] 3)将电泳后的凝胶置于100mL清洗缓冲液中清洗两次，每次20分钟；再用10mM Tris-HCl pH7.5的缓冲液清洗40分钟，以便移去PAGE胶中的SDS，使蛋白复性；最后换上新鲜的10mM Tris-HCl pH7.5的缓冲液，加入终浓度为10mM的MgCl2和5mM的CaCl2，37℃温浴4小时；将凝胶放入EB染液中，染色10-30分钟，在紫外灯下观察。因为鲑鱼精DNA存在于整块胶中，紫外灯下整块胶的背景色应该为白色。若所表达的蛋白具有DNA核酸酶活性，就会降解其所在位置的鲑鱼精DNA，因此在紫外灯中会出现黑斑。

[0066] 清洗缓冲液配方(100mL)：称取Tris粉末0.121g，加入60mL去离子水，调pH7.5，再加入25mL异丙醇，最后加水定容至100mL。

[0067] 图1中，1为蛋白分子量标准marker，从上到下条带对应的分子量依次为175kd、83kd、62kd、48kd、33kd；2为转pET28a(+)空载体的大肠杆菌对照；3为转pET28a-CsCaN大肠杆菌。结果显示CsCaN蛋白可以降解鲑鱼精DNA，具有DNA核酸酶活性。 [0068] 二、试管内酶活测定

[0069] 1、CsCaN蛋白的获得

[0070] 以中农五号(中国农科院蔬菜花卉研究所)黄瓜花的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有XmnI和SalI接头序列的特异引物PCR扩增CsCaN(序列表中的序列2)；然后XmnI和SalI双酶切PCR产物，回收，将CsCaN正向插入Pmal-c2x载体(New England Biolabs公司)的XmnI和SalI酶切位点之间，得到重组载体Pmal-CsCaN。 [0071] 引物序列如下：

[0072] P1：5’-ct-gaaggatttc-ATGGGAAACGCACTCAGGT-3’，

[0073] P2：5’-ca-gtcgac-TTATTTCCCCTCACGCTTTC-3’。

[0074] 将重组载体Pmal-CsCaN转化大肠杆菌BL21(DE3)，用引物P1和P2进行PCR鉴定。得到转入Pmal-CsCaN的重组大肠杆菌Pmal-CaCaN/大肠杆菌BL21(DE3)，LB培养到OD600nm＝0.5-0.8，用0.5m M IPTG诱导融合蛋白表达。诱导3小时后，利用麦芽糖结合蛋白吸附柱对诱导产生的蛋白进行纯化，纯化步骤为：将诱导的菌收集后破碎，离心收集上清液，然后过麦芽糖结合蛋白吸附柱，洗去杂蛋白后用洗脱液洗脱目的蛋白，收集。用Fxa(New England Biolabs公司)酶切融合蛋白，将酶切后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，得到纯化的CsCaN。

[0075] 2、CsCaN的底物特异性测定

[0076] 配制buffer：含终浓度为10mM的Tris(pH8.5)和10mM CaCl2。

[0077] 分别进行以下操作：

[0078] 1)在试管中加入20ul buffer，1ug单链鲑鱼精DNA，加入1ul纯化的CsCaN蛋白；在另一个试管中加入20uL buffer，1ug单链鲑鱼精DNA，作为对照。

[0079] 2)在试管中加入20uL buffer，1ug双链鲑鱼精DNA，加入1ul纯化的CsCaN蛋白；在另一个试管中加入20uL buffer，1ug双链鲑鱼精DNA，作为对照。

[0080] 3)在试管中加入20uL buffer，2ug 3kb的pGEM-Teasy质粒DNA，加入1ul纯化的CsCaN蛋白；在另一个试管中加入20uL buffer，2ug 3kb的pGEM-Teasy质 粒DNA，作为对照。 [0081] 4)在试管中加入20uL buffer，100ng marker(TAKARA DL15000)，加入1ul纯化的CsCaN蛋白；在另一个试管中加入20uL buffer，100ng marker(TAKARADL15000)，作为对照。 [0082] 分别进将上述试管37℃温浴2-4小时，然后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测各种DNA酶切后情况，结果如图2。

[0083] 图2中1为CsCaN消化的单链鲑鱼精DNA；2为未经消化的单链鲑鱼精对照；3为CsCaN消化的双链鲑鱼精DNA；4为未经消化的双链鲑鱼精对照；5为CsCaN消化的3kb的pGEM-Teasy质粒DNA；6为未经消化的3kb的pGEM-Teasy质粒对照；7为CsCaN消化的marker(TAKARA DL15000)；8为未经消化的marker对照。

[0084] 结果表明CsCaN能够切割超螺旋DNA(质粒)，双链DNA，单链DNA，基因组DNA，无底物特异性。

[0085] 3、酶活钙离子依赖的检测

[0086] 配制2X buffer：含浓度为20mM EGTA、20mM Tris(pH8.5)。

[0087] 每个反应体系中加入200ng的黄瓜基因组DNA，分别进行以下操作： [0088] 1)在试管中加入10uL DNA-buffer，加入1ul纯化的CsCaN蛋白，补水至20ul。 [0089] 2)在试管中加入10uL DNA-buffer，加入1ul纯化的CsCaN蛋白，加入CaCl2 至终浓度为0.001M，补水至20ul。

[0090] 3)在试管中加入10uL DNA-buffer，加入1ul纯化的CsCaN蛋白，加入CaCl2 至终浓度为0.01M，补水至20ul。

[0091] 4)在试管中加入10uL DNA-buffer，加入1ul纯化的CsCaN蛋白，加入CaCl2 至终浓度为0.1M，补水至20ul。

[0092] 结果如图3。图3中1为marker(TAKARA DL15000)；2为DNA-buffer；3为加入CsCaN蛋白的DNA-buffer；4为加入CsCaN蛋白、0.001M终浓度CaCl2的DNA-buffer；5为加入CsCaN蛋白、0.01M终浓度CaCl2的DNA-buffer；6为加入CsCaN蛋白、0.1M终浓度CaCl2的DNA-buffer。

[0093] 结果表明，酶活性是钙离子依赖的，可以被螯合物EDTA抑制。 [0094] 4、耐热性检测

[0095] 1)配制2X buffer：含浓度为20mM的Tris(pH8.5)和20mM CaCl2。 [0096] 2)在试管中加入120ul buffer，3ug pCAMBIA1302质粒DNA，加入10ul纯化的 CsCaN蛋白，补水至240ul。

[0097] 3)分别取40ul步骤2)制得的溶液在50℃、60℃、70℃、80℃度温浴4小时消化DNA。

[0098] 4)取20ul buffer，加入0.5ug pCAMBIA1302质粒DNA，补水至40ul，50℃温浴4小时，作为对照。

[0099] 5)将步骤3)和步骤4)的产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，检测各种DNA酶切后情况，结果如图4。

[0100] 图4中1为marker(TAKARA DL15000)；2为未经消化的pCAMBIA1302质粒DNA对照；3为50℃ CsCaN消化的pCAMBIA1302质粒DNA；4为60℃ CsCaN消化的pCAMBIA1302质粒DNA；5为70℃ CsCaN消化的pCAMBIA1302质粒DNA；6为80℃ CsCaN消化的pCAMBIA1302质粒DNA。

[0101] 结果表明CsCaN有一定热稳定性。

[0102] 序列表

[0103] <110>北京大学

[0104] <120>一种植物核酸酶及其编码基因与应用

[0105] <130>CGGNARY81045

[0106] <160>4

[0107] <210>1

[0108] <211>509

[0109] <212>DNA

[0110] <213>黄瓜属黄瓜(Cucumis sativus Linn.)

[0111] <400>1

[0112] gaattcacta gtgattagcg tggtcgcggc cgaggtacgc gggcgaattg gtatgcaaaa 60 [0113] ttggctgagg cttggaagac ggagaaacca actccacgaa ctcctgaaga agcttctaga 120 [0114] cttgtgattc agactctcaa aagacaccaa aagaaagatg tcgagggact attgacattc 180 [0115] tatggtcttc ctcttcctca tactctcgtc aaaccttctg ctccggttcc aactgccgtc 240 [0116] tcgatacctg tcggagtcaa gtttgagctg cagacgctgc cagttgatgc caaagctgta 300 [0117] gcagatggtg atacagtgac agtgtatgtg agcacatcac acccgagaga gtcctcttgt 360 [0118] gttccaaaag aggttagaaa tgcagccctt caaagatcac gagctagaaa cgcaaagaac 420 [0119] tttgtaaagg ccgatgctct tcacaagaca atcacggatg ctggttacag ggtaattact 480 [0120] tttcagaatg aggaggttct tgcaaaaaa 509 [0121] <210>2

[0122] <211>1005

[0123] <212>DNA

[0124] <213>黄瓜属黄瓜(Cucumis sativus Linn.)

[0125] <400>2

[0126] atgggaaacg cactcaggtt cctctgcggc cacttctccc gtcccacctc cgattccttc 60 [0127] cctcctcacg ccgccgtatc ttcctccact gccggcgtct ccgctctccc tcacgatctc 120 [0128] ttcgaattcg agatcacatc acaggttcct ccagggctta gtaagcatgt ggtttcatcg 180 [0129] aagaaggcac aggcgaattg gtatgcaaaa ttggctgagg cttggaagac ggagaaacca 240 [0130] actccacgaa ctcctgaaga agcttctaga cttgtgattc agactctcaa aagacaccaa 300 [0131] aagaaagatg tcgagggact attgacattc tatggtcttc ctcttcctca tactctcgtc 360 [0132] aaaccttctg ctccggttcc aactgccgtc tcgatacctg acggagtcaa gtttgagctg 420 [0133] cagacgctgc cagttgatgc caaagctgta gcagatggtg atacagtgac agtgtatgtg 480 [0134] agcacatcac acccgagaga gtcctcttgt gttccaaaag aggttagaaa tgcagccctt 540 [0135] caaagatcac gagctagaaa cgcaaagaac tttgcaaagg ccgatgctct tcacaagaca 600 [0136] atcacggatg ctggttacag ggtaattact tttcagaatg aggaggttct tgcaaaaaag 660 [0137] tacagaattc gtctcagagg aatagacgca ccagaaagtg caatgcctta tgggaaagag 720 [0138] gcaaaagaag aactgaaaag gcttgttgaa ggcaagtgtt tgagagtaca tgtgtatggt 780 [0139] gaagatcggt acaatcgatg tgtgggtgac ttgtattgta atggaaagtt tattcaggaa 840 [0140] gcaatgctga aaaaggggtt tgcttggcat tacacagcat atgacaaacg tccagagctg 900 [0141] tcaaagtggg aaaacgaggc tcgagctaaa agggctgggt tgtgggcttc ttcaaaccca 960 [0142] gagcagccat gggaatggag aaagggaaag cgtgagggga aataa 1005 [0143] <210>3

[0144] <211>334

[0145] <212>PRT

[0146] <213>黄瓜属黄瓜(Cucumis sativus Linn.)

[0147] <400>3

[0148] Met Gly Asn Ala Leu Arg Phe Leu Cys Gly His Phe Ser Arg Pro Thr [0149] 1 5 10 15 [0150] Ser Asp Ser Phe Pro Pro His Ala Ala Val Ser Ser Ser Thr Ala Gly [0151] 20 25 30 [0152] Val Ser Ala Leu Pro His Asp Leu Phe Glu Phe Glu Ile Thr Ser Gln [0153] 35 40 45

[0154] Val Pro Pro Gly Leu Ser Lys His Val Val Ser Ser Lys Lys Ala Gln [0155] 50 55 60

[0156] Ala Asn Trp Tyr Ala Lys Leu Ala Glu Ala Trp Lys Thr Glu Lys Pro [0157] 65 70 75 80 [0158] Thr Pro Arg Thr Pro Glu Glu Ala Ser Arg Leu Val Ile Gln Thr Leu [0159] 85 90 95 [0160] Lys Arg His Gln Lys Lys Asp Val Glu Gly Leu Leu Thr Phe Tyr Gly [0161] 100 105 110 [0162] Leu Pro Leu Pro His Thr Leu Val Lys Pro Ser Ala Pro Val Pro Thr [0163] 115 120 125

[0164] Ala Val Ser Ile Pro Asp Gly Val Lys Phe Glu Leu Gln Thr Leu Pro [0165] 130 135 140

[0166] Val Asp Ala Lys Ala Val Ala Asp Gly Asp Thr Val Thr Val Tyr Val [0167] 145 150 155 160 [0168] Ser Thr Ser His Pro Arg Glu Ser Ser Cys Val Pro Lys Glu Val Arg [0169] 165 170 175 [0170] Asn Ala Ala Leu Gln Arg Ser Arg Ala Arg Asn Ala Lys Asn Phe Ala [0171] 180 185 190 [0172] Lys Ala Asp Ala Leu His Lys Thr Ile Thr Asp Ala Gly Tyr Arg Val [0173] 195 200 205

[0174] Ile Thr Phe Gln Asn Glu Glu Val Leu Ala Lys Lys Tyr Arg Ile Arg [0175] 210 215 220

[0176] Leu Arg Gly Ile Asp Ala Pro Glu Ser Ala Met Pro Tyr Gly Lys Glu [0177] 225 230 235 240 [0178] Ala Lys Glu Glu Leu Lys Arg Leu Val Glu Gly Lys Cys Leu Arg Val [0179] 245 250 255 [0180] His Val Tyr Gly Glu Asp Arg Tyr Asn Arg Cys Val Gly Asp Leu Tyr [0181] 260 265 270 [0182] Cys Asn Gly Lys Phe Ile Gln Glu Ala Met Leu Lys Lys Gly Phe Ala [0183] 275 280 285

[0184] Trp His Tyr Thr Ala Tyr Asp Lys Arg Pro Glu Leu Ser Lys Trp Glu [0185] 290 295 300

[0186] Asn Glu Ala Arg Ala Lys Arg Ala Gly Leu Trp Ala Ser Ser Asn Pro [0187] 305 310 315 320 [0188] Glu Gln Pro Trp Glu Trp Arg Lys Gly Lys Arg Glu Gly Lys [0189] 325 330

[0190] <210>4

[0191] <211>3116

[0192] <212>DNA

[0193] <213>黄瓜属黄瓜(Cucumis sativus Linn.)

[0194] <400>4

[0195] atgggaaacg cactcaggtt cctctgcggc cacttctccc gtcccacctc cgattccttc 60 [0196] cctcctcacg ccgccgtatc ttcctccact gccggcgtct ccgctctccc tcacgatctc 120 [0197] ttcgaattcg agatcacatc acaggtaaat ctctagctcc cgttgttgct gttgttgtgg 180 [0198] tgagcattat tttaagattt gaattggatc atgtcttgtg ccctagttca atttgttaat 240 [0199] tgaacgattt ggactttgat ggtgttgacg aatttgtttg ttttttgata ggttcctcca 300 [0200] gggcttagta agcatgtggt ttcatcgaag aaggcacagg cgaattggtg aggttctttt 360 [0201] tacggggtgg ggaatttgta gttatgtggt ggtgagattt tgattgtttg gtggtcattt 420 [0202] gaaggtatgc aaaattggct gaggcttgga agacggagaa accaactcca cgaactcctg 480 [0203] aagaagcttc tagacttgtg attcagactc tcaaaagaca ccaaaagaaa gatgtcgagg 540 [0204] tacagtaaaa aatttagttt aattatgcca ttgtttactc tgttgtatgt gttgtttgat 600 [0205] tgagaatctg gcaacctctt cactttaagt agttcaattg aatgaatcaa agtcaccctt 660 [0206] tcaagtttgg gcagctctga ttatctcatt gattaaattt gtttttcttt ccatttcgtg 720 [0207] ttcaaaattt tagtaaagaa aagctgtatg tatatacatg gagatttcta gatgacttta 780 [0208] tagaacactc caaaatccaa tggggttgga tctgattaac tgtagtgcaa aacaaatcac 840 [0209] tatatacata atagtcaatt tctccaaaac cataatttac aaaatgggta aaataaagaa 900 [0210] ccccctctac aaatttccga gaaagaaaaa agaaaaaagg aaaacaattc tagtctccca 960 [0211] tatgcacttc aaaagggcat gtcaaactca cacttaatca agttttgtct catgggcaac 1020 [0212] agggactatt gacattctat ggtcttcctc ttcctcatac tctcgtcaaa ccttctgctc 1080 [0213] cggttccaac tgccgtctcg atacctgacg gagtcaagtt tgagctgcag acgctgccag 1140 [0214] taagatactt ctatgggaaa tgaccaacca ttttgatcat aacgtgtacg ttctcattgt 1200 [0215] gttaaattca tactaggttg atgccaaagc tgtagcagat ggtgatacag tgacagtgta 1260 [0216] tgtgagcaca tcacacccga gagagtcctc ttgtgttcca aaagaggtta gaaatgcagc 1320 [0217] ccttcaaaga tcacgagcta gaaacgcaaa gaactttgca aaggccgatg ctcttcacaa 1380 [0218] gacaatcacg gatgctggtt acaggtatat gatctctatc tctactatat ataattggaa 1440 [0219] tttataaata gattgctgag attcaatgcc tgtttcttct tcttcgaaag ggtaattact 1500 [0220] tttcagaatg aggaggttct tgcaaaaaag tacagaattc gtctcaggta attaaaaatt 1560 [0221] ttaaattagc tctatttgca ttagatgctt tagaccctat attttgatca tcgtttgtcc 1620 [0222] tttctgactc ataaactctc agtgcgttta ttttagttta tgtaaatttt aaatgttgtc 1680 [0223] tcctttgatc taaccgttct tttgaatctg gagttttcgt ttggtttttt gtacactcaa 1740 [0224] attttgagtt tgactaatac aaccatttta tttttgaaat ttggattttt gtttttgttt 1800 [0225] catatctagg tttcaacatt tatatcttta actttaattt tcatttcaaa cccacttcta 1860 [0226] ttcattaatt aagatgttta aaaatatcca ttaattaatg ttataaactt ttttattaat 1920 [0227] taatgttaga aaattttaat ttgacaaaat atttactaac ttattgtaaa aattcagatt 1980 [0228] ctatgacatt gatagacagt ttatcagttt ctattttgat agaatccaaa attgctatat 2040 [0229] ttggtaaata ttttagttta ttttactata tctgaaaatg tttcttaatc ttaaatacga 2100 [0230] aacttaatta ataatagttt cttagataaa ttattattca ttaacactga agattagaaa 2160 [0231] aaaaaaaagt atttagtgga aaatcaaaat tagaagtgta aatcttgccg cctaagacca 2220 [0232] aattgaaata aattcaaatg tgaagcctaa attgaaccaa ctcttaagat aataactaac 2280 [0233] tatatatata tatatatgtt tttccccata atttgtttcc tcattttttt aatcacaata 2340 [0234] tttataatat acaccaaact ttgtaaaata ttattacaac tctatattaa acaattatca 2400 [0235] cagtaaatag ttgagatcgt gaatttattc cataaaaaaa ttacaaattg tattgcccct 2460 [0236] tagagttgat atgatgcaga ggaatagacg caccagaaag tgcaatgcct tatgggaaag 2520 [0237] aggcaaaaga agaactgaaa aggcttgttg aaggcaagtg tttgagagta catgtgtatg 2580 [0238] gtgaagatcg gtacaatcga tgtgtgggtg acttgtattg taatggaaag tttattcagg 2640 [0239] taaaacacaa atttacactt tttttttttt ttttttgttc ttcgctatgg tatagtcttc 2700 [0240] atgttcatgt tattggttta gacaaataca agtttttggt tgtctttaca ggaagcaatg 2760 [0241] ctgaaaaagg ggtttgcttg gcattacaca gcatatgaca aacgtccaga gctgtcaaag 2820 [0242] gcaagggcta aatttaccat ttaacccatc tttaattaat ttagtgtttg attgcataaa 2880 [0243] cccttatttc aaaattaagg ttcaaaatca catgcaaaat ttcattaatc ataacatagg 2940 [0244] aaaagcagag cgacacatat ttctcaacaa gagccttttt ggctaagcct tacaaattgt 3000 [0245] ttaattattg ataacagtgg gaaaacgagg ctcgagctaa aagggctggg ttgtgggctt 3060 [0246] cttcaaaccc agagcagcca tgggaatgga gaaagggaaa gcgtgagggg aaataa 3116