一种枯草芽孢杆菌脱苦氨肽酶的发酵制备与提取的方法，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。本发明涉及利用枯草芽孢杆菌Zj016的发酵罐生产条件，收集发酵液，通过澄清、超滤浓缩和盐析，获得脱苦氨肽酶制品。选用的一株枯草芽孢杆菌Zj016，它生产的氨肽酶为外肽酶，可以从多肽链的氨基端解离氨基酸，经本实验室研究该氨肽酶与碱性蛋白酶协同水解大豆分离蛋白，制备的大豆多肽无苦味，且二肽、三肽等寡肽含量较高。此外，通过对该枯草芽孢杆菌所产酶系的研究发现，它只产外切型蛋白酶，不具备内切蛋白酶的活性，且此外切蛋白酶对末端疏水性强的氨基酸的水解能力较强，此研究更进一步说明它能够降低或消除大豆蛋白水解中产生的苦味。
1.一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的发酵制备与提取的方法，其特征是工艺为：A枯草芽孢杆菌发酵，收集发酵液：(1)出发菌株：采用枯草芽孢杆菌Zj016为出发菌株；
(2)种子培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，pH7.2；
(3)种子培养：分为一级种子培养和二级种子培养，一级和二级种子培养基相同；
一级种子培养：取0.2mL保藏好的菌种接入250mL培养瓶中的50mL种子培养基中，转速200rpm，37℃，培养8h；
二级种子培养：取一级种子液接种到种子培养基中，转速200rpm，37℃，培养6h；
(4)发酵培养基组成：玉米粉25～35g/L，豆渣粉6～12g/L，K2HPO42.7～3.8g/L，MgSO4·7H2O 0.5～0.7g/L，浓度0.1mol/L的CoCl21～3mL/每L培养基，调节pH至7.5；
液化处理：按发酵培养基的组成将发酵培养基的原料与一定量的水混匀，将温度升高到85℃，调pH至5.6，淀粉酶的用量40U/g培养基原料，不停地搅拌，水解2h；
糖化处理：将经过液化处理后的培养基原料冷却至65℃，调pH至4.5，糖化酶的用量
500U/g培养基原料，不停地搅拌，水解1.5h；
(6)发酵罐发酵条件：7L发酵罐装液量4L，接种量以体积计为4％，起始pH 7.0-8.0，培养温度35-40℃，转速400～1000rpm，通气量为2∶1v/v·min，溶氧DO与转速相协调，控制DO≥60％，培养15h；
发酵过程中的补料操作：补料的溶液为200g葡萄糖/L，补料体积为200mL，补料的方式选用一次性补料或两次补料，补料的时机根据发酵过程中的还原糖的浓度变化来确定，保持发酵液中还原糖浓度不低于2g/L；
(7)收集发酵液：将发酵液4℃、10000rpm离心10min后，弃沉淀，收集上清液；
(8)向收集的上清液中在4℃下加入质量分数为15％的(NH4)2SO4，4℃、10000rpm离心
(9)将收集到的澄清液选用截留相对分子质量为30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩
(10)向浓缩液中再加入质量分数为25％的(NH4)2SO4盐析，4℃、10000rpm离心10min，弃上清，取沉淀；
一种枯草芽孢杆菌脱苦氨肽酶的发酵制备与提取的方法
技术领域
[0001] 一种枯草芽孢杆菌脱苦氨肽酶规模化发酵制备与提取的方法，具体地说是利用枯草芽孢杆菌发酵，收集发酵液，通过澄清、超滤浓缩和盐析，获得脱苦氨肽酶制品，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。
背景技术
[0002] 蛋白质水解产生肽类物质和少量氨基酸，其溶解性、热稳定性以及营养特性得到明显改善，是现代食品加工过程中重要的原料。但水解液中往往产生呈苦味的苦味肽，这种苦味肽一般是氨端带有单个或多个疏水氨基酸的多肽链，有时也可能是羧端带疏水氨基酸，苦味限制了蛋白质水解物的应用。因此，减少、阻止及去除蛋白质水解物的苦味，成为当今研究的重要课题。
[0003] 脱苦方法有理化及酶法脱苦，理化脱苦包括分离、提取、吸附、掩盖、蛋白质改造以及酸碱水解等。但这些方法脱苦不彻底，会破坏一些氨基酸，尤其是必须氨基酸，使蛋白质的营养价值降低。相比，酶法具有水解效率高、条件温和、不会使蛋白多肽的营养成分丢失、水解过程易于控制、不改变蛋白肽的各种重要特性(如溶解性、低抗原性)等优点。利用酶控制肽的苦味，有氨肽酶法，羧肽酶法，碱性/中性蛋白酶法，相对来说氨肽酶法比后两种方法作用范围更为广泛，脱苦效果更好。国内关于微生物产羧肽酶的研究已有报导，而关于微生物产氨肽酶的报导则较少。另外，氨肽酶还可广泛用于肉制品加工、乳品业等，减少苦味增加游离氨基酸，提高食品营养价值。氨肽酶还可用作蛋白序列测定的分子工具及重组蛋白或融合产物的固化剂。
[0004] 酶解蛋白质生产多肽已成为当今热门研究，通过不同的酶切方式可以获得不同功能的活性多肽，关于这方面已有很多相关的报道。大豆蛋白水解生产大豆多肽是大豆深加工的一个重要方向，因为大豆多肽不仅具有良好的营养特性，还具有广泛的生理药理作用和比大豆蛋白更丰富的功能特性，所以大豆多肽是一种很有前景的功能性食品原料。随着生物技术的进步和生命科学的发展，生理活性肽的生理功能逐步被人们发现，并受到越来越多的重视，尤其是一些活性肽的结构和生理功能逐渐明确，推动了活性肽的研究，也促进了大豆肽的研究与开发。
[0005] 大豆多肽产品带有不同程度的苦味会直接影响食品的风味，给人们食用时会有一些“不愉快”，也在一定程度上限制了它在食品工业中的推广应用。研究证实当疏水性氨基酸残基处于多肽链的外侧时多肽呈现苦味，而单个的疏水 性氨基酸苦味却低的多，因此采用外切酶将疏水性氨基酸从多肽链末端切去可以有效地减少苦味。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌脱苦氨肽酶的发酵制备与提取的方法，采用一株能产具有脱苦效果氨肽酶的微生物，通过发酵培养、离心、澄清、超滤浓缩和盐析等工艺，最终获得氨肽酶。
[0007] 本发明的技术方案：将枯草芽孢杆菌接入以玉米粉、豆渣粉为碳、氮源的培养基中，调节发酵培养基的pH，发酵培养，收集发酵液，通过澄清、超滤浓缩和盐析，获得粗酶，工艺为：
[0008] A枯草芽孢杆菌发酵，收集发酵液：
[0009] (1)出发菌株：采用枯草芽孢杆菌Zj016为出发菌株；该菌株见【魏亚娟等，‘枯草芽孢杆菌脱苦氨肽酶在水解大豆分离蛋白中的应用研究’，食品工业科技Vol 29，No.04，2008.p149-151】；
[0010] (2)种子培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，pH7.2； [0011] (3)种子培养：分为一级种子培养和二级种子培养，一级和二级种子培养基相同； [0012] 一级种子培养：取0.2mL保藏好的菌种接入250mL培养瓶中的50mL种子培养基中，转速200rpm，37℃，培养8h；
[0013] 二级种子培养：取一级种子液接种到种子培养基中，转速200rpm，37℃，培养6h； [0014] (4)发酵培养基组成：玉米粉25～35g/L，豆渣粉6～12g/L，K2HPO42.7～3.8g/L，MgSO4·7H2O 0.5～0.7g/L，浓度0.1mol/L的CoCl21～3mL/每L培养基，调节pH至7.5； [0015] (5)原料的预处理：
[0016] 液化处理：按发酵培养基的组成将发酵培养基的原料与一定量的水混匀，将温度升高到85℃，调pH至5.6，淀粉酶的用量40U/g培养基原料，不停地搅拌，水解2h； [0017] 糖化处理：将经过液化处理后的培养基原料冷却至65℃，调pH至4.5，糖化酶的用量500U/g培养基原料，不停地搅拌，水解1.5h；
[0018] (6)发酵罐发酵条件：7L发酵罐装液量4L，接种量以体积计为4％，起始pH7.0-8.0，培养温度35-40℃，转速400～1000rpm，通气量为2∶1v/v·min，溶氧DO与转速相协调，控制DO≥60％，培养15h；
[0019] 发酵过程中的补料操作：补料的溶液为200g葡萄糖/L，补料体积为200mL，补料的方式选用一次性补料或两次补料，补料的时机根据发酵过程中的还原糖的浓度变化来确定，保持发酵液中还原糖浓度不低于2g/L；
[0020] (7)收集发酵液：将发酵液4℃、10000rpm离心10min后，弃沉淀，收集上清液； [0021] B氨肽酶的提取：
[0022] (8)向收集的上清液中在4℃下加入质量分数为15％的(NH4)2SO4，4℃、10000rpm离心10min，弃沉淀，收集澄清液；
[0023] (9)将收集到的澄清液选用截留相对分子质量为30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩3-5倍；
[0024] (10)向浓缩液中再加入质量分数为25％的(NH4)2SO4盐析，4℃、10000rpm离心10min，弃上清，取沉淀；
[0025] (11)将沉淀冷冻干燥，即得到固体的氨肽酶。
[0026] 将按上述方法制备的氨肽酶按一定方法分析其对几种底物的水解情况，发现其无内切型蛋白酶活性(酸性、中性或碱性蛋白酶)，仅具有外切氨肽酶活性，对末端为疏水性较强的氨基酸的作用较强。
[0027] 本发明的有益效果：本发明采用一株能产具有脱苦效果氨肽酶的微生物枯草芽孢杆菌Zj016，通过发酵培养、离心、澄清、超滤浓缩和盐析等工艺，最终获得氨肽酶，整个工艺流程的收率为87.7％，酶的比活为1102055U/mg，最适温度50℃，温度稳定范围45～70℃，最适pH 8.0，稳定pH范围7.0～9.5。
[0028] 制得的氨肽酶为外肽酶，可以从多肽链的氨基端解离氨基酸，经本实验室研究该氨肽酶与碱性蛋白酶协同水解大豆分离蛋白，制备的大豆多肽无苦味，且二肽、三肽等寡肽含量较高。此外，通过对该枯草芽孢杆菌所产酶系的研究发现，它只产外切型蛋白酶，不具备内切蛋白酶的活性，且该外切蛋白酶对末端疏水性强的氨基酸的水解能力较强，此研究更进一步说明它能够降低或消除大豆蛋白水解中产生的苦味。
[0029] 附图说明
[0030] 图1枯草芽孢杆菌脱苦氨肽酶制备工艺示意图。
[0031] 具体实例方式
[0032] 实施例1
[0033] 将枯草芽孢杆菌Zj016斜面接入种子液，扩大培养后，再按接种量4％接入4L发酵培养基中，发酵培养基组成如说明书所述，先经过液化和糖化处理。初始pH7.0～8.0，35～40℃、400～1000rpm、通气量2∶1，最低DO控制在60％，DO与转速相偶联，培养15h。
将发酵液在4℃，10000rpm离心10min收集3.28L发酵液，在4℃下加入质量分数为15％的(NH4)2SO4，4℃，10000rpm离心10min收集澄清液，选用30kDa的超滤膜进行浓缩适当的倍数，向浓缩液中再加入质量分数为25％的(NH4)2SO4盐析，4℃，10000rpm离心10min收集沉淀，将沉淀冷冻干燥，即得到固体的氨肽酶。
[0034] 实施例2
[0035] 对实施例1中所制备的氨肽酶进行酶系及底物特异性研究，分别测定其酸性、中性以及碱性蛋白酶活性，结果无相关内切型蛋白活性。进一步研究发现它具有外切氨肽酶活性，其对于底物为L-亮氨酸对硝基苯胺(Leu-pNA)的活性最强，可达3900U/mL左右，对于底物为L-谷氨酸对硝基苯胺(Glu-pNA)活性仅为391U/mL，而对于底物为L-甘氨酸-脯氨酸对硝基苯胺(Gly-Pro-pNA)无水解能力，表明其对末端为疏水性较强的氨基酸的作用较强。
