用脑膜细胞生成诱导的多能性干细胞的方法及其用途转让专利
申请号 : CN200810198517.0
文献号 : CN101492676B
文献日 : 2011-02-16
发明人 : 裴端卿 , 米盖尔.埃斯特班 , 曾令文 , 何文智 , 王涛 , 邵开峰 , 李雯 , 甘毅 , 秦大江
申请人 : 中国科学院广州生物医药与健康研究院
摘要 :
本发明涉及使用脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞(iPS)的方法，所述方法包括：用包含多能性干细胞因子的cDNA导入脑膜细胞；在适宜上述被导入的脑膜细胞生长的培养条件下培养该细胞。本发明还涉及脑膜细胞被诱导重编程为iPS的用途，特别是所述脑膜细胞在被导入了多能性干细胞因子的cDNA后而被诱导重编程为iPS的用途。
权利要求 :
1.将脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞的方法，所述方法包括：用cDNA导入脑膜细胞；
在适宜上述被导入的脑膜细胞生长的培养条件下培养该细胞，所述cDNA为Sox2、Oct4、Klf4与C-myc。
2.如权利要求1的将脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞的方法，所述方法还包括：c)鉴定多能性干细胞克隆。
3.如权利要求1或2所述的将脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞的方法，其中所述导入cDNA的方法为用包含所述cDNA的病毒载体感染脑膜细胞。
4.如权利要求3的将脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞的方法，所述病毒载体为逆转录病毒载体。
5.如权利要求4的将脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞的方法，所述逆转录病毒载体为pMX。
6.如权利要求5所述的将脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞的方法，所述脑膜细胞来源于哺乳动物。
7.如权利要求6所述的将脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞的方法，所述哺乳动物为小鼠。
8.如权利要求7所述的将脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞的方法，所述脑膜细胞优选为保藏在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：C200838的小鼠脑膜细胞。
9.通过权利要求7中方法产生的多能性干细胞用于产生嵌合小鼠的用途。
10.脑膜细胞用于经诱导重编程而产生多能性干细胞的用途，所述诱导脑膜细胞重编程的过程包括将cDNA导入脑膜细胞，所述cDNA为Sox2、Oct4、Klf4与C-myc。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述导入为使用cDNA的病毒载体感染脑膜细胞。
12.如权利要求10或11所述的脑膜细胞的用途，所述脑膜细胞来源于哺乳动物。
13.如权利要求12中脑膜细胞的用途，所述脑膜细胞来源于小鼠。
14.cDNA用于诱导脑膜细胞重编程为多能性干细胞的用途，所述诱导脑膜细胞重编程的过程包括将cDNA导入脑膜细胞，所述cDNA为Sox2、Oct4、Klf4与C-myc。
15.如权利要求14所述的cDNA的用途，其中所述导入为使用cDNA的病毒载体感染脑膜细胞。
16.如权利要求14或15所述的cDNA的用途，其中所述脑膜细胞来源于小鼠。
说明书 :
用脑膜细胞生成诱导的多能性干细胞的方法及其用途
[0001] 一.发明背景
[0002] 干细胞(stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为
成体干细胞(somaticstem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)。成
体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞等成体组织中存在的。
成体干细胞(somaticstem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)。成
体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞等成体组织中存在的。
[0003] 1981年，ES细胞的分离和培养首先在小鼠中获得成功，是至今研究最广泛、最成熟的干细胞体系。随后，牛、羊等大动物的ES细胞分离和培养也相继获得成功。
[0004] hES细胞研究的应用前景主要是移植治疗，在组织工程学领域中以hES细胞作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制hES细胞分
化培养环境、转染能够促进ES细胞定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得
特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血
病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。
化培养环境、转染能够促进ES细胞定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得
特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血
病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。
[0005] 一直以来，hES细胞研究面临着许多难题和争议，主要包括以下几个方面：(1)供体卵母细胞的来源困难，hES细胞建系效率低。此外，SCNT技术的不成熟必将需要进一步
耗费更多的人类卵母细胞，故而其来源难以得到保证。(2)免疫排斥反应，除非采用SCNT
技术，否则患者对hES细胞分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应。(3)hES
细胞具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移
植细胞设置自杀基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题(Reubinoff BE等
人.Embryonic stem cell lines from human blastocysts：somatic differentiation
in vitro。NatBiotechnol 2000；18：399-404；Richards M等人，Bongso A.Human feeders
support prolongedundifferentiated growth of human inner cell masses and
embryonic stem cells.Nat Biotechnol 2002；20：933-936；Burdon T等人，cell cycle
耗费更多的人类卵母细胞，故而其来源难以得到保证。(2)免疫排斥反应，除非采用SCNT
技术，否则患者对hES细胞分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应。(3)hES
细胞具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移
植细胞设置自杀基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题(Reubinoff BE等
人.Embryonic stem cell lines from human blastocysts：somatic differentiation
in vitro。NatBiotechnol 2000；18：399-404；Richards M等人，Bongso A.Human feeders
support prolongedundifferentiated growth of human inner cell masses and
embryonic stem cells.Nat Biotechnol 2002；20：933-936；Burdon T等人，cell cycle
[0006] and pluripotency in embryonic stem cells.Trends Cell Biol 2002；12：432-438)。(4)体外保持hES风险(Nakagawa M，等人，N，Yamanaka S.Generation of
induced pluripotentstem cells withoutMyc from mouse and human fibroblasts.Nat
Biotechnol 2008；26：101-106)。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。
induced pluripotentstem cells withoutMyc from mouse and human fibroblasts.Nat
Biotechnol 2008；26：101-106)。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。
[0007] 为避开hES细胞和治疗性克隆研究的伦理学争论，需要找到一种替代途径，以便将人类的体细胞直接转化为多潜能干细胞，为患者提供“个性化”的自体干细胞。2003年，
Gurdon研究小组发现，将已完全 分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注
入爪蟾卵母细胞后，哺乳动物细胞核的分化标志物丧失，而哺乳动物干细胞中最具特征性
的标志物Oct4则呈高表达，提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物卵母细胞核泡所重构
从而表达Oct4(Byrne JA等人，Nuclei of adult mammalian somatic cells aredirectly
reprogrammed to oct-4 stem cell gene expression by amphibian oocytes.Curr Biol
2003；13：1206-1213)。
Gurdon研究小组发现，将已完全 分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注
入爪蟾卵母细胞后，哺乳动物细胞核的分化标志物丧失，而哺乳动物干细胞中最具特征性
的标志物Oct4则呈高表达，提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物卵母细胞核泡所重构
从而表达Oct4(Byrne JA等人，Nuclei of adult mammalian somatic cells aredirectly
reprogrammed to oct-4 stem cell gene expression by amphibian oocytes.Curr Biol
2003；13：1206-1213)。
[0008] 2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子
导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ES细胞的培养条件下
获得了Fbx15+的多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸
胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动
物方面却不同于小鼠ES细胞，故将其命名为诱导的多能性干细胞(iPS细胞)(Takahashi
K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and
adultfibroblast cultures by defined factors.Cell2006；126：663-676)。
导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ES细胞的培养条件下
获得了Fbx15+的多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸
胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动
物方面却不同于小鼠ES细胞，故将其命名为诱导的多能性干细胞(iPS细胞)(Takahashi
K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and
adultfibroblast cultures by defined factors.Cell2006；126：663-676)。
[0009] 2007-07，Yamanaka研究小组进一步用Nanog代替Fbx15进行筛选，得到了Nanog+的iPS细胞系，该iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、标志物表达、移植到小鼠皮下可形
成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基
化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。
此外，研究还发现重新激活原癌基因c-Myc是嵌合体动物出现肿瘤形成的原因；而转染的
上述4个基因在iPS细胞中并没有表达，表明这些基因只在诱导过程中起作用，iPS细胞保
持多潜能性状态的原因是内源性转录因子Nanog基因的表达(Okita K，Ichisaka T等人，
germline-competent induced pluripotent stem cells.Nature2007；448：313-317)。同
时独立发表的另一篇来自美国科学家的研究论文同样证实了上述4个转录因子足以使小
鼠成纤维细胞在体外诱导重构成为类似小鼠ES细胞的iPS细胞(Wernig M等人，In vitro
reprogramming of fibroblasts intoa pluripotent ES cell-like state.Nature 2007；
448：318-324)。
成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基
化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。
此外，研究还发现重新激活原癌基因c-Myc是嵌合体动物出现肿瘤形成的原因；而转染的
上述4个基因在iPS细胞中并没有表达，表明这些基因只在诱导过程中起作用，iPS细胞保
持多潜能性状态的原因是内源性转录因子Nanog基因的表达(Okita K，Ichisaka T等人，
germline-competent induced pluripotent stem cells.Nature2007；448：313-317)。同
时独立发表的另一篇来自美国科学家的研究论文同样证实了上述4个转录因子足以使小
鼠成纤维细胞在体外诱导重构成为类似小鼠ES细胞的iPS细胞(Wernig M等人，In vitro
reprogramming of fibroblasts intoa pluripotent ES cell-like state.Nature 2007；
448：318-324)。
[0010] 新近报道了小鼠肝细胞和胃上皮细胞同样也可被重构成为iPS细胞，遗传学细胞谱系示踪分析显示，iPS细胞源自谱系定型的体细胞的直接重构，而未发现逆转录病毒整
合到特定的基因位点与细胞核重构相关(Aoi T等人，Generation of Pluripotent Stem
Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells.Science 2008)。
合到特定的基因位点与细胞核重构相关(Aoi T等人，Generation of Pluripotent Stem
Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells.Science 2008)。
[0011] 还有研究者利用相同的技术，将上述同样的4个转录因子导入到人类皮肤成纤维细胞中，也成功获得了iPS细胞。原代人类成纤维细胞样滑膜细胞和源自新生儿成纤维
细胞的细胞系同样也可被重构成为iPS细胞。这类iPS细胞在细胞形态、增殖能力、表面
抗原标志、基因表达谱、多潜能干细胞特异性基因的表 观遗传学状态、端粒酶活性等方面
与hES细胞相似，并且在体外培养时和在小鼠体内畸胎瘤形成中均可分化为3个胚层的
不同细胞类型(Takahashi K等人，Induction of pluripotent stem cells from adult
humanfibroblasts by defined factors.Cell2007；131：861-872)。与此同时，威斯康辛
大学Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有hES细胞基本特征的
人类iPS细胞，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了Oct4、
Sox2、Nanog、Lin28等4个基因进行转导(YuJ等人，Induced pluripotent stem cell lines
derived from human somatic cells.Science 2007；318：1917-1920)。
细胞的细胞系同样也可被重构成为iPS细胞。这类iPS细胞在细胞形态、增殖能力、表面
抗原标志、基因表达谱、多潜能干细胞特异性基因的表 观遗传学状态、端粒酶活性等方面
与hES细胞相似，并且在体外培养时和在小鼠体内畸胎瘤形成中均可分化为3个胚层的
不同细胞类型(Takahashi K等人，Induction of pluripotent stem cells from adult
humanfibroblasts by defined factors.Cell2007；131：861-872)。与此同时，威斯康辛
大学Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有hES细胞基本特征的
人类iPS细胞，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了Oct4、
Sox2、Nanog、Lin28等4个基因进行转导(YuJ等人，Induced pluripotent stem cell lines
derived from human somatic cells.Science 2007；318：1917-1920)。
[0012] Park IH 等 人，Reprogramming of human somatic cells to pluripotencywith defined factors.Nature2008；451：141-146利用来自胎儿、新生儿及成人的皮肤
或肺部的原代成纤维细胞，其中包括来自1名健康男性皮肤活检得到的成纤维细胞，采用
Yamanaka研究小组的策略也获得了相同的结果。他们还发现Oct4和Sox2在诱导重构为
iPS细胞过程中是必需的，正是这两个转录因子维持了人类iPS细胞的多潜能性，而Klf4和
c-Myc的作用是改变染色质的结构，从而有利于Oct4和Sox2的结合，以提高诱导的效率。此
外，这项研究的重要意义在于将取自皮肤活检的成纤维细胞诱导为iPS细胞。上述研究表
明，从活检人类皮肤组织中提取体细胞后进行诱导以制备患者特异性的干细胞是可行的，
因而有望克服细胞移植治疗中存在的免疫排斥反应。鉴于导入c-Myc基因可使嵌合体小鼠
的肿瘤发生率高达20％，可能会阻碍其未来的临床应用(Okita K，Ichisaka T，Yamanaka
S.Generation of germline-competent inducedpluripotent stem cells.Nature 2007；
448：313-317)。因此，Yamanaka研究小组新近报道，小鼠和人类皮肤成纤维细胞转染c-Myc
以外的其余3个基因，在调整培养条件后也可得到iPS细胞。去除c-Myc基因尽管可使未来
临床应用的安全性显著提高，但形成iPS细胞的效率却明显降低。虽然嵌合体小鼠在100d
内没有肿瘤发生，但逆转录病毒的再激活仍有导致肿瘤发生的潜在风险(NakagawaM，等人，
Generationof induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human
fibroblasts.Nat Biotechnol2008；26：101-106)。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似
的风险。
二.发明内容
或肺部的原代成纤维细胞，其中包括来自1名健康男性皮肤活检得到的成纤维细胞，采用
Yamanaka研究小组的策略也获得了相同的结果。他们还发现Oct4和Sox2在诱导重构为
iPS细胞过程中是必需的，正是这两个转录因子维持了人类iPS细胞的多潜能性，而Klf4和
c-Myc的作用是改变染色质的结构，从而有利于Oct4和Sox2的结合，以提高诱导的效率。此
外，这项研究的重要意义在于将取自皮肤活检的成纤维细胞诱导为iPS细胞。上述研究表
明，从活检人类皮肤组织中提取体细胞后进行诱导以制备患者特异性的干细胞是可行的，
因而有望克服细胞移植治疗中存在的免疫排斥反应。鉴于导入c-Myc基因可使嵌合体小鼠
的肿瘤发生率高达20％，可能会阻碍其未来的临床应用(Okita K，Ichisaka T，Yamanaka
S.Generation of germline-competent inducedpluripotent stem cells.Nature 2007；
448：313-317)。因此，Yamanaka研究小组新近报道，小鼠和人类皮肤成纤维细胞转染c-Myc
以外的其余3个基因，在调整培养条件后也可得到iPS细胞。去除c-Myc基因尽管可使未来
临床应用的安全性显著提高，但形成iPS细胞的效率却明显降低。虽然嵌合体小鼠在100d
内没有肿瘤发生，但逆转录病毒的再激活仍有导致肿瘤发生的潜在风险(NakagawaM，等人，
Generationof induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human
fibroblasts.Nat Biotechnol2008；26：101-106)。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似
的风险。
二.发明内容
[0013] 尽管已经证明了病毒转导一系列外源因子可以使得小鼠和人的成纤维细胞(例如MEF和MSF)以及神经干细胞的后生和转录状态重置成多能胚胎干细胞(ES细胞)的状
态(Takahashi K，Yamanaka S.Cell.2006；126：663-676；Wernig M，Meissner A，Foreman
R，等人，Nature.2007；448：318-324；Yu J，VodyanikMA，Smuga-Otto K等人Science.2007；
318：1917-1920)，但是神经干细胞的培养条件要求极高，而MEF则是必须从胎鼠中获得，
而且使用现有这些细胞诱导后产生的诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem
cell，iPS)产生嵌合小鼠的效率很低，产生的嵌合小鼠在一段时间后发生肿瘤的几率很
大 (OkitaK，Ichisaka T，Yamanaka S.Generation of germline-competent induced
pluripotent stem cells.Nature2007；448：313-317)。
态(Takahashi K，Yamanaka S.Cell.2006；126：663-676；Wernig M，Meissner A，Foreman
R，等人，Nature.2007；448：318-324；Yu J，VodyanikMA，Smuga-Otto K等人Science.2007；
318：1917-1920)，但是神经干细胞的培养条件要求极高，而MEF则是必须从胎鼠中获得，
而且使用现有这些细胞诱导后产生的诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem
cell，iPS)产生嵌合小鼠的效率很低，产生的嵌合小鼠在一段时间后发生肿瘤的几率很
大 (OkitaK，Ichisaka T，Yamanaka S.Generation of germline-competent induced
pluripotent stem cells.Nature2007；448：313-317)。
[0014] 在本发明中，令人惊讶的发现，尽管与已经发现的并且能够被诱导为多能干细胞的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和皮肤成纤维细胞(MSF)明显不同，小鼠脑膜细胞仍能被产
生iPS细胞系，并且这种细胞系在形成嵌合小鼠中是高度有效的。其效率远大于已经发现
的可以被诱导为iPS的神经干细胞、MEF等。而且形成的嵌合小鼠在经过很长时间后，仍然
存活良好，极大的降低了发生肿瘤的潜在风险。
生iPS细胞系，并且这种细胞系在形成嵌合小鼠中是高度有效的。其效率远大于已经发现
的可以被诱导为iPS的神经干细胞、MEF等。而且形成的嵌合小鼠在经过很长时间后，仍然
存活良好，极大的降低了发生肿瘤的潜在风险。
[0015] 在本发明的第一个方面中，本发明涉及将脑膜细胞诱导重编程为诱导的多能性干细胞的方法，所述方法包括：
[0016] (a)用包含多能性干细胞因子的cDNA导入脑膜细胞；
[0017] (b)在适宜上述被导入的脑膜细胞生长的培养条件下培养该细胞，以及任选地
[0018] (c)鉴定多能性干细胞克隆。
[0019] 其中，所述多能性因子为对于干细胞多能性维持关键的因子，优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)，以及Klf4(任
选地，Klf5或Klf2)。最优选地，所述多能性因子包括Oct4、Sox2、C-myc以及Klf4。上
述多能性因子可以是任何来源的，优选为小鼠的多能性因子以及其变体，如Sox2，NCBI登
录号为NM_011443.3(小鼠包含基因2的SRY-框)(SEQ ID NO：1)；Oct4，NCBI登录号为
NM_013633.2(小鼠POU结构域，5类，转录因子1(Pou5f1))(SEQ ID NO：2)；Klf4，NCBI登
录号为NM_010637.2(小鼠Kruppel-样因子4(肠(gut)))(SEQ ID NO：3)；c-Myc，NCBI登
录号为NM_O10849.4(小鼠髓细胞瘤病癌基因(myelocytomatosis oncogene)(c-Myc))(SEQ
ID NO：4)；Sox1，NCBI登录号为NM_009233.3，(小鼠包含基因1的SRY-框)(SEQ ID NO：
5)；Klf2，NCBI登录号为NM_008452.2，(小鼠Kruppel-样因子2(肺))(SEQ ID NO：6)；
Klf5，NCBI登录号为NM_009769.4，(小鼠Kruppel-样因子5)(SEQ ID NO：7)。C-Myc还可
以被换为其突变体L-myc(登录号为NM_008506.2，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒爱基因同源
物1v，肺癌来源的(禽类)((Mycl1)))(SEQ ID NO：8)；或者N-Myc(登录号为NM_008709.3，
小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因，神经母细胞瘤衍生的(禽类)(Mycn)(SEQ ID NO：
10)。
选地，Klf5或Klf2)。最优选地，所述多能性因子包括Oct4、Sox2、C-myc以及Klf4。上
述多能性因子可以是任何来源的，优选为小鼠的多能性因子以及其变体，如Sox2，NCBI登
录号为NM_011443.3(小鼠包含基因2的SRY-框)(SEQ ID NO：1)；Oct4，NCBI登录号为
NM_013633.2(小鼠POU结构域，5类，转录因子1(Pou5f1))(SEQ ID NO：2)；Klf4，NCBI登
录号为NM_010637.2(小鼠Kruppel-样因子4(肠(gut)))(SEQ ID NO：3)；c-Myc，NCBI登
录号为NM_O10849.4(小鼠髓细胞瘤病癌基因(myelocytomatosis oncogene)(c-Myc))(SEQ
ID NO：4)；Sox1，NCBI登录号为NM_009233.3，(小鼠包含基因1的SRY-框)(SEQ ID NO：
5)；Klf2，NCBI登录号为NM_008452.2，(小鼠Kruppel-样因子2(肺))(SEQ ID NO：6)；
Klf5，NCBI登录号为NM_009769.4，(小鼠Kruppel-样因子5)(SEQ ID NO：7)。C-Myc还可
以被换为其突变体L-myc(登录号为NM_008506.2，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒爱基因同源
物1v，肺癌来源的(禽类)((Mycl1)))(SEQ ID NO：8)；或者N-Myc(登录号为NM_008709.3，
小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因，神经母细胞瘤衍生的(禽类)(Mycn)(SEQ ID NO：
10)。
[0020] 在本发明的另一个方面中，本发明涉及脑膜细胞经诱导重编程产生的多能性干细胞的用途。特别是使用所述多能性干细胞来产生嵌合小鼠的用途。
[0021] 在本发明的另外的方面中，本发明涉及脑膜细胞用于诱导重编程而产生多能性干细胞的用途。特别是通过将多能性干细胞因子的cDNA导入脑膜细胞后脑膜细胞被诱导重
编程为多能性干细胞的用途。
编程为多能性干细胞的用途。
[0022] 在本发明的另一个方面中，本发明还涉及多能性干细胞因子cDNA通过被导入到脑膜细胞中来诱导脑膜细胞形成多能性干细胞的用途。
[0023] 根据本发明所述，与现有技术公开的其它可以被诱导为iPS的细胞不同，脑膜细胞不仅可以诱导形成iPS，而且所产生的iPS产生嵌合小鼠的比例远大于现在已知的其它
细胞；而且产生的这些嵌合小鼠存活状况良好，不会成瘤。这对于今后通过使用诱导的多能
性细胞，而非直接从人体及动物体提取的胚胎干细胞，来利用组织再生医学治疗某些现有
阶段难于治愈的疾病，尤其是与脑部相关的疾病，提供了更加有效且更加具有针对性的方
案。
细胞；而且产生的这些嵌合小鼠存活状况良好，不会成瘤。这对于今后通过使用诱导的多能
性细胞，而非直接从人体及动物体提取的胚胎干细胞，来利用组织再生医学治疗某些现有
阶段难于治愈的疾病，尤其是与脑部相关的疾病，提供了更加有效且更加具有针对性的方
案。
附图说明
[0024] 图1.小鼠脑膜细胞(MENINGEAL)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、皮肤成纤维细胞(MSF)、3株小鼠脑膜来源的iPS(iPS-C5、C8和C12)以及小鼠胚胎干细胞系CGR8进行的全
基因表达谱比较。
基因表达谱比较。
[0025] 图1.A iPS-C5、C8和C12分别与小鼠脑膜细胞的全基因表达谱比较。
[0026] 图1.B iPS-C5、C8和C12分别与多能性干细胞CGR8的全基因表达谱比较。
[0027] 图1.C小鼠脑膜细胞与MEF的全基因表达谱比较。
[0028] 图1.D小鼠脑膜细胞与MSF的全基因表达谱比较。
[0029] 图2.CGR8与iPS、脑膜细胞与MEF基因表达异同的示意图。
[0030] 图3.利用逆转录病毒载体从新生小鼠的脑膜产生iPS细胞的示意图。第12天的克隆与小鼠ES细胞在形态学上没有可见的区别。
[0031] 图4.从3株随机挑选的iPS克隆(iPS-C5、C6和C12)衍生的细胞所形成的ES样克隆，其碱性磷酸酶(AP)染色为阳性。其与多能性干细胞CGR8形成的克隆没有可见的区
别。
别。
[0032] 图5.半定量RT-PCR证实这3株iPS克隆表达关键的胚胎干细胞(ES)标志物；使用CGR8小鼠ES细胞作为阳性对照，使用未感染的脑膜细胞和MEF作为阴性对照。
[0033] 图6.使用SEQ NO ID：10作为探针，3株iPS细胞基因组中Southern印迹的结果，图中显示的条带数目表示基因组中整合的Klf4基因的拷贝数。使用ES细胞系作为对照。
[0034] 图7.共聚焦免疫荧光显微摄影显示在挑选的iPS细胞中Nanog、Rex1和SSEA1的均匀表达(homogeneous)。横线指示放大倍数。空白区域的方框内显示在低倍放大下的
DAPI染色。
DAPI染色。
[0035] 图8.使用酸式硫酸盐测序分析Oct4和Nanog启动子的甲基化状态。空白区域表示未甲基化，填充区域表示甲基化的CpG二核苷酸。
[0036] 图9.iPS-C5和iPS-C6胚状体(EB)分化第4天的相差照片
[0037] 图10.iPS-C5和iPS-C6胚状体(EB)分化第9天的半定量RT-PCR结果，使用分析3胚层的标志物。使用培养在添加LIF的ES培养基中的iPS细胞作为对照。
[0038] 图11.显示了使用本发明方法获得的iPS构建的嵌合鼠，其中非嵌合小鼠为纯白色，用星号标记；嵌合小鼠由于注射的iPS细胞来源于黑色的ICR小鼠，呈现黑色与白色相
间分布的体色。
间分布的体色。
[0039] 具体实施方案
[0040] 1.定义和技术
[0041] 除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch
和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR
BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书METHODS INENZYMOLOGY(Academic Press，
Inc.)：PCR2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编 著，
(1995))，Harlow和Lane编著，(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL and ANIMALCELL
CULTURE(R.I.Freshney 编 著，(1987))；W.French Anderson 等 人，HANDBOOK OF STEM
CELLS，卷2。
和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR
BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书METHODS INENZYMOLOGY(Academic Press，
Inc.)：PCR2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编 著，
(1995))，Harlow和Lane编著，(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL and ANIMALCELL
CULTURE(R.I.Freshney 编 著，(1987))；W.French Anderson 等 人，HANDBOOK OF STEM
CELLS，卷2。
[0042] 本文中使用的一些术语具有下列定义的含义。
[0043] 在说明书和权利要求书中使用的，单数型“一个”，和“这个”包括复数参考，除非上下文另有清楚的表述。例如，术语“(一个)细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。
[0044] 所有的数字标识，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其以0.1的增量变动(+)或(-)。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术
语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本
领域已知的。
语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本
领域已知的。
[0045] 本文所述的“诱导的多能性干细胞(iPS细胞)”是这样的细胞，其在ES细胞培养条件下，与ES细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚
层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表
达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。
层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表
达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ES细胞几乎完全相似。
[0046] 本文所述的脑膜细胞是来自哺乳动物的脑膜细胞，其来自神经脊(neuralcrest)，并且可以被分化成几种细胞系，包括成骨细胞和神经元细胞，既可以是体内的又可
以是体外的(Gagan JR，Tholpady SS，Ogle RC.Birth Defects Res C Embryo Today.2007；
81：297-304.)。脑膜细胞由两层组成，软脑脊膜(内部1)和硬膜(外部)，其包含脑并保
护其不受伤害。
以是体外的(Gagan JR，Tholpady SS，Ogle RC.Birth Defects Res C Embryo Today.2007；
81：297-304.)。脑膜细胞由两层组成，软脑脊膜(内部1)和硬膜(外部)，其包含脑并保
护其不受伤害。
[0047] 所述的脑膜细胞可以来源于任何动物(包括人)，优选是哺乳动物，更优选是小鼠。各种动物来源的脑膜细胞可以从动物中容易地分离，例如从新生小鼠中分离；或者从人
脑部手术后的脑部废弃物中分离得到；原代脑膜细胞还可以是商业可购得的，例如从美国
Sciencell公司方便地购得(人脑膜细胞，货号1405，上海麦莎公司代理)。特别地，使用在
中国典型培养物保藏中心(武汉市武昌珞珈山)于2008年8月21日提交保藏的小鼠原代
脑膜细胞(保藏编号为CCTCC NO：C200838；分类命名：小鼠脑膜细胞GIBH001)。
脑部手术后的脑部废弃物中分离得到；原代脑膜细胞还可以是商业可购得的，例如从美国
Sciencell公司方便地购得(人脑膜细胞，货号1405，上海麦莎公司代理)。特别地，使用在
中国典型培养物保藏中心(武汉市武昌珞珈山)于2008年8月21日提交保藏的小鼠原代
脑膜细胞(保藏编号为CCTCC NO：C200838；分类命名：小鼠脑膜细胞GIBH001)。
[0048] 本文所述的术语“诱导重编程”是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分
化成为多能性于细胞(Takahashi K，Yamanaka S.Cell.2006；126：663-676；Wernig M，
Meissner A，Foreman R，等人，Nature.2007；448：318-324；Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto
K等人Science.2007；318：1917-1920)。其中，优选地，所述的多能性因子包括Oct4、
Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)，以及Klf4(任选地，Klf5或Klf2)。最
优选地，所述多能性因子为Oct4、Sox2、C-myc以及Klf4。具体地，所述多能性因子为Sox2，
NCBI登录号为NM_011443.3(小鼠包含基因2的SRY-框)(SEQ ID NO：1)；Oct4，NCBI登录
号为NM_013633.2(小鼠POU结构域，5类，转录因子1(Pou5f1))(SEQ ID NO：2)；Klf4，NCBI
登录号为NM_010637.2(小鼠Kruppel-样因子4(肠(gut)))(SEQ ID NO：3)；c-Myc，NCBI
登录号为NM_010849.4(小鼠髓细胞瘤病癌基因(myelocytomatosis oncogene)(c-Myc))
(SEQ ID NO：4)；Sox1，NCBI登录号为NM_009233.3，(小鼠包含基因1的SRY-框)(SEQ ID
NO：5)；Klf2，NCBI登录号为NM_008452.2，(小鼠Kruppel-样因子2(肺))(SEQ ID NO：6)；
Klf5，NCBI登录号为NM_009769.4，(小鼠Kruppel-样因子5)(SEQ ID NO：7)。C-Myc还可
以被换为其突变体L-myc(登录号为NM_008506.2，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒爱基因同源
物1v，肺癌来源的(禽类)((Mycl1)))(SEQ ID NO：8)；或者N-Myc(登录号为NM_008709.3，
小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因，神经母细胞瘤衍生的(禽类)(Mycn)(SEQ ID NO：
10)。
化成为多能性于细胞(Takahashi K，Yamanaka S.Cell.2006；126：663-676；Wernig M，
Meissner A，Foreman R，等人，Nature.2007；448：318-324；Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto
K等人Science.2007；318：1917-1920)。其中，优选地，所述的多能性因子包括Oct4、
Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)，以及Klf4(任选地，Klf5或Klf2)。最
优选地，所述多能性因子为Oct4、Sox2、C-myc以及Klf4。具体地，所述多能性因子为Sox2，
NCBI登录号为NM_011443.3(小鼠包含基因2的SRY-框)(SEQ ID NO：1)；Oct4，NCBI登录
号为NM_013633.2(小鼠POU结构域，5类，转录因子1(Pou5f1))(SEQ ID NO：2)；Klf4，NCBI
登录号为NM_010637.2(小鼠Kruppel-样因子4(肠(gut)))(SEQ ID NO：3)；c-Myc，NCBI
登录号为NM_010849.4(小鼠髓细胞瘤病癌基因(myelocytomatosis oncogene)(c-Myc))
(SEQ ID NO：4)；Sox1，NCBI登录号为NM_009233.3，(小鼠包含基因1的SRY-框)(SEQ ID
NO：5)；Klf2，NCBI登录号为NM_008452.2，(小鼠Kruppel-样因子2(肺))(SEQ ID NO：6)；
Klf5，NCBI登录号为NM_009769.4，(小鼠Kruppel-样因子5)(SEQ ID NO：7)。C-Myc还可
以被换为其突变体L-myc(登录号为NM_008506.2，小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒爱基因同源
物1v，肺癌来源的(禽类)((Mycl1)))(SEQ ID NO：8)；或者N-Myc(登录号为NM_008709.3，
小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因，神经母细胞瘤衍生的(禽类)(Mycn)(SEQ ID NO：
10)。
[0049] 将所述多能性因子cDNA导入体细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、电穿孔、粒子轰击等各种将DNA转入细胞的方法。优选地，
使用包含cDNA的病毒载体进行转染，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体等多
种病毒载体。优选地逆转录病毒载体(例如pMX载体)，如实施例中所述的。
使用包含cDNA的病毒载体进行转染，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体等多
种病毒载体。优选地逆转录病毒载体(例如pMX载体)，如实施例中所述的。
[0050] 本文所述的“适宜被导入多能性干细胞因子cDNA的脑膜细胞的生长条件”是本领域的常规干细胞培养条件，并且包括一些适宜各个具体细胞系，但是不影响细胞基本性质
的修饰，培养方法以及培养条件参见W.French Anderson等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，
卷2。
的修饰，培养方法以及培养条件参见W.French Anderson等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，
卷2。
[0051] 本文所述的“嵌合小鼠”是通过本领域普通技术人员熟知的“嵌合鼠”技术实施的。是指将胚胎干细胞或通过本文技术获得的iPS注射入小鼠囊胚中，使得其与所注射
入小鼠的囊胚中的胚胎细胞混合，共同在代孕母鼠中的子宫内生长发育，小鼠出生后全身
上下的各个组织即由两种胚胎细胞共同混合组成，如马赛克拼图样，这样的小鼠被称为嵌
合鼠(Evans M J，等人；The ability of EK cell to form chimerasafter selection
of clones in G418and some observation on the intergration of retroviral
vectorproviral DNA into EK cells[M]；Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative
Biology；1985 年；Xian MW，Wu BY，Hu XL，Shang KG，Wu HL，1996.Construction of
chimeric mice of ES cells bymicroinjection method.Hereditas( 北 京 )18(1)：
7-10(中文))。使用iPS能否形成嵌合鼠是检验iPS是否与胚胎干细胞具有类似性质的最
直接和最关键的证据。
入小鼠的囊胚中的胚胎细胞混合，共同在代孕母鼠中的子宫内生长发育，小鼠出生后全身
上下的各个组织即由两种胚胎细胞共同混合组成，如马赛克拼图样，这样的小鼠被称为嵌
合鼠(Evans M J，等人；The ability of EK cell to form chimerasafter selection
of clones in G418and some observation on the intergration of retroviral
vectorproviral DNA into EK cells[M]；Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative
Biology；1985 年；Xian MW，Wu BY，Hu XL，Shang KG，Wu HL，1996.Construction of
chimeric mice of ES cells bymicroinjection method.Hereditas( 北 京 )18(1)：
7-10(中文))。使用iPS能否形成嵌合鼠是检验iPS是否与胚胎干细胞具有类似性质的最
直接和最关键的证据。
[0052] 实施例
[0053] 下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例。根据本文公开和本领域技术人员的
普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、
修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、
细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。
普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、
修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、
细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。
[0054] 实施例1.
[0055] 细胞的制备和培养
[0056] 分离新生C57BJ/L6小鼠的脑膜，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco )于37℃消化8-10分钟，然后用过火(fire-polished)移液器轻柔解离。将样品静置5分钟，沉淀组
5
织碎，将得到的细胞悬液以3.5×10 个细胞/ml的密度接种在100-mm培养皿中，所述培养
皿用聚-D-赖氨酸(100μg/ml)预包被处理。用高葡萄糖DMEM培养基(4.5g/L的葡萄糖，
HyClone公司)培养所得到的细胞，培养基中包含10％胎牛血清(HyClone公司)、2mM丙酮
酸钠(Gibco公司)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco公司)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/
ml)。
5
织碎，将得到的细胞悬液以3.5×10 个细胞/ml的密度接种在100-mm培养皿中，所述培养
皿用聚-D-赖氨酸(100μg/ml)预包被处理。用高葡萄糖DMEM培养基(4.5g/L的葡萄糖，
HyClone公司)培养所得到的细胞，培养基中包含10％胎牛血清(HyClone公司)、2mM丙酮
酸钠(Gibco公司)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco公司)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/
ml)。
[0057] 将胚胎干细胞(ES)和诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS细胞)培养在用丝裂霉素(10μg/ml)处理的MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)上，并且培养在
高葡萄糖DMEM(HyClone公司)中，所述高葡萄糖DMEM包含15％ FBS(Gibco)，白血病抑制
因子(LIF)、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和非必需氨基酸(Gibco公司)。
在纯化RNA或DNA之前，去除滋养层细胞，在0.2％明胶上传2代。
高葡萄糖DMEM(HyClone公司)中，所述高葡萄糖DMEM包含15％ FBS(Gibco)，白血病抑制
因子(LIF)、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和非必需氨基酸(Gibco公司)。
在纯化RNA或DNA之前，去除滋养层细胞，在0.2％明胶上传2代。
[0058] 对于胚体的形成，通过胰蛋白酶消化收获iPS细胞，铺在非粘附的细菌培养皿上，并且在没有LIF的培养基中培养。
[0059] 实施例2.
[0060] DNA微阵列
[0061] 使用RNAeasy min试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)根据制造商的说明从细胞分离总RNA。以3毫克总RNA为模板，使用T7-Oligo(dT)启动子(Affymetrix，Santa Clara，
CA)和Superscript II聚合酶(Ivitrogen公司)合成cDNA。使用体外转录系统(使用
RNA Transcript Labeling Kit(Affymetrix))合成附有生物素标记的cRNA(按Affymetrix
RNA Transcript Labeling Kit说明书)。
CA)和Superscript II聚合酶(Ivitrogen公司)合成cDNA。使用体外转录系统(使用
RNA Transcript Labeling Kit(Affymetrix))合成附有生物素标记的cRNA(按Affymetrix
RNA Transcript Labeling Kit说明书)。
[0062] 将片段化的生物素-cRNA与小鼠GeneChip430.2(Affymetrix)杂交。使用GeneArray Scanner 7G(Affymetrix)扫描芯片，根据制造商说明，使用默认参数用Robust
Multi-chip Average(RMA)方法处理数据(CEL文件形式)，从中减去背景(以默认的内参探
针为基准)，并使用软件ArrayAssist5.5.1(Stratagene Corp.and Strand Life Sciences
Pvt Ltd.)进行归一化。
Multi-chip Average(RMA)方法处理数据(CEL文件形式)，从中减去背景(以默认的内参探
针为基准)，并使用软件ArrayAssist5.5.1(Stratagene Corp.and Strand Life Sciences
Pvt Ltd.)进行归一化。
[0063] 图1.A-C是使用上述方法对脑膜细胞(MENINGEAL)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、皮肤成纤维细胞(MSF)、3株小鼠脑膜来源的iPS(iPS-C5、C8和C12)以及小鼠胚胎干细胞
系CGR8进行的全基因表达谱比较。
系CGR8进行的全基因表达谱比较。
[0064] 图1中每一个点均代表一种基因，X轴代表X轴所示细胞(如，图1.C的X轴对应MEF)中归一化的基因表达水平，Y轴代表Y轴所示细胞(如，图1.A的Y轴对应脑膜细胞)
中归一化的基因表达水平。所有点相对于过X/Y轴交点的对角线越集中，说明两种细胞的
基因表达谱相似度越高，也就提示两种细胞越相似。基于系统默认参数，图中红色的点代表
在两种细胞中均存在高表达的基因；蓝色的点代表只在其中一种细胞中具有可检测的表达
的基因。黄色的点代表在两种细胞中均无可检测的表达的基因。平行的线指示一种细胞中
的基因表达相对于另一种细胞中的基因表达2、3、5和10倍的改变(高或低)。
中归一化的基因表达水平。所有点相对于过X/Y轴交点的对角线越集中，说明两种细胞的
基因表达谱相似度越高，也就提示两种细胞越相似。基于系统默认参数，图中红色的点代表
在两种细胞中均存在高表达的基因；蓝色的点代表只在其中一种细胞中具有可检测的表达
的基因。黄色的点代表在两种细胞中均无可检测的表达的基因。平行的线指示一种细胞中
的基因表达相对于另一种细胞中的基因表达2、3、5和10倍的改变(高或低)。
[0065] 以图1.C为例，箭头所示的点分别对应Sox2、Oct4和Nanog基因，其中，脑膜细胞中Sox2的表达量比MEF中的高10倍以上，而Oct4和Nanog在两种细胞中均没有可检测的
表达。
表达。
[0066] 从图1.A和B可见，3株诱导性多潜能干细胞(iPS-C6、C8和C12)与多能性干细胞系CGR8之间具有极高的相似度，而与原脑膜细胞具有较大的差异；另一方面，从图1.C和
D可见，脑膜细胞与MEF、MSF的基因表达谱也显著不同。
D可见，脑膜细胞与MEF、MSF的基因表达谱也显著不同。
[0067] 图2的示意图具体显示了CGR8与iPS、脑膜细胞与MEF的基因表达异同。
[0068] 由此可见，虽然以前认为脑膜细胞中大部分为成纤维细胞，但是经我们的基因芯片研究可以看出，其基因表达谱与成纤维细胞存在很大差异，在此不解释为对机制的任何
限定，这种差异有可能是导致脑膜细胞来源的iPS与以前使用的MEF来源的iPS在后续细
胞性质中差异的原因之一。
限定，这种差异有可能是导致脑膜细胞来源的iPS与以前使用的MEF来源的iPS在后续细
胞性质中差异的原因之一。
[0069] 实施例3.
[0070] 病毒载体感染脑膜细胞
[0071] 根据实施例1所述的方法，在p6孔培养板中按每孔约4×104个细胞接种小鼠的脑膜细胞，在37℃、5％ CO2的常规培养条件下培养过夜，用收集的病毒上清液感染培养的脑
膜细胞。所述病毒上清液是通过用包含小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的反转录病
毒pMX载体(Addgene公司)按常规方法转染Plat-E细胞(Lipofectamine2000，Invitrogen
公司)获得的(参见Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002))。
与编码GFP的载体的对照孵育表明接近了100％的转染效率(数据未显示)。
膜细胞。所述病毒上清液是通过用包含小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的反转录病
毒pMX载体(Addgene公司)按常规方法转染Plat-E细胞(Lipofectamine2000，Invitrogen
公司)获得的(参见Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002))。
与编码GFP的载体的对照孵育表明接近了100％的转染效率(数据未显示)。
[0072] 实施例4.
[0073] 感染细胞的继续培养和克隆筛选
[0074] 在感染后第2天，将感染后的脑膜细胞的培养基，替换为实施例1中所述的ES细胞培养用培养基，在37℃、5％ CO2的常规培养条件下培养6天，每天更换一次培养基，用
0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco )于37℃消化为单细胞悬液，将消化后的细胞按每培养皿约
20000个细胞的密度接种到100mm培养皿中，所述培养皿按实施例1中描述的方法，预先用
滋养层细胞包被。接种后的细胞在37℃、5％ CO2的常规培养条件下培养6天，显微镜检可
见ES样克隆(如图3所示)。
0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco )于37℃消化为单细胞悬液，将消化后的细胞按每培养皿约
20000个细胞的密度接种到100mm培养皿中，所述培养皿按实施例1中描述的方法，预先用
滋养层细胞包被。接种后的细胞在37℃、5％ CO2的常规培养条件下培养6天，显微镜检可
见ES样克隆(如图3所示)。
[0075] 移去100mm培养皿中的大部分培养基，使用移液器用10μL枪头吸取生长紧密，边缘光滑的单个克隆，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco )于37℃消化为单细胞悬液，将消化
后的细胞接种到24孔板的单个孔中，每个孔接种一个ES样克隆，所述24孔板按实施例1
中描述的方法，预先用滋养层细胞包被。接种后的细胞在37℃、5％ CO2的常规培养条件下
培养。
后的细胞接种到24孔板的单个孔中，每个孔接种一个ES样克隆，所述24孔板按实施例1
中描述的方法，预先用滋养层细胞包被。接种后的细胞在37℃、5％ CO2的常规培养条件下
培养。
[0076] 通过上述方法，在第6天，将105个细胞转移到10cm用小鼠成纤维细胞滋养层细5
胞包被的培养皿中(图3)。10 个转导的脑膜的1000个集落与4因子一起孵育后12天，
这与以前介绍的使用成纤维细胞的情况类似(Takahashi K，Yamanaka S.Cell.2006；126：
663-676；Qin D，Li W，Zhang J，et al.Cell research.2007.)。这些具有典型的ES集落
的致密形态，并且在第16天，证明了80％为AP染色阳性(数据未显示)。来自不同培养皿
的12个集落被选出进行进一步表征。其中的10个能够在滋养层细胞上维持增殖。我们
的方法的总体效率为大约0.8％，与以前报道的用4个因子(不选择)的成纤维细胞诱导
(约0.5％-0.8％)类似(Qin D，Li W，Zhang J，等人Cell research.2007；Meissner A，
Wernig M，Jaenisch R.Nat Biotech.2007；25(10)：1177-81)，略低于使用神经干细胞在相
似的培养条件下进行的实验(3.6％，Kim JB，ZaehresH，Wu G，等人Nature.2008)。在这10
个脑膜-iPS集落中，选择了3个，用AP染色这些集落也是阳性的 (图4)。
胞包被的培养皿中(图3)。10 个转导的脑膜的1000个集落与4因子一起孵育后12天，
这与以前介绍的使用成纤维细胞的情况类似(Takahashi K，Yamanaka S.Cell.2006；126：
663-676；Qin D，Li W，Zhang J，et al.Cell research.2007.)。这些具有典型的ES集落
的致密形态，并且在第16天，证明了80％为AP染色阳性(数据未显示)。来自不同培养皿
的12个集落被选出进行进一步表征。其中的10个能够在滋养层细胞上维持增殖。我们
的方法的总体效率为大约0.8％，与以前报道的用4个因子(不选择)的成纤维细胞诱导
(约0.5％-0.8％)类似(Qin D，Li W，Zhang J，等人Cell research.2007；Meissner A，
Wernig M，Jaenisch R.Nat Biotech.2007；25(10)：1177-81)，略低于使用神经干细胞在相
似的培养条件下进行的实验(3.6％，Kim JB，ZaehresH，Wu G，等人Nature.2008)。在这10
个脑膜-iPS集落中，选择了3个，用AP染色这些集落也是阳性的 (图4)。
[0077] 实施例5
[0078] 半定量RT-PCR鉴定iPS中干细胞标志物的表达
[0079] 使用Trizol(Takara公司)试剂，按照制造商说明提取总RNA。用M-MLV(Takara公司)试剂盒进行逆转录，并使用rTaq试剂盒(Takara公司)对于实施例2中选出的3个集
落进行PCR。用Takara公司的基因组DNA提取试剂盒，根据制造商的说明提取基因组DNA，
并且用rTaq酶进行RT-PCR。所有上述PCR条件均使用常规PCR条件(参见分子克隆实验
指南，第3版)，按照制造商说明进行。
落进行PCR。用Takara公司的基因组DNA提取试剂盒，根据制造商的说明提取基因组DNA，
并且用rTaq酶进行RT-PCR。所有上述PCR条件均使用常规PCR条件(参见分子克隆实验
指南，第3版)，按照制造商说明进行。
[0080] 其中各标志物基因使用引物列表如表1所示。
[0081] 表1，RT-PCR所用引物
[0082]SEQ ID NO： 引物名称(前：因子名称)F：正向；R反向 引物序列
SEQ ID NO：11 pMX-F GACGGCATCGCAGCTTGGATACAC
SEQ ID NO：12 pMX-R TTATCGTCGACCACTGTGCTG
SEQ ID NO：13 c-Myc-S1093 CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
SEQ ID NO：14 Sox2-S768 GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG
SEQ ID NO：15 Klf4-S1236 GCGAACTCACACAGGCGAGAAACC
SEQ ID NO：16 Oct3/4-AS210 TGCGGGCGGACATGGGGAATCC
SEQ ID NO：11 pMX-F GACGGCATCGCAGCTTGGATACAC
SEQ ID NO：12 pMX-R TTATCGTCGACCACTGTGCTG
SEQ ID NO：13 c-Myc-S1093 CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
SEQ ID NO：14 Sox2-S768 GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG
SEQ ID NO：15 Klf4-S1236 GCGAACTCACACAGGCGAGAAACC
SEQ ID NO：16 Oct3/4-AS210 TGCGGGCGGACATGGGGAATCC
[0083] 如图5所示，使用本申请的方法获得的iPS表达与多能性干细胞CGR8均表达相同的多能性因子，而这些因子在原始脑膜细胞中均没有可检测到的表达。
[0084] 实施例6
[0085] Southern印迹
[0086] 使用上述方法从小鼠iPS细胞系和R1ES细胞中提取基因组DNA，取10μg基因组DNA用限制性酶消化过夜，根据制造商说明，酶切体系按常规方法配制，所述酶为EcoRI，
BglII和NocI。
BglII和NocI。
[0087] 取10uL消化制备的基因组DNA片段样品，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在碱变性后，将电泳分离的基因组DNA过夜转移到带阳性电荷的尼龙膜(Amersham公司)上，用紫外
线辐射交联(条件)。然后，将上述尼龙膜在42℃，在DIG Easy Hyb缓冲液(Roche公司)
中，与地高辛配基(DIG)-标记的DNA探针孵育过夜。洗涤(室温PBS洗涤15次)后，将碱性
磷酸酶-缀合的抗-DIG抗体(1：10,000，Roche公司)添加到膜上。在与CDP-star(Roche
公司)一起孵育后，将膜暴露于X-射线膜。
线辐射交联(条件)。然后，将上述尼龙膜在42℃，在DIG Easy Hyb缓冲液(Roche公司)
中，与地高辛配基(DIG)-标记的DNA探针孵育过夜。洗涤(室温PBS洗涤15次)后，将碱性
磷酸酶-缀合的抗-DIG抗体(1：10,000，Roche公司)添加到膜上。在与CDP-star(Roche
公司)一起孵育后，将膜暴露于X-射线膜。
[0088] 图6显示了使用SEQ NO ID：10作为探针，在3株iPS细胞的基因组中的Southern印迹的结果，图中显示的条带数目表示基因组中整合的Klf4基因的拷贝数。这证明了转基
因有多个拷贝整合。
因有多个拷贝整合。
[0089] 实施例7
[0090] 鉴定iPS基因组中病毒基因的插入
[0091] A.免疫荧光
[0092] 室温下，将细胞在4％的多聚甲醛中固定30分钟后，用PBS洗涤，并且在室温下用含有5％FBS和0.1％的Triton-X100的PBS封闭20分钟。再用含有兔抗鼠Rex1、Nanog
和鼠SSEA1单抗一抗(1：50，Chemicon公司)的PBS(含有1％FBS)孵育1小时后，用PBS
洗涤细胞。再与具有荧光素标记的合适二抗(Santa公司)孵育后，用PBS洗涤3次并且用
80％的甘油封片。使用共聚焦显微镜(LEICA TCS AP2 AOBS)用于视觉观察。
和鼠SSEA1单抗一抗(1：50，Chemicon公司)的PBS(含有1％FBS)孵育1小时后，用PBS
洗涤细胞。再与具有荧光素标记的合适二抗(Santa公司)孵育后，用PBS洗涤3次并且用
80％的甘油封片。使用共聚焦显微镜(LEICA TCS AP2 AOBS)用于视觉观察。
[0093] 图7中显示了三株iPS细胞所产生的ES样克隆的免疫荧光的结果，可见，多能性因子Nanog、SSEA1和Rex-1在三株iPS细胞中均有均匀的高表达。
[0094] B.亚硫酸氢盐基因组测序
[0095] 根据制造商的说明，使用CpGenome修饰试剂盒(Chemicon公司)进行亚硫酸氢盐处理。处理过程中使用的Oct4和Nanog启动子的PCR引物见下表2。将上述PCR产物克隆
到pMD18-T(Takara公司)载体中，随机选择克隆用于对每个基因测序，所述测序用M13正
向和M13反向引物。启动子被封闭，基因不表达，证明了iPS中标志物的存在。
到pMD18-T(Takara公司)载体中，随机选择克隆用于对每个基因测序，所述测序用M13正
向和M13反向引物。启动子被封闭，基因不表达，证明了iPS中标志物的存在。
[0096] 表2：PCR所用引物
[0097]SEQIDNO： 引物名称(前：因子名称)F：正向；R反向 引物序列
SEQ IDNO：17 mOct4U GGTTTTTAGAGGATGGGTTGAGTG
SEQ IDNO：18 mOct4L CGGATCCCTAAAACCAAATATCCAACCATA
SEQ IDNO：19 mNanogU AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT
SEQ IDNO：20 mNanogL CCCACACTCATATCAATATAATAAC
SEQ IDNO：17 mOct4U GGTTTTTAGAGGATGGGTTGAGTG
SEQ IDNO：18 mOct4L CGGATCCCTAAAACCAAATATCCAACCATA
SEQ IDNO：19 mNanogU AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT
SEQ IDNO：20 mNanogL CCCACACTCATATCAATATAATAAC
[0098] 图8中显示iPS克隆中内源性Oct4和Nanog启动子区域没有或只有极低程度的甲基化，而MEF和未 接受注射的脑膜细胞中，上述基因组区域均呈现高度甲基化。也就是
说，经过诱导重编程的iPS细胞中，内源性多能性干细胞因子的表达被激活了。
说，经过诱导重编程的iPS细胞中，内源性多能性干细胞因子的表达被激活了。
[0099] 实施例8
[0100] iPS多能性的鉴定
[0101] A.EB分化和各胚层标志物的鉴定
[0102] 为了证明脑膜iPS的多能型，将脑膜-iPS克隆培养在没有LIF的不粘着培养皿上以形成胚状体(图9)
[0103] 将使用实施例3-4的方法制备，并经过实施例5-7的方法鉴定筛选出来的3株iPS细胞按常规方法用0.25％胰酶消化，转入无菌的细菌培养皿中，在不加LIF的常规ES培养
基中悬浮培养。培养第4天，可见3株iPS细胞均形成了紧密、光滑的胚状体(EB)(参见图
9)。
基中悬浮培养。培养第4天，可见3株iPS细胞均形成了紧密、光滑的胚状体(EB)(参见图
9)。
[0104] 根据实施例5例举的方法，提取上述iPS-C5和iPS-C6及其形成的EB(第9天)的总RNA，并逆转录为cDNA进行多能性干细胞因子和各胚层分化标志物的RT-PCR鉴定，使
用表3中列出的RT-PCR引物。
用表3中列出的RT-PCR引物。
[0105] 表3：RT-PCR鉴定标志物所用的引物
[0106]SEQ ID NO： 引物名称(前：因子名称)F：正向；R反向 引物序列
SEQ ID NO：21 Gata-6-F GCAATGCATGCGGTCTAC
SEQ ID NO：22 Gata-6-R CTCTTGGTAGCACCAGCTCA
SEQ ID NO：23 Fgf-5-F AAAGTCAATGGCTCCCACGAA
SEQ ID NO：24 Fgf-5-R CTTCAGTCTGTACTTCACTGG
SEQ ID NO：25 T-F ATGCCAAAGAAAGAAACGAC
SEQ ID NO：26 T-R AGAGGCTGTAGAACATGATT
SEQ ID NO：27 Is11-F AGCAAGAACGACTTCGTGATG
SEQ ID NO：28 Is11-R GACTGAGAGGGTCTCCAGCTC
SEQ ID NO：29 Bmp-2-F GTTTGTGTTTGGCTTGACGC
SEQ ID NO：30 Bmp-2-R AGACGTCCTCAGCGAATTTG
SEQ ID NO：31 GAPDH-F CATCACCATCTTCCAGGAGC
SEQ ID NO：32 GAPDH-R ATGCCAGTGAGCTTCCCGTC
SEQ ID NO：21 Gata-6-F GCAATGCATGCGGTCTAC
SEQ ID NO：22 Gata-6-R CTCTTGGTAGCACCAGCTCA
SEQ ID NO：23 Fgf-5-F AAAGTCAATGGCTCCCACGAA
SEQ ID NO：24 Fgf-5-R CTTCAGTCTGTACTTCACTGG
SEQ ID NO：25 T-F ATGCCAAAGAAAGAAACGAC
SEQ ID NO：26 T-R AGAGGCTGTAGAACATGATT
SEQ ID NO：27 Is11-F AGCAAGAACGACTTCGTGATG
SEQ ID NO：28 Is11-R GACTGAGAGGGTCTCCAGCTC
SEQ ID NO：29 Bmp-2-F GTTTGTGTTTGGCTTGACGC
SEQ ID NO：30 Bmp-2-R AGACGTCCTCAGCGAATTTG
SEQ ID NO：31 GAPDH-F CATCACCATCTTCCAGGAGC
SEQ ID NO：32 GAPDH-R ATGCCAGTGAGCTTCCCGTC
[0107] 图10中显示RT-PCR的结果，可见使用本发明方法获得的iPS细胞具有分化为各胚层细胞的潜力。
[0108] B.构建嵌合鼠
[0109] 注射用囊胚取自四周龄超排ICR母小鼠(黑色)，与同品系公鼠合笼，见栓3.5d(当日见栓为0.5d)时从子宫和输卵管中收集胚胎，移入上覆石蜡油的M16培养液滴
内，于37℃ 5％ CO2孵箱内培养。
内，于37℃ 5％ CO2孵箱内培养。
[0110] 注射前3h将嵌合用iPS细胞更换新鲜培养液，胰酶消化后制成单细胞悬液备用。将适量iPS细胞悬 液和囊胚期胚胎移入M2注射液滴内，在显微注射系统下，用持卵针固
定囊胚，用注射针吸取iPS细胞，从远离内细胞团的滋养层部位进针，每个囊胚注射细胞
10-12个。注射后囊胚腔消失，置于培养液中于孵箱中培养1-3h，待囊胚腔恢复后，移入见
栓2.5d的假孕母鼠子宫中进行培育。
定囊胚，用注射针吸取iPS细胞，从远离内细胞团的滋养层部位进针，每个囊胚注射细胞
10-12个。注射后囊胚腔消失，置于培养液中于孵箱中培养1-3h，待囊胚腔恢复后，移入见
栓2.5d的假孕母鼠子宫中进行培育。
[0111] 图11显示了使用本发明方法获得的iPS构建的嵌合鼠，其中非嵌合小鼠为纯白色，嵌合小鼠由于注射的iPS细胞来源于黑色的ICR小鼠，故呈现黑色与白色相间分布的体色。
[0112] 代孕母鼠产生的小鼠及其中嵌合鼠数统计如下表
[0113] 表3.
[0114]IPS细胞系 注射的囊胚数 出生小鼠数 嵌合鼠数
C57 iPS-C5 52 16 2C57 iPS-C6 55 28
9C57 iPS-C12 78 18 6
ICR iPS-C7 36 7 0ICR iPS-C8 40 9
0ICR iPS-C10 40 10 0
C57 iPS-C5 52 16 2C57 iPS-C6 55 28
9C57 iPS-C12 78 18 6
ICR iPS-C7 36 7 0ICR iPS-C8 40 9
0ICR iPS-C10 40 10 0
[0115] 其中，C57 iPS-C系列表示使用本发明的方法获得的三株iPS细胞系，ICR iPS-C系列表示使用传统方法从MEF获得的三株iPS细胞系，从嵌合鼠数/出生的小鼠数可以看
出，使用本发明的脑膜-iPS产生嵌合鼠的比例远高于用现有技术所列的各种细胞产生的
iPS。表明使用本发明的方法构建的iPS细胞系在产生嵌合鼠，也就是说在更彻底的诱导重
编程方面具有突出的、预料不到的效果。
出，使用本发明的脑膜-iPS产生嵌合鼠的比例远高于用现有技术所列的各种细胞产生的
iPS。表明使用本发明的方法构建的iPS细胞系在产生嵌合鼠，也就是说在更彻底的诱导重
编程方面具有突出的、预料不到的效果。
[0116] 截止至本申请递交日，本发明所产生的嵌合小鼠无一只成瘤，已经成功存活了100多天，也表明使用脑膜-iPS得到的嵌合鼠的成瘤性远低于现有技术所产生的各种iPS。
[0117] 序列表
[0118] <110>中国科学院广州生物医药与健康研究院
[0119] <120>用脑膜细胞生成诱导的多能性干细胞的方法及其用途
[0120] <160>32
[0121] <170>PatentIn版本3.3
[0122] <210>1
[0123] <211>2457
[0124] <212>DNA
[0125] <213>小鼠(Mus musculus)
[0126] <220>
[0127] <221>小鼠包含基因2的SRY-框(Sox2)
[0128] <222>(1)..(2457)
[0129] <400>1
[0130]
[0131]
[0132]
[0133] <210>2
[0134] <211>1346
[0135] <212>DNA
[0136] <213>小鼠
[0137] <220>
[0138] <221>小鼠POU结构域，5类，转录因子1(Pou5f1)(Oct4)
[0139] <222>(1)..(1346)
[0140] <400>2
[0141]
[0142]
[0143] <210>3
[0144] <211>2905
[0145] <212>DNA
[0146] <213>小鼠
[0147] <220>
[0148] <221>小鼠Kruppel-样因子4(肠(gut))(Klf4)
[0149] <222>(1)..(2905)
[0150] <400>3
[0151]
[0152]
[0153]
[0154] <210>4
[0155] <211>2399
[0156] <212>DNA
[0157] <213>小鼠
[0158] <220>
[0159] <221>小鼠髓细胞瘤病癌基因(myelocytomatosis oncogene)(c-Myc)
[0160] <222>(1)..(2399)
[0161] <400>4
[0162]
[0163]
[0164]
[0165] <210>5
[0166] <211>4037
[0167] <212>DNA
[0168] <213>小鼠
[0169] <220>
[0170] <221>小鼠包含基因1的SRY-框(Sox1)
[0171] <222>(1)..(4037)
[0172] <400>5
[0173]
[0174]
[0175]
[0176]
[0177] <210>6
[0178] <211>1816
[0179] <212>DNA
[0180] <213>小鼠
[0181] <220>
[0182] <221>小鼠Kruppel-样因子2(肺)(Klf2)
[0183] <222>(1)..(1816)
[0184] <400>6
[0185]
[0186]
[0187] <210>7
[0188] <211>1728
[0189] <212>DNA
[0190] <213>小鼠
[0191] <220>
[0192] <221>小鼠Kruppel-样因子5(Klf5)
[0193] <222>(1)..(1728)
[0194] <400>7
[0195]
[0196]
[0197] <210>8
[0198] <211>3518
[0199] <212>DNA
[0200] <213>禽类
[0201] <220>
[0202] <221>小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒爱基因同源物1v，
[0203] 肺癌来源的(禽类)(L-Myc)
[0204] <222>(1)..(3518)
[0205] <400>8
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210] <210>9
[0211] <211>2596
[0212] <212>DNA
[0213] <213>禽类
[0214] <220>
[0215] <221>小鼠v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因，神经母细胞瘤衍生的(禽类)(N-Myc)
[0216] <222>(1)..(2596)
[0217] <400>9
[0218]
[0219]
[0220]
[0221] <210>10
[0222] <211>1425
[0223] <212>DNA
[0224] <213>人造
[0225] <220>
[0226] <223>探针序列
[0227] <220>
[0228] <221>Klf4探针序列
[0229] <222>(1)..(1425)
[0230] <400>10
[0231]
[0232]
[0233] <210>11
[0234] <211>24
[0235] <212>DNA
[0236] <213>人造
[0237] <220>
[0238] <223>引物
[0239] <400>11
[0240]
[0241] <210>12
[0242] <211>21
[0243] <212>DNA
[0244] <213>人造
[0245] <220>
[0246] <223>引物
[0247] <400>12
[0248]
[0249] <210>13
[0250] <211>24
[0251] <212>DNA
[0252] <213>人造
[0253] <220>
[0254] <223>引物
[0255] <400>13
[0256]
[0257] <210>14
[0258] <211>24
[0259] <212>DNA
[0260] <213>人造
[0261] <220>
[0262] <223>引物
[0263] <400>14
[0264]
[0265] <210>15
[0266] <211>24
[0267] <212>DNA
[0268] <213>人造
[0269] <220>
[0270] <223>引物
[0271] <400>15
[0272]
[0273] <210>16
[0274] <211>22
[0275] <212>DNA
[0276] <213>人造
[0277] <220>
[0278] <223>引物
[0279] <400>16
[0280]
[0281] <210>17
[0282] <211>24
[0283] <212>DNA
[0284] <213>人造
[0285] <220>
[0286] <223>引物
[0287] <400>17
[0288]
[0289] <210>18
[0290] <211>30
[0291] <212>DNA
[0292] <213>人造
[0293] <220>
[0294] <223>引物
[0295] <400>18
[0296]
[0297] <210>19
[0298] <211>25
[0299] <212>DNA
[0300] <213>人造
[0301] <220>
[0302] <223>引物
[0303] <400>19
[0304]
[0305] <210>20
[0306] <211>25
[0307] <212>DNA
[0308] <213>人造
[0309] <220>
[0310] <223>引物
[0311] <400>20
[0312]
[0313] <210>21
[0314] <211>18
[0315] <212>DNA
[0316] <213>人造
[0317] <220>
[0318] <223>引物
[0319] <400>21
[0320]
[0321] <210>22
[0322] <211>20
[0323] <212>DNA
[0324] <213>人造
[0325] <220>
[0326] <223>引物
[0327] <400>22
[0328]
[0329] <210>23
[0330] <211>21
[0331] <212>DNA
[0332] <213>人造
[0333] <220>
[0334] <223>引物
[0335] <400>23
[0336]
[0337] <210>24
[0338] <211>21
[0339] <212>DNA
[0340] <213>人造
[0341] <220>
[0342] <223>引物
[0343] <400>24
[0344]
[0345] <210>25
[0346] <211>20
[0347] <212>DNA
[0348] <213>人造
[0349] <220>
[0350] <223>引物
[0351] <400>25
[0352]
[0353] <210>26
[0354] <211>20
[0355] <212>DNA
[0356] <213>人造
[0357] <220>
[0358] <223>引物
[0359] <400>26
[0360]
[0361] <210>27
[0362] <211>21
[0363] <212>DNA
[0364] <213>人造
[0365] <220>
[0366] <223>引物
[0367] <400>27
[0368]
[0369] <210>28
[0370] <211>21
[0371] <212>DNA
[0372] <213>人造
[0373] <220>
[0374] <223>引物
[0375] <400>28
[0376]
[0377] <210>29
[0378] <211>20
[0379] <212>DNA
[0380] <213>人造
[0381] <220>
[0382] <223>引物
[0383] <400>29
[0384]
[0385] <210>30
[0386] <211>20
[0387] <212>DNA
[0388] <213>人造
[0389] <220>
[0390] <223>引物
[0391] <400>30
[0392]
[0393] <210>31
[0394] <211>20
[0395] <212>DNA
[0396] <213>人造
[0397] <220>
[0398] <223>引物
[0399] <400>31
[0400]
[0401] <210>32
[0402] <211>20
[0403] <212>DNA
[0404] <213>人造
[0405] <220>
[0406] <223>引物
[0407] <400>32
[0408]