合成具有增加的溶胀性的淀粉的遗传修饰性植物

摘要

本发明涉及遗传修饰性植物细胞和植物，用于产生遗传修饰性植物细胞和植物的方法，其中在所述遗传修饰性植物细胞和植物中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加且具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加。所述植物合成具有增加的热水溶胀性的淀粉。本发明还涉及具有增加的热水溶胀性的淀粉及其生产方法。

权利要求

1.产生遗传修饰性的稻、玉米或小麦植物细胞的方法，其中，对稻、玉米或小麦植物细胞进行遗传修饰以获得遗传修饰性植物细胞，其中与未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比，在该遗传修饰性植物细胞中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加且具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加，其中遗传修饰为将至少一个外源核酸分子导入植物的基因组。

2.权利要求1的方法，其中，与从相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞分离的淀粉相比，所述遗传修饰性植物细胞合成改性淀粉。

3.权利要求2的方法，其中所述遗传修饰性植物细胞合成具有增加的热水溶胀性的淀粉。

4.用于产生遗传修饰性稻、玉米或小麦植物的方法，其中

a)对植物细胞进行遗传修饰，该遗传修饰包括以任何期望顺序、单个地或同时地进行的以下步骤i和iii)将遗传修饰导入植物细胞，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比，该遗传修饰导致具有淀粉合酶II的酶活性的蛋白质的活性增加，其中遗传修饰为将至少一个外源核酸分子导入植物细胞的基因组，ii)将遗传修饰导入植物细胞，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比，该遗传修饰导致具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质的活性增加，其中遗传修饰为将至少一个外源核酸分子导入植物细胞的基因组，b)从步骤a)的植物细胞再生植物；

c)任选地利用步骤b)的植物产生其他植物，

其中任选地从步骤b)或c)的植物分离植物细胞，和重复方法步骤a)至c)，直至产生其中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加且具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的植物。

5.权利要求4的方法，其中，i)中所述外源核酸分子编码来自小麦的具有淀粉合酶II活性的蛋白质，且ii)中所述外源核酸分子编码来自马铃薯的具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质。

6.权利要求5的方法，其中，来自马铃薯的具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

7.权利要求5的方法，其中，来自小麦的具有淀粉合酶II活性的蛋白质为SEQ ID NO：

6所示的氨基酸序列。

8.用于产生改性淀粉的方法，所述方法包括步骤：从权利要求1至3之任一项的遗传修饰性植物细胞或可通过权利要求4-7之任一项的方法获得的植物，提取淀粉。

9.可通过权利要求4-7之任一项的方法获得的植物用于生产淀粉的用途。

10.可通过权利要求8的方法获得的改性淀粉，其具有至少110g／g的热水溶胀性，且该改性淀粉的淀粉磷酸含量，相比于分离自未遗传修饰的相应野生型植物细胞或分离自未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉，增加至少10倍。

11.一种分离自稻、玉米或小麦植物或植物细胞的改性淀粉，其具有至少110g/g的热水溶胀性，且该改性淀粉的淀粉磷酸含量，相比于分离自权利要求1中所定义的未遗传修饰的相应野生型植物细胞或未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉，增加至少10倍。

12.用于生产衍生淀粉的方法，其中将如权利要求10或11的改性淀粉随后衍生化。

13.可通过权利要求12的方法获得的衍生淀粉。

14.权利要求10或11的改性淀粉用于生产衍生淀粉的用途。

15.一种面粉，其包含可通过权利要求8的方法获得的改性淀粉或包含权利要求10或

11的改性淀粉。

16.用于生产面粉的方法，所述方法包括步骤：研磨可通过权利要求4-7之任一项的方法获得的植物。

17.权利要求1至3之任一项的遗传修饰性植物细胞或可通过权利要求4-7之任一项的方法获得的植物用于生产面粉的用途。

18.用于产生遗传修饰性的稻、玉米或小麦植物细胞的方法，其中对稻、玉米或小麦植物细胞进行遗传修饰以得到该遗传修饰性植物细胞，其中，该遗传修饰包括以任何期望顺序、单个地或同时地进行的以下步骤i和iii)将遗传修饰导入植物细胞，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比，该遗传修饰导致具有淀粉合酶II的酶活性的蛋白质的活性增加，其中遗传修饰为将至少一个外源核酸分子导入植物细胞的基因组，ii)将遗传修饰导入植物细胞，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比，该遗传修饰导致具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质的活性增加，其中遗传修饰为将至少一个外源核酸分子导入植物细胞的基因组。

19.权利要求18的方法，其中，i)中所述外源核酸分子编码来自小麦的具有淀粉合酶II活性的蛋白质，且ii)中所述外源核酸分子编码来自马铃薯的具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质。

20.权利要求19的方法，其中，来自马铃薯的具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

21.权利要求19的方法，其中，来自小麦的具有淀粉合酶II活性的蛋白质为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

说明书

合成具有增加的溶胀性的淀粉的遗传修饰性植物

技术领域

[0001] 本发明涉及遗传修饰性植物细胞和植物，涉及用于生产遗传修饰性植物细胞和植物的方法，在所述细胞和植物中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加并且具有葡聚糖-水二激酶(glucan-water dikinase)活性的蛋白质的活性增加。该类植物合成具有增加的热水溶胀性的淀粉。本发明也涉及具有增加的热水溶胀性的淀粉及其制备方法。

背景技术

[0002] 除了油、脂肪和蛋白质以外，多糖是植物中主要的可再生原料。除了纤维素以外，淀粉作为高等植物中的一种最重要的贮藏物质，在多糖中占据中心位置。

[0003] 此外，淀粉在营养生理学方面中是人和动物营养的必需成分。食物中所包含的淀粉的结构特征可以影响所有种类食物的赋予功能(例如持水性、溶胀性(swelling power))、营养生理学(例如消化性、食物对血糖指数的影响)或结构(例如抗剪切性、质地、粘性、加工性)的性质。因此食物组合物常包含具有某些结构特征的淀粉，这些结构特征决定所述食物的期望性质。包含贮藏淀粉的植物组织的食物(例如谷粒、果实、面粉)的性质也会受到该植物组织中所含淀粉的影响。

[0004] 多糖淀粉是化学上均一的基本结构单位葡萄糖分子的聚合物。然而，此处涉及的是不同分子形式的非常复杂的混合物，这些分子形式在它们的聚合程度、葡萄糖链分支的发生和它们的链长度方面相异，此外它们还可以被修饰，例如磷酸化。因此淀粉不是均一的原材料。特别是，直链淀粉(α-1，4-糖苷键连接的葡萄糖分子的基本上不分支的聚合物)与支链淀粉(不同分支的葡萄糖链的复杂混合物)是不同的。在此，分支的出现是额外的α-1，6-糖苷键出现的结果。在用于工业淀粉生产或用作食物的典型植物，例如玉米、稻、小麦或马铃薯中，合成的淀粉由大约20％-25％的直链淀粉和大约70％-75％的支链淀粉组成。

[0005] 淀粉的结构特征影响例如淀粉的赋予功能、营养生理学或结构的性质，例如淀粉的溶解性、老化行为、持水性、成膜性质、粘性、糊化性质、冻融稳定性、酸稳定性、凝胶强度、溶胀性、消化性和淀粉颗粒大小，所述结构特征是例如直链淀粉/支链淀粉的比率、葡萄糖聚合物的分子量、侧链分布的模式、离子的含量、脂质和蛋白质的含量和/或淀粉颗粒形态等。

[0006] 通过基于育种的方法，可在植物细胞中改变选择的淀粉结构特征，从而改变淀粉的赋予功能、营养生理学或结构的性质。然而，今天这只有对选择的淀粉结构特征(例如直链淀粉/支链淀粉含量，US 5,300,145)才是可能的。例如，目前不可能只通过育种措施影响植物淀粉中磷酸的含量。

[0007] 作为育种方法的一个替代方法是通过基因工程方法对产生淀粉的植物进行选择性修饰。然而其前提是参与淀粉合成和/或淀粉修饰的酶的鉴定和表征以及随后在转基因植物中对它们功能的分析。

[0008] 催化不同反应的多种酶参与植物细胞中的淀粉合成。淀粉合酶(EC2.4.1.21，ADP-葡萄糖，1，4-α-D-葡聚糖4-α-D-葡糖基转移酶)通过将ADP-葡萄糖的葡糖基转移至α-1，4-葡聚糖来催化聚合反应，转移的葡糖基通过α-1，4键的产生而与α-1，4-葡聚糖连接。在迄今研究的几乎所有植物中，在每种情况下都可以证实有多种淀粉合酶同种型(isoform)。淀粉合酶可以分成不同的两组：颗粒结合型淀粉合酶(GBSS)和可溶性淀粉合酶(在本发明中也缩写为“SS”)。颗粒结合型淀粉合酶催化直链淀粉的合成，而可溶性淀粉合酶参与支链淀粉的合成(Ball和Morell，2003，Annu.Rev，PlantBiol.54，207-233；Teltow等人，2004，J.Expt.Bot.55(406)，2131-2145)。可溶性淀粉合酶组具有多种同种型，在技术文献中命名为SSI、SSII、SSIII、SSIV。通过目的淀粉合酶的蛋白质序列的序列同源性，可以将该酶分至相应的组(SSI、SSII、SSIII、SSIV)(Ball和Morell，2003，Annu.Rev，Plant Biol.54，207-233)。根据当前的教导，水溶性淀粉合酶的每一种同种型都被确定在淀粉合成中具有特定功能。在双子叶植物中，迄今只能证实SSII蛋白质的一种同种型，然而在许多单子叶植物(例如玉米)中，显示有两种不同类型的SSII蛋白质，命名为SSIIa和SSIIb。在单子叶植物中，SSIIa优先在胚乳中表达，SSIIb优先在叶组织中表达(Teltow等人，2004，J.Expt.Bot.55(406)，2131-2145)。具体功能，特别是这些单个可溶性淀粉合酶在淀粉合成中的具体功能，目前仍然未得到最终阐明(Ball和Morell，2003，Annu.Rev，Plant Biol.54，207-233)。

[0009] 淀粉的赋予功能、营养生理学或结构的性质还受到淀粉的磷酸(一种非碳成分)含量的影响。在此，应区分以单酯形式与淀粉的葡萄糖分子共价键合的磷酸(在本发明中称为淀粉磷酸)和以磷脂形式与淀粉结合的磷酸。

[0010] 淀粉磷酸的含量因植物类型而异。例如，某些玉米突变体合成具有增加的淀粉磷酸含量的淀粉(蜡质玉米0.002％和高直链淀粉玉米0.013％)，而常规类型的玉米只包含痕量的淀粉磷酸。同样，在小麦中发现少量淀粉磷酸(0.001％)，然而在燕麦和高粱(Sorghum)中，不能检测到任何淀粉磷酸。同样在稻突变体(蜡质稻0.003％)中发现比常规类型的稻(0.013％)少的淀粉磷酸。在合成块茎或根贮藏淀粉的植物，例如木薯(0.008％)、甘薯(0.011％)、竹芋(0.021％)或马铃薯(0.089％)中发现显著量的淀粉磷酸。前文中提及的淀粉磷酸含量的百分数值在每一情况下均涉及淀粉的干重，并已经由Jane等人(1996，Cereal Foods World 41(11)，827-832)确定。

[0011] 淀粉磷酸可以以单酯的形式存在于聚合的葡萄糖单体的C2、C3或C6位置(Takeda和Hizukuri，1971，Starch/ 23，267-272)。在植物合成的淀粉中磷酸的磷酸分布一般具有如下特征：大约30％至40％的磷酸基团共价键合在葡萄糖分子的C3位置，而大约60％至70％的磷酸基团共价键合在葡萄糖分子的C6位置(Blennow等人，2000，Int.J.of BiologicalMacromolecules 27，211-218)。Blennow等人(2000，CarbohydratePolymers
41，163-174)测定了不同淀粉中与葡萄糖分子的C6位置键合的淀粉磷酸的含量，例如马铃薯淀粉(取决于栽培品种，在每mg淀粉7.8至33.5nmol之间)、来自不同姜黄属(Curcuma)物种的淀粉(取决于栽培品种，在每mg淀粉1.8至63nmol之间)、木薯淀粉(每mg淀粉
2.5nmol)、稻淀粉(每mg淀粉1.0nmol)、绿豆淀粉(每mg淀粉3.5nmol)和高梁淀粉(每mg淀粉0.9nmol)。在大麦淀粉和来自玉米的各种蜡质种突变体的淀粉中，这些作者未能检测到任何与C6位置键合的淀粉磷酸。迄今，尚未能在植物的基因型和淀粉磷酸的含量之间建立起任何联系(Jane等人，1996，Cereal Foods World 41(11)，827-832)。因此目前不可能通过育种方法影响植物中淀粉磷酸的含量。

[0012] 迄今，已描述了两种蛋白质可以介导将磷酸基团共价键引入淀粉的葡萄糖分子中。第一种蛋白具有α-葡聚糖水二激酶(GWD，E.C.：2.7.9.4)的酶活性(Ritte等人，2002，PNAS 99，7166-7171)，常称为R1(特别是在较早的科学文献中)，其与马铃薯块茎中的储存淀粉的淀粉颗粒结合(Lorberth等人，1998，Nature Biotechnology 16，473-477)。
文献中描述的催化将淀粉磷酸导入淀粉的第二种蛋白质具有磷酸葡聚糖-水二激酶(PWD，E.C.：2.7.9.5)的酶活性( 等人，2005，Plant Physiol.137，2424-252，Baunsgaard等人，2005，Plant Journal 41，595-605)。

[0013] GWD和PWD之间的一个显著差异在于：GWD可使用未磷酸化的淀粉作为底物，即，GWD可催化未磷酸化的淀粉的从头磷酸化，而PWD需要己磷酸化的淀粉作为底物，即，向己磷酸化的淀粉中额外地导入磷酸( 等人，2005，Plant Physiol.137，2424-252，Baunsgaard等人，2005，Plant Journal 41，595-605)。GWD和PWD之间的另一显著差异在于：GWD只将磷酸基团导入淀粉的葡萄糖分子的C6位置，而PWD只磷酸化己磷酸化的淀粉的葡萄糖分子的C3位置(Ritte等人，2006，FEBS Letters 580，4872-4876)。

[0014] 在GWD或PWD催化的反应中，起始材料α-1，4-葡聚糖(对于GWD)或磷酸化的α-1，4-葡聚糖(对于PWD)、三磷酸腺苷(ATP)和水反应，产生产物磷酸葡聚糖(淀粉磷酸)、一磷酸和一磷酸腺苷( 等人，2005，Plant Physiol.137，2424-252，Ritte等人，2002，PNAS 99，7166-7171)。

[0015] WO 02 34923中描述了因来自马铃薯的GWD编码基因的表达而具有增加的GWD蛋白活性的小麦植物。与其中不能检测到任何淀粉磷酸的相应野生型植物相比，这些植物合成在葡萄糖分子的C6位置包含显著量的淀粉磷酸的淀粉。

[0016] WO 05 2359描述了来自马铃薯的GWD在玉米植物中的过表达，所述GWD基于玉米31
植物所使用的密码子进行了优化。通过 P NMR，确定了所述玉米淀粉的总磷酸含量(键合在葡萄糖分子的C6、C3和C2位置上)，基于葡萄糖的量为0.0736％磷酸。如果将磷酸的分子量取为98，则WO 052359中就分离自转基因玉米植物的淀粉所测定到的0.0736％总磷酸含量，相应于每mg淀粉大约7.5nmol磷酸的总磷酸含量。

[0017] WO 05 095617描述了因过表达来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的PWD编码基因而具有增加的PWD蛋白活性的植物。与相应的未转化的野生型植物相比，这些植物具有增加的淀粉磷酸含量。

[0018] 在例如食品业的淀粉加工中，一个重要的功能性质是溶胀性。淀粉的多种结构性质，例如直链淀粉/支链淀粉比率、侧链长度、分子量、分支的数目，对所述淀粉的溶胀性具有影响(Narayana和Moorthy，2002，Starch/ 54，559-592)。

[0019] 从科学文献可知，除了直链淀粉/支链淀粉比率、支链淀粉的侧链分布和淀粉聚合物的分子量分布外，淀粉磷酸的量也对淀粉的功能性质，特别是溶胀性具有影响(Narayana和Moorthy，2002，Starch/ 54，559-592)。

[0020] 要强调的是，关于淀粉的溶胀性，应区分冷水中(例如室温)的溶胀性和温水或热水中的溶胀性。原淀粉(native starch)在冷水中具有如果有也可以忽略不计的溶胀性，而物理改性的(预糊化的、干燥的)淀粉则能够在冷水中溶胀。在例如US 4,280,851中描述了在冷水中溶胀的淀粉的生产方法。根据本发明，术语“溶胀性”涉及淀粉在温水/热水悬浮液中的行为。溶胀性的标准测定方式是：在过量水存在的情况下温育淀粉颗粒，离心悬浮液后除去未结合的水，计算所获残留物的重量与所称取的淀粉量的重量的商。当进行该方法时，在温育淀粉悬浮液时，淀粉颗粒的结晶区域溶解，水分子嵌入淀粉颗粒，但此时淀粉颗粒本身的结构未被破坏，即只发生由于水分子的吸收而引起的各单个淀粉颗粒的溶胀。

[0021] 与谷物淀粉相比，从块茎或块茎组织分离的淀粉具有显著更高的热水溶胀性。

[0022] 对于从不同品种分离的马铃薯淀粉，按照Leach等人(1959，CerealChemistry36，534-544)的方法在85℃测定到74.15g/g的最大溶胀性(KufriJyoti品种)(Singh等人，2002，Journal of the Science of Food andAgriculture 82，1376-1383)。Takizawa等人(2004，Brazilian Archives ofBiology and Technology 47(6)，921-931)测定到100g/g的马铃薯淀粉溶胀性(90℃，按照Leach等人(1959，Cereal Chemistry 36，534-544)的方法)。从不同栽培品种分离的小麦淀粉具有16.6g/g至26.0g/g的溶胀性(温度：沸腾的0.1％AgNO3水悬浮液)(Yamamori和Quynh，2000，Theor ApplGenet 100，23-28)。从不同栽培品种的无壳大麦分离的淀粉具有16.5g/g或19.3g/g的溶胀性，不同栽培品种的无壳大麦的蜡质或不含直链淀粉的淀粉具有36.0g/g至55.7g/g的溶胀性(温度：70℃水性0.1％AgNO3，Yasui等人，2002，Starch/ 54，179-184)。对于玉米淀粉，测定了(90℃，Shi等人，1998，J.Cereal Sci.27，289-299)溶胀性为22.3g/g，对于高直链淀粉的玉米淀粉，溶胀性为9.6g/g(Hylon V)、6.1g/g(Hylon VII)或3.9g/g(LAPS＝低支链淀粉的淀粉)。在US 6,290 9,907中给出蜡质玉米淀粉的溶胀性为35.4g/g。对于从不同稻栽培品种分离的淀粉，按照Leach等人(1959，Cereal Chemistry 36，534-544)的方法测定到
26.0g/g至33.2g/g的溶胀性(Sodhi和Singh，2003，Food Chemistry 80，99-108)。Chen等人(2003，Starch/ 55，203-212)测定了蜡质稻淀粉与高直链淀粉的稻淀粉的各种混合物的溶胀性，为大约25g/g至大约49g/g(95℃，水性悬浮液)。Yasui等人(2002，Starch/ 54，179-184)测定了不含直链淀粉的稻淀粉的溶胀性，为55.7g/g(在沸水中在0.1％硝酸银水溶液中测量)。

[0023] 通过制备原淀粉的衍生物，可改变淀粉的功能性质。“交联的”小麦淀粉，取决于交联的程度，具有6.8g/g至8.9g/g的溶胀性，乙酰化的小麦淀粉具有不超过10.3g/g的溶胀性，同时交联且乙酰化的小麦淀粉具有9.4g/g的溶胀性，而相应的未衍生化的淀粉具有8.8g/g的溶胀性(在90℃测量；Van Hung和Morita，2005，Starch/ 57，413-420)。

[0024] 对于乙酰化的蜡质稻淀粉，测定了溶胀性为大约30g/g，对于交联的蜡质稻淀粉，溶胀性为大约15g/g，然而，相应的未衍生化的蜡质稻淀粉具有大约41g/g的溶胀性。乙酰化的稻淀粉具有大约20g/g的溶胀性，交联的稻淀粉具有大约13g/g的溶胀性，然而相应的未衍生化的稻淀粉具有大约14g/g的溶胀性(在90℃测量，Liu等人，1999，Starch/ 52，249-252)。US 6,299,907描述了交联淀粉，其中在氢氧化钠/硫酸钠溶液中预溶胀所述淀粉后进行交联反应。取决于交联的程度，测定了(在95℃测量)小麦淀粉的溶胀性为6.8g/g至7.3g/g(相应的未衍生化的小麦淀粉为14.7g/g)，羟丙基-小麦淀粉的溶胀性为9.7g/g(相应的未衍生化的小麦淀粉为22.9g/g)，交联玉米淀粉的溶胀性为5.9g/g(相应的未衍生化的玉米淀粉为16.7g/g)，交联的蜡质玉米淀粉的溶胀性为8.3g/g(相应的未衍生化的蜡质玉米淀粉为35.4g/g)和交联的马铃薯淀粉的溶胀性为6.7g/g(相应的未衍生化的马铃薯淀粉的溶胀性未有准确的说明)。由此可得出，淀粉的溶胀性通过当前的常规衍生化方法，即使有增加，也未能够得到显著增加。

发明内容

[0025] 本发明的目的在于提供具有改变的功能性质的改性淀粉、以及合成具有改变的功能性质的淀粉的植物细胞和植物、和用于产生所述植物和/或植物细胞的方法和手段。

[0026] 因此，本发明涉及遗传修饰性植物细胞和遗传修饰性植物，所述植物细胞和植物与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞或野生型植物相比，具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加且具有葡聚糖水二激酶活性的蛋白质的活性增加。

[0027] 本发明的第一方面涉及遗传修饰的植物细胞或植物，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞或野生型植物相比，该遗传修饰导致至少一种具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加且同时至少一种具有葡聚糖水二激酶活性的蛋白质的活性增加。

[0028] 此处的遗传修饰可以是，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞或野生型植物相比，在遗传修饰性植物细胞或遗传修饰性植物中，导致至少一种具有淀粉合酶II活性的蛋白质和(同时)至少一种具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的任何遗传修饰。

[0029] 根据本发明，术语“野生型植物细胞”是指用作产生本发明植物细胞的原料的植物细胞，即，除了导入的遗传修饰外，它们的遗传信息相应于本发明的植物细胞的遗传信息。

[0030] 根据本发明，术语“野生型植物”是指用作产生本发明植物的原料的植物，即，除了导入的遗传修饰外，它们的遗传信息相应于本发明植物的遗传信息。

[0031] 根据本发明，术语“相应”是指在比较多个物件时，将相互比较的所述物件保持在相同条件下。根据本发明，与野生型植物细胞或野生型植物相连的术语“相应”是指相互比较的植物细胞或植物在相同的栽培条件下生长且它们具有相同的(栽培)年龄。

[0032] 在此，术语“至少一种具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加”在本发明中是指细胞中编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的内源基因的表达增加和/或具有淀粉合酶II活性的蛋白质的量增加，和/或细胞中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的酶活性增加。

[0033] 在此，术语“具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加”在本发明中是指细胞中编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的内源基因的表达增加和/或具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的量增加，和/或细胞中具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的酶活性增加。

[0034] 可以例如通过测量编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质或编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的转录物的量来确定表达的增加。这可以例如通过Northern印迹分析或RT-PCR来进行。编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的转录物的量增加在此优选是指与相应的未进行遗传修饰的细胞相比，转录物的量增加至少100％，特别地至少125％，优选至少150％，特别优选至少200％。编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的转录物的量增加还指不包含可检测量的编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的转录物的植物或植物细胞，在进行本发明的遗传修饰后，包含可检测量的编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的转录物。

[0035] 编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的转录物的量增加在此优选指与相应的未进行遗传修饰的细胞相比，转录物的量增加至少50％，特别地至少70％，优选至少85％，特别优选至少100％。

[0036] 编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的转录物的量增加还指不包含可检测量的编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的转录物的植物或植物细胞，在进行本发明的遗传修饰后，包含可检测量的编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的转录物。

[0037] 可以例如通过免疫学方法例如Western印迹分析、ELISA(酶联免疫吸附测定)或RIA(放射免疫测定法)来确定具有淀粉合酶II活性或具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的量的增加，这种量的增加导致在所涉及的植物细胞中这些蛋白质的活性增加。具有淀粉合酶II活性的蛋白质的量的增加在此优选指与相应的未进行遗传修饰的细胞相比，所述蛋白质的量增加至少100％，特别地至少125％，优选至少150％，特别优选至少200％。具有淀粉合酶II活性的蛋白质的量的增加还指不包含可检测量的具有淀粉合酶II活性的蛋白质的植物或植物细胞，在进行本发明的遗传修饰后，包含可检测量的具有淀粉合酶II活性的蛋白质。

[0038] 具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的量的增加在此优选指与相应的未进行遗传修饰的细胞相比，所述蛋白质的量增加至少50％，特别地至少70％，优选至少85％，特别优选至少100％。

[0039] 具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的量的增加还指不包含可检测量的具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的植物或植物细胞，在进行本发明的遗传修饰后，包含可检测量的具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质。

[0040] 用于产生与某种蛋白质特异性反应，即与所述蛋白质特异性结合，的抗体的方法对于本领域技术人员来说是已知的(参见，例如，Lottspeich和Zorbas(Eds.)，1998，Bioanalytik[生物分析学]，Spektrum akad.Velag，Heidelberg，Berlin，ISBN
3-8274-0041-4)。一些公司(例如Eurogentec，Belgium)以约定劳务的方式提供该类型抗体的生产。可以利用Lorberth等人(1998，Nature Biotechnology 16，473-477)和Ritte等人(2000，PlantJournal 21，387-391)中描述的抗体，通过免疫学方法检测具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的量的增加。可以利用Walter(″Untersuchungen derExpression und Funktion der II(SS II)aus Weizen(Triticum aestivum)″[研
究小麦(普通小麦)的淀粉合酶II(SSII)的表达和功能]，Hamburg大学生物系论文，ISBN
3-8265-8212-8)中描述的抗体，通过免疫学方法确定具有淀粉合酶II活性的蛋白质的量的增加。

[0041] 可以例如，如文献(Mikkelsen等人，2004，Biochemical Journal 377，525-532；Ritte等人，2002，PNAS 99，7166-7171)中所述，检测具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性的量。

[0042] 可以例如，如文献(Nishi等人，2001，Plant Physiology 127，459-472)中所述，确定具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性的量。在一般方法第9项下描述了用于确定具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性量的优选方法。

[0043] 优选，本发明的植物细胞或本发明的植物具有淀粉合酶II活性蛋白质的活性，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞或野生型植物相比，所述活性增加至少6倍，优选至少7倍，特别优选至少8倍，特别优选至少9倍，非常特别优选至少10倍。

[0044] 具有淀粉合酶II(ADP-葡萄糖-1，4-α-D-葡聚糖-4-α-D-葡糖基转移酶；EC2.4.1.21)活性的蛋白质在其结构中具有一系列某些结构域。在N端，它们具有用于质体转运的信号肽。从N端至C端的方向，跟着N端区和催化结构域。(Li等人，2003，Funct Integr Genomics 3，76-85)。基于具有淀粉合酶II活性的多种蛋白质的氨基酸序列比较(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)，进一步的分析显示这些蛋白质具有3个特定的结构域。在SEQ ID NO 6所示氨基酸序列中，氨基酸322至351代表结构域1，氨基酸
423至462代表结构域2，氨基酸641至705代表结构域3。结构域1由SEQ ID NO 5所示核酸序列的核苷酸1190至1279编码，结构域2由核苷酸1493至1612编码，结构域3由核苷酸2147至2350编码。

[0045] 根据本发明，术语“具有淀粉合酶II活性的蛋白质”应当理解为指催化糖基化反应的蛋白质，在所述反应中，底物ADP-葡萄糖的葡萄糖分子被转移至α-1，4-连接的葡聚糖链上形成α-1，4-键(ADP-葡萄糖+{(1，4)-α-D-葡糖基}(N)<＝>ADP+{(1，4)-α-D-葡糖基}(N+1))，其中具有淀粉合酶II蛋白质活性的蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO 6所示氨基酸序列的氨基酸322至351(结构域1)具有至少86％，优选至少93％，特别优选至少95％的同一性，且与SEQ ID NO 6所示氨基酸序列的氨基酸423至462(结构域
2)具有至少83％，优选至少86％，特别优选至少95％的同一性，且与SEQ ID NO 6所示氨基酸序列的氨基酸641至705(结构域3)具有至少70％，优选至少82％，优选86％，特别优选98％，特别优选至少95％的同一性。

[0046] 与结构域1、2和3具有所述同一性且编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸序列及其相应氨基酸序列，对于本领域技术人员来说是已知的且公布在例如登录号AY133249(大麦(Hordeum vulgare))、登录号AY133248(节节麦(Aegilops
tauschii))、登录号XP467757、AAK64284(稻(Oryza sativa))、AAK81729(稻)、登录号AAD13341、AAS77569、登录号AAD13342(玉米(Zea Mays))、登录号AAF13168(木薯(Manihoteculenta))、登 录 号BAD18846( 菜 豆 (Phaseolus vulgaris))、登 录 号CAA61241(马铃薯(Solanum tuberosum))、登录号CAA61269(豌豆(Pisum sativum))、登录号AAC19119(甘薯(Ipomea batatas))、登录号AAF26156(拟南芥)、登录号
AAP41030(芋(Colocasia esculenta))、登录号AAS 88880(Ostraeococcus tauri)或登录号AAC17970(雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardii))下。可通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)容易地获得所提及的、编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸序列和氨基酸序列，所述序列通过引用明确地包括在本申请说明书中。

[0047] 在本发明中，术语“具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质”应当理解为指将β-磷酸残基从ATP转移至淀粉的蛋白质。从拟南芥sex1-3突变体的叶子分离的淀粉不具有可检测量的共价键合的磷酸基团，但其可被具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质磷酸化，即，例如从拟南芥sex1-3突变体的叶子分离的未磷酸化的淀粉可以在由具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质催化的磷酸化反应中用作底物。

[0048] ATP的β-磷酸残基从具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质转移至淀粉，且ATP的γ-磷酸残基转移至水。AMP(一磷酸腺苷)作为另一反应产物产生。因此具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质也称为[α-1，4-葡聚糖]-水二激酶或淀粉-水二激酶(EC：2.7.9.4；Ritte等人，2002，PNAS 99，7166-7171)。在由具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质催化的淀粉磷酸化中，只在葡萄糖分子的C6位上产生额外的磷酸单酯键(Ritte等人，2006，FEBS Letters 580，4872-4876)。在由具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质催化的淀粉磷酸化反应中，生成中间产物磷酸化蛋白质，在该磷酸化蛋白质中ATP的β-磷酸基团共价键合至具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的氨基酸上(Ritte等人，2002，PNAS 99，7166-7171)。该中间物通过具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的自磷酸化作用产生，即具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质自身催化了导致该中间物的反应。编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的氨基酸序列包含磷酸组氨酸结构域。在例如Tien-Shin Yu等人(2001，PlantCell
13，1907-1918)中描述了磷酸组氨酸结构域。在具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的自磷酸化中，编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的氨基酸序列的磷酸组氨酸结构域中的组氨酸残基被磷酸化(Mikkelsen等人，2004，Biochemical Journal 377，525-532)。在SEQ ID NO 2所示的来自马铃薯的具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的蛋白质序列中，氨基酸1064至1075是磷酸组氨酸结构域。如果磷酸组氨酸结构域中的保守组氨酸残基(例如，在SEQ ID NO 2所示蛋白质序列中氨基酸1069)被另一氨基酸替代，那么经诱变的蛋白质不再发生自身磷酸化，且由此不再发生葡聚糖的磷酸化(Mikkelsen等人，2004，Biochemical Journal 377，525-532)。此外，具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质还具有如下特征：其具有C端核苷酸结合结构域，该结构域在例如SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列中包括在氨基酸1121至1464中。核苷酸结合结构域的缺失导致具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质失活(Mikkelsen和Blennow，2005，Biochemical Journal 385，355-361)。在N端上，具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质包含碳水化合物结合结构域(CBM)，该结构域包括在SEQ ID NO 2所示的氨基酸78至362的氨基酸序列中。碳水化合物结合结构域具有诸如如下特征：它们的氨基酸序列包含保守的色氨酸残基。如果这些保守的氨基酸残基被其它氨基酸替代，那么碳水化合物结合结构域将失去它们结合葡聚糖的能力。例如，在SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中氨基酸W139或W194的替代将导致该碳水化合物结合结构域的功能丧失。然而，缺失葡聚糖-水二激酶的碳水化合物结合结构域(例如氨基酸1至362的缺失，其中在SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中氨基酸1至77是质体信号肽)，并不导致酶的磷酸化活性的失活(Mikkelsen等人，2006，Biochemistry 45，4674-4682)。

[0049] 描述了多种物种，例如马铃薯(WO 97 11188，GenBank Acc.：AY027522，Y09533)、小麦(WO 00 77229，US 6,462,256，GenBankAcc.：AAN93923，GenBank Acc.：AR236165)、稻(GenBank Acc.：AAR61445，GenBank Acc.：AR400814)、玉米(GenBank Acc.：AAR61444，GenBank Acc.：AR400813)、大豆(GenBank Acc.：AAR61446，GenBankAcc.：AR400815)、姜黄(Curcuma longa)(SEQ ID NO 3)、柑桔(GenBankAcc.：AY094062)、拟南芥(GenBank Acc.：AF312027)和绿藻Ostreococcustauri(GenBank Acc.：AY570720.1)的编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸序列及其相应的氨基酸序列。所提及的编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸序列和氨基酸序列已由例如NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)公开，并通过引用明确地包括在本申请说明书中。

[0050] 本发明的另一实施方案涉及本发明的遗传修饰性植物细胞或本发明的遗传修饰性植物，其中所述遗传修饰在于将至少一个外源核酸分子导入植物细胞的基因组或导入植物的基因组。

[0051] 在此，术语“遗传修饰”是指将同源的和/或异源的外源核酸分子导入植物细胞的基因组或植物的基因组，其中这些分子的导入将导致具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加和具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加。

[0052] 通过导入外源核酸分子，本发明的植物细胞或本发明的植物在它们的遗传信息方面发生改变。至少一个外源核酸分子的存在或其表达将导致表型改变。“表型”改变在此优选指细胞的一个或多个功能的可测量的改变。例如，本发明的遗传修饰性植物细胞和本发明的遗传修饰性植物，将由于导入的外源核酸分子的存在或表达，显示出具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加和具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加。

[0053] 术语“外源核酸分子”在本发明中应理解为指该类分子并不天然存在于相应的野生型植物细胞中，或该类似分子并不以其目前的空间排布方式天然地存在于野生型植物细胞中，或该类分子在野生型植物细胞的基因组中的位置并非该分子的天然存在位置。优选，外源核酸分子是由多种元件组成的重组分子，其中这些元件的组合或其特定空间排布并不天然地存在于植物细胞中。

[0054] 原则上，外源核酸分子可以是能够在植物细胞或植物中引起具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质和具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的任何期望的核酸分子。

[0055] 术语“重组核酸分子”根据本发明应当理解为指包含不同核酸分子的核酸分子，其中这些不同核酸分子并不以其在重组核酸分子中的相同组合方式天然地组合存在。因此，例如，除了编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质和/或具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子外，重组核酸分子还可以包含与所述核酸分子并不天然组合存在的额外核酸序列。在此，与编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质或具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子组合存在于重组核酸分子中的所述额外核酸序列，可以是任何期望的序列。它们可以是例如基因组的和/或植物的核酸序列。优选，所述额外的核酸序列是调控序列(启动子、终止信号、增强子)，特别优选在植物组织中具有活性的调控序列，特别优选在植物组织中具有活性的组织特异性调控序列。用于产生重组核酸分子的方法对于本领域技术人员来说是已知的，其包括基因工程方法例如，通过连接进行的核酸分子的连接，核酸分子的遗传重组或从头合成(参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.ISBN：0879695773，Ausubel等人，ShortProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons；
第5版(2002)，ISBN：0471250929)。

[0056] 根据本发明，术语“基因组”应当理解为指存在于植物细胞中的全体遗传物质。本领域技术人员明了，除了细胞核以外，其他区室(例如质体、线粒体)也包含遗传物质。

[0057] 在另一实施方案中，本发明的植物细胞和本发明的植物的特征在于至少一个外源核酸分子编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质。优选，编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的外源核酸分子是已提及的、本领域技术人员已知的来自各种植物物种的核酸分子，特别优选来自马铃薯或姜黄的编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸分子，特别优选具有SEQID NO 2所示氨基酸序列或由SEQ ID NO 1所示核酸序列编码的具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的编码核酸分子。

[0058] 在SEQ ID NO 3及SEQ ID NO 4下显示的序列迄今尚未公布。包含来自姜黄的编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的外源核酸分子的植物细胞或植物，特别是稻植物细胞或稻植物，具有如下特征：与包含来自其他物种(例如马铃薯)的编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的外源核酸分子的植物细胞或植物相比，它们合成具有更高的淀粉磷酸含量的淀粉。

[0059] 因此，本发明还涉及编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸分子，其选自：

[0060] a)编码具有SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；

[0061] b)编码氨基酸序列与SEQ ID NO 4所示氨基酸序列有至少90％，优选至少93％，优选至少96％，特别优选至少99％同一性的蛋白质的核酸分子；

[0062] c)包含SEQ ID NO 3所述核酸序列或其互补序列的核酸分子；

[0063] d)与SEQ ID NO 3所示核酸序列具有至少90％、优选至少93％，优选至少96％，特别优选至少99％的同一性的核酸分子；

[0064] e)在严格条件下与在a)或c)下描述的核酸分子的至少一条链杂交的核酸分子；

[0065] f)由于遗传密码简并性的原因，与在a)或c)下提及的核酸分子具有不同的核苷酸序列的核酸分子；

[0066] g)是a)、b)、c)、d)、e)或f)下提及的核酸分子的片段、等位基因变体和/或衍生物的核酸分子，

[0067] h)与在植物细胞中起始转录的调控序列(启动子)连接的根据a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)的核酸分子；或

[0068] i)根据h)的核酸分子，其中启动子是组织特异性启动子，特别优选特异地在植物胚乳细胞中起始转录的启动子。

[0069] 此外，本发明涉及包含本发明的外源核酸分子的质粒、载体和植物细胞或植物。

[0070] 在其他实施方案中，本发明的植物细胞和本发明的植物的特征在于至少一个外源核酸分子编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质。优选，编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的外源核酸分子是已提及的、本领域技术人员已知的、来自各种植物物种的核酸分子，特别优选来自小麦的编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子，特别优选具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列或由SEQ ID NO 5所示核酸序列编码的、具有淀粉合酶II活性的蛋白质的编码核酸分子。

[0071] 在其他实施方案中，本发明的植物细胞和本发明的植物的特征在于第一外源核酸分子编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质，第二外源核酸分子编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质。

[0072] 导入植物细胞或植物中用于遗传修饰的外源核酸分子可以是单个核酸分子或多个核酸分子。因此，它们可以是既包含编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸序列又包含编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸序列的核酸分子，它们也可以是其中编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸序列和编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸序列存在于不同的核酸分子中的核酸分子。编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸序列和编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸序列可以同时包含在例如一个载体、质粒或以线性形式存在的核酸分子中，或可以是两个相互分开的载体、质粒或线性核酸分子的成分。

[0073] 如果编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸序列和编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸序列存在于相互分开的两个核酸分子上，则它们可以同时(“共转化”)或相继地，即，按时间先后一个跟着一个地(“超转化(supertransformation)”)，导入植物细胞或植物的基因组。还可将相互分开的这些核酸分子导入一个物种的不同个体植物细胞或植物中。由此可产生其中至少一种具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质或至少一种具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的植物细胞或植物。然后可通过随后将其中具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的植物与其中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的植物杂交来产生本发明的植物。

[0074] 此外，对于外源核酸分子的导入，可以使用突变细胞或突变体代替野生型植物细胞或野生型植物，所述突变细胞或突变体的特征在于其中具有葡聚糖-水二激酶活性蛋白质的活性已经增加或具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性已经增加。突变体可以是自发(天然)突变体也可以是通过选择性使用诱变剂(例如，化学试剂、电离辐射)或基因工程方法(例如T-DNA激活标签、转座子激活标签、原位激活、体内诱变)产生的突变体。

[0075] 因此，还可以通过将能够引起具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的外源核酸分子导入其中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性已增加的突变细胞或突变体中，产生本发明的植物细胞或本发明的植物。还可以通过将能够引起具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的外源核酸分子导入其中具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性已增加的突变细胞或突变体中，产生本发明的植物细胞或本发明的植物。

[0076] 还可以通过将其中具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的突变体与由于外源核酸分子的导入而使得具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的植物杂交，产生本发明的植物细胞或本发明的植物。同样，可以通过将其中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的突变体与由于外源核酸分子的导入而使得具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的植物杂交，产生本发明的植物细胞或本发明的植物。

[0077] 还可以通过将其中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的突变体与其中具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的突变体杂交来产生本发明的植物。

[0078] 有大量的技术可用于将DNA导入植物宿主细胞中。这些技术包括使用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)作为转化剂用T-DNA对植物细胞进行的转化、原生质体的融合、DNA的注射、电穿孔、通过生物轰击法进行的DNA导入和其他可能的方法。

[0079] 例 如， 在 EP 120516；Hoekema，(In：The Binary Plant VectorSystemOffsetdruckkerij Kanters B.V.Alblasserdam(1985)，Chapter V；Fraley等人，Crit.Rev.Plant Sci.4，1-46)中和在An等人(1985，EMBO J.4，277-287)中详细地研究和描述了农杆菌介导的植物细胞转化的用途。关于马铃薯的转化，参见，例如，Rocha-Sosa等人(1989，EMBO J.29-33)。

[0080] 也已描述基于农杆菌转化借助载体进行的单子叶植物的转化(1993，Chan等人，Plant Mol.Biol.22，491-506；Hiei 等 人，1994，Plant J.6，271-282；Deng 等 人，1990，Science in China 33，28-34；Wilmink等人，1992，PlantCell Reports 11，76-80；May等人，1995，Bio/Technology 13，486-492；Conner和Domisse，1992，Int.J.Plant Sci.153，550-555；Ritchie等人，1993，Transgenic Res.2，252-265)。可选择的单子叶植物转化方法是通过生物轰击方法(Wan和Lemaux，1994，Plant Physiol.104，37-48；Vasil等人，
1993，Bio/Technology 11，1553-1558；Ritala等人，1994，Plant Mol.Biol.24，317-325；
Spencer等人，1990，Theor.Appl.Genet.79，625-631)、原生质体转化、部分透化的细胞的电穿孔或借助玻璃纤维的DNA掺入进行的转化。尤其是，在文献(参考，例如，WO95/06128、EP0513849、EP0465875、EP0292435；Fromm 等 人，1990，Biotechnology 8，833-844；
Gordon-Kamm等人，1990，Plant Cell 2，603-618；Koziel等人，1993，Biotechnology 11，
194-200；Moroc等人，1990，Theor.Appl.Genet.80，721-726)中反复地描述了玉米的转化。

[0081] 也已描述了其他谷类物种，例如大麦(Wan和Lemaux，参见上面；Ritala等人，参见上面；Krens等人，1982，Nature 296，72-74)和小麦(Nehra等人，1994，Plant J.5，285-297；Becker等人，1994，Plant Journal 5，299-307)的成功转化。所有上述方法均适用于本发明。

[0082] 通过导入具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质和/或具有淀粉合酶II活性的蛋白质进行遗传修饰的植物细胞和植物，与野生型植物细胞或野生型植物的区别可以在于：例如它们具有至少一个天然不存在于野生型植物细胞或野生型植物中的外源核酸分子，或该类分子整合在本发明植物细胞的基因组中或本发明植物的基因组中的位置与该分子在野生型植物细胞或野生型植物中的存在位置是不同的，即，在另外的基因组环境中。此外，本发明的植物细胞和本发明的植物与野生型植物细胞或野生型植物的区别可以在于：它们包含至少一个拷贝的稳定地整合入它们的基因组中的外源核酸分子，任选地还包含该分子在野生型植物细胞或野生型植物中的天然拷贝。如果导入本发明植物细胞或本发明植物的外源核酸分子是已天然存在于野生型植物细胞或野生型植物中的分子的额外拷贝，那么尤其可以基于如下事实区分本发明的植物细胞和本发明的植物与野生型植物细胞或野生型植物，所述事实是该(这些)额外的拷贝在基因组中的位置与该分子在野生型植物细胞或野生型植物中存在的位置是不同的。这可以例如借助于Southern印迹分析来验证。

[0083] 此外，优选地，本发明的植物细胞和本发明的植物与野生型植物细胞或野生型植物的区别可以在于至少一个如下特征：如果导入的外源核酸分子对于植物细胞或植物而言是异源的，则本发明的植物细胞或本发明的植物包含导入的核酸分子的转录物。这些可以例如通过Northern印迹分析或通过RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)来检测。优选，本发明的植物细胞和本发明的植物包含由导入的核酸分子编码的蛋白质。这可以例如通过免疫学方法，特别地通过Western印迹分析来检测。

[0084] 如果导入的外源核酸分子对于植物细胞或植物而言是同源的，那么本发明的植物细胞和本发明的植物可以例如由于导入的外源核酸分子的额外表达而与野生型植物细胞或野生型植物相区别。本发明的植物细胞和本发明的植物优选包含外源核酸分子的转录物。这可以例如通过Northern印迹分析或借助于“定量”RT-PCR来检测。

[0085] 本发明的植物原则上可以是任何期望的植物物种的植物，即单子叶植物和双子叶植物。优选，它们是有用的植物，即，为了营养目的或为了技术目的，特别是工业目的而人为栽培的植物。

[0086] 在再一实施方案中，本发明的植物是贮藏淀粉的植物。

[0087] 根据本发明，术语“贮藏淀粉的植物”是指具有包含贮藏性淀粉的植物部分的所有植物，例如玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、西米(sago)、芋头、绿豆、豌豆、高粱、甘薯。

[0088] 在一个优选实施方案中，本发明涉及本发明的贮藏淀粉的单子叶植物，特别优选(分类上)禾本科(Poaceae)的植物。特别优选，这些植物是稻、玉米或小麦植物。

[0089] 根据本发明，术语“小麦植物”是指小麦属(Triticum)的植物物种或通过与小麦属的植物杂交产生的植物，特别是在农业上为商业目的栽培的小麦属植物物种，或通过与小麦属植物杂交产生的植物；普通小麦(Triticumaestivum)是特别优选的。

[0090] 根据本发明，术语“玉米植物”是指玉蜀黍属(Zea)的植物物种，特别是在农业上为商业目的栽培的玉蜀黍属植物物种，特别优选玉米(Zeamais)。

[0091] 根据本发明，术语“稻植物”是指稻属(Oryza)的植物物种，特别是在农业上为商业目的栽培的稻属植物物种，特别优选稻(Oryza sativa)。

[0092] 在其他实施方案中，本发明的植物细胞和本发明的植物是转基因植物细胞或转基因植物。

[0093] 与从未遗传修饰的野生型植物细胞或野生型植物分离的淀粉相比，本发明的植物细胞和本发明的植物合成改性淀粉。

[0094] 因此，本发明的再一主题涉及本发明的植物细胞或本发明的植物，与从相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞分离的或从相应的未进行遗传修饰的野生型植物分离的淀粉相比，本发明植物细胞或植物合成改性淀粉。

[0095] 本发明还涉及包含本发明的植物细胞的遗传修饰性植物。通过再生可以从本发明的植物细胞产生此类植物。

[0096] 本发明还涉及包含本发明植物细胞的本发明植物的繁殖材料。

[0097] 术语“繁殖材料”此处包括适用于以无性或有性方式产生后代的植物的任何成分。对于无性繁殖，例如插条、愈伤组织培养物、根茎或块茎是合适的。其他繁殖材料包括例如果实、种子、幼苗、原生质体、细胞培养物等。特别优选，繁殖材料是包含胚乳的种子(谷粒)。

[0098] 在其他实施方案中，本发明涉及本发明植物的可收获植物部分，例如果实、贮藏根、根、花、芽、枝条或茎，优选种子、谷粒或块茎，这些可收获部分包含本发明的植物细胞。

[0099] 从本发明的植物细胞或从本发明的植物合成的淀粉，与从相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞分离的淀粉相比或与从相应的未进行遗传修饰的野生型植物分离的淀粉相比，区别尤其在于它具有增加的热水溶胀性。

[0100] 此外，本发明还涉及用于产生遗传修饰性植物的方法，其中

[0101] a)对植物细胞进行遗传修饰，该遗传修饰包括以任何期望的顺序、单个地或同时地进行以下步骤i和ii

[0102] i)将遗传修饰导入植物细胞，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比，该遗传修饰导致具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加，

[0103] ii)将遗传修饰导入植物细胞，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比，该遗传修饰导致具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加；

[0104] b)从步骤a)的植物细胞再生植物；

[0105] c)任选地借助于步骤b)的植物产生其他植物，

[0106] 其中任选地从步骤b)或c)的植物分离植物细胞，重复进行方法步骤a)至c)直至产生包含编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的外源核酸分子和编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的外源核酸分子的植物。

[0107] 在一个优选实施方案中，用于制备遗传修饰性植物的本发明方法包括下列步骤：

[0108] a)对植物细胞进行遗传修饰，该遗传修饰包括以任何期望的顺序或任何期望的组合、单个地或同时地实施的以下步骤i和ii

[0109] i)将遗传修饰导入植物细胞，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比，该遗传修饰导致具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加，

[0110] ii)将遗传修饰导入植物细胞，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比，该遗传修饰导致具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加；

[0111] b)从包含根据步骤

[0112] i)a)i

[0113] ii)a)ii

[0114] iii)a)i和a)ii，

[0115] 的遗传修饰的植物细胞再生植物；

[0116] c)

[0117] i)在根据步骤b)i的植物的植物细胞中引入根据步骤a)ii的遗传修饰，

[0118] ii)在根据步骤b)ii的植物的植物细胞中引入根据步骤a)i的遗传修饰，和再生植物；

[0119] d)任选地借助于根据步骤b)iii或c)i或c)ii之一获得的植物产生其他植物。

[0120] 对于根据步骤a)导入植物细胞的遗传修饰，它们原则上可以是能够导致具有淀粉合酶II酶活性的蛋白质的活性增加和/或导致具有葡聚糖-水二激酶酶活性的蛋白质的活性增加的任何类型修饰。

[0121] 可按照本领域技术人员已知的方法(例如在″Plant Cell CultureProtocols″，1999，R.D.Hall编，Humana Press，ISBN 0-89603-549-2中描述的)，实现本发明方法的步骤b)和任选步骤c)的植物的再生。

[0122] 可以例如通过无性繁殖(例如通过幼苗、块茎或通过愈伤组织培养和全株再生)或通过有性繁殖，实现本发明方法(取决于不同的方法，为步骤c)或步骤d))的其他植物的产生。有性繁殖在此处优选以受控方式发生，即，将选择的具有某些性质的植物相互杂交和繁殖。在此，优选地，以使所述其他植物(按照方法步骤c)或步骤d)产生的其它植物)包含之前步骤中导入的修饰的方式，进行该选择。

[0123] 在用于产生遗传修饰性植物的本发明方法中，可同时或在一个接一个的步骤中实施用于产生本发明遗传修饰性植物细胞的遗传修饰。在此，对于导致具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质的活性增加的遗传修饰，和对于导致具有淀粉合酶II的酶促活性的蛋白质的活性增加的相继遗传修饰，是否使用相同的方法，并不是重要的。

[0124] 在用于产生遗传修饰性植物的本发明方法的一个优选实施方案中，在步骤b)之后跟随方法步骤b)-1，其中选择根据步骤a)i的其中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的植物和/或根据步骤a)ii的其中具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的植物。然后将选择的植物用于进一步的方法步骤中。

[0125] 优选，此处选择包含根据步骤a)i的遗传修饰且具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的植物，其中，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物相比，所述活性增加至少6倍，优选至少7倍，特别优选至少8倍，特别优选至少9倍，非常特别优选至少10倍。

[0126] 优选，此处选择包含根据步骤a)ii的遗传修饰且合成如下淀粉的植物，其中，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物相比，所述淀粉具有增加至少4倍，特别优选至少5倍，特别优选至少6倍的淀粉磷酸含量。

[0127] 在用于产生遗传修饰性植物的本发明方法的再一实施方案中，遗传修饰为将至少一个外源核酸分子导入植物细胞的基因组，该(一或多个)外源核酸分子的存在或表达在细胞中导致具有淀粉合酶II酶活性的蛋白质的活性增加和/或具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质的活性增加。

[0128] 在用于产生遗传修饰性植物的本发明方法的再一实施方案中，遗传修饰为将至少一个外源核酸分子导入植物细胞的基因组，该(一或多个)外源核酸分子包含编码具有淀粉合酶II酶活性的蛋白质和/或具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质的序列。

[0129] 在用于产生本发明的遗传修饰性植物的本发明方法的再一实施方案中，至少一个外源核酸分子编码来自马铃薯、小麦、稻、玉米、大豆、柑桔、姜黄属或拟南芥属的具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质。优选，至少一个外源核酸分子编码来自姜黄或马铃薯，特别优选来自马铃薯的、具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质，特别优选具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白质或由SEQ ID NO 5所示核酸序列编码的蛋白质。关于来自所述植物的、具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质编码核酸序列，已经在上面提及。

[0130] 在用于产生本发明的遗传修饰性植物的本发明方法的再一实施方案中，至少一个外源核酸分子编码来自大麦、山羊草属(Aegilops)、稻、玉米、木薯、大豆、马铃薯、豌豆、甘薯、拟南芥属、芋头、Ostreococcus或衣藻属(Chlamydomonas)的、具有淀粉合酶II的酶活性的蛋白质。优选，至少一个外源核酸分子编码来自小麦的具有淀粉合酶II的酶活性的蛋白质。关于来自所述植物的、具有淀粉合酶II的酶活性的蛋白质的编码核酸序列，已经在上面提及。

[0131] 如上面针对整合入植物细胞或植物中用于遗传修饰的外源核酸分子所描述的，用于产生遗传修饰性植物的本发明方法的步骤a)可涉及单个核酸分子或多个核酸分子。因此，编码具有淀粉合酶II的酶活性的蛋白质或编码具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质的外源核酸分子可一起存在于单个核酸分子上或它们可存在于分开的核酸分子上。如果编码具有淀粉合酶II的酶活性的蛋白质和编码具有葡聚糖-水二激酶的活性的蛋白质的核酸分子存在于分开的核酸分子上，那么可将这些核酸分子同时或在相继的步骤中导入植物细胞。

[0132] 此外，在执行本发明方法的过程中对于外源核酸分子的导入，可以使用突变细胞或突变体代替野生型植物细胞或野生型植物，其中所述突变细胞或突变体的特征在于其中具有淀粉合酶II的酶活性的蛋白质的活性已增加或具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质的活性已增加。在更上面就突变体在本发明植物细胞或植物的制备中的应用而作出的陈述，同样适用于此。

[0133] 在一个优选实施方案中，本发明涉及用于产生遗传修饰性植物的本发明方法，其中编码具有淀粉合酶II的酶活性的蛋白质的核酸分子选自：

[0134] a)编码具有SEQ ID NO 6所示氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；

[0135] b)编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子，其中所述蛋白质的氢基酸序列与SEQ ID NO 6所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，优选至少90％，特别优选至少95％，最优选至少98％的同一性；

[0136] c)包含SEQ ID NO 5所示核酸序列或互补序列的核酸分子；

[0137] d)与c)下描述的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，优选至少90％，特别优选至少95％，最优选至少98％的同一性的核酸分子，

[0138] e)在严格条件下与a)或c)下描述的核酸分子的至少一条链杂交的核酸分子；

[0139] f)由于遗传密码简并性的原因，与a)或c)下提及的核酸分子具有不同核苷酸序列的核酸分子；

[0140] g)是a)、b)、c)、d)、e)或f)下提及的核酸分子的片段、等位基因变体和/或衍生物的核酸分子，

[0141] h)编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子，其中编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸序列与在植物细胞中起始转录的调控元件(启动子)连接；或

[0142] i)根据h)的核酸分子，其中启动子是组织特异性启动子，特别优选特异性地在植物胚乳细胞中起始转录的启动子。

[0143] 在其他优选实施方案中，本发明涉及用于产生遗传修饰性植物的本发明方法，其中编码具有葡聚糖-水二激酶的酶活性的蛋白质的核酸分子选自

[0144] a)编码具有SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；

[0145] b)编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸分子，其中所述蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4下显示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，优选至少90％，特别优选至少95％，最优选至少98％的同一性；

[0146] c)包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3下显示的核酸序列或互补序列的核酸分子；

[0147] d)与c)下描述的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，优选至少90％，特别优选至少95％，最优选至少98％的同一性的核酸分子，

[0148] e)在严格条件下与在a)或c)下描述的核酸分子的至少一条链杂交的核酸分子；

[0149] f)由于遗传密码简并性的原因，与a)或c)下提及的核酸分子具有不同的核苷酸序列的核酸分子；

[0150] g)是在a)、b)、c)、d)、e)或f)下提及的核酸分子的片段、等位基因变体和/或衍生物的核酸分子，

[0151] h)编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸分子，其中编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸序列与在植物细胞中起始转录的调控元件(启动子)连接，或

[0152] i)h)的核酸分子，其中启动子是组织特异性启动子，特别优选特异性地在植物胚乳细胞中起始转录的启动子。

[0153] 根据本发明，术语“同一性”应当理解为是指以百分数表示的与其他蛋白质/核酸相同的氨基酸/核苷酸(同一)的数目。优选，借助于计算机程序，将其他蛋白质/核酸与SEQ ID NO 6下显示的氨基酸序列比较，确定具有淀粉合酶II活性的蛋白质的同一性；与SEQ ID NO 5下显示的核酸序列比较，确定编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子的同一性；与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4下显示的氨基酸序列比较，确定具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的同一性；或与SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3下显示的核酸序列比较，确定编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸分子的同一性。如果相互进行比较的序列具有不同的长度，则以由较短序列与较长序列所共有的氨基酸/核苷酸的数目来确定同一性的百分数比例的方式，确定同一性。优选，通过已知的和公共可获得的计算机程序ClustalW(Thompson等人，Nucleic Acids Research 22(1994)，4673-4680)确定同一性。公众可以通过Julie Thompson([e-mail])和Toby Gibson([e-mail])，European Molecular BiologyLaboratory，Meyerhofstrasse 1，D 69117 Heidelberg，German获得ClustalW。同样地，可从各国际互联网址，例如IGBMC(Institut deGénétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire，B.P.163，67404 IllkirchCedex，France；ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) 和EBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)和EBI的所有镜像国际互联网地址(European Bioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB 101SD，UK)下载ClustalW。

[0154] 优选，为了确定本发明说明书中描述的蛋白质和其他蛋白质之间的同一性，使用版本1.8的ClustalW计算机程序。此处将设置下列参数：KTUPLE＝1、TOPDIAG＝5、WINDOW＝5、PAIRGAP＝3、GAPOPEN＝10、GAPEXTEND＝0.05、GAPDIST＝8、MAXDIV＝40、MATRIX＝GONNET、ENDGAPS(OFF)、NOPGAP、NOHGAP。

[0155] 优选，为确定例如本发明的说明书中描述的核酸分子的核苷酸序列和其他核酸分子的核苷酸序列之间的同一性，使用版本1.8的ClustalW计算机程序。此处将设置下列参数：KTUPLE＝2、TOPDIAGS＝4、PAIRGAP＝5、DNAMATRIX：IUB、GAPOPEN＝10、GAPEXT＝5、MAXDIV＝40、TRANSITIONS：未加权的。

[0156] 同一性还意味着功能和/或结构等价性存在于所涉及的核酸分子或由它们编码的蛋白质之间。与上述分子同源且是这些分子的衍生物的核酸分子通常是这些分子的变异，所述变异是行使相同生物学功能的修饰。此处，它们可以是天然发生的变异，例如其他物种的序列，或可以是突变，其中这些突变可以天然发生或通过选择性诱变引入。此外，所述变异可以是通过合成制备的序列。在等位基因变体的情况下，它们可以是天然发生的变体和通过合成制备的或通过重组DNA技术产生的变体。衍生物的一种特定形式是例如由于遗传密码的简变性而与本发明的说明书中描述的核酸分子不同的核酸分子。

[0157] 本发明中的术语“杂交”是指在常规杂交条件下，优选在严格条件下的杂交，如，例如在Sambrook等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，3rd edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY.ISBN：0879695773)中所描述的。特别优选，“杂交”是指在下列条件下的杂交：

[0158] 杂交缓冲液：

[0159] 2×SSC；10×Denhardt溶液(Ficoll 400+PEG+BSA；比率1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml的鲱鱼精子DNA；50μg/ml的tRNA；或25M磷酸钠缓冲液pH7.2；1mM EDTA；7％SDS

[0160] 杂交温度：

[0161] T＝65至68℃

[0162] 洗涤缓冲液：0.1×SSC；0.1％SDS

[0163] 洗涤温度：T＝65至68℃。

[0164] 可以例如从基因组或cDNA文库分离与所述分子杂交的核酸分子。此处，可使用所述核酸分子或这些分子的部分或这些分子的反向互补物，例如通过按照标准方法进行杂交或通过PCR进行扩增，鉴定和分离此类核酸分子。

[0165] 关于用于分离编码具有淀粉合酶II活性或具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸序列的探针，可以使用例如完全含有或基本上含有SEQ IDNO 5(淀粉合酶II)或SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3(葡聚糖-水二激酶)下显示的核苷酸序列或这些序列的部分的核酸分子。用作杂交探针的片段可以是借助于常规合成技术产生的合成片段或寡核苷酸，其序列与本发明的说明书中描述的核酸分子的序列基本相符。如果已鉴定和分离到与本发明中描述的核酸序列杂交的基因，则应当测定该序列编码的蛋白质的序列和分析其性质，以便确定其是否是具有淀粉合酶II活性或葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质。

[0166] 与本发明中描述的核酸分子杂交的分子特别包括所述核酸分子的片段、衍生物和等位基因变体。根据本发明，术语“衍生物”是指这些分子的序列在一个或多个位置上与上述核酸分子的序列相异并与这些序列具有高度同一性。在此，与上述核酸分子的差异可以例如由缺失、添加、替换、插入或重组来产生。

[0167] 对于编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质和/或具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的本发明核酸分子的表达，优选将这些核酸分子与在植物细胞中保证转录的调控DNA序列连接。这些调控序列尤其包括启动子。通常，在植物细胞中具有活性的任何启动子均适用于表达。

[0168] 此处，可选择启动子，以使表达可以组成型地发生或只在某个组织中、在植物发育的某个时间点或在由外部影响决定的时间点发生。对于植物和核酸分子两者而言，启动子都可以是同源的或异源的。

[0169] 合适的启动子是例如用于组成型表达的烟草花叶病毒35S RNA启动子和来自玉米的遍在蛋白启动子、来自稻的肌动蛋白-1基因启动子(McElroy等人，1990，Plant Cell2(2)，163-171)、来自玉米的组蛋白启动子(WO 99 34005)、用于马铃薯中块茎特异性表达的Patatingen启动子B33(Rocha-Sosa等人，EMBO J.8(1989)，23-29)或确保只在具有光合作用的组织中表达的启动子，例如ST-LS1启动子(Stockhaus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stockhaus等人，EMBO J.8(1989)2445-2451)或用于胚乳特异性表达的来自小麦的HMG启动子、USP启动子、菜豆蛋白启动子、来自玉米的玉米醇溶蛋白基因启动子(Pedersen等人，Cell 29(1982)，1015-1026；Quatroccio等人，Plant Mol.Biol.15(1990)，81-93)、谷蛋白启动子(Leisy等人，Plant Mol.Biol.14(1990)，41-50；
Zheng等人，Plant J.4(1993)，357-366；Yoshihara等人，FEBS Lett.383(1996)，213-218)、球蛋白启动子(Nakase等人，1996，Gene 170(2)，223-226)、谷醇溶蛋白启动子(Qu and Takaiwa，2004，Plant Biotechnology Journal 2(2)，113-125)或Shrunken-1 启 动 子(Werr等人，EMBO J.4(1985)，1373-1380)。然而，也可使用只在由外部影响决定的时间点上被激活的启动子(参见，例如，WO 9307279)。允许简单诱导的热激蛋白启动子也是有益的。此外，可使用种子特异性启动子例如在蚕豆和其他植物中确保种子特异性表达的、来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(Fiedler等人，Plant Mol.Biol.22(1993)，669-679；
等人，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。

[0170] 此外，可以存在用于将多聚A尾添加至转录物的终止序列(多腺苷酸化信号)。多聚A尾被认为具有稳定转录物的功能。此类元件描述于文献中(参考Gielen等人，EMBO J.8(1989)，23-29)且可任意地置换。

[0171] 在启动子和编码区之间还可以存在内含子序列。该类型的内含子序列可在植物中导致稳定的表达和增加的表达(Callis等人，1987 Genes Devel.1，1183-1200；Luehrsen 和 Walbot，1991，Mol.Gen.Genet.225，81-93；Rethmeier 等 人，1997；Plant Journal.12(4)：895-899；Rose 和 Beliakoff，2000，Plant Physiol.122(2)，535-542；
Vasil等人，1989，Plant Physiol.91，1575-1579；Xu等人，2003，Science in China Series C Vol.46 No.6，561-569)。合适的内含子序列是例如来自玉米的sh1基因的第一个内含子、来自玉米的多聚遍在蛋白基因1的第一个内含子、来自稻的EPSPS基因的第一个内含子、来自稻的肌动蛋白-1基因的第一个内含子(McElroy等人，1990，Plant Cell 2(2)，163-171)或来自拟南芥属的PAT1基因的头两个内含子之一。

[0172] 本发明的再一实施方案涉及用于产生本发明的遗传修饰性植物的方法，其中[0173] a)对植物细胞进行遗传修饰，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比，该遗传修饰导致具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加；

[0174] b)从步骤a)的植物细胞再生植物；

[0175] c)任选地借助于步骤b)的植物产生其他植物；和

[0176] d)将按照步骤b)或c)获得的植物与和相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比其中的具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的植物杂交。

[0177] 本发明的再一实施方案涉及用于产生本发明的修饰性植物的方法，其中

[0178] a)对植物细胞进行遗传修饰，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比，该遗传修饰导致具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加；

[0179] b)从步骤a)的植物细胞再生植物；

[0180] c)任选地借助于步骤b)的植物产生其他植物，和

[0181] d)将按照步骤b)或c)获得的植物与和相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞相比其中的具有淀粉合酶II活性的蛋白质的酶活性增加的植物杂交。

[0182] 在最后提及的两个用于产生遗传修饰性植物的方法中，可如上面已描述的，实施根据步骤a)的植物的遗传修饰。同样上面也已描述了根据步骤b)的植物的再生和根据步骤c)的其他植物的产生。

[0183] 在最后提及的两个实施方案中，根据步骤d)和获自步骤b)或c)的植物或植物后代杂交的植物可以是与相应的野生型植物相比，其中的具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加或具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的任何植物。此处，关于增加具有淀粉合酶II活性的蛋白质或具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性，可通过能够在相应植物中导致所述蛋白质的活性增加的任何修饰来实现。这些植物可以是突变体或是通过基因工程方法修饰的植物。突变体可以是自发(天然)突变体，还可以是通过选择性使用诱变剂(例如，化学试剂、电离辐射)或基因工程方法(例如转座子激活标签法、T-DNA激活标签法、体内诱变)产生的突变体。优选，通过基因工程方法产生的植物是通过插入诱变产生的突变体，特别优选表达外源核酸分子的遗传修饰性植物，特别优选其中外源核酸分子编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质或具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的遗传修饰性植物。

[0184] 在两个最后提及的本发明方法中，对于杂交，优选使用如下植物，在该植物中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物相比，增加至少6倍，优选至少7倍，特别优选至少8倍，特别优选至少9倍，非常特别优选至少10倍。

[0185] 在最后提及的两个本发明方法中，对于杂交，就其中具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的植物而言，优选使用如下植物，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物相比，所述植物合成具有增加至少4倍，特别优选至少5倍，特别优选至少6倍的淀粉磷酸含量的淀粉。

[0186] 在一个优选实施方案中，用于产生遗传修饰性植物的本发明方法用于产生本发明的植物或具有本发明植物的性质的植物。

[0187] 本发明还涉及可通过本发明的方法获得的植物。

[0188] 令人吃惊地发现：其中的具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加且具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的本发明植物细胞和本发明植物合成改性淀粉。特别是，令人吃惊地，由本发明的植物细胞和本发明的植物合成的淀粉具有增加的热水溶胀性。可从本发明植物细胞和本发明植物分离的淀粉的增加的热水溶胀性孵育了该淀粉某些性质，这些性质使得该淀粉比常规淀粉能更好地适应于某些应用。例如，如果将淀粉用作增稠剂，淀粉的增加的热水溶胀性将使得为了获得相同的增稠度而需使用的淀粉显著较少。这导致例如使用淀粉增稠的食物的卡路里含量减少。

[0189] 本发明的再一主题涉及具有增加的热水溶胀性的改性淀粉。特别优选，本发明的改性淀粉的热水溶胀性与从相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞分离的或从相应的未进行遗传修饰的野生型植物分离的淀粉相比，增加至少2倍，特别优选至少3倍，非常特别优选至少4倍。

[0190] 用于确定热水溶胀性的方法对于本领域技术人员来说是已知的，并描述于文献(例如Leach等人，1959，Cereal Chemistry 36，534-544)中。在一般方法第1项下描述了根据本发明优选用于确定热水溶胀性的方法。

[0191] 优选，本发明涉及改性淀粉，所述改性淀粉具有至少110g/g，优选至少115g/g，特别优选至少120g/g和特别优选至少125g/g的热水溶胀性。优选，改性淀粉具有不超过350g/g，特别优选不超过300g/g，特别优选不超过250g/g和特别优选不超过200g/g的热水溶胀性。

[0192] 本发明的再一主题涉及从单子叶植物细胞或从单子叶植物分离的改性淀粉，所述改性淀粉具有至少60g/g，优选至少75g/g，特别优选至少90g/g，特别优选至少105g/g和特别优选至少120g/g的热水溶胀性。优选，从单子叶植物细胞或从单子叶植物分离的改性淀粉具有不超过250g/g，特别优选不超过200g/g，特别优选不超过175g/g和特别优选不超过150g/g的热水溶胀性。

[0193] 本发明的再一主题涉及从稻植物细胞或稻植物分离的改性淀粉，所述改性淀粉具有至少65g/g，优选至少80g/g，特别优选至少100g/g，特别优选至少115g/g和特别优选至少125g/g的热水溶胀性。优选，从稻植物细胞或稻植物分离的改性淀粉具有不超过250g/g，特别优选不超过200g/g，特别优选不超过175g/g和特别优选不超过150g/g的热水溶胀性。

[0194] 本发明的再一优选主题涉及从玉米植物细胞或玉米植物分离的改性淀粉，所述改性淀粉具有至少40g/g，优选至少42g/g，更优选至少45g/g和最优选55g/g的热水溶胀性。

[0195] 本发明的再一优选主题涉及从小麦植物细胞或小麦植物分离的改性淀粉，所述改性淀粉具有至少35g/g，优选至少50g/g的热水溶胀性。

[0196] 从本发明遗传修饰性植物细胞或本发明遗传修饰性植物合成的淀粉优选具有增加的淀粉磷酸含量。从本发明植物细胞或本发明植物分离的淀粉的淀粉磷酸含量显著高于杂交后从所涉及的亲本植物的磷酸含量的总和预期的淀粉磷酸含量。

[0197] 因此，本发明的一个优选主题涉及本发明的改性淀粉，所述改性淀粉与从相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞或从相应的未进行遗传修饰的野生型植物分离的淀粉相比，具有增加的淀粉磷酸含量。优选，本发明淀粉的淀粉磷酸含量，与从相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞分离的或从相应的未进行遗传修饰的野生型植物分离的淀粉相比，增加至少10倍，特别优选至少15倍，特别优选至少20倍，非常特别优选至少25倍。

[0198] 优选，本发明的改性淀粉比从相应的野生型植物细胞分离的或从相应的野生型植物分离的淀粉，在淀粉的葡萄糖分子的C6位置中具有多至少10倍，特别优选多至少15倍，特别优选多至少20倍和非常特别优选多至少25倍的淀粉磷酸。

[0199] 可使用本领域技术人员已知的方法，例如偶联酶试验的光度测定法或按照31
Kasemusuwan和Jane(1996，Cereal Chemistry 73，702-707)中描述的方法进行的 P-NMR，确定葡萄糖分子的C6位置中键合的淀粉磷酸的量。根据本发明，优选使用一般方法第2项下描述的方法确定葡萄糖分子的C6位置中键合的淀粉磷酸的量。

[0200] 本发明的再一优选主题涉及从单子叶植物细胞或从单子叶植物分离的本发明改性淀粉，所述改性淀粉具有每mg淀粉至少11nmol，特别优选每mg淀粉至少12nmol的、键合在淀粉的葡萄糖分子的C6位置中的淀粉磷酸含量。特别地，本发明的该改性淀粉优选是玉米、稻或小麦淀粉。

[0201] 在本发明的再一实施方案中，本发明的改性淀粉是原淀粉(nativestarch)。

[0202] 根据本发明，术语“原淀粉”是指按照本领域技术人员已知的方法从本发明的植物、本发明的可收获植物部分、本发明的淀粉贮藏性部分或本发明植物的繁殖材料分离的淀粉。

[0203] 本发明还涉及可从本发明的植物细胞或本发明的植物、本发明的繁殖材料或本发明的可收获植物部分获得的、或可从利用本发明的遗传修饰性植物生产方法产生的植物获得的、本发明改性淀粉。

[0204] 本发明还涉及合成本发明改性淀粉的植物细胞或植物。

[0205] 本发明还涉及用于产生改性淀粉的方法，所述方法包括步骤：从本发明的植物细胞或本发明的植物，从本发明的该类植物的繁殖材料和/或从本发明的该类植物的可收获植物部分，优选从本发明的该类植物的淀粉贮藏性部分，提取淀粉。优选，该方法还包括步骤：在提取淀粉之前收获栽培的植物或植物部分和/或这些植物的繁殖材料，并且特别优选地，还包括步骤：在收获之前栽培本发明的植物。

[0206] 用于从植物或植物的淀粉贮藏性部分提取淀粉的方法对于本领域技术人员来说是已知的。此外，在例如淀粉：化学和技术(Starch：Chemistryand Technology)(编者：Whistler，BeMiller和Paschall(1994)，第2版，Academic Press Inc.London Ltd；ISBN
0-12-746270-8；参见，例如，XII章，412-468页：玉米和高粱淀粉：生产；Watson著；XIII章，469-479页：木薯、竹芋和西米淀粉：生产；Corbishley和Miller著；XIV章，479-490页；马铃薯淀粉：生产和应用；Mitch著；XV章，491至506页；小麦淀粉：生产、改性和应用；
Knight和Oson著；及XVI章，507至528页：稻淀粉：生产和应用；Rohmer和Klem著；玉米淀粉：Eckhoff等人，Cereal Chem.73(1996)，54-57，通常使用“湿磨”法工业规模提取玉米淀粉。)中描述了从各种贮藏淀粉的植物提取淀粉的方法。通常在从植物材料提取淀粉的方法中使用的设备是分离机、滗析器、旋流分离器、喷雾干燥器和流化床干燥器。

[0207] 根据本发明，术语“淀粉贮藏性部分”应当理解为是指这样的植物部分，在该植物部分中的淀粉与短暂的叶淀粉不同，其以贮库的形式持续更长期地贮存。优选的淀粉贮藏性植物部分是例如块茎、贮藏根和谷粒、包含胚乳的谷粒是特别优选的，来自玉米、稻或小麦植物的包含胚乳的谷粒是特别优选的。

[0208] 在一个优选实施方案中，用于产生改性淀粉的本发明方法用于生产本发明的淀粉。

[0209] 同样本发明涉及可通过用于产生改性淀粉的本发明方法获得的改性淀粉。

[0210] 本发明还涉及本发明植物细胞或本发明植物用于生产改性淀粉的用途。

[0211] 本领域技术人员已知：可以例如通过热、化学、酶学或机械衍生化作用改变淀粉的性质。衍生淀粉(derivatized starch)特别适用于食品和/或非食品领域中的多种应用。本发明的淀粉比常规淀粉更适用作产生衍生淀粉的起始物质，因为它们例如由于更高的淀粉磷酸含量而具有更高含量的反应性官能团。此外，由于本发明淀粉的增加的热水溶胀性，可在更高的温度进行衍生化而不在该过程中显著破坏淀粉颗粒结构。

[0212] 因此，本发明还涉及用于生产衍生淀粉的方法，其中将本发明的改性淀粉随后进行衍生化。

[0213] 术语“衍生淀粉”，根据本发明，应当理解为是指这样的本发明改性淀粉，该改性淀粉的性质在该淀粉从植物细胞分离后通过化学、酶学、热或机械的方法已经发生了改变。

[0214] 在本发明的再一实施方案中，本发明的衍生淀粉是用热和/或用酸处理的淀粉。

[0215] 在再一实施方案中，衍生淀粉是淀粉醚类，特别是淀粉烷基醚、O-烯丙基醚、羟烷基醚、O-羧甲基醚、含氮淀粉醚、含磷酸的淀粉醚或含硫淀粉醚。

[0216] 在其他实施方案中，衍生淀粉是交联淀粉。

[0217] 在其他实施方案中，衍生淀粉是淀粉接枝聚合物。

[0218] 在其他实施方案中，衍生淀粉是氧化的淀粉。

[0219] 在再一实施方案中，衍生淀粉是淀粉酯类，特别是使用有机酸已导入淀粉中的淀粉酯类。该衍生淀粉特别优选是淀粉“磷酸”、“硝酸”、“硫酸”、“黄原酸”、“醋酸”或“柠檬酸”酯。

[0220] 本发明的衍生淀粉适用于制药工业和食品和/或非食品领域中的各种用途。用于产生本发明的衍生淀粉的方法对于本领域技术人员来说是已知的且在一般文献中有充分描述。有关衍生淀粉的生产的概述见于例如Orthoefer(in Corn，Chemistry and Technology，1987，eds.Watson andRamstad，章16，479-499)中。

[0221] 本发明同样涉及可通过用于产生衍生淀粉的本发明方法获得的衍生淀粉。

[0222] 本发明还涉及本发明改性淀粉用于生产衍生淀粉的用途。

[0223] 通常加工植物的淀粉贮藏性部分以产生面粉。可用于产生面粉的植物部分的实例是例如马铃薯植物的块茎和谷类植物的谷粒。为自谷类植物生产面粉，可以研磨和筛分这些植物的包含胚乳的谷粒。淀粉是胚乳的主要成分。在不含胚乳但含有其他淀粉贮藏性部分例如块茎或根的其他植物中，通常通过粉碎、干燥和随后研磨所述贮藏器官来生产面粉。胚乳的淀粉或植物的淀粉贮藏性部分中包含的淀粉是从所述植物部分产生的面粉的主要部分。因此，面粉的性质也受到存在于所述面粉中的淀粉的影响。本发明的植物细胞和本发明的植物与相应的未进行遗传修饰的野生型植物细胞或相应的未进行遗传修饰的野生型植物相比，合成已改变的淀粉。因此，从本发明的植物细胞、本发明的植物、本发明的繁殖材料或本发明的可收获部分产生的面粉具有改变的性质。还可通过将淀粉与面粉混合或通过混合具有不同性质的面粉来影响面粉的性质。

[0224] 因此，本发明的再一主题涉及包含本发明淀粉的面粉。

[0225] 本发明的再一主题涉及可从本发明的植物细胞、本发明的植物、本发明的植物的淀粉贮藏性部分、可从本发明的繁殖材料或从本发明的可收获植物部分产生的面粉。用于生产面粉的本发明的植物的淀粉贮藏性部分优选是块茎、贮藏根和包含胚乳的谷粒。根据本发明，来自(分类上)禾本科的植物的谷粒是特别优选的，来自玉米、稻或小麦植物的谷粒是特别优选的。

[0226] 根据本发明，术语“面粉”应当理解为指通过研磨植物部分获得的粉末。任选地，在研磨之前干燥植物部分，并在研磨后进行粉碎和/或筛分。

[0227] 本发明面粉由于存在于其中的本发明淀粉而具有如下特征，即，它们具有改变的磷酸含量和/或增加的热水溶胀性。这在例如用于多种用途的食品工业面粉加工中，特别是在烘焙食品的生产中是期望的。

[0228] 本发明的一个优选主题涉及从单子叶植物的谷粒产生的面粉，所述面粉具有至少28g/g，优选至少33g/g，特别优选至少38g/g，特别优选至少43g/g的热水溶胀性。

[0229] 在此，可以以类似于已描述的用于确定淀粉的热水溶胀性的方法，但是以面粉代替淀粉，确定面粉的热水溶胀性。一般方法第1项下描述了用于确定面粉的热水溶胀性的优选方法。

[0230] 本发明的再一主题是用于生产面粉的方法，所述方法包括步骤：研磨本发明的植物细胞、本发明的植物、本发明的植物部分、本发明的植物的淀粉贮藏性部分、本发明的繁殖材料或本发明的可收获材料。

[0231] 可通过研磨本发明的植物的淀粉贮藏性部分产生面粉。本领域技术人员知道如何生产面粉。优选，生产面粉的方法还包括在研磨之前收获栽培的植物或植物部分和/或这些植物的繁殖材料或淀粉贮藏性部分的步骤以及特别优选地还包括在收获之前栽培本发明植物的步骤。

[0232] 在本发明的再一实施方案中，用于生产面粉的方法包括在研磨前加工本发明的植物、本发明的植物的淀粉贮藏性部分、本发明的繁殖材料或本发明的可收获材料。

[0233] 此处的加工可以是例如热处理和/或干燥。可以通过在研磨前进行热处理及之后对热处理后的材料进行干燥，例如以从贮藏根或块茎，例如马铃薯块茎产生面粉。在研磨前粉碎本发明的植物、本发明的植物的淀粉贮藏性部分、本发明的繁殖材料或本发明的可收获材料，同样可以是本发明意义上的加工。研磨前除去植物组织，例如从谷粒除去谷壳，也是本发明意义上的研磨前加工。

[0234] 在本发明的再一实施方案中，用于生产面粉的方法包括在研磨后加工粗面粉(grist)。

[0235] 在此，可以例如在研磨后筛分粗面粉，例如以产生各种类型的面粉。

[0236] 本发明的再一主题是本发明的遗传修饰性植物部分、本发明的植物、本发明的植物的部分、本发明的植物的淀粉贮藏性部分、本发明的繁殖材料或本发明的可收获材料用于生产面粉的用途。

[0237] 序列描述

[0238] SEQ ID NO 1：来自马铃薯的编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸序列。

[0239] SEQ ID NO 2：来自马铃薯的由SEQ ID NO 1编码的具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的氨基酸序列。

[0240] SEQ ID NO 3：来自姜黄的编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的核酸序列。

[0241] SEQ ID NO 4：来自姜黄的由SEQ ID NO 3编码的具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的氨基酸序列。

[0242] SEQ ID NO 5：来自普通小麦的编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸序列。

[0243] SEQ ID NO 6：来自普通小麦的由SEQ ID NO 3编码的具有淀粉合酶II活性的蛋白质的氨基酸序列。

[0244] 附图描述

[0245] 图1显示通过与野生型比较确定具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性的酶谱。使用野生型植物(WT)和3株遗传修饰性植物(oe-SSII-O.s.-5、oe-SSII-O.s.-12、oe-SSII-O.s.-19)的未成熟谷粒(在开花开始后15天)的总蛋白质提取物，所述3株遗传修饰性植物彼此独立地自使用表达载体AH32-191进行的转化中产生。在泳道WT和pur(未稀释的)中，加载等量的相应提取物的蛋白质。系列稀释(1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶20或1∶100)遗传修饰性植物的蛋白质提取物，同样地将这些稀释物彼此分开进行电泳。用Lugol氏溶液染色由酶谱上存在的具有淀粉合酶II活性的蛋白质合成的特定产物(由箭头标出)后，通过比较来自野生型植物的蛋白质提取物的条带的强度与来自所述遗传修饰植物的蛋白质提取物的条带的强度，可以确定与野生型植物相比淀粉合酶II的活性的增加。此处，相等强度意味着相等活性。

[0246] 图2显示与未进行遗传修饰的野生型植物(WT)相比，稻品系oe-SSII-O.s.-19、oe-SSII-O.s.-20、oe-SSII-O.s.-21、oe-SSII-O.s.-22、oe-SSII-O.s.-23的未成熟T1种子的Northern印迹分析的放射自显影图。为此，从使用表达载体AH32-191转化而独立地产生的各品系的3粒种子，提取RNA，按照一般方法第8项下描述的方法分析所述RNA。以SSII标出与来自小麦的编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的标记核酸探针杂交的条带。

[0247] 图3显示在用Lugol氏溶液染色后，与未进行遗传修饰的野生型植物(WT)的种子相比，稻品系oe-SSII-O.s.-8、oe-SSII-O.s.-19、oe-SSII-O.s.-23的未成熟T1种子的蛋白质提取物的酶谱。每一品系，分析两粒(oe-SSII-O.s.-8)或三粒(oe-SSII-O.s.-19、oe-SSII-O.s.-23)不同谷粒的蛋白质提取物。此处按照一般方法第9项下描述的方法进行酶谱分析。以SSII标出酶谱中特异于具有淀粉合酶II活性的蛋白质的条带。

[0248] 图4显示质粒pJH77的图谱。

[0249] 图5显示来自野生型植物(WT)的未成熟玉米籽粒和来自其中具有淀粉合酶II(SS2)活性的蛋白质的活性增加的转基因品系(TG)的蛋白质提取物的酶谱。标出了所用的蛋白质的量。

[0250] 图6显示质粒pHN3的图谱。

[0251] 一般方法

[0252] 下面描述可用于实施本发明方法的方法。这些方法是本发明的具体实施方案，但本发明不限于这些方法。本领域技术人员知道可以通过修饰所述方法和/或通过将方法的单个部分替换成可选择的方法部分，以相同的方式实施本发明。所有引用的出版物的内容通过引用额外地合并入本申请说明书中。

[0253] 1.热水溶胀性(SP)的确定

[0254] 将100mg样品(淀粉或面粉)悬浮在6ml水中，然后在92.5℃溶胀20分钟。在92.5℃温育样品的期间，通过小心地旋转样品容器360°，反复混合悬浮液(前2分钟持续地进行，之后于3、4、5、10、15或25分钟进行)。在92.5℃温育总共30分钟后，将悬浮液在冰水中冷却大约1分钟，之后25℃温育5分钟。离心(室温，1000×g，15分钟)后，小心地从胶状沉淀吸出获得的上清液，确定沉淀的重量。根据以下公式计算热水溶胀性：

[0255] SP＝(胶状沉淀的重量)/(称取的样品(面粉或淀粉)的重量)

[0256] 2.淀粉磷酸含量的确定

[0257] a)葡萄糖分子C6位置中的磷酸含量的确定

[0258] 在淀粉中，葡萄糖单位的C2、C3和C6位置可被磷酸化。对于淀粉或面粉的C6P含量的确定(按照Nielsen等人，1994，Plant Physiol.105：111-117改进的)，在95℃在500μl 0.7M HCl中，在持续振荡的情况下水解50mg稻/玉米面粉或稻/玉米淀粉4小时。
然后，以15,500×g离心10分钟，通过滤膜(0.45μm)从悬浮物和混浊中纯化上清液。将
20μl清澈的水解物与180μl咪唑缓冲液(300mM咪唑、pH7.4；7.5mM MgCl2、1mMEDTA和
0.4mM NADP)混合，在光度计中在340nm处测量样品。在确定基础吸收后，通过加入2个单位的葡萄糖6-磷酸脱氢酶(来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，Boehringer Mannheim)起始酶反应。基于产生6-磷酸葡萄糖酸和NADPH的葡萄糖6-磷酸和NADP的等摩尔反应，测量变化(OD)，在上述波长检测NADPH的形成。监测反应直至达到终点。可根据该测量的结果计算水解物中的葡萄糖6-磷酸的含量：

[0259]

[0260] 为了避免由于所称取的材料(面粉或淀粉)中淀粉的不完全水解所导致的错误结果，随后确定水解的程度。为此，从经过葡萄糖6-磷酸测量的相应水解物中取出10μl水解物，用10μl 0.7M NaOH中和，用水补至终体积2ml，用水以1∶100进行稀释。用196μl测量缓冲液(100mM咪唑pH6.9；5mM MgCl2、1mM ATP、0.4mM NADP)处理4μl该稀释物，然后用于光度计确定葡萄糖含量。在于340nm处确定基础吸收后，通过加入2μl酶混合物(己糖激酶1∶10；来自酵母的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1∶10；于测量缓冲液中)，在光度计中(340nm)监测反应直至达到终点。测量原理相应于第一反应。根据获得的测量结果，可计算相应样品的葡萄糖的量：

[0261]

[0262] 在此，检测到的单个样品的葡萄糖量对应于可用于C6磷酸确定的淀粉的比例。为了简化，在进一步的计算中将葡萄糖含量转换成淀粉含量。

[0263]

[0264] 然后，将葡萄糖6-磷酸测量的结果与相应样品的淀粉含量关联起来，表示为葡萄糖6-磷酸含量/mg水解的淀粉：

[0265]

[0266] 与提及葡萄糖6-磷酸在称取的样品(面粉或淀粉)重量中的量不同，通过该计算方法，葡萄糖6-磷酸的量只与完全水解成葡萄糖的淀粉部分相关。

[0267] b)总磷酸含量的确定

[0268] 按照Ames(Methods in Enzymology VIII，(1966)，115-118)的方法确定总磷酸含量。

[0269] 用30μl硝酸镁乙醇溶液处理大约50mg淀粉，在回热炉中500℃焚烧混合物3小时。用300μl 0.5M HCl处理残留物，在60℃温育30分钟。然后，用0.5M HCl将等分试样补至300μl，加入至100μl 10％浓抗坏血酸与600μl于2M硫酸中的0.42％钼酸铵的混合物中，在45℃温育20分钟。

[0270] 3.稻植物的转化

[0271] 按照由Hiei等人(1994，Plant Journal 6(2)，271-282)描述的方法转化稻植物。

[0272] 4.小麦植物的转化

[0273] 按照由Becker等人(1994，Plant Journal 5，299-307)描述的方法转化小麦植物。

[0274] 5.玉米植物的转化

[0275] 按照由Ishida等人(1996，Nature Biotechnology 14，745-750)描述的方法转化品系A188的玉米植物的未成熟胚。

[0276] 6.稻粒的加工和稻面粉的生产

[0277] 为了产生足够量的研究材料，将稻植物栽培在温室中，在达到完全成熟后收获稻。为了进一步干燥，将成熟稻粒在37℃贮存3至7天。

[0278] 然后，通过脱壳机(Laboratory Paddy sheller，Grainman，Miami，Florida，USA)将谷粒与谷壳分离，通过抛光1分钟(Pearlest Rice Polisher，Kett，Villa Park，CA，USA)对获得的糙米进行加工，从而产生精白米。关于研究稻粒组成和淀粉性质，通过实验室碾磨机(Cyclotec，Sample mill，Foss，Denmark)研磨精白米，从而产生“稻面粉”。

[0279] 7.从稻面粉提取稻淀粉

[0280] 按照Wang和Wang(2004；Journal of Cereal Science 39：291-296)中描述的方法从稻面粉提取稻淀粉。

[0281] 将大约10g稻面粉与40ml 0.05％(w/v)NaOH一起在振荡器上室温温育16至18小时。然后，为了消化完全，将悬浮液转移至快速搅拌机，以低速充分混合15秒，然后以高速混合45秒。为分离较大的组分(例如细胞壁)，使悬浮液连续通过具有125μm和63μm的筛格宽度的筛子。在以1500rpm离心15分钟(Microfuge 3.OR；Heraeus)后，倒出上清液，使用刮刀将覆于沉淀物表面的蛋白质层除去。将所得的沉淀物再次重悬浮于0.05％(w/v)NaOH，重复上述过程。然后，将沉淀物重悬浮于水，使用HCl将悬浮液的pH调整至6.5至7。用水清洗获得的稻淀粉，总共3次，每个清洗步骤包括沉淀(以1500rpm离心，15分钟，RT)，弃去上清液，然后将沉淀重悬浮于新鲜水中。在最后的清洗步骤前，再次检查pH，任选地使用HCl将其调整至pH7。将最后的清洗步骤的沉淀重悬浮于丙酮，沉淀，弃去上清液。再次将沉淀重悬浮于丙酮，之后将悬浮液倒入培养皿，室温在通风橱中干燥至少18小时。

[0282] 在最后的步骤中，通过在研钵中研磨将所得的稻淀粉转变成细粉，该细粉可直接用于进一步的研究。

[0283] 8.通过Northern印迹法分析蛋白质的表达水平

[0284] 通过Northern印迹分析研究编码蛋白质的核酸的表达。为此，对于每一株通过转化独立获得的植物，收获3粒未成熟稻粒(开花后大约15天)，将其于液氮中冷冻。关于匀浆，在Retsch碾磨机(model MM300)中使用4.5mm钢球以30hertz的频率粉碎96孔微量滴定板中的冷冻稻粒30秒。然后，通过Promega RNA提取试剂盒，按照厂商说明书(SV96Total RNA Isolation System，order no.Z3505，Promega，Mannheim)分离RNA。通过在
260nm处光度计测定吸收，确定单个样品的RNA浓度。

[0285] 每一个样品2μg RNA，配至相同体积，然后用相同体积的RNA样品缓冲液(65％(v/v)甲酰胺、8％甲醛、13％(v/v)凝胶缓冲液(参见上面)、50μg/ml溴化乙锭)处理。加热(10分钟，65℃)并在冰上立即冷却后，使用RNA洗脱缓冲液(20mM MOPS pH8.0，5mM醋酸钠、1mM EDTA)以50-80mA的恒定电流强度在1.2％(w/v)琼脂糖凝胶(20mM MOPS pH8.0，5mM醋酸钠，1mM EDTA，6％(v/v)甲醛)上分离RNA，大约2小时。然后，使用10×SSC(1.5M NaCl，150mM柠檬酸钠pH7.0)通过扩散印迹将RNA转移至Hybond-N膜，通过UV照射将其固定在膜上。

[0286] 为了进行Northern印迹杂交以检测编码具有淀粉合酶II活性的蛋白质的核酸分子的表达，使用质粒AH32-191的大约1kb Spel/BspHI片段(bp4568-5686)，所述片段包含编码来自小麦的具有淀粉合酶II活性的蛋白质的cDNA的5’区。利用Roche的随机引发DNA标记试剂盒(order no.1004760)，按照厂商的说明书，使用32P-α-dCTP进行DNA片段的放射性标记。在轻柔振荡下，在包含杂交缓冲液(250mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mMEDTA、6％(w/v)SDS、1％(w/v)BSA)的水浴中60℃温育包含转移的RNA的尼龙膜4小时，之后将放射性标记的DNA加入杂交缓冲液。在温育16小时后，除去杂交缓冲液，在轻柔振荡下在水浴中60℃相继地用3×SSC清洗膜1次，用2×SSC(参见上面)清洗1次，以除去非特异性结合的DNA分子。

[0287] 为了检测标记的RNA，在-70℃在X光片上进行1至3天尼龙膜的放射自显影。

[0288] 9.利用活性胶(酶谱)确定具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性

[0289] 通过活性胶(酶谱)检测未成熟稻粒中具有淀粉合酶活性的蛋白质的活性，其中在非变性条件下在聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白质提取物，然后与合适的底物一起温育。使用Lugol氏溶液染色凝胶中所得的反应产物(α-葡聚糖)。

[0290] 将单个未成熟稻粒(开花后大约15天)在液氮中冷冻，在150-200μl冷提取缓冲液(50mM tris/HCl pH7.6、2.5mM EDTA、2mM DTT、4mMPMSF、0.1％(w/v)糖原、10％(v/v)甘油)中匀浆。在离心(15分钟，13,000g，4℃)后，将清澈的上清液转移至新反应容器，使用提取物的等分试样，按照Bradford(1976，Anal Biochem 72：248-254)确定蛋白质含量。

[0291] 通过连续7.5％聚丙烯酰胺凝胶(7.5％丙烯酰胺∶双丙烯酰胺37.5∶1；25mM tris/HCl pH7.6、192mM甘氨酸、0.1％(w/v)APS、0.05％(v/v)TEMED)，使用单个浓洗脱缓冲液(25mM tris/HCl，192mM甘氨酸)，分离蛋白质提取物。对于每一个样品，使用相应于15μg蛋白质的量，在4℃电泳2至2.5个小时。然后，在持续振荡的情况下，在15ml温育缓冲液(0.5mM柠檬酸钠pH7.0、25mM醋酸钾、2mM EDTA、2mM DTT、0.1％(w/v)支链淀粉、50mM tricine/NaOH pH8.5、1mM ADP-葡萄糖)中室温温育凝胶过夜。使用Lugol氏溶液对形成的淀粉进行染色。

[0292] 为了确定与相应的未进行遗传修饰的野生型植物相比具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的倍数，在每一情况下连续稀释遗传修饰品系的蛋白质提取物，然后按照上述方法进行电泳分离。如上面已描述的进行其他步骤。在用Lugol氏溶液对酶谱进行染色后，就遗传修饰性植物的蛋白质提取物的各种稀释物与所涉及的未稀释的野生型蛋白质提取物，目视比较由具有淀粉合酶II活性的蛋白质产生的染色产物的强度(图1中以箭头指示)。因为产物的染色强度与具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性直接相关，因此具有相同强度的产物的条带具有相同的活性。如果稀释的蛋白质提取物中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的产物条带与相应的未稀释的来自所述野生型植物的蛋白质提取物的产物条带具有相同强度，那么稀释倍数相应于所述遗传修饰性植物中活性增加的程度(关于该比较，见图1)。

[0293] 10.通过稻胚产生植物(胚胎拯救)

[0294] 从圆锥花序分离种子，除去谷壳。使用解剖刀将胚乳与胚分开和用于合适的分析。为了提高可湿性，用70％乙醇短暂地处理胚，然后在包含10％NaOCl和一滴可商购获得的用于消毒的去垢剂的溶液中温育20分钟。

[0295] 然后，尽可能完全地除去消毒溶液，用无菌脱矿质水清洗胚1次1分钟，然后清洗2次，每次10分钟。将种子放置在培养皿中使用琼脂固化的培养基上，所述培养基包含四分之一盐浓度的MS培养基(Murashige-Skoog培养基)和4％蔗糖。然后，用石蜡膜密封培养皿，在黑暗处在23℃温育。在萌发后(放置胚后大约5-7天)，将培养皿转移至光下。当幼苗的下胚轴已达到大约2cm的长度时，将植物转移至包含使用含有2％蔗糖的琼脂固化的MS培养基的玻璃盆。在根充分形成后，可将植物盆载于土壤中。

[0296] 11.玉米籽粒的加工

[0297] 为了产生足够的材料，在温室条件下栽培玉米植物。收获完全成熟的玉米穗，在37℃贮存3-7天以进一步干燥，之后从穗上取下籽粒。

[0298] 12.玉米淀粉的提取

[0299] 按照由“Corn Refiners Association”(http://www.corn.org)描述的湿磨法提取玉米淀粉。在50℃将10-50g玉米籽粒在过量的亚硫酸中温育3天以除去蛋白质基质。用水清洗籽粒并短暂干燥后。在配备有具有2mm网格宽度的筛子的超速离心-碾磨机(retsch，Germany，ZM100)中研磨籽粒。将磨碎的材料转移至玻璃烧杯，在20％NaCl溶液中温育至少30分钟，从而导致淀粉颗粒的沉降和上相中飘浮的脂质小体。滗析包含胚的上相，再次将沉淀物悬浮于剩下的溶液中。接着通过多个筛分步骤进一步纯化淀粉颗粒。使用500μm筛子(DIN 4188)，然后200μm筛子(DIN 4188)和125μm筛子(ISO 3310-1)，其中通过使用喷雾器用20％NaCl(2-3l)洗筛子直至筛子下的液滴不再包含淀粉颗粒。将收获的淀粉在室温沉降过夜，以在沉降的淀粉上方保留大约5mm的上清液的方式滗析上清液。之后，将淀粉转移至离心管，在Heraeus Variofuge中以3500rpm再次沉降10分钟。离心后，使用刮刀除去沉淀物顶上的淀粉-蛋白质层(通常通过具有不同的颜色而被识别)并且弃去。使用0.2M醋酸钠，pH4.6再悬浮获得的淀粉几次，离心(5分钟，其余参数参见上面)，每一次如上所述除去沉淀物顶上的淀粉-蛋白质层。接着在持续旋转下，在包含0.2M醋酸钠，pH4.6、1％菠萝蛋白酶和1％ pesin的溶液中消化获得的淀粉1小时，然后离心(3000rpm，其他参数参见上面)。如上所述再次除去沉淀物顶部的淀粉-蛋白质层，将获得的沉淀物悬浮于水中，再次离心，之后如上所述除去沉淀物顶部的蛋白质层。重复该洗涤步骤总共5次，之后将获得的淀粉悬浮于80％乙醇中并离心(3000rpm，其他参数参见上面)。重复该步骤4次。最后在丙酮中清洗获得的淀粉一次，以除去脂质。之后室温干燥淀粉。

[0300] 13.玉米植物的栽培

[0301] 植物材料 玉米，品种A188

[0302] 温室中的栽培条件：

[0303] 土壤：80％白泥炭(white peat)

[0304] 20％褐泥炭

[0305] 100kg/m3玻璃砂

[0306] 40kg/m3粘土

[0307] 结构：细

[0308] pH5.3-6.1

[0309] 基 肥：2kg/m3 12-12-17(+2) 和 100g/m3 Radigen(TheraforGmbH，Isrlohn，Germany)

[0310] 花盆：10升的容器

[0311] 密度：最大6株植物/m2

[0312] 施肥：在4叶期，1TAB Plantosan 4g(20-10-15+6)

[0313] 在另外的3周后，1TAB Plantosan(参见上面)

[0314] 温度：日22℃至25℃/夜16℃

[0315] 光照：18小时，350-400μEinstein/s/m

[0316] 湿度：50％相对湿度

[0317] 实施例

[0318] 1.包含具有淀粉合酶II活性的蛋白质的编码序列的植物表达载体AH32-191的制备

[0319] 通过限制性核酸内切酶Ecl136ll和Xho I从质粒pCF31(在WO 9745545中描述，称为pTaSS1)切出来自小麦的具有淀粉合酶II活性的蛋白质(T.a.-SSII)的全长编码序列，然后将其克隆入使用限制性核酸内切酶EcoRV和Xho I切割的质粒IR103-123(WO 05030941中描述)。获得的表达载体称为AH32-191。植物表达载体IR103-123用于在来自稻的球蛋白启动子控制下胚乳特异性地表达该靶基因。植物表达载体IR103-123还包含在CaMV35S启动子控制下的bar基因，所述bar基因用作植物转化的选择标记。

[0320] 2.其中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的稻植物的产生

[0321] 使用Hiei等人(1994，Plant Journal 6(2)，271-282)中描述的方法，通过包含质粒AH32-191的农杆菌转化稻植物(品种M202)。将获得的植物命名为oe-SSII-O.s.-X，其中X表示从转化产生的独立植物。

[0322] 3.其中具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的稻植物的产生

[0323] 使用Hiei等人(1994，Plant Journal 6(2)，271-282)中描述的方法，通过包含质粒pML82(WO 05 095619中描述)的农杆菌转化稻植物(品种M202)。将获得的植物命名为oe-GWD-O.s.-X，其中X表示从转化产生的独立植物。

[0324] 4.分析使用表达载体AH32-191转化的稻植物

[0325] 将使用表达载体AH32-191从转化产生的、称作oe-SSII-O.s.-X的稻植物品系(T0植物)栽培在温室的土壤中。从具有名称oe-SSII-O.s.-X的不同品系的未成熟谷粒(T1种子)分离RNA，按照一般方法第8项下描述的方法进行Northern印迹分析。可以鉴定到多个如下品系，所述品系与相应的未进行遗传修饰的野生型植物相比，来自小麦的具有淀粉合酶II活性的蛋白质的表达增加(参见图2中的示例性表示)。

[0326] 通过酶谱(参见图1和2中示例性表示)也在多个oe-SSII-O.s.-X品系的未成熟T1种子中检测到具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加。按照一般方法第9项下描述的方法进行酶谱分析。

[0327] 5.分析使用表达载体pML82转化的稻植物

[0328] 将使用表达载体pML82从转化产生的、具有名称oe-GWD-O.s.-X的稻植物品系(T0植物)栽培在温室的土壤中。从具有名称oe-GWD-O.s.-X的不同品系的单个成熟谷粒(T1种子)产生面粉。为此，将单个谷粒细细地磨成粉，随后在球磨机(Retsch，model MM300)中以30hertz的频率粉碎研磨后的材料30秒。然后，按照一般方法第2项下描述的方法，确定面粉的葡萄糖分子C6位置中淀粉磷酸的含量。

[0329] 对于选择的植物获得下列结果：

[0330]每mg鲜重种子的C6磷
植物名称
酸nmol数
oe-GWD-O.s.-2 1.68
oe-GWD-O.s.-4 1.70
oe-GWD-O.s.-9 1.47
WT 0.30

[0331] 表1：与从未进行遗传修饰的相应野生型植物(WT)品种M202的种子产生的面粉相比，在从称作oe-GWD-O.s.-X的不同品系的单个T1种子产生的面粉中，葡萄糖分子C6位键合的磷酸的含量。

[0332] 从表1显见，可以使用表达载体pML82鉴定从转化产生的如下独立品系，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物相比，所述品系在面粉中具有增加的键合在葡萄糖分子C6位的磷酸含量。因为已知增加地表达具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的植物细胞，与相应的未进行遗传修饰的野生型植物相比，合成具有更高的淀粉磷酸含量的淀粉(参见，例如，WO 0234923)，因此在称为oe-GWD-O.s.-X的品系中磷酸含量的增加归因于具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加。.

[0333] 6.其中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加且具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的植物的产生

[0334] 再次将具有名称oe-SSII-O.s.-X的不同品系的植物或品系oe-GWD-O.s.-X的植物的各30粒T1种子栽培在温室中，用包含0.5％ (Bayer CropScience)的溶液喷洒所述植物。在已处理的品系oe-SSII-O.s.-19、oe-GWD-O.s.-2、oe-GWD-O.s.-4和oe-GWD-O.s.-9的植物中，大约四分之一对 处理反应敏感，由此可以得出：它们不包含介导对 的抗性的bar基因，并且表达载体的T-DNA整合在基因组中的一个位点上或者整合在基因组中的紧靠在一起以至不发生分离的多个位点上。将抗 处理的这些品系的T1植物的T2种子再次播种在温室中，如刚才所述使用 处理。然后，对这些品系的T3植物进行相同 处理：在此可以鉴定到品系oe-GWD-O.s.-19、oe-GWD-O.s.-2、oe-GWD-O.s.-4和oe-GWD-O.s.-9的多个T3植物，其中所有植物均具有抗 抗性。由此可以得出：所述T3种子所来源自的T2植物对于整合的T-DNA而言是纯合的。再次播种品系oe-SSII-O.s.-19、oe-GWD-O.s.-2、oe-GWD-O.s.-4和oe-GWD-O.s.-9的纯合植物的T2种子，并在每一情况下均用品系oe-GWD-O.s.-2、oe-GWD-O.s.-4和oe-GWD-O.s.-9的花粉给品系oe-SSII-O.s.-19的不同植物授粉。由此获得的杂交后代命名为oe-SSII/GWD-O.s.-1(oe-SSII-O.s.-19 X oe-GWD-O.s.-2)、oe-SSII/GWD-O.s.-2(oe-SSII-O.s.-19 X oe-GWD-O.s.-4)和oe-SSII/GWD-O.s.-3(oe-SSII-O.s.-19 X oe-GWD-O.s.-9)。

[0335] 7.分析其中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加且具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的植物

[0336] 自通过杂交产生的品系oe-SSII/GWD-O.s.-1、oe-SSII/GWD-O.s.-2、oe-SSII/GWD-O.s.-3和纯 合亲 本植物(oe-SSII-O.s.-19、oe-GWD-O.s.-2、oe-GWD-O.s.-4 和oe-GWD-O.s.-9)，各收获单个F1种子，分离胚并且将其在室温贮存。使用一般方法第6项描述的方法，就葡萄糖分子C6位结合的磷酸含量，调查从相应的单个F1种子的剩余胚乳获得的面粉。获得下列结果。

[0337]

[0338]

[0339] 表2：与从相应的未进行遗传修饰的野生型植物品种M202(WT)的单个种子产生的面粉相比，从具有名称oe-SSII/GWD-O.s.-X的品系的单个F1种子产生的面粉中葡萄糖分子C6位置键合的磷酸含量。此外，还显示了从亲本品系的单个纯合种子产生的面粉中葡萄糖分子C6位置键合的磷酸含量。

[0340] 通过一般方法第10项下描述的方法使品系oe-SSII/GWD-O.s.-X(其面粉中键合在葡萄糖分子C6位置中的磷酸含量为每mg淀粉至少6.0nmol的C6磷酸)的种子的胚萌发，然后在温室中栽培以产生F2种子。为了鉴定对于两个整合的T-DNA(介导具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加或介导具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加)而言均是纯合的后代，对F2种子重复刚才针对F1种子所描述的操作过程。然后，对于其面粉中键合在葡萄糖分子C6位置中的磷酸含量为每mg鲜重的种子至少6.0nmol的C6磷酸的种子，再次使其胚萌发，然后栽培在温室中以产生F3种子。对于各来源于F2植物的单个F3种子获得下列结果：

[0341]

[0342]

[0343] 表3：与从相应的未进行遗传修饰的野生型植物品种M202(WT)的单个种子产生的面粉相比，从具有名称oe-SSII/GWD-O.s.-X的品系(其通过亲本品系oe-SSII-O.s.-19(母本)与品系oe-GWD-O.s.-X(父本)植物杂交而产生)的单个F3种子产生的面粉中葡萄糖分子C6位置中键合的磷酸含量。同时显示了从相应亲本品系的单个纯合种子产生的面粉中葡萄糖分子C6位置中键合的磷酸含量。

[0344] 在每一种情况下，在从来自所述品系的F2植物的各单个F3种子产生的面粉中，键合在葡萄糖分子C6位的磷酸含量几乎相同，这说明就两个整合的T-DNA而言所述F2植物是纯合的。按照一般方法第6项下描述的方法加工品系oe-SSII/GWD-O.s.-1、oe-SSII/GWD-O.s.-2、oe-SSII/GWD-O.s.-3的F2植物的F3种子以产生面粉，其中所述F2植物对于两个整合的T-DNA(介导具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加或介导具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加)而言是纯合的。按照一般方法第7项下描述的方法从该面粉的一部分分离淀粉。然后，在面粉和淀粉中确定葡萄糖分子C6位置中键合的磷酸含量。获得下列结果：

[0345]每mg淀粉的C6 每mg淀粉的C6磷
植物名称
磷酸nmol数 酸nmol数
oe-SSII/GWD-O.s.-1 12.9 11.5
oe-SSII/GWD-O.s.-2 13.4 12.6
oe-SSII/GWD-O.s.-3 13.0 12.4
oe-SSII-O.s.-19(母本) 1.5 1.2

[0346]oe-GWD-O.s.-2(父本1) 3.9 3.3
oe-GWD-O.s.-4(父本2) 3.9 3.5
oe-GWD-O.s.-9(父本3) 3.9 3.5
WT 1.1 0.4

[0347] 表4：与从亲本品系oe-SSII-O.s.-19(母本)和oe-GWD-O.s.-X(父本)或野生型植物品种M202(WT)的种子产生的面粉或淀粉相比，从通过杂交产生的具有名称oe-SSII/GWD-O.s.-X的品系的纯合植物的种子产生的面粉或淀粉中，葡萄糖分子C6位置中键合的磷酸含量。

[0348] 按照一般方法第1项下描述的方法，测定面粉或淀粉的热水溶胀性，其中所述面粉或淀粉产生自品系oe-SSII/GWD-O.s.-X的纯合植物(就T-DNA整合而言)的F3种子、以及品系oe-SSII-O.s.-19和oe-GWD-O.s.-X和野生型植物。对于品系oe-SSII/GWD-O.s.-X，与一般方法第1项下描述的方法不同，此处使用2倍的基于面粉或淀粉量的水量，因为当对这些品系使用在一般方法第1项下所述的水量时，无法分辨出溶胀物质与水性上清液的分离。获得下列结果：

[0349]面粉的溶胀性 面粉的溶胀性[g/g]
植物名称
[g/g]
oe-SSIIGWD-O.s.-1 42.8 95.2
oe-SSIIGWD-O.s.-2 41.1 128.3
oe-SSIIGWD-O.s.-3 34.1 91.4
oe-SSII-O.s.-19(母本) 22.6 36.2
oe-GWD-O.s.-2(父本1) 20.1 30.8
oe-GWD-O.s.-4(父本2) 20.0 36.5
oe-GWD-O.s.-9(父本3) 17.4 34.0
WT 16.3 27.7

[0350] 表5：与从亲本品系oe-SSII-O.s.-19(母本)和oe-GWD-O.s.-X(父本)或野生型植物品种M202(WT)的种子产生的面粉或淀粉相比，从通过杂交产生的具有名称oe-SSII/GWD-O.s.-X的品系的纯合植物的种子产生的面粉或淀粉的热水溶胀性。

[0351] 8.制备包含具有淀粉合酶II活性的蛋白质的编码序列的植物表达载体pJH77[0352] 亚克隆来自小麦的具有淀粉合酶II活性的蛋白质(T.a.-SSII)的全长编码序列。获得的质粒命名为pJH77(参见图4)，其包含下列功能元件：

[0353] 表6：质粒pJH77的遗传元件。

[0354]Nt位置 方向 来源
6600-6623 RB：来自根瘤农杆菌的右边界
T-DNA(Zambryski，1988)
6624-6909 位于右边界侧翼的pTiAch5的剩余
TL-DNA(Gielen等人，1984)
6910-7285 逆时针方 3′nos：包含来自质粒pTiT37的T-DNA的胭脂碱
向 合酶基因3’非翻译区的序列(Depicker等人，
1982)
7286-9685 逆时针方 ss2aTa：来自普通小麦的具有淀粉合酶II活性的
向 小麦蛋白质(T.a.-SSII)的编码序列(SEQ ID
No.5)
9686-10437 逆时针方 intron1 ubi1 Zm：来自玉米的遍在蛋白-1基因
向 (ubi1)的第一个内含子(Christensen等人，1992)。
10438-11478 逆时针方 PglobulinOs：包含来自稻的球蛋白-1基因的启动
向 子区域的序列(Hwang等人(2002))
11479-13261 顺时针方 Pact1Os：包含来自稻的肌动蛋白1基因的启动
向 子区域的序列(Mc Elroy等人，1990)。
13262-13739 顺时针方 intron1 act1 Os：来自稻的肌动蛋白-1基因的第
向 一个内含子(Mc Elroy等人，1990)。
13740-14291 顺时针方 bar：来自吸水链霉菌(Streptomyces
向 hygroscopicus)的膦丝菌素乙酰转移酶基因的编
码序列(Thompson等人(1987))。

[0355]14292-14561 顺时针方 3′nos：包含来自质粒pTiT37的T-DNA的胭脂碱
向 合酶基因的3’非翻译区的序列(Depicker等人，
1982)
14562-296 位于左边界侧翼的pTiAch5的剩余
TL-DNA(Gielen等人，1984)(Gielen等人，1984)
297-320 LB：来自根瘤农杆菌的左边界
T-DNA(Zambryski，1988)

[0356] 表7：表6中引用的参考文献。

[0357]Christensen A.H.，Sharrock R.A.，Quail P.H.(1992).玉米多聚遍在
蛋白基因：结构、表达的热干扰和转录物剪接、及电穿孔转移至原生
体后的启动子活性(Maize polyubiquitin genes：structure，thermal
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activity following transfer to protoplasts by electroporation).Plant
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Lemmers M.；Van Montagu M.；Schell J.(1984).分离有效用于稻转
化的肌动蛋白启动子(Isolation of an efficient actin promoter for use
in rice transformation).The EMBO journal，3，835-846
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[0358]Leroux B.，Pelissier B.，Lebrun M.(1996).嵌合除草剂抗性基因
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的肌动蛋白启动子(Isolation of an efficient actin promoter for use in
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抗性基因bar(Characterization of the herbicide resistance gene bar
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基本方法(Basic processes underlying Agrobacterium-mediated DNA
transfer to plant cells).Annual Review of Genetics，22，1-30.

[0359] 9.产生和鉴定其中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的玉米植物

[0360] 按照一般方法第5项下描述的方法，用质粒pJH77转化玉米植物(品种A188)。获得的植物命名为JH77-X，其中X表示从转化产生的独立植物。将来源于使用质粒JH77进行的转化的植物(T0植物)栽培在温室中，使用来自野生型植物(品种A188)的花粉对其进行授粉。

[0361] 从质粒pJH77转化及用野生型异花授粉后获得的独立植物以及未转化的野生型植物(A188)的单个未成熟(授粉后大约15天)籽粒(T1籽粒)提取蛋白质。按照一般方法第9项下描述的方法，在酶谱中分析不同植物的相应蛋白质提取物。为了定量具有SS II活性的蛋白质的活性增加，连续稀释来自转基因品系的蛋白质提取物。图5示例了该分析的结果。与野生型植物(A188)相比，几株植物显示具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加3至5倍。

[0362] 10.制备包含编码具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的编码序列的植物表达载体pHN3

[0363] 从pRPA-BL150-Aα2(EP0337899)衍生载体pHN3(图7)。载体主链包含下列遗传元件：

[0364] 表8：质粒pHN3的遗传元件。

[0365]Nt位置 方向 来源
RB：来自根瘤农杆菌的T-DNA的右边界重复
6600-6623
(Zambryski，1988)
6624-6909 pTiAch5的TL-DNA(Gielen等人，1984)
attB2：大肠杆菌的识别序列attB的变体
6910-6934
(Hartley等人，2000)
逆时针 3’nos：包含来自pTiT37的T-DNA的胭脂碱
6935-7254 合酶基因3’非翻译区的序列(Depicker等人，
方向
1982)
逆时针 r1St：马铃薯r1基因的编码序列(Lorberth等
7255-11984
方向 人，1998)
逆时针 ubi1Zm(intron)：玉米遍在蛋白-1基因的第一
11985-12504
方向 个内含子(Christensen等人，1992)
逆时针 PubiZm：如Christensen等人，1992所述的、包
12505-13537 含玉米遍在蛋白-1基因的启动子区域的序列
方向
attB1：大肠杆菌(Escherichia coli)的识别序
13538-13562
列attB的变体(Hartley等人，2000)
顺时针 Pact1Os：包含稻的肌动蛋白1基因的启动子
13563-15337
方向 区域的序列(McElroy等人，1990)
顺时针 act1Os(intron)：包含稻的肌动蛋白1基因的
15338-15815
方向 内含子的序列(McElroy等人，1990)

[0366]顺时针 bar：如Thompson等人(1987)所述来自吸水
15816-16367 方向 链霉菌的膦丝菌素乙酰转移酶基因的编码序
列。
顺时针 3’nos：包含来自pTiT37的T-DNA的胭脂
16368-16638 方向 碱合酶基因3’非翻译区的序列(Depicker等人，
1982)
16639-296 pTiAch5的TL-DNA(Gielen等人，1984)
LB：来自根瘤农杆菌的T-DNA的左边界重复
297-320
(Zambryski，1988)

[0367] 表9：表8中引用的参考文献。

[0368]Bolivar，F.，Rodriguez，R.L.，Greene，P.J.，Betlach，M.C.，Heyneker，
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[0369]Gielen，J.，De Beuckeleer，M.，Seurinck，J.，Deboeck，F.，De Greve，H.，
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[0370]Zambryski P.(1988).用于农杆菌介导的向植物细胞的DNA转移的基本
方法.Ann.Rev.Genet.22：1-30.

[0371] 11.产生和鉴定其中具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的玉米植物[0372] 按照一般方法第5项下描述的方法，用质粒pHN3转化玉米植物(品种A188)。获得的植物命名为HN3-X，其中X表示自转化产生的独立植物。

[0373] 将通过使用质粒pHN3转化产生的植物(T0植物)栽培在温室中，使用来自野生型植物(品种A188)的花粉对其进行授粉。将所得的T1代植物栽培在温室中，在三叶期用包含0.5％ 的溶液喷洒。只对如下T1植物组进行进一步研究，在所述每一个T1植物组中，栽种的30株植物中有大约25％在 溶液喷洒后死亡，在这些植物中质粒pHN3的相关T-DNA整合于基因组的单个基因座中。从喷洒 溶液后存活的大约75％植物
的叶材料分离基因组DNA，并且分别地通过 技术(Pielberg等人2003，Genome
Res.；13，2171-2177)研究在每一例中存在的拷贝数目。对于在 技术分析中显示出与相同T0植物的其余后代相比具有大约2倍强的信号的T0植物后代组，其中的T1植物就质粒T-DNA所整合的基因座而言是纯合的。如果在 溶液处理后存活的T0植物
后代中有大约30％在Invader技术分析中显示出与相同T0植物的其余大约70％的后代相比具有大约2倍强度的信号，那么这进一步表明T-DNA的整合发生在单个基因座上。

[0374] 按照一般方法第2a)项下描述的方法，在淀粉中确定淀粉磷酸含量，所述淀粉从收获自如紧前面所描述的选择的植物的籽粒中分离。从品系HN3-101分离的淀粉具有每mg淀粉4.6nmol的C6位置淀粉磷酸含量。

[0375] 12.产生和鉴定其中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加且具有葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的玉米植物

[0376] 几个独立的品系(JH77-X)(在所述品系中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性显示出不同程度的增加)用于与来自品系HN3-101的植物杂交，品系HN3-101就质粒pHN3的T-DNA的整合而言是纯合的。将命名为HN3-101的植物用作花粉供体(雄性杂交伴侣)，品系JH77-X的植物用作雌性杂交伴侣。将来源于这些杂交的F1植物栽培在温室中，从叶子提取DNA。可以利用PCR选择确实携带了两个转基因的多个F1植物。将来自这些植物之每一个的多株F2植物栽培在温室中，从叶材料分离基因组DNA，就每一例利用 技术(Pielberg等人2003，Genome Res.；13，2171-2177)分析两种转基因所存在的拷贝数。
对于在 技术分析中显示出与相同F1植物的其余后代相比具有大约2倍强度的
信号的F1植物后代组，可以看出其中的F2植物就两种质粒的T-DNA的相应整合座位而言是纯合的。

[0377] 下表显示如刚才所述选择的植物的来源：

[0378]雄性杂交伴侣 雌性杂交伴侣 选择的F2植物的名
称
HN3-101 JH77-01903 Cross-13
HN3-101 JH77-02101 Cross-49

[0379] 表10：在品系HN3-101和JH77-X的植物杂交后获得的植物的来源。

[0380] 13.分析来自其中具有淀粉合酶II活性和具有α-葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的植物的淀粉

[0381] 收获命名为Cross-13和Cross-49的植物的成熟穗，如一般方法第11项下所描述的进一步对其进行干燥。如在一般方法第12项下所描述的，从谷粒提取淀粉。按照一般方法第2a)项下所描述的方法，分析这些淀粉中的淀粉磷酸含量，并如一般方法第1项下所描述的，分析热水溶胀性。获得下列结果：

[0382]每mg淀粉的C6 淀粉的溶胀性[g/g]
植物名称
磷酸nmol数
A188-105 0.34 28.2
A188-114 0.13 30.8
JH77-01903 0.16 22.0
JH77-02101 0.16 22.2
HN3-101 4.70 42.3
Cross-13 6.49 48.6
Cross-49 5.97 47.4

[0383] 表11：与野生型植物(A188-105，A188-114)相比，从其中具有淀粉合酶II活性的蛋白质的活性增加的植物(JH77-01903，JH77-02101)、从其中具有α-葡聚糖-水二激酶活性的蛋白质的活性增加的植物(HN3-101)或从其中两种蛋白质的活性均增加的植物(Cross-13，Cross-49)分离的淀粉的淀粉磷酸含量和溶胀性。