本发明公开了一种烟草用高效抗病解磷菌肥及其生产方法，涉及一种菌肥，同时还涉及该菌肥的生产方法。一种烟草用高效抗病解磷菌肥包括吸附剂和菌悬液，菌悬液中含有绿针假单胞菌(Pseudomonascholoraphis)XQ902，所述的吸附剂为草炭、活性碳、蛭石或它们中的混合物。高效抗病解磷菌肥中，每400-600g吸附剂中加入100ml菌悬液。烟草用高效抗病解磷菌肥的生产方法，按以下步骤进行：[1]菌悬液的制备；[2]吸附剂灭菌；[3]吸附剂接种和培养。本发明的菌肥可增加上等烟率，使烟叶的化学成分协调，杂气和刺激性减少。能促进烟草根系发育，可有效防治烟草病菌的侵染；能够提高土壤磷的利用率。
1.一种烟草用高效抗病解磷菌肥，包括吸附剂和菌悬液，其特征在于：菌悬液中含有绿针假单胞菌(Pseudomonas choloraphis)XQ902，即绿针假单胞菌XQ902 CGMCC No.2324。
2.根据权利要求1所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥，其特征在于：所述的吸附剂为草炭、活性碳、蛭石或它们中的混合物。
3.根据权利要求2所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥，其特征在于：所述的吸附剂为草炭，草炭的含水量为10-20％，粉碎至60-80目。
4.根据权利要求1所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥，其特征在于：所述的高效抗病解磷菌肥中，每400-600g吸附剂中加入100ml菌悬液。
5.根据权利要求1所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥，其特征在于所述的菌悬液的制备方法为：(1)选取菌种绿针假单胞菌XQ902 CGMCC No.2324；
(2)斜面菌种培养，培养方法：26-30℃培养2-3d；
(3)摇瓶种子培养，培养方法：500ml三角瓶装培养基100ml，121℃灭菌30-40min，冷却后接入1环斜面菌种，28-30℃振荡培养，摇床转速190-210rpm，培养时间26-30h；
(4)发酵，培养方法：400L发酵罐装培养基280L，121℃灭菌30-40min，冷却后接入28L种子培养液，28-30℃振荡培养，搅拌转速250-270rpm，通风比1∶(0.5-0.8)，培养时间
6.根据权利要求5所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥，其特 征在于：所述的步骤(2)斜面菌种培养的培养基是：葡萄糖6-15g、甘油80-120ml、酪蛋白3-8g、NaHCO3
0.5-1.5g、MgSO4·7H2O 0.5-1.5g、K2HPO4 2-3g、十二烷基硫酸钠(SDS)0.4-1g、蒸馏水
所述的步骤(3)摇瓶种子培养和步骤(4)发酵的培养基是：玉米水解液100-150ml，蔗糖10-40g，蚕蛹粉2-6g，卵磷脂0.1-0.5g，KH2PO4 1-5g，CaCO3 1-5g，MgSO4 0.1-0.5g，水
1000ml，另含有FeSO4.7H2O 3-10PPM，MnSO4.H2O 3-10PPM，复合维生素3-10PPM。
7.一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产方法，其特征在于所述的生产方法包括以下步骤： [1]菌悬液的制备
(1)选取菌种假单胞菌XQ902 CGMCC No.2324； (2)斜面菌种培养，培养方法：26-30℃培养2-3d；
(3)摇瓶种子培养，培养方法：500ml三角瓶装培养基100ml，121℃灭菌30-40min，冷却后接入1环斜面菌种，28-30℃振荡培养，摇床转速190-210rpm，培养时间26-30h； (4)发酵，培养方法：400L发酵罐装培养基280L，121℃灭菌30-40min，冷却后接入28L种子培养液，28-30℃振荡培养，搅拌转速250-270rpm，通风比1∶(0.5-0.8)，培养时间
吸附剂含水量10％～20％，粉碎至60～80目，1～1.5kg装/袋，布袋或塑料袋，
将吸附剂置于洁净塑料布上，每400-600g吸附剂拌入100ml菌悬液，搅拌均匀，使含水量达“手握成团、触之即散”程度，将已 接种菌悬液的吸附剂置于20～30℃培养2～7天，使细菌进一步繁殖，达到每克菌肥中活菌数不低于1亿，包装后即为高效抗病解磷菌肥产品。
8.根据权利要求7所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产方法，其特征在于： 所述的步骤(2)斜面菌种培养的培养基是：葡萄糖6-15g、甘油80-120ml、酪蛋白3-8g、NaHCO3 0.5-1.5g、MgSO4·7H2O 0.5-1.5g、K2HPO4 2-3g、十二烷基硫酸钠(SDS)0.4-1g、蒸馏水900-1200ml； 所述的步骤(3)摇瓶种子培养和步骤(4)发酵的培养基是：玉米水解液100-150ml，蔗糖10-40g，蚕蛹粉2-6g，卵磷脂0.1-0.5g，KH2PO4 1-5g，CaCO3 1-5g，MgSO4 0.1-0.5g，水
1000ml，另含有FeSO4.7H2O 3-10PPM，MnSO4.H2O 3-10PPM，复合维生素3-10PPM。
9.根据权利要求7所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产方法，其特征在于：所述的吸附剂为草炭、活性碳、蛭石或它们中的混合物。
10.根据权利要求9所述的一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产方法，其特征在于：所述的吸附剂为草炭。
一种烟草用高效抗病解磷菌肥及其生产方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种菌肥，同时还涉及该菌肥的生产方法，尤其涉及一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产方法。
背景技术
[0002] 微生物肥料能够减少和缓和农产品，尤其是蔬菜和水果中硝酸盐的污染，并且能改善作物的品质，目前在玉米、小麦和水稻等农作物及蔬菜生产中应用较多。 [0003] 土壤中栖息着大量的微生物，其中对植物生产影响较大的是那些生活在植物根际的微生物，这些根际微生物多而活跃，构成了根际特有的微生物区系，根际微生物区系又主要以细菌为主，根据其对植物的作用，根际细菌(rhizobacteria)分为有益(2％～5％)，有害(8％～15％)和中性(80％～90％)3类，能够促进植物生长、防治病害、增加作物产量的微生物被称为促生根际菌(plant growth-promotingrhizobacteria，简称PGPR)，PGPR对土壤中有害病原微生物与非寄生性根际有害微生物(deleterious rizosphere microorganisms，简称DRMO)都有生防作用，对植物吸收利用矿物质营养也有促进作用，并可以产生有益植物生长的代谢产物，从而促进植物的生长发育。
[0004] 在上世纪70-80年代，我国曾大规模推广应用根瘤菌肥。目前，国内外应用的PGPR的作用机理主要有固氮、解磷、解钾、抗生、产生植物激素和植物修复等。固氮菌包括共生固氮菌根瘤菌和自生固氮菌如固氮螺菌(Azospirillun)、固氮菌(Azotobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、肠杆菌(Enterobacter)和黄色杆菌(Xanthobacter)等。解 磷细菌，能够使土壤中无效态磷转化为有效态磷，如假单胞菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌(B.pumillus)等。解钾细菌，能够使土壤中矿物态钾转化为有效形态的细菌，目前发现的主要有扭脱芽胞杆菌(B.torquens)、胶质芽胞杆菌(B.mucilginos)、环状芽胞杆菌(B.circulans)等。抗生菌通过定殖于植物根系，优先占领根际，产生抗生素、铁载体、诱导植物的系统抗性、产生HCN等，拮抗根际的病原菌和DRMO来保护促进植物生长发育。植物激素产生菌，其产生的植物激素有生长素(IAA)、细胞分裂素和赤霉素，以及降低植物的乙烯水平。乙烯产生于植物根部，可加快植物对生物的或非生物的环境条件的变化的反应。高浓度的乙烯抑制植物根的生长，导致植物生产不正常。许多PGPR可分泌1-氨基环丙烷-1-羧酸盐(1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC)脱氨酶，ACC脱氨基酶可降解ACC生成-丁酸和氨，使得ACC不再被植物能够氧化ACC生产乙烯，从而降低植物苗期根部及其周围乙烯的含量，刺激植物生长，提高植物对盐分、高温、干旱、水涝、病害和土壤污染物等的抗性，提高产量。植物修复菌已报道的有放射农杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、Arthrobacter mysorens、黄杆菌(Flavobacterium)、固氮螺菌、假单胞菌、Stenotrophomas、肠杆菌、Crobacterium、Kluyvraascorbata等。
[0005] 我国推广的菌肥主要是融有益微生物、有机肥、无机肥的生物复肥，所用的菌种主要是解磷菌、解钾菌和固氮菌。现有微生物肥料的生产厂家仅400家左右，年产300万t，只占化肥产量的0.5％。如北京世纪阿姆斯生物技术有限公司研制开发成功的“阿姆斯”世纪生物肥料，已在全国近20个省市自治区的34种作物上试用，可使蔬菜增产13-21％，棉花增产28％。北京绿源生物技术研究所开发的生物肥，可使水稻小麦等增产10％-20％。武汉利泰技术有限公司及北京大学 也分别研究开发成功多功能生物肥，可使作物增产10％以上。湖北德隆生化有限公司提出利用一种多效有机生物肥料的生产方法。海南兰德工贸技术公司提出一种生物复混肥料的制造工艺，它含有耐氨菌剂、改造后的铵态氮肥和微量元素化合物。
[0006] 也分别研究开发成功多功能生物肥，可使作物增产10％以上。湖北德隆生化有限公司提出利用一种多效有机生物肥料的生产方法。海南兰德工贸技术公司提出一种生物复混肥料的制造工艺，它含有耐氨菌剂、改造后的铵态氮肥和微量元素化合物。 [0007] 菌肥在玉米、小麦和水稻等农作物及蔬菜生产中应用较多，在烟草生产中应用很少，即使有应用，也只是起到单纯的解磷作用。
[0008] 本发明的目的在于提供一种烟草用高效抗病解磷菌肥，既能防治烟草病害又能够解磷的作用。同时，本发明的目的还在于提供一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产方法。 [0009] 本发明的技术方案是：提供一种烟草用高效抗病解磷菌肥，包括吸附剂和菌悬液，菌悬液中含有绿针假单胞菌(Pseudomonascholoraphis)XQ902，即绿针假单胞菌CGMCC No.2324。
[0010] 所述的吸附剂为草炭、活性碳、蛭石或它们中的混合物。所述的吸附剂优选为草炭，草炭的含水量为10-20％，粉碎至60-80目。
[0011] 所述的高效抗病解磷菌肥中，每400-600g吸附剂中加入100ml菌悬液。 [0012] 所述的菌悬液的制备方法为：
[0013] (1)选取菌种绿针假单胞菌XQ902 CGMCC No.2324；
[0014] (2)斜面菌种培养，培养方法：26-30℃培养2-3d；
[0015] (3)摇瓶种子培养，培养方法：500ml三角瓶装培养基100ml，121℃灭菌30-40min，冷却后接入1环斜面菌种，28-30℃振荡培养，摇床转速190-210rpm，培养时间26-30h； [0016] (4)发酵，培养方法：400L发酵罐装培养基280L，121℃灭菌30-40min，冷却后接入28L种子培养液，28-30℃振荡培养，搅拌转速250-270rpm，通风比1∶(0.5-0.8)，培养时间
48-50h；所 得即为菌悬液。
[0017] 所述的步骤(2)斜面菌种培养的培养基是：葡萄糖6-15g、甘油80-120ml、酪蛋白3-8g、NaHCO3 0.5-1.5g、MgSO4·7H2O0.5-1.5g、K2HPO4 2-3g、十二烷基硫酸钠(SDS)0.4-1g、蒸馏水900-1200ml；
[0018] 所述的步骤(3)摇瓶种子培养和步骤(4)发酵的培养基是：玉米水解液100-150ml，蔗糖10-40g，蚕蛹粉2-6g，卵磷脂0.1-0.5g，KH2PO4 1-5g，CaCO3 1-5g，MgSO4 0.1-0.5g，水1000ml，另含有FeSO4.7H2O 3-10PPM，MnSO4.H2O 3-10PPM，复合维生素
3-10PPM。
[0019] 一种烟草用高效抗病解磷菌肥的生产方法，按以下步骤进行：
[0020] [1]菌悬液的制备
[0021] (1)选取菌种绿针假单胞菌XQ902 CGMCC No.2324；
[0022] (2)斜面菌种培养，培养方法：26-30℃培养2-3d；
[0023] (3)摇瓶种子培养，培养方法：500ml三角瓶装培养基100ml，121℃灭菌30-40min，冷却后接入1环斜面菌种，28-30℃振荡培养，摇床转速190-210rpm，培养时间26-30h； [0024] (4)发酵，培养方法：400L发酵罐装培养基280L，121℃灭菌30-40min，冷却后接入28L种子培养液，28-30℃振荡培养，搅拌转速250-270rpm，通风比1∶(0.5-0.8)，培养时间
48-50h；所得即为菌悬液。
[0025] [2]吸附剂灭菌
[0026] 吸附剂含水量10％～20％，粉碎至60～80目，1～1.5kg装/袋，布袋或塑料袋，0.1MPa高压灭菌2～3小时，取出冷却备用；
[0027] [3]吸附剂接种和培养
[0028] 将吸附剂置于洁净塑料布上，每400-600g吸附剂拌入100ml菌悬液，搅拌均匀，使含水量达“手握成团、触之即散”程度，将已 接种菌悬液的吸附剂置于20～30℃培养2～7天，使细菌进一步繁殖，达到每克菌肥中活菌数不低于1亿，包装后即为高效抗病解磷菌肥产品。
[0029] 所述的步骤(2)斜面菌种培养的培养基是：葡萄糖6-15g、甘油80-120ml、酪蛋白3-8g、NaHCO3 0.5-1.5g、MgSO4·7H2O 0.5-1.5g、K2HPO4 2-3g、十二烷基硫酸钠(SDS)0.4-1g、蒸馏水900-1200ml；
[0030] 所述的步骤(3)摇瓶种子培养和步骤(4)发酵的培养基是：玉米水解液100-150ml，蔗糖10-40g，蚕蛹粉2-6g，卵磷脂0.1-0.5g，KH2PO4 1-5g，CaCO3 1-5g，MgSO4 0.1-0.5g，水1000ml，另含有FeSO4.7H2O 3-10PPM，MnSO4.H2O 3-10PPM，复合维生素
3-10PPM。
[0031] 所述的吸附剂为草炭、活性碳、蛭石或它们中的混合物。所述的吸附剂优选为草炭，草炭的含水量为10-20％，粉碎至60-80目。
[0032] 本发明的菌肥应用于烟草可增加上等烟率，并可使烟叶的化学成分协调性好，杂气和刺激性减少。本发明的菌肥能够明显促进烟草根系发育、提高上等烟比例，并有改善烟草香吃味的作用。在拌种或育苗时使用本发明的菌肥，苗齐苗壮，可有效防治苗期烟草病菌的侵染；能够提高土壤磷的利用率，本发明的菌肥含有高效溶磷菌，可将土壤和有机肥中难溶性的磷(无效磷)分解成速效磷(有效磷)，容易被烟草吸收利用；可以增强植物抗病能力，抑制病菌和病毒的侵染，本发明的菌肥能够在植物根际迅速繁殖，形成根际微生物屏障，阻止病原菌和病毒的侵染，从而提高作物的抗病性，减少化学农药的使用量，降低成本，减少环境污染，生产出绿色烟叶；还可以促进作物生长，增加作物产量，本发明的菌肥能产生多种烟草生长促进物质，烟株生长健壮，烟草产量、产值和均价可分别提高15％-30％、20％-35％和5％-10％。本发明的菌肥既能防治烟草病害又能够解磷，具有很 好的社会价值和经济价值。
[0033] 菌种保藏信息
[0034] 本发明的菌种绿针假单胞菌(Pseudomonas choloraphis)XQ902保藏在北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。保藏日期是2008年01月07日。菌种的保藏号是绿针假单胞菌XQ902 CGMCC No.2324。
[0035] 下面描述本发明的抗病解磷菌菌种假单胞菌XQ902的筛选。
[0036] 1、初筛
[0037] (1)培养基葡萄糖5-10g、NaCl 0.2-0.5g、KCl 0.2-0.5g、MgSO4·7H2O 0.2-0.5g、(NH4)2 SO4 0.2-0.5g、FeSO4·7H2O0.02-0.05g、MnSO4·H2O 0.02-0.05g、Ca3(PO3)4 2.0-5.0g、蒸馏水1000ml、pH7.0～7.5。
[0038] (2)筛选方法
[0039] 采用平板稀释分离法，选出生长速度快、水解透明圈大的菌落，经划线分离纯化后，转解斜面保藏。
[0040] 2、拮抗实验
[0041] (1)培养基解磷菌培养基：葡萄糖5-10g、NaCl 0.2-0.5g、KCl 0.2-0.5g、MgSO4·7H2O 0.2-0.5g、(NH4)2SO4 0.2-0.5g、FeSO4·7H2O 0.02-0.05g、MnSO4·H2O0.02-0.05g、Ca3(PO3)4 2.0-5.0g、蒸馏水1000ml、pH7.0～7.5。
[0042] 原真菌用PDA培养基：马铃薯100-200g，葡萄糖10-20g，琼脂15-25g，蒸馏水1000ml。
[0043] 病原细菌用牛肉汁培养基：牛肉浸膏1.0-3.0g，蛋白胨2.0-5.0g，酵母膏1.0-3.0g，葡萄糖5.0-10.0g，琼脂15.0-25.0g，蒸馏水1000ml。
[0044] (2)实验方法 对峙平板法测定抑菌活性。分别将各种病原菌的菌苔或孢子用0.85％的灭菌生理盐水制成菌悬液，每个平板加入0.2ml，涂匀，30℃培养，24h后，用直径
1cm的滤纸片沾取摇瓶培养的解磷菌菌株，进行接种；或病原细菌和待测的解磷菌菌株同时接种。病原菌和待测菌株接种后，30℃培养48h，观察有无抑菌圈，并测量抑菌圈的直径。 [0045] 3、盆栽试验
[0046] 选在平板抑菌试验中对烟草病原菌有明显抗性的解磷菌对应于炭疽病、猝倒病、黑胫病、根黑腐病，病原细菌青枯病、野火病病原菌为指示病原菌，将待测菌的发酵液接种在盆栽烟株上或蘸根处理，然后接种病原菌，置于适于发病的条件下使其感病，根据是否感病或感病轻重而选出有效拮抗菌，并对植株感病情况进行分级，计算病情指数、防治效果、叶发病率及出苗率。根据解磷菌的抗病效果选择高效菌株，这里所述的高效菌株即为本发明的绿针假单胞菌XQ902，该菌的属名是绿针假单胞菌，其拉丁文学学名是Pseudomonascholoraphis。
[0047] 下面描述与本发明有关的其它技术问题。本发明的烟草高效抗病解磷菌(绿针假单胞菌)菌肥可有多种使用方法，简单介绍如下：
[0048] 1、拌种 将浸泡、消毒后的烟草种子冲洗干净后，加入适量的菌肥进行拌种。 [0049] 2、漂浮育苗
[0050] 每1000kg营养液加入1-2kg菌肥，充分搅拌均匀后用于漂浮育苗。
[0051] 3、营养钵育苗
[0052] 营养土按常规方法配制后，装入营养钵中达2/3处，每10平方米均匀撒施1-2公斤菌肥，直接播种覆土。
[0053] 4、用作基肥
[0054] 移栽前每公顷沟(穴)内施入菌肥20-30kg，按常规施用N肥肥的使用量比常规用量减少20％-30％。
[0055] 本申请人进行了应用试验，情况如下：
[0056] 1、实验地基本情况
[0057] 在湖北兴山县进行，土壤类型为粘土。土壤理化性状见表1
[0058] 表1实验地土壤基本理化性状
[0059]
[0060] 2、实验处理
[0061] 试验田应安排在历年来发病的地块，自然发病，具有代表性。每个处理试验小区面积4亩，采用随机区组排列，每个处理设置3个重复。所有试验小区的条件(如土壤、灌溉、肥料、移栽期、生育期和行株距等田间管理措施以及坡向、光照等因素)一致，且符合当地科学的农业实践。
[0062] 移栽前每公顷沟(穴)内施入菌肥20kg，按常规施用N肥和K肥，P肥的使用量比常规用量减少20％-30％。
[0063] 3、试验结果调查与数据分析
[0064] (1)病情调查每处理根据烟田实际情况划分4个调查小区，每小区采用5点取样方法，每点固定调查20株，记录调查总株数及 各级病株数。三次调查时间分别为发病初期、发病高峰期间和收获期。调查应在晴日午后进行。按国家标准进行病害等级调查。 [0065] (2)经济性状调查各小区挂牌采烤，烟叶分级按国家40级标准分别分级、称重计产。考核指标：产量、产值、均价、上等烟比例、中上等烟比例。
[0066] 4、实验结果如表2、3、4、5所示
[0067] 表2、对几种烟草主要病害的防效
[0068]
[0069] 表3、不同生育期烟叶含磷量测定结果
[0070]
[0071] 表4、烤后烟叶化学成分分析结果
[0072]
