本发明涉及一种从木豆根茎中提取、分离和纯化中草药活性成分染料木素的方法。目的是提供一种简便、安全、经济有效的从木豆根茎中提取、分离纯化高纯度染料木素的方法，所采取的技术方案是：以木豆新鲜或干燥根茎为原料，采用匀浆诱导技术、酶和酸诱导技术、溶剂提取技术、超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液固萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析分离技术及低温析晶和重结晶技术等得到精制的染料木素，纯度达95％以上。该方法的原料丰富易得，工艺简单易行，所得染料木素得率高和纯度高。本方法适用于工业化生产，产品附加值高。
1.一种从木豆根茎中提取、分离和纯化染料木素的方法，其主要特征在于：木豆新鲜或干燥根茎匀浆诱导后经酶和酸诱导水解以增加游离的染料木素含量，诱导后固形物使用
70-95％乙醇提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后加入40-50℃水超声波振荡絮凝，静止，所得到絮凝物经乙酸乙酯负压空化混悬液固萃取、大孔吸附树脂法富集和一次正相硅胶中压柱层析后得到染料木素的制品，经过低温析晶和重结晶得到纯度大于95％的纯品。
2.按照权利要求1所述的从木豆根茎中提取、分离和纯化染料木素的方法，其特征在于：匀浆诱导所用的溶剂为水，温度40-50℃，体积为固体质量的4-8倍，连续诱导3次，每次1-5min；匀浆过程的强大剪切力使植物细胞壁破坏，细胞内酶、染料木素游离物和加合物以及各种前体底物向溶剂中充分释放，在匀浆机械胁迫诱导和自体内酶生物转化合成的双重作用下可提高染料木素含量。
3.按照权利要求1所述的从木豆根茎中提取、分离和纯化染料木素的方法，其特征在于：在提取过程中使用酶和酸对木豆新鲜或干燥根茎进行诱导水解；将匀浆诱导后的浆液用柠檬酸、冰醋酸或盐酸调PH为4.0-5.5；取0.2-0.8％固形物重量的复合酶，溶于pH为
4.0-5.5的缓冲液中，在50-60℃水浴中激活8-15分钟；将激活后的复合酶缓冲液加入匀浆诱导浆液中，在温度为45-60℃的水浴上酶解5-10小时；通过诱导水解，在有效破除细胞壁的同时可以使染料木素葡萄糖苷、染料木素与纤维素和木质素等的结合体水解，使得游离染料木素含量显著提高，所用复合酶为纤维素酶、果胶酶、葡萄糖苷酶。
4.按照权利要求1所述的从木豆根茎中提取、分离和纯化染料木素的方法，其特征在于：乙醇提取液所提物质为匀浆诱导和酶和酸诱导后的固形物，提取方法选自超声波辅助提取、冷浸提取、超临界C02提取、微波辅助提取，所用溶剂为70-95％乙醇。
5.按照权利要求1所述的从木豆根茎中提取、分离和纯化染料木素的方法，其特征在于：木豆根茎提取物中加入水，温度40-50℃，体积为提取物质量的3-6倍，超声波振荡絮凝时间为20-30min，频率为50-60KHz，静止时间为15-20min；超声波的震荡作用使得粘稠絮凝物中包含的极性较大的杂质逐渐溶出，絮凝物富集了提取液中95～99％的染料木素。
6.按照权利要求1所述的从木豆根茎中提取、分离和纯化染料木素的方法，其特征在于：对絮凝物进行负压空化混悬液固萃取，所用溶剂除乙酸乙酯外还包括三氯甲烷、二氯甲烷，萃取所用的溶剂体积为提取物质量的0.5-2％(L∶g)，萃取次数为5-7次，所用压力为
0.04-0.06MPa，有机相回收溶剂后可得目标固形物；该方法是以负压为动力，利用气泡产生的空化效应、湍流效应的一种强化液固萃取工艺。
7.按照权利要求1所述的从木豆根茎中提取、分离和纯化染料木素的方法，其特征在于：所用树脂选自D101、NKA-9、NKA-2、AB-8、AL-9、H103、ADS-7、ADS-8、ADS-17、ADS-21广谱性大孔吸附树脂，该方法中大孔树脂吸附步骤采用湿法装柱，保留液面，将负压空化混悬液固萃取所得到的固形物部分用20-30％乙醇溶液配制成料液浓度为2-4mg/mL混悬药液，同时将大孔吸附树脂采用湿法装柱，保留液面，将混悬的药液通过吸附柱，上样量为0.5-1BV，以流速为每小时6-8mL/g树脂、PH＝5条件下过吸附柱；吸附后用30-40％乙醇3BV洗杂质，然后用50-60％乙醇8-10BV解吸；收集解吸液，浓缩至干，所得固形物为粗目标产物。
8.按照权利要求1所述的从木豆根茎中提取、分离和纯化染料木素的方法，其特征在于：正相硅胶中压柱层析所用样品为树脂富集后所得固形物，所用硅胶为300-800目；预先称取质量为样品量的5-8倍的硅胶，采用湿法装柱，所用溶剂除三氯甲烷外，还包括二氯甲烷、乙酸乙酯；将样品用少量有机溶剂溶解，加入与浸膏质量比为1∶1.2(w/w)的层析硅胶拌匀、减压旋干，装入预先装好的硅胶柱中；先后以10-20BV三氯甲烷、三氯甲烷∶甲醇(20∶1)、甲醇连续中压洗脱，收集洗脱液，每份1/40-1/20BV；用硅胶薄层层析检测洗脱液成分，合并相同部分，展开剂为三氯甲烷∶甲醇＝30∶1-1∶1，紫外波长为254nm和
9.按照权利要求1所述所述的从木豆根茎中提取、分离和纯化染料木素的方法，其特征在于：重结晶所用的溶剂为石油醚、乙醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙睛和甲醇，重结晶所用溶剂比例为(石油醚、乙醚或正己烷)∶(三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、乙睛或甲醇)＝50∶1-1∶1，低温析晶温度为-10℃-25℃。
一种从木豆根茎中提取、分离和纯化染料木素的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及从植物中提取、分离和纯化活性性成分的一种方法，具体是从木豆的新鲜或干燥根茎中提取、分离和纯化染料木素。
背景技术
[0002] 染料木素(Genistein)是一种异黄酮类化合物，广泛存在于豆科植物中，是一种雌激素样化合物。在体内代谢中它能与内源性雌激素受体结合发挥雌激素样作用，被称为植物性雌激素类药物。医药中主要用于治疗由缺乏雌激素引起的妇女病和老年性骨质疏松症。在当今世界范围内，由于人口老龄化，骨质疏松症等老年疾病发病率呈上升趋势，雌激素类药物作为骨质疏松治疗的主要药物有着良好的市场销售前景。异黄酮类雌激素只有苷原形式才有雌激素活性，染料木素为异黄酮的苷原，易吸收，吸收至人体后可直接发挥作用，无需象大豆异黄酮中大多数苷在体内代谢后才可起作用，临床使用排除了吸收不完全和吸收后体内水解不完全等因素，提高了药物利用度，减少了对疗效的干扰。此外，染料木素还在抗肿瘤(SanjeevBanerjee et al，2005)、抗氧化(Huachen Wei et al，1998)、降血脂(金永生等，2002)、体外抗肝纤维化(Qi Lihong et al，2001)、雌激素作用和抗雌激素作用(郑杰等，1998)等方面具有明显的生物活性，估计随着研究的深入，有关染料木素的研究和开发将成为倍受人们关注的新热点。染料木素的开发应用具有良好的发展前景。但是，有关提纯工艺的文献报道很少，已有的提取纯化染料木素的方法主要是传统的醇提取、柱层析纯化。传统的提纯过程漫长且目标化合物损失较多，采用多次硅胶柱层析，操作步骤繁多且洗脱液以氯仿、丙酮、乙酸乙醋等毒性较大、价格较高的试剂为主。中国专利“染料木素的提取方法”(公开号CNl465571)中采用传统的醇提、浓缩、水沉、回流、抽滤、加热回流水解等方法得到染料木素，此法不够精细、有机溶剂用量大、产品杂质含量高、得率低。王凤芹(2007年)等采用传统的柱层析方法分离得到染料木素，历时长，得率低。为此，有必要寻找来源丰富的原料和提取简单、成本低廉的制备工艺，以供大量生产，为染料木素作为药品的开发提供条件。目前，作为提取染料木素的原料主要为豆类作物和齿状植物，据文献报道染料木素在主要原料中的含量为：葛根：0.065％-0.078％；槐角：0.5％-1％；红车轴草：0.3％左右；豆豉：0.34％左右；大豆：0.04％-0.24％。国内外的研究普遍认为大豆是染料木素的重要食物来源，但由于分离条件、手段等多种因素影响，大豆异黄酮中各种活性成分分离难度较大、分离成本高，而且大量实验研究证明大豆中的染料木素含量较低，成品收率约为原料的0.04％，因此，用大豆作为原料很难产生较大的开发价值。
[0003] 为了克服上述问题，本发明人通过多年来对木豆的实验研究，发现从木豆根茎中可提取含量较高的染料木素，并且木豆是迄今为止世界上唯一一种食用木本且用途最多的豆类作物。因此，木豆可作为一种生产染料木素的理想原料。
[0004] 木豆[Cajanus cajan(L.)Millsp.]，英文常用名为Pigeonpea，为蝶形花科热带或亚热带木本植物、常绿灌木。又名树豆、千年豆等，其根、茎、叶、化、荚全身是宝，综合价值极高，除具有显著的药用价值外，还具有很高的经济、生态利用价值。作为一种民间用药它具有清凉、消热、解毒、止痛止血、抑菌消炎等功效，常用于治疗外伤、烧伤、感染、褥疮和抗菌消炎等(刘中秋等，1998；孙绍美等，1995)。此外，木豆提取物制剂在印度、巴西、古巴、墨西哥、南非等国用于治疗感冒、支气管炎、麻疹、痢疾、肝炎、皮肤病、烧伤、溃疡、肿瘤等疾病(Abbiw DK.，1990；Duke JA.et al，1994；Milliken W.，1997；Graver JK.，2002)，疗效显著。我国临床组方用于治疗股骨头坏死以及循环系统疾病(袁浩等，2004)。
[0005] 现在已知的木豆中活性成分包括芹菜素、木犀草素、牡荆苷、异牡荆苷、木豆素、木豆素A、木豆素C、球松素、染料木素、水杨酸、β-谷甾醇、柚皮素-4’、7-二甲醚、三十一烷、二十一烷、Cajanol和一些挥发油类成分(林励等，1999；Christopher JC.et al，1982；程赫青等，1992)。其中木豆根茎中的染料木素含量可达到原料的2％左右，且原料资源丰富、活性突出，具有良好的保健品和药用开发前景。
[0006] 综上所述，在利用植物资源分离纯染料木素的过程中，主要的影响因素在于原料选取不当、提取工艺落后、原料处理和分离过程中普遍存在染料木素的流失、纯化过程漫长，使得成本升高。因此，有必要寻找一种简便安全经济高效的提取纯化染料木素的方法。本发明旨在建立一种通过多种现代生物诱导技术和分离纯化技术相结合的方法，实现简单快速、收率高的提取、分离纯化染料木素的方法。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种以木豆新鲜或干燥的根茎为原料，通过匀浆诱导技术、酶和酸诱导技术、溶剂提取技术、超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液固萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析分离技术及低温析晶和重结晶技术大量、快速获得染料木素单体，该方法简单易行、目标化合物损失少。本发明的目的是通过以下方案来达到的：
[0008] 木豆新鲜或干燥的根茎经过水匀浆体系诱导、酶和酸诱导水解，可提高染料木素含量，后经70-95％乙醇溶剂提取，提取物加入水在40-50℃超声波振荡、静止絮凝，所得到絮凝物经负压空化混悬液固萃取、大孔树脂法富集和一次正相硅胶中压柱层析后得到染料木素的产品，纯度大于80％，经过低温析晶和重结晶得到纯度大于95％的纯品。
[0009] 上述的染料木素提取纯化方法，其特征在于，取一定量的新鲜或干燥的木豆根茎加入水，温度40-50℃，体积为固体质量的4-8倍，连续匀浆诱导3次，每次1-5min。匀浆过程的强大剪切力使植物细胞壁破坏，细胞内酶、染料木素游离物和加合物以及各种前体底物向溶剂中充分释放，在匀浆机械胁迫诱导和自体内酶生物转化合成的双重作用下可提高染料木素含量。在提取过程中使用酶和酸对木豆新鲜或干燥根茎进行诱导水解；将匀浆诱导后的浆液用柠檬酸、冰醋酸或盐酸调PH为4.0-5.5；取0.2-0.8％固形物重量的复合酶(纤维素酶、果胶酶、葡萄糖苷酶)，溶于pH为4.0-5.5的缓冲液中，在50-60℃水浴中激活8-15分钟；将激活后的复合酶缓冲液加入匀浆诱导浆液中，在温度为45-60℃的水浴上酶解5-10小时。通过诱导水解，在有效破除细胞壁的同时可以使染料木素葡萄糖苷、染料木素与纤维素和木质素等的结合体水解，使得游离染料木素含量显著提高，所用复合酶为纤维素酶、果胶酶、葡萄糖苷酶。乙醇提取液所提物质为匀浆诱导和酶和酸诱导后的固形物，提取方法选自超声波辅助提取、冷浸提取、超临界CO2提取、微波辅助提取，诱导后固形物使用70-95％乙醇提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后，木豆根茎提取物中加入水，将提取物加入3-6倍体积的40-50℃温水，于超声波振荡提取器中50-60KHz条件下振荡絮凝20-30min，静止15-20min，超声波的震荡作用使得粘稠絮凝物中包含的极性较大的杂质逐渐溶出，絮凝物富集了提取液中95～99％的染料木素。得到絮凝物，以0.04-0.06MPa负压为动力用乙酸乙酯进行负压空化混悬液固萃取，萃取所用的溶剂体积为提取物质量的0.5-2％(L∶g)，萃取次数为5-7次，所用溶剂除乙酸乙酯外还包括三氯甲烷、二氯甲烷，有机相回收溶剂后可得目标固形物；该方法是以负压为动力，利用气泡产生的空化效应、湍流效应的一种强化液固萃取工艺。浓缩萃取液至干，得到的固形物以20-30％乙醇混悬，配置成料液浓度为2-4mg/mL混悬药液，同时将大孔吸附树脂采用湿法装柱，保留液面，将混悬的药液通过吸附柱，上样量0.5-1BV，以流速为每小时6-8mL/g树脂、PH＝5条件下过吸附柱。吸附后用30-40％乙醇3BV洗杂质，然后用50-60％乙醇8-10BV解吸。收集解析液，浓缩至干得到固形物。预先称取质量为提取物质量的5-8倍的硅胶，采用湿法装柱，所用溶剂除三氯甲烷外，还包括二氯甲烷、乙酸乙酯。将所得固形物用少量有机溶剂溶解，加入与浸膏质量比为1∶1.2(w/w)的层析硅胶拌匀、减压旋干，装入正相硅胶中压柱。先后以10-20BV三氯甲烷、三氯甲烷∶甲醇(20∶1)、甲醇连续中压洗脱连续中压洗脱，收集洗脱液，每份1/40-1/20BV。TLC监测收集流分，合并相同部分，展开剂为三氧甲烷∶甲醇＝
30∶1-1∶1，紫外波长为254nm和360nm。得到染料木素溶液，低温析晶得到产品，重结晶后得到纯品。
[0010] 上述的木豆中染料木素的提取纯化方法所用的大孔吸附树脂为D101、NKA-9、NKA-2、AB-8、AL-9、H103、ADS-7、ADS-8、ADS-17、ADS-21型等。
[0011] 上述的木豆中染料木素的提取纯化方法所用硅胶为300-800目。中压硅胶柱流动相包括(二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮)一(甲醇)的不同比例梯度。
[0012] 重结晶所用的溶剂为石油醚、乙醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙睛和甲醇，重结晶所用溶剂比例为(石油醚、乙醚或正己烷)∶(三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、乙睛或甲醇)＝50∶1-1∶1。低温析晶温度为-10℃-25℃。
[0013] 本发明的优点：
[0014] 1.本发明以在农业生产中大都被废弃的新鲜或者干燥木豆根茎为原料，可以在不破坏植物生态平衡、不影响农业生产的基础上，对植物资源进行高效合理的利用。
[0015] 2.采用先进的匀浆诱导技术、酶和酸诱导技术、溶剂提取技术、超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液固萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析分离技术及低温析晶和重结晶技术用于染料木素的诱导和提取分离，所得产品得率高、纯度高。
[0016] 3.该方法简单易行，周期短，有机溶剂用量少，能耗低，成本低，可实现大规模的染料木素产业化生产。
附图说明
[0017] 图一为染料木素的结构
[0018] 图二为分离纯化流程图具体实施方案
[0019] 实施例1
[0020] 称取木豆干燥根茎1000g，加入8倍体积的40℃温水后连续匀浆诱导3次，每次1min，将匀浆诱导好的浆液用柠檬酸、冰醋酸或盐酸调PH为4.0；取0.2％固形物重量的复合酶(纤维素酶、果胶酶、葡萄糖苷酶)，溶于pH为4.0的缓冲液中，在50℃水浴中激活8分钟；将激活后的复合酶缓冲液加入匀浆诱导浆液中，在温度为45℃的水浴上酶解5小时。
诱导液分离后固形物使用70％乙醇提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后将提取物加入
40℃温水(4.5L)中，于超声波提取器中50-60KHz条件下振荡絮凝20min，静止15min，取絮凝物，以0.05MPa负压为动力用13.5L乙酸乙酯进行负压空化混悬液固萃取，浓缩萃取液，以30％乙醇配置成料液浓度为4mg/mL混悬药液，上样量0.8BV，流速为每小时8mL/g树脂、PH＝5条件下过NKA-9型大孔过吸附树脂柱。吸附后用30％乙醇3BV洗杂质，然后用60％乙醇10BV解吸。收集解吸液，浓缩至干后用少量甲醇溶解，加入与浸膏质量比为1∶1.2(w/w)的目数为500-800的层析硅胶拌匀、50℃减压蒸干。预先称取提取物质量5-8倍的500-800目硅胶，采用三氯甲烷湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入中压柱内，先后以15BV三氯甲烷、三氯甲烷∶甲醇(20∶1)、甲醇连续中压洗脱连续中压洗脱，TLC监测收集流分，浓缩得到染料木素，低温析晶得到产品，重结晶后得到化合物为染料木素，91.18mg，纯度为95％。
[0021] 实施例2
[0022] 称取木豆新鲜根茎3.32kg(干重为1kg)，加入6倍体积的50℃温水后连续匀浆诱导3次，每次5min，将匀浆诱导好的浆液用柠檬酸、冰醋酸或盐酸调PH为5.5；取0.8％固形物重量的复合酶(纤维素酶、果胶酶、葡萄糖苷酶)，溶于pH为5.5的缓冲液中，在60℃水浴中激活15分钟；将激活后的复合酶缓冲液加入匀浆诱导浆液中，在温度为60℃的水浴上酶解10小时。诱导液分离后固形物使用95％乙醇提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后将提取物加入50℃温水(6L)中，于超声波提振荡取器中50-60KHz条件下振荡絮凝20min，静止15min，取絮凝物，以0.06MPa负压为动力用三氯甲烷进行负压空化混悬液固萃取，浓缩萃取液，以30％乙醇配置成料液浓度为2mg/mL混悬药液，上样量0.6BV，流速为每小时8mL/g树脂、PH＝5条件下过NKA-2型大孔过吸附树脂柱。吸附后用30％的乙醇洗杂质，之后用60％乙醇9BV解吸，收集解吸液，浓缩至干后用少量甲醇溶解，加入与浸膏质量比为
1∶1.2(w/w)的目数为300-400层析硅胶拌匀、50℃减压蒸干。预先称取提取物质量5-8倍的300-400目硅胶，采用三氯甲烷湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入中压柱内，先后以13BV三氯甲烷、三氯甲烷∶甲醇(20∶1)、甲醇连续中压洗脱连续中压洗脱，TLC监测收集流分，浓缩得到染料木素，低温析晶得到产品，重结晶后得到化合物为染料木素102.33mg，纯度为
95％。
