一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法

摘要

本发明涉及一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，属于生物技术领域。根据NCBI Genbank公布的已知CUC3基因cDNA序列，设计兼并引物，利用反转录PCR技术进行目的片段克隆；筛选的阳性克隆进行酶切、PCR鉴定、DNA测序以及核苷酸序列同源性比较，获得罗布麻CUC3基因的保守区基因片段；构建反义表达载体，通过发根农杆菌途径转化罗布麻；由罗布麻发根途径实现植株再生，以达到控制罗布麻分枝的目的。

权利要求

1.一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，其特征是：

(1).罗布麻分枝调控基因CUC3保守区的克隆；

应用RT-PCR方法，提取罗布麻总RNA反转录产生cDNA，以cDNA为模板克隆分枝调控基因CUC3保守区基因片段，并根据反义RNA基因沉默原理构建反义表达载体；

CUC3基因片段的克隆：从罗布麻无菌种子苗中制备总RNA，通过反转录反应产生cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板进行RT-PCR反应，根据Genbank中收录的CUC3基因保守区的序列设计1对兼并引物，其序列为：Primer1：5′-ATTACT/CTTT/CTACTTAGCTTCCAAAA/G-3′；

Primer2：5′-CCTTTGTAGAAC/AACC/AAA/GC/TGTC/TTTCTTC-3′(2).基因沉默载体的构建；

将RT-PCR的目的产物片段插入克隆载体pEASY-T1，然后进行DNA序列分析，测序结果与Genbank中序列进行同源性比较；

将测序正确的CUC3基因片段用XbaI和SacI从pEASY-T1切下，反向插入含有35S启动子和NOS终止子的表达载体pCAMBIA-1301，构建成反义表达载体pCAMBIA-1301-CUC3；

(3).通过发根农杆菌介导的方法进行基因转移；

采用冻融法将反义表达载体pCAMBIA1301-CUC3导入发根农杆菌，涂布含50-100mg/L卡那霉素的YEB平板后，在28℃恒温培养箱，培养2天后，挑取单菌落，用PCR方法进行检测，检测为阳性的克隆用于感染罗布麻真叶、茎、子叶节，子叶，下胚轴，根不同外植体部位；

(4).罗布麻的转化和转基因植株再生；

用导入反义表达载体的发根农杆菌感染罗布麻上述不同外植体部位，感染后的外植体在黑暗条件下共培养2天，然后转至含有500mg/L头孢霉素的MS培养基，25±1℃，14h/10h光/暗培养，每隔5-7天转接一次，共转接3-5次，感染后约7-10天产生毛状根，待毛状根长至2-3cm，用PCR方法进行检测，将检测为阳性的根切下转至50mg/L卡那霉素和300mg/L头孢霉素的芽诱导培养基上进行筛选，待筛选到的芽长至2-3cm高时，转入生根培养基，经过2-3周培养，转化植株生根并长成完整再生植株；

(5).转基因植株的检测和筛选；

对转基因植株采取三步法筛选，第一步，通过采用PCR和Southern blot方法检测转基因植株的目的基因，其PCR引物为步骤(1)中所述克隆CUC3保守区基因片段的兼并引物，Southern blot的DNA探针为35S启动子-CUC3保守区基因片段的全部序列，第二步，对检测为阳性的转基因株系，进行炼苗后，移栽到大田培养，在一个生长季后，对其分枝数进行单株统计，与同时期野生型种子苗比较后，筛选获得分枝较少的转基因罗布麻株系，第三步，多代筛选，将上一年收获的种子，大田种植后，进一步反复筛选，以获得稳定的表型和种质资源。

2.根据权利要求1所述的一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，其特征在于克隆得到的CUC3基因保守区基因片段的核苷酸序列为： 1ATTACCTTTT ACTTAGCTTC CAAAGTCTTA TACGGACGCT TCTGTGGACT CGACATTGCT 61GAAGTCGACC TCAACAGATG TGAGCCATGG GAGCTTCCCG ATGCAGCTAA GATGGGAGAG

121AGAGAGTGGT ACCTTTTCAG CTTAAGGGAC AGGAAGTACC CAACGGGGCT GAGAACAAAT

181AGAGCCACTT GTGCCGGGTA CTGGAAAGCA ACGGGGAAAG ATAGAGAAGT CTACGGCAGT

241GAAGGCGTTG TTGTGGGCAT GAAGAAGACA TTTGTTTTCT ACAAAGG。

3.根据权利要求1所述的一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，其特征在于该克隆得到的基因片段编码的氨基酸序列为： 1ITFYLASKVL YGRFCGLDIA EVDLNRCEPW ELPDAAKMGE REWYLFSLRD RKYPTGLRTN

61RATCAGYWKA TGKDREVYGS EGVVVGMKKT FVFYK。

4.根据权利要求1所述的一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，其特征是：所述发根农杆菌的培养条件是基本培养基为pH＝7.0的YEB培养基，温度为28℃，转数为

160-200r/min，对发根的最佳诱导浓度范围为OD600＝0.5-1.0。

5.根据权利要求1所述的一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，其特征是：所述的芽诱导培养基的配方是1/2MS，生根培养基的配方是IBA 0.2-0.4mg/L+1/2MS。

6.根据权利要求1所述的一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，其特征是：所述罗布麻品种包括罗布红麻(Apocynum venetum Linn)和罗布白麻(Apocynum hendersonii Hook.f.)。

7.根据权利要求1所述的一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，其特征是：所述的发根农杆菌为R1601，R1000或LBA9402。

说明书

一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种通过基因沉默控制罗布麻分枝的方法，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 罗布麻是夹竹桃科(Apocynaceae)罗布麻属(Apocynum)的一种多年生宿根草本植物，它包括罗布红麻(Apocynum venetum Linn)和罗布白麻(Apocynumhendersonii
Hook.f.)。罗布麻无论在纤维利用、药用还是保健品开发方面均具有极高的综合利用价值。
国内外现有的报道主要是关于罗布麻纤维脱胶技术的研究，而对前期的育种、生长特性和
如何提高麻纤维质量的研究报道很少。由于罗布麻分枝较多，既影响种植密度，也难于实现
机械化剥麻，直接影响了纤维长度和产量。野生资源已经远远无法满足不断增长的市场需
求。目前，虽然进行了一些小规模人工种植试验，但分枝多，纤维短及产量低的问题仍然无
法解决。因此，通过现代生物工程技术，利用转基因育种方法减少罗布麻的分枝，培育出分
枝少、纤维产量高的新品种，提高麻皮的质量和产量，不但在控制植物分枝研究方面具有重
要意义，而且所选育新品种的推广将会产生巨大的社会和经济效益。

[0003] 虽然目前对于其它植物的分枝发育调控国内外已有较多研究，但分枝控制涉及到十分复杂的植物激素调控和信号转导途径。随着一些分枝调控基因和转录因子的发现，
为我们通过转基因技术实现对植物分枝的控制提供了可能。玉米的tblgene被认为是分
枝调控基因(J.Doebley et al.Nature，1997，386，485-488)，此基因本身有抑制分枝的作
用。另外，还有研究通过构建含有MADS-box基因的表达载体以实现增加农作物和观赏植
物分枝的目的(United States Patent No.6995302)。在Ken-ichiro Hibara和Casper
W.Vroemen等对拟南芥的研究中发现，CUC3基因对侧枝发育有重要作用(Ken-ichiro
Hibara et al.The Plant Cell，2006，18，2946-2957；Casper W.Vroemen et al.The plant
cell，2003，15，1563-1577)。CUC3基因属于NAC转录因子家族，它对侧枝的发育、器官原基
边界的界定和顶端分生组织的形成发挥主要作用。在拟南芥中抑制CUC3基因，使拟南芥的
侧枝生长受到抑制。最近的研究发现，在侧枝发育方面，CUC3起正调控作用。本发明将反
义RNA技术应用于罗布麻，沉默罗布麻的CUC3基因，实现对其分枝的控制。

[0004] 反义RNA技术是通过与RNA进行碱基配对的方式从复制、转录和翻译等水平上对基因表达发挥调控作用。目前，反义RNA技术已经广泛应用于植物基因工程中，成为作物遗
传改良的一个重要工具。目前利用反义RNA技术调控植物RNA技术已经渗透到植物学研究
各个领域(孟博等.国外医学遗传学分册，2001，24(6)，289-292)，如：植物生长发育基因表
达调控、农艺性状的改良(许本波等.中国农学通报，2003，19(3)，84-88)、次生代谢途径的
调控和抗病转基因植物育种(娄红等，辽宁大学学报，2005，32(4)，328-333)，并获得了稳
定转基因新品系，具有广泛的应用前景。目前还没有通过反义RNA技术沉默CUC3基因来控
制罗布麻及其他作物和观赏植物分枝的相关报道。

[0005] 虽然国内外已对罗布麻的组织培养进行了一些研究，但尚未建立稳定的再生体系。本发明通过发根农杆菌感染罗布麻外植体，可得到发根，从发根途径可直接得到再生植
株，从而建立了罗布麻稳定的再生体系。与以往对罗布麻组培途径实现再生的研究相比，这
种方法不易产生嵌合体植株，因此，是一种理想且稳定的转化和转基因植株再生体系。

[0006] 本发明通过构建CUC3基因的反义表达载体，利用发根农杆菌途径对罗布麻进行转化和实现转基因植株的再生，从而实现对罗布麻分枝的控制。本发明是一种对植物实现
分枝调控的新途径，同时也为其他作物及观赏植物分枝性状控制提供了新的思路。

[0007] 发明内容

[0008] 本发明的目的在于应用反义RNA引发的基因沉默技术，设计和构建罗布麻的分枝调控基因CUC3保守区基因片段的反义表达载体，导致该基因的沉默，抑制罗布麻的分枝发
育，获得分枝少的罗布麻新品种。本发明提供了一种应用反义RNA基因沉默技术控制罗布
麻分枝的方法，主要内容包括：

[0009] 1.罗布麻分枝调控基因CUC3保守区的克隆；

[0010] 应用RT-PCR方法，提取罗布麻总RNA反转录产生cDNA，以cDNA为模板克隆分枝调控基因CUC3保守区基因片段，并根据反义RNA基因沉默原理构建反义表达载体。

[0011] 1)克隆CUC3保守区的兼并引物：

[0012] Primer1：5′-ATTACT/CTTT/CTACTTAGCTTCCAAAA/G-3′

[0013] Primer2：5′-CCTTTGT AGAAC/A ACC/AAA/G C/TGTC/TT TCTTC-3′

[0014] 2)克隆到的CUC3保守区cDNA序列及同源性比较：

[0015] 克隆到的CUC3保守区cDNA全长为287bp，编码95个氨基酸，将此氨基酸序列与NCBI Genbank中其它植物编码CUC3基因的核苷酸序列相比较表明：罗布麻CUC3基因保守
区与矮牵牛，拟南芥，大豆和水稻相应区域核苷酸序列的同源性分别为76％、75％、75％和
74％，与公布的CUC3，CUC2，CUC1相应保守区氨基酸序列的同源性为77％，73％，68％。这
说明利用反转录PCR技术获得了编码罗布麻CUC3基因的保守区cDNA。该保守区的序列如
下：

[0016] SEQ.ID.NO 1的信息

[0017] a)序列特征

[0018] 长度：287个核苷酸

[0019] 类型：核酸

[0020] 链型：双链

[0021] b)分子类型：cDNA

[0022] c)假设：否

[0023] d)反义：否

[0024] e)最初来源：罗布麻

[0025] f)序列描述：SEQ.ID.NO 1

[0026] 1 ATTACCTTTT ACTTAGCTTC CAAAGTCTTA TACGGACGCT TCTGTGGACT CGACATTGCT

[0027] 61 GAAGTCGACC TCAACAGATG TGAGCCATGG GAGCTTCCCG ATGCAGCTAA GATGGGAGAG

[0028] 121 AGAGAGTGGT ACCTTTTCAG CTTAAGGGAC AGGAAGTACC CAACGGGGCT GAGAACAAAT

[0029] 181 AGAGCCACTT GTGCCGGGTA CTGGAAAGCA ACGGGGAAAG ATAGAGAAGT CTACGGCAGT

[0030] 241 GAAGGCGTTG TTGTGGGCAT GAAGAAGACA TTTGTTTTCT ACAAAGG

[0031] SEQ.ID.NO 2的信息

[0032] (a)序列特征

[0033] 长度：95个氨基酸

[0034] 类型：氨基酸

[0035] 链型：单链

[0036] (b)分子类型：蛋白质

[0037] (c)序列描述：SEQ.ID.NO 2

[0038] 1 ITFYLASKVL YGRFCGLDIA EVDLNRCEPW ELPDAAKMGE REWYLFSLRD RKYPTGLRTN

[0039] 61 RATCAGYWKA TGKDREVYGS EGVVVGMKKT FVFYK

[0040] 2.基因沉默载体的构建；

[0041] 将RT-PCR的目的产物片段连入克隆载体pEASY-T1，然后进行DNA序列分析，测序结果与Genbank中序列进行同源性比较；将测序正确的CUC3基因片段用XbaI和SacI从
pEASY-T1切下，反向插入含有35S启动子和NOS终止子的表达载体pCAMBIA-1301，构建成
反义表达载体pCAMBIA-1301-CUC3。

[0042] 3.通过发根农杆菌介导的方法进行基因转移；

[0043] 采用冻融法将反义表达载体pCAMBIA1301-CUC3导入发根农杆菌，涂布含卡纳霉素(50-100mg/L)的YEB平板后，在28℃恒温培养箱，培养2天后，挑取单菌落，用PCR方法
进行检测。检测为阳性的克隆用于感染罗布麻真叶、茎、子叶节，子叶，下胚轴，根等不同外
植体部位。

[0044] 4.罗布麻的转化和转基因植株再生；

[0045] 用导入反义表达载体的发根农杆菌感染罗布麻上述不同外植体部位。感染后的外植体在黑暗条件下共培养2天，然后转至含有500mg/L头孢霉素的MS培养基，25±1℃，
14h/10h光/暗培养，每隔5-7天转接一次，共转接3-5次，感染后约7-10天产生毛状根。
待毛状根长至2-3cm，用PCR方法进行检测。将检测为阳性的根切下转至50mg/L卡那霉素
和300mg/L头孢霉素的芽诱导培养基上进行筛选，待筛选到的芽长至2-3cm高时，转入生根
培养基，经过2-3周培养，转化植株生根并长成完整再生植。

[0046] 5.转基因植株的检测和筛选；

[0047] 对转基因植株采取三步法筛选。第一步，通过采用PCR和Southern blot方法检测转基因植株的目的基因。第二步，对检测为阳性的转基因株系，进行炼苗后，移栽到大田
培养。在一个生长季后，对其分枝数进行单株统计，与同时期野生型种子苗比较后，筛选获
得分枝较少的转基因罗布麻株系。第三步，多代筛选，将上一年收获的种子，大田种植后，进
一步反复筛选，以获得稳定的表型和种质资源。

[0048] 本发明通过CUC3基因保守区基因片段的反义表达载体的构建，可以提高目的基因的表达效率；通过建立罗布麻的高效、稳定的发根遗传转化体系，提高了选育转基因罗布
麻株系的再生效率；可缩短育种周期，提高育种效率，得到分枝少的罗布麻新品种，这将促
进我国的罗布麻产业的发展，而且也对其它作物及观赏植物的分枝调控提供了一条新的途
径。

[0049] 技术路线

[0050] 1.兼并引物设计

[0051] 目前，仅拟南芥、水稻、矮牵牛、大豆等模式植物中的CUC3基因被克隆得到全长。因此要克隆CUC3基因的保守区，首先要检索NCBI获取CUC3在植物中已知的cDNA序列，然
后使用序列比对工具DNAMAN对核苷酸序列进行比对，得到目的基因的保守区域，在保守区
内设计兼并引物。序列如下：

[0052] Primer1：5′-ATTACT/CTTT/CTACTTAGCTTCCAAAA/G-3′

[0053] Primer2：5′-CCTTTGT AGAAC/AACC/AAA/G C/TGTC/TT TCTTC-3′

[0054] 2.罗布麻CUC3基因保守区克隆

[0055] 提取罗布麻幼苗植物总RNA。(参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》，(第二版)，金冬雁等译，1992，科学出版社)。以总RNA为模板，使用First-StandcDNA Synthesis
Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)，反转录生成cDNA第一链，之后进行RT-PCR，使用上
述兼并引物。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后回收目的DNA片段，和TransGen Biotech公司的
克隆载体pEASY-T1连接成重组质粒p-EASY-CUC3，热激转化Top10感受态细胞，蓝白斑筛
选。挑选白斑，摇菌，提取质粒，进行PCR检测和酶切分析。检测正确的转化子，由上海英俊
生物技术有限公司测序。测序结果在基因文库中进行核苷酸和蛋白质序列比对，及同源性
分析。选用与其他植物的CUC3基因序列同源性较高的克隆。

[0056] 3.反义表达载体的构建

[0057] 通过DNAMAN对已知序列进行酶切图谱分析。CUC3保守区基因片段要反向插入含35S启动子和终止子的表达载体pCAMBIA-1301。在克隆载体及表达载体上选取合适的酶切
位点。分别选取了XbaI和Sacl进行双酶切反应，回收目的片段用T4DNA连接酶连接，构建
重组质粒pCAMBIA1301-CUC3。转化Top10感受态细胞筛选阳性连接子，进行PCR检测和酶
切分析。

[0058] 4.反义表达载体转化发根农杆菌

[0059] 将检测连接正确的克隆，提取质粒。采用冻融法将反义表达载体导入发根农杆菌感受态细胞，28℃培养箱中培养2-3天。挑选单克隆进行菌落PCR检测(图

[0060] 1)。检测正确的克隆培养后用于感染罗布麻外植体，进行遗传转化。

[0061] 5.罗布麻的转化体系及转基因再生体系的建立

[0062] 导入反义表达载体的发根农杆菌通过叶盘法感染罗布麻不同外植体部位，产生毛状根(图2)。通过头孢霉素杀菌和卡那霉素抗性筛选后得到的阳性根系，用CTAB法提取基
因组DNA，进行PCR检测。

[0063] 对农杆菌T-DNA的检测：根据Ri质粒TL-DNA上的rolC基因设计引物。目的产物为574bp(图3)。

[0064] rolC基因F引物：5’-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3’

[0065] rolC基因R引物：5’-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3’

[0066] 检测为阳性的发根，在芽诱导培养基上培养出芽，生根培养基上生根，得到罗布麻转基因再生植株(图4)。

[0067] 6.转基因植株目的基因的检测

[0068] 通过CTAB法提取转基因植株的基因组DNA，采用PCR和Southern blot方法检测转基因植株的目的基因。

[0069] PCR检测：采用上述克隆CUC3保守区基因片段的兼并引物，目的片段287bp.

[0070] Southern blot检测：再生植株总DNA(10μg)经HindIII完全酶解后进行Southern杂交。DNA探针为35S启动子-CUC3保守区基因片段的全部序列，按TAKaRa公司
的随机引物法地高辛标记试剂盒说明书进行标记。

[0071] 7.分枝较少的转基因株系的筛选

[0072] 对转基因植株采取三步法筛选。第一步，通过采用PCR和Southern blot方法检测转基因植株的目的基因。第二步，对检测为阳性的转基因株系，进行炼苗后，移栽到大田
培养。在一个生长季后，对其分枝数进行单株统计，与同时期野生型种子苗比较后，筛选获
得分枝较少的转基因罗布麻株系。第三步，多代筛选。将上一年收获的种子，大田种植后，
进一步反复筛选，以获得稳定的表型和种质资源。

附图说明

[0073] 图1：重组质粒pCAMBIA1301-CUC3转化发根农杆菌R1601后PCR检测。

[0074] 1：阴性对照2-10：阳性克隆

[0075] 图2：发根农杆菌转化罗布麻外植体后生成的发根

[0076] 图3：发根PCR检测

[0077] 1-2：发根农杆菌质粒阳性对照PCR结果；

[0078] 3-4：发根基因组DNAPCR结果

[0079] 图4：通过发根途径再生转基因苗

具体实施方式

[0080] 实施例1：罗布麻CUC3基因保守区的克隆

[0081] 1.罗布麻总RNA的提取：将组培6-8周的罗布麻幼苗按照《分子克隆实验指南》的Trizol法提取植物总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测。

[0082] 2.反 转 录 及RT-PCR：使 用 上 海 申 能 博 彩 生 物 科 技 有 限 公 司 的First-StandcDNASynthesis Kit，反转录生成cDNA第一链，以cDNA第一链为模板，用设计
的兼并引物进行RT-PCR扩增。

[0083] 3.目的片段与克隆载体连接，筛选阳性克隆：PCR电泳产物回收后与TransGenBiotech公司的pEASY-T1克隆载体连接，转化Top10感受态细胞后，在含有氨苄青霉素和卡
那霉素/IPTG/X-Gal的LB固体培养基培养，37℃倒置培养12-20小时，有的菌落为白色，有
的变为蓝色。选取白色菌落，提取质粒DNA，进行酶切和PCR鉴定。

[0084] 4.序列测定：上海英俊生物技术有限公司完成测序。

[0085] 实施例2：罗布麻CUC3基因保守区基因片段序列信息

[0086] SEQ.ID.NO 1的信息

[0087] g)序列特征

[0088] 长度：287个核苷酸

[0089] 类型：核酸

[0090] 链型：双链

[0091] h)分子类型：cDNA

[0092] i)假设：否

[0093] i)反义：否

[0094] k)最初来源：罗布麻

[0095] l)序列描述：SEQ.ID.NO 1

[0096] 1 ATTACCTTTT ACTTAGCTTC CAAAGTCTTA TACGGACGCT TCTGTGGACT CGACATTGCT

[0097] 61 GAAGTCGACC TCAACAGATG TGAGCCATGG GAGCTTCCCG ATGCAGCTAA GATGGGAGAG

[0098] 121 AGAGAGTGGT ACCTTTTCAG CTTAAGGGAC AGGAAGTACC CAACGGGGCT GAGAACAAAT

[0099] 181 AGAGCCACTT GTGCCGGGTA CTGGAAAGCA ACGGGGAAAG ATAGAGAAGT CTACGGCAGT

[0100] 241 GAAGGCGTTG TTGTGGGCAT GAAGAAGACA TTTGTTTTCT ACAAAGG

[0101] SEQ.ID.NO 2的信息

[0102] (d)序列特征

[0103] 长度：95个氨基酸

[0104] 类型：氨基酸

[0105] 链型：单链

[0106] (e)分子类型：蛋白质

[0107] (f)序列描述：SEQ.ID.NO 2

[0108] 1 ITFYLASKVL YGRFCGLDIA EVDLNRCEPW ELPDAAKMGE REWYLFSLRD RKYPTGLRTN

[0109] 61 RATCAGYWKA TGKDREVYGS EGVVVGMKKT FVFYK

[0110] 实施例3：反义表达载体的构建和转化

[0111] 1.反义表达载体的构建

[0112] 用限制性内切酶XbaI和SacI将CUC3保守区序列从pEASY-T1克隆载体上切下，用相同限制性内切酶酶切表达载体pCAMBIA1301，分别回收目的片段。用T4DNA连接酶于
16℃连接16h。连接产物转化Top10感受态细胞，用卡那霉素抗性进行筛选。挑选单克隆进
行PCR检测和酶切分析。

[0113] 2.反义表达载体转化发根农杆菌感受态细胞

[0114] 质粒转化发根农杆菌使用冻融法。取6μl构建好的质粒pCAMBIA-1301-CUC3转入到刚制好的发根农杆菌R1601感受态细胞中，冰上放置30min。浸入液氮中5min，37℃水
浴5min，加入500μl空YEB，28℃，150-160rpm，摇3-5h。在含有卡那霉素的YEB固体平板
上，28℃培养箱中培养2-3天。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定。

[0115] 实施例4：罗布麻发根培养体系建立

[0116] 将转入反义表达载体的发根农杆菌R1601，R1000，LBA9402活化2-3次，挑取单克隆，在含卡那霉素(50mg/L)的YEB的液体培养基，28℃，200r/min，过夜培养。次日按1∶50
体积比扩大培养3-5h，在对数生长期，OD600值为0.5-1.0用于感染。3500r/min收集菌体，
用pH 5.80的相同体积的MS培养基稀释后，分别对罗布麻的真叶、茎、子叶节等不同部位外
植体感染20-30min，7-10天后陆续有毛状根长出。以无菌水冲洗后转入含头孢霉素500mg/
L的MS固体培养基上，25±1℃，14h/10h光/暗培养。5-7天转接一次，共转接3-5次，脱菌
至无菌。

[0117] 3种发根农杆菌对罗布麻子叶节的发根诱导率及诱导密度如表1所示。

[0118] 毛状根诱导率＝产生毛状根的外植体数/接种的外植体数

[0119] 毛状根诱导密度＝产生毛状根的总数/产生毛状根的外植体数

[0120] 表1不同菌株对罗布麻子叶节毛状根的诱导率

[0121]发根农杆菌 接种外植体 数 产生毛状根 外植体数 毛状根总数 毛状根诱导 率(％) 毛状根诱导 密度
R1000 30 26 242 86.7 8.07
R1601 30 28 225 93.3 7.50
LBA9402 30 30 216 100 7.20

[0122] 实施例5：罗布麻转基因植株发根途径再生

[0123] 待毛状根长至2-3cm长，切下，用CTAB法提取基因组DNA，进行PCR检测。检测为阳性的发根，转入无激素固体1/2MS芽诱导培养基上培养，2-3周后出现芽点，不定芽长到
2-4厘米，切下转入含IBA0.2-0.4mg/l的1/MS根诱导培养基，2-3周长出根。上述三种发
根农杆菌诱导产生的发根的再生植株诱导率如表2所示。

[0124] 再生植株诱导率：产生再生植株总数/接种的发根数

[0125] 表2不同菌株来源的发根的再生植株的的诱导率

[0126]发根来源 接种的发根数 产生再生植株 总数 再生植株 诱导率(％)
R1000 50 5 10
R1601 50 15 30
LBA9402 50 8 16

[0127] 实施例6：转基因植株目的基因的检测

[0128] 转基因罗布麻PCR检测：采用上述克隆CUC3保守区基因片段的兼并引物，目的片段287bp.PCR检测结果表明，在64株检测植株中有50株为PCR阳性，扩增出了与目的基因
片段相同的分子量条带，而对照植株未扩增出相应条带。

[0129] 转基因罗布麻Southern blot检测：用35S启动子-目的基因序列作为探针与转基因再生植株的DNA杂交，在PCR阳性植株中，80％的植株转基因真实性经Southern杂交
分析得到证实，含有一至多条杂交带。

[0130] 实施例7：分枝较少的转基因株系的筛选

[0131] 将得到的40株转基因罗布麻株系，进行炼苗后，移栽到大田培养。在一个生长季后，对其分枝数进行单株统计，与同时期1000株大田种植的野生型种子苗比较后，筛选获
得分枝较少的转基因罗布麻株系，之后进行多代筛选。将上一年收获的种子，大田种植后，
进一步反复筛选，以获得稳定的表型和种质资源。