本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测方法。其特征在于包括以下步骤：收集人体尿液，将尿液离心后保存；向尿液中加入内标萘羟心胺，再加入甲醇和盐酸进行酸解；向剩余尿液中加入氢氧化钠溶液和乙酸钠缓冲液，然后过cleanert PCX固相萃取柱，收集洗脱液为A液，剩余液待用；取剩余尿液，过cleanert PEP固相萃取柱，收集洗脱液为B液；吹干A液，用乙腈复溶后衍生化；吹干B液，加碳酸钾溶液后用石油醚萃取两次，合并有机相，经无水硫酸钠脱水吹干，最后用正己烷复溶；取吹干A液和吹干B液用于气相色谱质谱联用测定；本发明具有简便、快捷、结果可靠、自动化程度高、便于产业化应用的特点。
1.一种人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测方法，其特征在于包括以下步骤：第一步，收集人体尿液10-20ml将收集的尿液离心后保存；
第二步，取第一步得到的尿液，加入内标萘羟心胺，再加入甲醇和盐酸进行酸解；
第三步，取第二步中的剩余液，加入氢氧化钠溶液和乙酸钠缓冲液，然后过cleanert PCX固相萃取柱，固相萃取条件为：用2ml甲醇和2ml 0.1M的HCl活化预处理；以8ml/min的流速过样品；用2ml 0.1M的HCl和2ml甲醇洗柱；用2ml体积比为80∶2∶2的氯仿/异丙醇/32％氨水的混合液洗脱，收集洗脱液为A液，上固相萃取柱的直接流出液待用；
第四步，取第三步中的样品上固相萃取柱的直接流出液，过cleanert PEP固相萃取柱，固相萃取条件为：用3ml MTBE、3ml甲醇和3ml纯水活化预处理；用3ml体积比为1∶1的甲醇/水的混合液洗涤；用6ml体积比为1∶9的甲醇∶MTBE的混合液洗脱，收集洗脱液为B液；
第五步，吹干A液，用乙腈复溶后加MSTFA衍生化；
第六步：吹干B液，加PFPA衍生化，加碳酸钾溶液后用石油醚萃取两次，合并有机相，经无水硫酸钠脱水吹干，最后用正己烷复溶；
第七步：取第五步和第六步中的反应液用于气相色谱质谱联用测定。
2.如权利要求1所述的人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测方法，其特征是所述第一步中尿液离心后保存的温度为-20℃。
3.如权利要求1所述的人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测方法，其特征是所述第二步中尿液的体积为5ml，萘羟心胺加入的量为200μl，浓度为10μg/ml，甲醇加入的量为1ml，盐酸加入的量为300μl，浓度为6M。
4.如权利要求1所述的人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测方法，其特征是所述第三步中氢氧化钠溶液加入的量为180μl，浓度为5M；所述乙酸钠缓冲液加入的量为600μl，pH为5.0。
5.如权利要求1所述的人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测方法，其特征是所述第五步中乙腈的用量为50μl；所述衍生化试剂为MSTFA，加入的量为
50μl，衍生化温度为60℃，衍生化时间为30min。
6.如权利要求1所述的人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测方法，其特征是所述第六步中加入碳酸钾溶液的量为3mL，质量分数为1％；加入石油醚的量为
7.如权利要求1所述的人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测方法，其特征是所述第七步中所取的反应液进样体积为1～5μl。
8.如权利要求1所述的人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测方法，其特征是所述第七步中用于气相色谱质谱联用测定的条件为：色谱柱选择中等极性或非极性色谱柱中的一种，采用EI源电离和SIM扫描模式，电离电压为70eV，离子源温度在
220～250℃，进样口温度在260℃～290℃。
人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测
方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测方法。
背景技术
[0002] 雌二醇属于甾体同化激素，对体内糖、脂肪、蛋白质、盐等物质的代谢有不同程度的影响，雌二醇常被用于畜牧业养殖中，用来提高动物体重和喂养效率。雌二醇属于内源性(天然)激素，而双酚A和己烯雌酚是雌激素类似物。环境雌激素属于环境内分泌干扰物，它的分子结构与雌激素相似，进入体内后无法分辨，于是在体内就具有雌激素效应。外源性雌激素及其类似物进入动物或人体后，能对机体内正常内分泌物质的合成、释放、运转、代谢以及结合等产生干扰，从而破坏内分泌系统的调控作用。外源性雌激素及其类似物会增加癌症的患病几率，特别是男性的睾丸癌、前列腺癌以及女性的乳腺癌、子宫颈癌。滥用激素对人和动物健康、生态环境都会造成直接或潜在的危害。20世纪80年代以来，欧盟等许多国家和组织通过立法限制或禁止在食用性动物饲养中使用激素。
[0003] 沙丁胺醇为β-受体激动剂，临床上用于治疗支气管哮喘或喘息型支气管炎伴有的支气管痉挛等病症。该药物除具有上述药理作用外，若大剂量使用还会兴奋中枢神经系统，并会产生蛋白同化作用，所以被运动员用作刺激剂和蛋白同化制剂[1]。沙丁胺醇作为β-肾上腺素受体兴奋剂，用于动物饲养可起促生长作用，所以还常用于饲料添加剂中。
[0004] 鉴于环境污染的形势非常严峻，建立环境污染对人体危害的预警体系非常有必要。学术界对污染物质检测的研究非常多，但多集中在环境外暴露测量。上个世纪末，学者研究通常是对环境样本(空气、土壤和水)中单个或多个污染物质进行检测，是环境监理实施监督管理的耳目和手段，着重检测环境样品中污染物质的含量以此间接评价其对人体健康的影响。这在环境卫生学中属于环境外暴露剂量研究。近十年，对人体内某些污染物质的检测逐渐增多，涉及的物质越来越广泛，包括芳香族化合物、农药、兽药、食品添加剂和环境激素等。这在环境卫生学中属于环境内暴露剂量研究。对于环境外暴露的检测，由于每个人接触到的环境污染物质种类、污染水平和污染程度是不同的，另外人体对这些污染物质的敏感程度也不一样，环境污染对人体伤害的潜伏期又较长，很难从直觉来感知其污染的程度，所以往往出现“身在毒中不知毒”的情况。而环境内暴露检测通常是对大量人群体内某种或某一类污染物质的分布进行测定，能够避免个体差异的影响，真实客观地反映人体污染物质的暴露水平。作为内暴露的检测样本主要有血样，组织样本和尿样。而尿样作为内暴露的检测样本，对人体无损伤，取样方便，易获得。可用于临床上大规模的体检排查。
[0005] 目前环境雌激素的测定方法文献报道多为气相色谱/质谱法(GC/MS)和液相色谱/质谱法(LC/MS)。沙丁胺醇常用的检测方法主要是以酶联免疫法(ELISA)为主，也有用高效液相色谱法测定的报道，但主要用于饲料样品的检测。GC/MS法是国际公认的确证方法，同时检测灵敏度高，能定性定量，为检测低浓度代谢物提供条件，并且其自动化检测更容易进行大批量的测定。方法方便，快捷，准确。
发明内容
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种方法简便、快捷、结果可靠、自动化程度高、便于产业化应用的人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测方法。
[0007] 本发明方法是通过以下技术方案实现的，其特征在于包括以下步骤：
[0008] 第一步，将收集的尿液离心后保存；
[0009] 第二步，取第一步得到的尿液，加入内标萘羟心胺，再加入甲醇和盐酸进行酸解；
[0010] 第三步，取第二步中的剩余液，加入氢氧化钠溶液和乙酸钠缓冲液，然后过cleanert PCX固相萃取柱，收集洗脱液为A液，剩余液待用；
[0011] 第四步，取第三步中的样品剩余液，过cleanert PEP固相萃取柱，收集洗脱液为B液；
[0012] 第五步，吹干A液，用乙腈复溶后衍生化；
[0013] 第六步：吹干B液，加碳酸钾溶液后用石油醚萃取两次，合并有机相，经无水硫酸钠脱水吹干，最后用正己烷复溶；
[0014] 第七步：取第五步和第六步中的反应液用于气相色谱质谱联用测定。
[0015] 本发明具有以下优点：
[0016] 1.本发明采用尿样作为检测样本，对人体无损伤，方便且易获得。
[0017] 2.在面对同样的环境污染条件下，个人受损伤程度并不一致。本发明致力于对人环境污染物质内暴露(尿样)水平的测定，能真实反映暴露水平和个人损伤程度。不仅反映了多种途径暴露的总水平，而且能避免由环境外暴露剂量估计暴露水平时吸收率的个体差异性的影响。
[0018] 3.用气质联用检测样本，检测灵敏度高，能定性定量，为检测低浓度代谢物提供条件，并且其自动化检测更容易进行大批量的测定。方法方便，快捷，准确。
[0019] 4.本发明以尽可能少的步骤同时检测沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚，检测成本低，能系统化全面评价人体的污染物接触程度，有利于产业化推广到普通人群。
[0020] 5.本发明通过同时检测沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚内暴露对人的健康危害，建立这两类污染物内暴露对健康危害程度评价的参考标准。通过这个检测方法的建立，人们能对自身健康进行评价，知道这些环境污染物对自己的危害程度，为诊断或预测其患有某种疾病的可能性和发展趋势提供科学依据。
[0021] 6.在同时检测沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚内暴露健康危害的同时，还进行跟踪和干预。对有安全隐患的个体进行饮食、作息、生活习惯等等各种因素的调整，把威胁隐患降到最低。
附图说明
[0022] 图1是本发明实施例1所得通过固相萃取衍生1号人体尿液所得气相质谱选择离子流图。
[0023] 图2是本发明实施例1所得通过固相萃取衍生2号人体尿液所得气相质谱选择离子流图。
具体实施方式
[0024] 本发明方法的各个步骤如下：
[0025] 第一步，收集人体尿液：10-20ml，将收集的尿液离心后保存，保存温度为：
[0026] -20℃；
[0027] 第一步，将收集的尿液离心后保存，保存温度为：-20℃；
[0028] 第二步，取第一步得到的尿液，加入内标萘羟心胺，再加入甲醇和盐酸进行酸解；
[0029] 所述取尿液的体积为5ml，萘羟心胺加入的量为200μl，浓度为10μg/ml，甲醇加入的量为1ml，盐酸加入的量为300μl，浓度为6M；
[0030] 第三步，取第二步中的剩余液，加入氢氧化钠溶液和乙酸钠缓冲液，然后过cleanert PCX固相萃取柱，收集洗脱液为A液，剩余液待用；
[0031] 所述氢氧化钠溶液加入的量为180μl，浓度为5M；所述乙酸钠缓冲液加入的量为600μl，PH为5.0。所述固相萃取条件为：用2ml甲醇和2ml 0.1M的HCl活化预处理；以
8ml/min的流速过样品；用2ml 0.1M的HCl和2ml甲醇洗柱；用2ml氯仿/异丙醇/32％氨水[80∶2∶2 v∶v∶v]洗脱；
[0032] 第四步，取第三步中的样品剩余液，过cleanert PEP固相萃取柱，收集洗脱液为B液；
[0033] 所述固相萃取条件为：用3ml MTBE、3ml甲醇和3ml纯水活化预处理；用3ml甲醇∶水(1∶1 v∶v)洗涤；用6ml甲醇∶MTBE(1∶9 v∶v)洗脱；
[0034] 第五步，吹干A液，用乙腈复溶后衍生化；
[0035] 所述乙腈的用量为50μl；所述衍生化试剂为硅烷化试剂，加入的量为50μl，衍生化温度为60℃，衍生化时间为30min；
[0036] 第六步：吹干B液，加碳酸钾溶液后用石油醚萃取两次，合并有机相，经无水硫酸钠脱水吹干，最后用正己烷复溶；
[0037] 所述加入碳酸钾溶液的量为3mL，质量分数为1％；加入石油醚的量为2ml；加入正己烷复溶的量为100ul；
[0038] 第七步：取第五步和第六步中的反应液分别用于气相色谱质谱联用测定；
[0039] 所取反应液的进样体积为1～5ul，优选2ul；
[0040] 所述用于气相色谱质谱联用测定的条件为：色谱柱选择中等极性或非极性色谱柱中的一种，采用E1源电离和SIM扫描模式，电离电压为70eV，离子源温度在220～250℃，进样口温度在260℃～290℃。
[0041] 实施例1
[0042] 取-20℃保存的2份尿样，分别标记为1、2号，自然解冻后离心，分别同时进行以下实验操作步骤：取上清尿样5ml，加200ul 10μg/ml的内标萘羟心胺，lml甲醇，0.3ml 6M浓盐酸，80℃放10min，然后加180ul 5M的氢氧化钠，600ul乙酸钠缓冲液(PH 5.0)，然后过柱。
[0043] 先过柱1cleanert PCX：用2ml甲醇和2ml 0.1M的HCl活化预处理；以8ml/min的流速过样品，同时接废液用来过柱2；用2ml 0.1M的HCl和2ml甲醇洗柱；用2ml氯仿/异丙醇/32％氨水[80∶2∶2 v∶v∶v]洗脱，流速6ml/min，得洗脱液A；吹干后加50ul乙腈复溶，再加50ul MSTFA，60℃，衍生化30min；反应液用GC/MS分析。
[0044] 将收集的废液过柱2 cleanert PEP：用3ml MTBE、3ml甲醇和3ml纯水活化预处理；过样品后用3ml甲醇∶水(1∶1 v∶v)洗涤；用6ml甲醇∶MTBE(1∶9 v∶v)洗脱，得洗脱液B；吹干B液，加50ulPFPA室温衍生化30min，加2mL石油醚和3mL 1％(质量分数)碳酸钾溶液；在涡流振荡器上振摇1min；静置分层后，将石油醚层流经无水硫酸钠脱水，流出液收集于离心管中；再用2mL石油醚萃取，重复两次，脱水后，合并石油醚层，缓缓吹干；最后用100μL正己烷复溶，用GC/MS分析。
[0045] GC/MS条件为：采用DB-5ms柱，EI离子源，电压为70eV，离子源温度为230℃，进样口温度为280℃。采用SIM方式采集实验结果。结果如附图1、2所示。图1为1号尿样SIM色谱图，从中分析出了沙丁胺醇。图2为2号尿样SIM色谱图，从中分析出了雌二醇、双酚A和己烯雌酚。
[0046] 本发明所述的人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的共检测方法，可用于人体尿液中沙丁胺醇的检测，也可以用于人体尿液中雌二醇、双酚A和己烯雌酚的检测，还可以用于同时检测人体尿液中沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚。通过对人体样本的检测，反映个体的沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚的内暴露情况，可以预防沙丁胺醇、雌二醇、双酚A和己烯雌酚这些环境污染物对人造成的危害和疾病，从而说明个体的环境污染物接触情况，提示个体改善生活习惯方式，减少污染物的接触，提高健康水平。同时本方法还可以作为环境监测的指标，来对人们的居住环境进行评价。
