使免疫原性组合物稳定且抑制其沉淀的新颖调配物转让专利
申请号 : CN200780014734.3
文献号 : CN101500612B
文献日 : 2013-12-25
发明人 : 拉克希米·坎德克 , 陈英 , 汉扬·韩 , 罗伯特·詹塞·小赛义德 , 金照伟 , 吉·隆·卢克 , 罗纳德·马隆 , 杨旭东
申请人 : 惠氏公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种使多糖-蛋白质连结物稳定的调配物,所述调配物包含
(i)pH值缓冲盐水溶液,其中所述缓冲液为具有氯化钠的琥珀酸盐缓冲液,其中琥珀酸盐的最终浓度为5mM以及氯化钠的终浓度为150mM,所述缓冲液具有5.8到6.0的pH值;(ii)聚山梨醇酯80,其最终浓度为每体积所述调配物0.01重量%到0.05重量%聚山梨醇酯80;和(iii)多糖-蛋白质连结物,其为13价肺炎球菌连结物(13vPnC),包含肺炎链球菌(S.pneumoniae)血清型4多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6B多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型9V多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型23F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型1多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型3多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型5多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6A多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型7F多糖与CRM197多肽的连结物和肺炎链球菌血清型19A多糖与CRM197多肽的连结物。
2.根据权利要求1所述的调配物,其中所述调配物另外包含佐剂。
3.根据权利要求2所述的调配物,其中所述佐剂为磷酸铅。
4.根据权利要求3所述的调配物,其中所述多糖-蛋白质连结物调配物包含于容器装置中,所述容器装置选自一个或多个以下组成的群组:小瓶、注射器、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋于、广口瓶、安瓶、药筒和一次性笔。
5.根据权利要求4所述的调配物,其中所述容器装置经硅化。
6.一种容器装置,其填充有权利要求3-5中任一权利要求所述的调配物。
7.根据权利要求6所述的容器装置,其选自如下构成的群组:烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋于、广口瓶、小瓶、安瓶和注射器。
8.根据权利要求6所述的容器装置,其中所述容器由玻璃、金属或聚合物制备。
9.根据权利要求6所述的容器装置,所述容器为注射器。
10.根据权利要求6所述的容器装置,所述容器为玻璃注射器。
11.根据权利要求6-10中任一权利要求所述的容器装置,所述容器装置经硅化。
说明书 :
使免疫原性组合物稳定且抑制其沉淀的新颖调配物
技术领域
背景技术
者时,须看起来新鲜、品质优良且专门的。免疫原性组合物的稳定性和/或物理性质的任何改变(诸如颜色改变、变浑或浑浊)都可能使患者或用户对产品失去信心。此外,由于许多
免疫原性调配物是分配于多剂量容器中,故必须确保随时间流逝活性成分(例如,多糖-蛋
白质连结物)的剂量均匀(例如,浑浊溶液可导致不均匀的剂量模式)。另外,免疫原性组
合物须在其“预期”保存期限内具活性,其中使免疫原性组合物失去活性或其它不合需要的形式(例如,聚集)的任何破坏都会降低产品的总浓度。
(Ho)等人,2002;波尔加诺(Bolgiano)等人,2001)。举例来说,与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)或CRM197载体蛋白连结的C群脑膜炎球菌(meningococcal C,MenC)多糖和b
型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)多糖的稳定性分析揭示视载体蛋
白而定不同的稳定性概况(胡等人,2002)。在另一研究(胡等人,2001)中,分析来自两个
不同制造商的MenC-CRM197连结物(胡等人,2001),其中MenC-CRM197连结物的连结化学和
连结物多糖的长度不同(二者具有相同的载体蛋白,CRM197)。来自这项研究的数据进一步
表明,诸如连结化学(例如,直接或经由化学联接基团还原胺化)、连结位点的数量、多糖链长、pH值、存储缓冲剂、存储温度和冷冻/解冻循环等因素也会影响免疫原性组合物的稳定性。
80年代的若干报道涉及到由一次性塑料注射器释放的硅油为引起人类胰岛素聚集的病
原体(辰特罗(Chantelau)和伯杰(Berger),1985;辰特罗(Chantelau)等人,1986;辰
特罗(Chantelau),1989;伯恩思坦(Bernstein),1987;鲍德温(Baldwin),1988;科利尔(Collier)和道森(Dawson),1985)。辰特罗等人(1986)观察到,在三次或三次以上从十剂
量的胰岛素制剂抽出(使用硅化一次性注射器)后,小瓶会因硅油污染而开始变浑浊,从而
导致胰岛素聚集和失活(辰特罗等人,1986)。不合理的是,硅油是塑料注射器的必需组分,因为其用于润滑橡胶柱塞并且便利将柱塞移下注射管(即,硅油改进调配物的可注射性)。
润滑剂;和便利针头穿透小瓶的橡胶塞的润滑剂,故硅油的使用不限于注射器。另外,注射器、玻璃小瓶、橡胶塞等的硅化并非充分可控制和标准化的过程,且因此各批次间存在硅油含量高可变性。
发明内容
配物。在一个特定实施例中,本发明针对使免疫原性组合物对于硅油相互作用、剪切力、装运搅动等稳定的新颖调配物。
结物调配物包含于容器装置中。在某些实施例中,所述容器装置选自一个或多个以下组成
的群组:小瓶、小瓶塞、小瓶密封物(vial closure)、玻璃密封物、橡胶密封物、塑料密封物、注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。在某些实施例中,所述容器装置经硅化。
冲液的最终浓度为5mM。在其它实施例中,pH值缓冲盐水溶液中的盐包含氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。在一个特定实施例中,pH值缓冲盐水溶液中的盐为氯化钠。
酯20(polysorbate20)(吐温20(Tween 20))、聚山梨醇酯40(吐温40)、聚山梨醇酯
60(吐温60)、聚山梨醇酯65(吐温65)、聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯85(吐
TM
温85)))、曲通N-101(Triton N-101)、曲通X-100、氧托夕醇40(oxtoxynol40)、壬苯
醇醚-9(nonoxynol-9)、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧化乙烯-660羟基硬脂
酸酯(PEG-15,索罗托H15(Solutol H15))、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯(克林莫佛
TM
EL(Cremophor EL ))、大豆卵磷脂(soy lecithin)和泊洛沙姆(poloxamer)。在一个特定
实施例中,表面活性剂为聚山梨醇酯80。在另一实施例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终
浓度为每体积调配物至少0.01重量%到10重量%聚山梨醇酯80。在其它实施例中,调配
物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.01重量%聚山梨醇酯80。在其它实施
例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.05重量%聚山梨醇酯80。在
另一实施例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.1重量%聚山梨醇酯
80。在某些其它实施例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物1.0重量%
聚山梨醇酯80。在其它实施例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物10.0
重量%聚山梨醇酯80。
链球菌血清型6B多糖、肺炎链球菌血清型9V多糖、肺炎链球菌血清型14多糖、肺炎链球
菌血清型18C多糖、肺炎链球菌血清型19F多糖、肺炎链球菌血清型23F多糖、肺炎链球菌
血清型1多糖、肺炎链球菌血清型3多糖、肺炎链球菌血清型5多糖、肺炎链球菌血清型
6A多糖、肺炎链球菌血清型7F多糖和肺炎链球菌血清型19A多糖。在某些实施例中,多
糖-蛋白质连结物调配物中的蛋白质选自由以下组成的群组:CRM197、破伤风类毒素、霍乱类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌(E.coli)热敏性类毒素(LT)、肺炎球菌溶血素类毒素、
肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白A(PsaA)、来自链球菌(Streptococcus)的
C5a肽酶、流感嗜血杆菌蛋白D、卵清蛋白、钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative of
tuberculin,PPD)。
糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型9V多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物和肺炎链球菌血清型23F多糖与CRM197多
肽的连结物。
链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的
连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型23F多糖与
CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型1多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型
3多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型5多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球
菌血清型6A多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型7F多糖与CRM197多肽的连结物
和肺炎链球菌血清型19A多糖与CRM197多肽的连结物。
表面活性剂;和(iii)链球菌C5a肽酶。在一个特定实施例中,SCP调配物包含于容器装置
中。在某些实施例中,所述容器装置选自一个或多个以下组成的群组:小瓶、小瓶塞、小瓶密封物、玻璃密封物、橡胶密封物、塑料密封物、注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。
盐缓冲液的最终浓度为5mM。在其它实施例中,pH值缓冲盐水溶液中的盐包含氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。
聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯85(吐温85)、曲通N-101、曲通X-100、氧托夕醇40、
壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧化乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15,索罗托H15)、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯(克林莫佛EL)、大豆卵磷脂和泊洛沙姆。在一个
特定实施例中,表面活性剂为聚山梨醇酯80。在某些实施例中,调配物中聚山梨醇酯80的
最终浓度为每体积调配物0.01重量%到10重量%聚山梨醇酯80。在其它实施例中,调配
物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.01重量%聚山梨醇酯80。在其它实施
例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.05重量%聚山梨醇酯80。在
其它实施例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.1重量%聚山梨醇酯
80。在另一实施例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物1.0重量%聚山
梨醇酯80。在另一实施例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物10.0重
量%聚山梨醇酯80。
菌多糖、脑膜炎球菌多糖和葡萄球菌多糖。
述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值;(ii)铝盐;和(iii)一种或多种多糖-蛋白质连
结物。在某些实施例中,所述硅化容器装置选自一个或多个以下组成的群组:小瓶、小瓶塞、小瓶密封物、玻璃密封物、橡胶密封物、塑料密封物、注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。
琥珀酸盐缓冲液的最终浓度为5mM。在其它实施例中,pH值缓冲盐水溶液中的盐包含氯化
镁、氯化钾、氯化钠或其组合。在一个特定实施例中,pH值缓冲盐水溶液中的盐为氯化钠。
山梨醇酯80。
多糖、肺炎链球菌血清型9V多糖、肺炎链球菌血清型14多糖、肺炎链球菌血清型18C多糖、肺炎链球菌血清型19F多糖、肺炎链球菌血清型23F多糖、肺炎链球菌血清型1多糖、肺炎
链球菌血清型3多糖、肺炎链球菌血清型5多糖、肺炎链球菌血清型6A多糖、肺炎链球菌血
清型7F多糖和肺炎链球菌血清型19A多糖。
的C5a肽酶、流感嗜血杆菌蛋白D、卵清蛋白、钥孔贝血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)
和结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)。
糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型9V多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物和肺炎链球菌血清型23F多糖与CRM197多
肽的连结物。
链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的
连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型23F多糖与
CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型1多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型
3多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型5多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球
菌血清型6A多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型7F多糖与CRM197多肽的连结物
和肺炎链球菌血清型19A多糖与CRM197多肽的连结物。
冲液具有约3.5到约6.5的pKa值;(ii)铝盐;和(iii)链球菌C5a肽酶。在某些实施例中,
所述容器装置选自一个或多个以下组成的群组:小瓶、小瓶塞、小瓶密封物、玻璃密封物、橡胶密封物、塑料密封物、注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。
液中的盐包含氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。
醇酯80。
6.5的pKa值;(ii)表面活性剂;和(iii)脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。例示性脑膜炎奈瑟菌
2086蛋白将于下文中描述。在一个特定实施例中,脑膜炎奈瑟菌2086蛋白调配物包含于
容器装置中。在某些实施例中,所述容器装置选自一个或多个以下组成的群组:小瓶、小瓶塞、小瓶密封物、玻璃密封物、橡胶密封物、塑料密封物、注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。
盐缓冲液的最终浓度为5mM。在其它实施例中,pH值缓冲盐水溶液中的盐包含氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。
聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯85(吐温85)、曲通N-101、曲通X-100、氧托夕醇40、
壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧化乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15,索罗托H15)、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯(克林莫佛EL)、大豆卵磷脂和泊洛沙姆。在一个
特定实施例中,表面活性剂为聚山梨醇酯80。在某些实施例中,调配物中聚山梨醇酯80的
最终浓度为每体积调配物0.01重量%到10重量%聚山梨醇酯80。在其它实施例中,调配
物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.01重量%聚山梨醇酯80。在其它实施
例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.05重量%聚山梨醇酯80。在
其它实施例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.1重量%聚山梨醇酯
80。在另一实施例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物1.0重量%聚山
梨醇酯80。在另一实施例中,调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物10.0重
量%聚山梨醇酯80。
组成的群组的多糖:链球菌多糖、肺炎球菌多糖、脑膜炎球菌多糖和葡萄球菌多糖。
缓冲液具有约3.5到约6.5的pKa值;(ii)铝盐;和(iii)脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。在某
些实施例中,所述容器装置选自一个或多个以下组成的群组:小瓶、小瓶塞、小瓶密封物、玻璃密封物、橡胶密封物、塑料密封物、注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。
液中的盐包含氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。
醇酯80。
附图说明
0%)调配的SCP的2天稳定性,而图1B所提供的数据为用0.025%吐温80调配的SCP的
2天稳定性。图1A和1B中所示的调配物中所使用的缓冲液为琥珀酸盐缓冲盐水(SBS)、磷
酸盐缓冲盐水(PBS)和三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
的总抗原性损失。
射器中的13vPnC的总抗原性损失。
具体实施方式
物稳定且抑制其沉淀的新颖表面活性剂调配物和/或新颖铝盐调配物。更具体来说,下文
所述的本发明针对所属领域中关于使免疫原性组合物稳定且抑制其微粒形成(例如,聚
集、沉淀)的调配物的需求,所述免疫原性组合物在诸如发酵罐、生物反应器、小瓶、烧瓶、袋子、注射器、橡胶塞、管道等容器装置中经加工、研制、调配、制造和/或存储。
组合物与容器/密封物系统的相容性、免疫原性组合物与无活性成分(例如,缓冲剂、盐、赋形剂、防冻剂)之间的相互作用、制造工艺、剂型、装运、存储和处理过程中所遇到的环境条件(例如,温度、湿度、剪切力)和制造与使用之间的时间长度。
定性、聚集、免疫原性、微粒形成、蛋白质(浓度)损失等:光散射、光密度、沉降速度离心、沉降平衡离心、圆二色性(CD)、洛瑞分析(Lowry assay)、二辛可宁酸(bicinchoninic acid,BCA)分析、抗体结合等。
本发明(例如参看实例2)中观察到,在2-8℃下当经由水平旋转式振荡器轻柔搅动时,在
缓冲盐水中调配且填充于单剂量注射器中的13价肺炎球菌连结物(13vPnC)将在10分钟
内从溶液中沉淀析出。(水平旋转式振荡器用于模拟13vPnC免疫原性组合物的典型加工、
装运和存储条件)。然而,意外地观察到,在2-8℃下轻柔搅动的在缓冲盐水和0.001%吐
温80中调配且填充于单剂量注射器中的13vPnC可稳定25天而无可见的沉淀迹象(资料
未显示)。因此,此资料表明,将表面活性剂(例如,吐温80)添加到免疫原性组合物调配物中会增强免疫原性组合物的稳定性。
存在吐温80(0.0%,表1)的13vPnC调配物的稳定性(即,通过测量13vPnC抗原性的改变
来分析)。如表1中所示,在2小时的分析中,13种血清型多糖(未用吐温80调配)的抗
原性显著降低。然而,特别引人注目的是,包含0.05%吐温80(表1)的13vPnC调配物在
2小时的抗原性分析中展现稳固的稳定性。还观察到,在250mL玻璃瓶中用0.01%吐温80
或0.05%吐温80调配的13vPnC可经受经由在2-8℃下涡旋所述调配物30分钟所诱导的
显著剪切力,存在极少或无抗原性损失(例如参看实例2,表2)。
盐缓冲液(pH6.0)、10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0和7.4)或10mM Tris缓冲液(pH7.5)中调
配的SCP(55μg/mL)涡旋2天后,SCP浓度明显降低(例如,大于90%)。然而,如图1B所
示,在2天的涡旋之前,将0.025%吐温80添加到SCP琥珀酸盐、SCP磷酸盐和SCP Tris调
配物中完全抑制SCP损失,这与图1A中所观察的相同。
调配物中不包括吐温80)的情况下,在5mM琥珀酸盐缓冲液(pH5.8)、0.85%NaCl和
AlPO4(0.25mg铝/ml)中调配13vPnC免疫原性组合物。
装运和处理条件。在这些实验(实例4)中观察到,具有较高聚硅氧含量的容器装置展现较
高程度的13vPnC微粒形成和较高的13vPnC抗原性损失百分比。对于微粒的FTIR分析表
明,所述微粒是由蛋白质和聚硅氧组成(资料未显示),且约85%的13vPnC与AlPO4结合,
其中剩余15%为在溶液中游离(未结合AlPO4)的13vPnC。
况下调配的13vPnC保持比在存在AlPO4的情况下调配的13vPnC高的免疫原性损失(例如
参看图6和图7)。
各种影响免疫原性组合物的稳定性的因素(例如,剪切力、装运搅动、硅油相互作用、吸附、制造工艺、温度、湿度、制造与使用之间的时间长度等)稳定且抑制其聚集或沉淀的新颖调配物。
种或多种多糖-蛋白质连结物。在其它实施例中,多糖-蛋白质连结物调配物包含于容器
装置中。在另一实施例中,本发明针对使链球菌C5a肽酶(SCP)组合物稳定的调配物,所述
调配物包含pH值缓冲盐水溶液,其中所述缓冲液具有约3.5到约6.5的pKa值;表面活性
剂;和链球菌C5a肽酶。在某些实施例中,SCP调配物包含于容器装置中。在另一实施例中,本发明针对使脑膜炎奈瑟菌2086蛋白组合物稳定的调配物,所述调配物包含pH值缓冲盐
水溶液,其中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值;表面活性剂;和脑膜炎奈瑟菌2086
蛋白。在某些实施例中,脑膜炎球菌2086调配物包含于容器装置中。
有约3.5到约7.5的pKa值;铝盐;和一种或多种多糖-蛋白质连结物。在另一实施例中,
本发明针对抑制聚硅氧诱导的硅化容器装置中所包含的链球菌C5a肽酶(SCP)组合物沉淀
的调配物,所述调配物包含pH值缓冲盐水溶液,其中所述缓冲液具有约3.5到约6.5的pKa
值;铝盐;和链球菌C5a肽酶。在某些其它实施例中,本发明针对抑制聚硅氧诱导的硅化容器装置中所包含的脑膜炎奈瑟菌2086蛋白组合物沉淀的调配物,所述调配物包含pH值缓
冲盐水溶液,其中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值;铝盐;和脑膜炎奈瑟菌2086蛋
白。
中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值;表面活性剂;和脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。在
某些实施例中,调配物包含于容器装置中。
解)且描述,并且其通常受多种物理化学应力的影响,包括热、压力、pH值、搅动、剪切力、冷冻-解冻、脱水、重金属、酚系化合物、硅油、变性剂等。
活性剂的调配物。
张力的分子、物质或化合物。如本文所定义,本发明的“表面活性剂”为降低免疫原性组合物调配物的表面张力的任何分子或化合物。
包括(但不限于)聚山梨醇酯20(吐温20)、聚山梨醇酯40(吐温40)、聚山梨醇酯60(吐
温60)、聚山梨醇酯65(吐温65)、聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯85(吐温85)、曲
通N-101、曲通X-100、氧托夕醇40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧化乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15,索罗托H15)、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯(克林莫佛
EL)、大豆卵磷脂、泊洛沙姆、十六烷基胺、十八烷基胺、氨基酸十八烷酯、溶血卵磷脂、二甲基-二十八烷基溴化铵、甲氧基十六烷基甘油、普流尼克多元醇(pluronicpolyol)、聚胺
(例如,吡喃、硫酸右旋糖苷、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyIC)、卡伯波(carbopol))、肽(例如,胞壁肽和二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬素(tuftsin)、油乳液、矿物凝胶(例如磷酸铝)和免疫刺激复合物(ISCOM)。
面活性剂降低、抑制或防止免疫原性组合物聚集的能力定性(例如目视检查微粒的形成)
或定量(例如,光散射、沉降速度离心、光密度、抗原性)评估表面活性剂。
烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、小瓶、小瓶密封物(例如,橡胶塞、螺旋盖)、安瓿、注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡胶密封物、塑料密封物、玻璃密封物等。本发明的容器装置不受制造材料的限制,且包括诸如玻璃、金属(例如,钢、不锈钢、铝等)和聚合物(例如,热塑性塑料、弹性体、热塑性塑料-弹性体)。
开目录中:美国塑料公司(United States Plastic Corp.)(俄亥俄州利马(Lima,OH))、
TM
VWR (宾西法尼亚州西切斯特(West Chester,PA))、BD生物技术公司(BDBiosciences)(新
泽西州弗兰克林湖(Franklin Lakes,NJ))、菲舍尔科技国际有限公司(Fisher Scientific International Inc.)(新罕布什尔州汉普顿(Hampton,NH))和西格玛-奥德里奇公司
(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))。
湿度、剪切力等)稳定,而且还增强免疫原性组合物对于诸如免疫原性组合物与容器/密封
物系统(例如,硅化容器装置)不相容等不利因素或影响的稳定性且抑制其沉淀。
日申请的共同待决的美国申请案第60/795,098号(特别以引用的方式并入本文中)描述
免疫原性组合物在容器装置(诸如注射器、玻璃小瓶、橡胶塞等)上所见的硅油存在下发生
聚集,其中将表面活性剂添加到容器装置中防止硅油诱导的这些免疫原性组合物聚集。
子具有免疫调节活性且因此可用作佐剂,包括(但不限于)白细胞介素1-α、1-β、2、4、5、
6、7、8、10、12(例如参看美国专利第5,723,127号)、13、14、15、16、17和18(和其突变形式);干扰素-α、β、γ;粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF,例如参看美国专利第
5,078,996号和ATCC登记号39900);巨噬细胞集落刺激因子(MCSF);粒细胞集落刺激因子
(GCSF);和肿瘤坏死因子α和β(TNF)。适用于本发明中的其它佐剂包括趋化因子,包括
(但不限于)MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。
MT)),其描述于美国专利第4,912,094号中,所述专利以引用的方式并入本文中。适用作
佐剂的还包括合成脂质A类似物,或氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)或其衍生物或类
似物,其购自科里沙公司(Corixa),蒙大拿州汉弥敦(Hamilton,MT)且描述于美国专利第
6,113,918号中,所述专利以引用的方式并入本文中。一种所述AGP为2-[(R)-3-十四烷
酰氧基十四烷酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦基-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰
基]-2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基-氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷,其也称为529(曾
称为RC529)。此529佐剂是调配为水溶液形式或稳定乳液形式(RC529-SE)。
苷;普流尼克多元醇;胞壁酰二肽;灭活博德特氏菌(killed Bordetella);皂草苷,诸如TM
契木伦QS-21(Stimulon QS-21)(马萨诸塞州弗拉明汉的安帝君斯公司(Antigenics,
Framingham,MA.),描述于美国专利第5,057,540号中,其以引用的方式并入本文中;和由其产生的颗粒,诸如ISCOMS(免疫刺激复合物)、ISCOMATRIX(澳大利亚派克威尔CSL有限
公司(CSL Limited,Parkville,Australia)),描述于美国专利第5,254,339号中;结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)细菌脂多糖;合成聚核苷酸,诸如含有CpG基元的
寡核苷酸(美国专利第6,207,646号,其以引用的方式并入本文中)、IC-31(奥地利维也
纳英特塞尔AG公司(Intercell AG,Vienna,Austria),描述于欧洲专利第1,296,713号和
第1,326,634号中;百日咳毒素(PT),或大肠杆菌热敏性毒素(LT),尤其LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129;例如参看国际专利公开案第WO93/13302号和第WO92/19265号,其以引用的方
式并入本文中。
天冬氨酸外)、优选组氨酸置换)。类似CT毒素或突变体描述于已公开的国际专利申请案
第WO02/098368号中(其中单独第16位氨基酸处的异亮氨酸经另一氨基酸置换,或者所
述置换与第68位氨基酸处的丝氨酸经另一氨基酸置换的组合;和/或其中第72位氨基
酸处的缬氨酸经另一氨基酸置换)中。其它CT毒素描述于已公开的国际专利申请案第
WO02/098369号(其中第25位氨基酸处的精氨酸经另一氨基酸置换;和/或将一个氨基酸
插入第49位氨基酸处;和/或将两个氨基酸插入第35位和第36位氨基酸处)。
水、无菌等渗盐水或生物缓冲剂。将多糖-蛋白质连结物和/或蛋白质免疫原与所述稀释
剂或载剂以常规方式混合。如本文所使用,短语“医药学上可接受的载剂”意欲包括与对
人类或其它脊椎动物宿主投药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸附延迟剂等。所属领域技术人员显而易见适当载剂且其在很大程度上视投药
途径而定。
降解调配物。
述组分制备具有适当pH值、等渗性、稳定性和其它常规特征的所述医药学上可接受的组合
物在所属领域的技术范围内。
在其它实施例中,本发明的多糖-蛋白质连结物调配物包含一种或多种脑膜炎球菌多糖。
在其它实施例中,本发明的多糖-蛋白质连结物调配物包含一种或多种肺炎球菌多糖、一
种或多种肺炎球菌多肽、一种或多种链球菌多糖、一种或多种链球菌多肽、一种或多种脑膜炎球菌多糖和/或一种或多种脑膜炎球菌多肽的组合。
糖、肺炎链球菌血清型18C多糖、肺炎链球菌血清型19F多糖、肺炎链球菌血清型23F多糖、肺炎链球菌血清型1多糖、肺炎链球菌血清型3多糖、肺炎链球菌血清型5多糖、肺炎链球
菌血清型6A多糖、肺炎链球菌血清型7F多糖和肺炎链球菌血清型19A多糖。
14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物和肺炎链球菌血清型23F多糖与CRM197多肽的
连结物。
链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的
连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型23F多糖与
CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型1多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型
3多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型5多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球
菌血清型6A多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型7F多糖与CRM197多肽的连结物
和肺炎链球菌血清型19A多糖与CRM197多肽的连结物。
备链球菌多糖(例如,一种或多种来自诸如A群链球菌、B群链球菌、C群链球菌和G群链球
菌等乙型溶血性链球菌(β-hemolytic Streptococcus)的多糖(或寡糖))和脑膜炎球菌
糖(例如,脑膜炎奈瑟菌脂寡糖(LOS)或脂多糖(LPS))。随后将经纯化多糖化学活化(例
如,经由还原胺化)以使所述糖能够与载体蛋白反应。活化后,即将各荚膜多糖与载体蛋白(例如CRM197)单独连结以形成糖连结物(或者,将各荚膜多糖与相同载体蛋白连结)并且
将其调配成单剂量调配物。
C7(β197)的培养物中分离的白喉毒素的无毒变体(即,类毒素)。将CRM197通过超滤、硫
酸铵沉淀和离子交换色谱纯化。或者,根据美国专利第5,614,382号(其以引用的方式并
入本文中)重组制备CRM197。其它白喉毒素也适于用作载体蛋白。
种SCP变体)。
诸如外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)或流感嗜血杆菌蛋白D。也可将诸如卵清蛋白、钥孔戚
血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)用作载体蛋白。
部过滤。
炎球菌连结物与生理学上可接受的媒剂一起调配来制备所述组合物。所述媒剂的实例包括
(但不限于)水、缓冲盐水、多元醇(例如,甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)和右旋糖溶液。
值;表面活性剂;和链球菌C5a肽酶。C5a肽酶为高度保守的丝氨酸蛋白酶且其在所有乙型
溶血性链球菌(例如A群、B群、C群和G群链球菌)中表达。举例来说,编码B群链球菌
(GBS)C5a肽酶的核苷酸序列与编码A群链球菌(GAS)C5a肽酶的核苷酸序列98%一致。因
此,在本发明的某些实施例中,针对由乙型溶血性链球菌所引起的感染的免疫原性组合物
包含C5a肽酶免疫原(或抗原)。
种SCP变体,所述专利各自特定地以引用的方式并入本文中)。在另一特定实施例中,用于
本发明的新颖免疫原性组合物调配物中的SCP是从B群链球菌克隆。在另一实施例中,已
使B群链球菌SCP序列基因突变以使其无蛋白分解活性(例如参看美国专利6,951,653、
6,355,255和6,270,775)且在大肠杆菌中表达为重组蛋白。
pKa值;表面活性剂;和脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。通过鉴别为“ORF2086”的核酸序列开放
式阅读框(ORF)编码脑膜炎奈瑟菌2086蛋白(例如参看国际公开案第WO03/063766A2号
(国际申请案第PCT/US02/32369号)、国际公开案第WO04/094596A2号(国际申请案第
PCT/US04/011901号)和国际公开案第WO04/065603A2号(国际申请案第PCT/US04/000800
号),其各自特定地以引用的方式并入本文中)。在另一实施例中,本发明针对使脑膜炎奈
瑟菌2086蛋白的抗原稳定性以及与铝盐佐剂(例如AlPO4)的结合百分比优化的调配物,其
中所述调配物包含pH值缓冲盐水溶液,其中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值;表
面活性剂;和脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。
的范围。
说,使各肺炎球菌多糖血清型在含大豆的培养基中生长,随后通过离心、沉淀、超滤和柱色谱来纯化个别多糖。将经纯化多糖化学活化以供连结,且将各多糖与CRM197载体蛋白单独
连结以形成糖连结物,并将其调配成单剂量调配物。
Sanford,NC))为从生长于含酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培养基中的白喉杆菌菌株
C7(β197)的培养物中分离的白喉毒素的无毒变体(即,类毒素)。通过超滤、硫酸铵沉淀
和离子交换色谱将CRM197纯化。
顿(Fullerton,CA))上进行光散射测量以检测免疫复合物来进行下文所述的抗原性实验。
随后将所检测的13种血清型中每一种的光散射测量值与标准曲线相比较并报导为抗原性
(μg/ml)。
TM TM
隆( )密封物的透明硼硅酸盐小瓶(VWR TraceClean ,40mL)是购自VWR (宾西
法尼亚州西切斯特(West Chester,PA))。聚山梨醇酯80(吐温80)是购自J.T.Baker(马
林克罗特贝克有限公司(Mallinckrodt Baker,Inc.);新泽西州菲利斯堡(Phillipsburg,NJ))。缓冲盐水为pH5.8的琥珀酸盐(5mM)和NaCl(0.85%)。
血清型连结物的最终浓度为4.4μg/mL(血清型6B除外,其为8.8μg/mL)。随后将13vPnC
调配物分到5个单独玻璃小瓶(每瓶50mL)中,其中将0.0%、0.001%、0.005%、0.01%
或0.05%吐温80(w/v)添加到5个小瓶中的一个中,且使各溶液过滤通过0.22μm杜鲁珀
( )过滤器(密理博公司(Millipore);马萨诸塞州毕莱卡(Billerica,MA))。接
TM
着,将0.65mL各溶液填充于分开的具有w4432灰色塞子的3mL BD海派SCF 玻璃注射器(BD
医疗器械公司(BD Medical Pharmaceutical Systems);新泽西州弗兰克林湖(Franklin
Lakes,NJ))中,并在2℃到8℃下将注射器放于水平旋转式振荡器(60cpm)上达100小时。
出。相比之下,在0.001%、0.005%、0.01%或0.05%吐温80中调配且在2-8℃下轻柔搅动的13vPnC可稳定长达25天,而无可见的沉淀迹象(资料未显示)。因此,此资料表明,将表
面活性剂(例如,吐温80)添加到免疫原性组合物调配物中会增强免疫原性组合物的稳定
性。
13vPnC。在不存在吐温80(即0.0%)的情况下调配的13vPnC制备如下:将0.85%盐水
(150mMNaCl)添加到1升派热克斯玻璃烧杯中,随后添加50mM琥珀酸盐缓冲液(最终浓
度5mM)和13vPnC,总体积为500mL。具有0.05%吐温80的13vPnC调配物制备如下:将
0.85%盐水(150mM NaCl)添加到1升派热克斯玻璃烧杯中,随后添加50mM琥珀酸盐缓冲
液(最终浓度5mM)、0.05%吐温80和13vPnC,总体积为500mL。500mL调配物中各血清型
连结物的最终浓度为4.4ug/mL(血清型6B除外,其为8.8μg/mL)。经由转子/定子均质机
以6,000rpm(2-8℃)将500mL调配物均质化120分钟。均质化过程产生空气-液体界面
(具有气泡)。
调配物中移出,将样本以1:2稀释于蛋白质稀释剂( 360蛋白质稀释剂(目录号
663630);贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter,Inc.);加州富尔顿(Fullerton,CA))中,且在 360系统上分析13vPnC的所有13种血清型的抗原性。
时的抗原性分析中展现稳固的稳定性,不存在抗原性的降低。
到3个包含0.0%、0.01%或0.05%吐温80的250mL玻璃瓶中。随后在涡旋振荡器
(Vortex-Genie 2;科技工业有限公司(Scientific Industries,Inc.);纽约州波
希米亚(Bohemia,NY))上将3个瓶涡旋30分钟(2-8℃)并在最高速度设定下产生空气-液
体界面。30分钟后,从各瓶中取出10-30mL样本,以1:2稀释于 360蛋白质稀释剂
中且在 360系统上分析13种血清型的抗原性。
2-10%的范围内降低(平均8%),且在存在0.05%吐温80的情况下调配的13vPnC的抗原
性在0-8%的范围内降低(平均3%)。因此,表2中所提供的数据表明,相对于在不存在吐
温80的情况下调配的13vPnC,在存在0.01%或0.05%吐温80的情况下调配的13vPnC明
显对于剪切力稳定。
下的抗原性 +涡旋下的抗 下的抗原性 +涡旋下的抗 下的抗原性 +涡旋下的抗
原性 原性 原性
1 4.7μg/mL 3.6μg/mL 4.8μg/mL 4.3μg/mL 4.7μg/mL 4.6μg/mL
3 4.6μg/mL 3.4μg/mL 4.7μg/mL 4.2μg/mL 4.7μg/mL 4.4μg/mL
4 5.5μg/mL 4.4μg/mL 5.9μg/mL 54μg/mL 5.9μg/mL 5.6μg/mL
5 3.2μg/mL 2.5μg/mL 3.5μg/mL 3.2μg/mL 3.3μg/mL 3.3μg/mL
6A 4.3μg/mL 3.6μg/mL 4.6μg/mL 4.5μg/mL 4.7μg/mL 4.8μg/mL
6B 9.7μg/mL 7.7μg/mL 10.2μg/mL 9.6μg/mL 10.2μg/mL 10.1μg/mL
7F 4.6μg/mL 3.5μg/mL 54μg/mL 5.0μg/mL 5.4μg/mL 5.3μg/mL
9V 5.3μg/mL 4.1μg/mL 5.7μg/mL 5.1μg/mL 5.6μg/mL 5.3μg/mL
14 6.8μg/mL 54μg/mL 7.3μg/mL 6.7μg/mL 7.4μg/mL 6.8μg/mL
18C 4.1μg/mL 3.4μg/mL 4.5μg/mL 4.3μg/mL 4.5μg/mL 4.5μg/mL
19A 5.1μg/mL 4.2μg/mL 5.5μg/mL 5.3μg/mL 5.6μg/mL 54μg/mL
19F 4.8μg/mL 3.6μg/mL 5.2μg/mL 4.9μg/mL 5.2μg/mL 5.1μg/mL
23F 3.0μg/mL 2.4μg/mL 3.4μg/mL 3.3μg/mL 3.5μg/mL 34μg/mL
解的大肠杆菌标准发酵方案。通过在搅拌下饱和达到60%(约3M)硫酸铵达12-24小时
从细胞溶解产物的可溶部分中纯化出重组SCP。将饱和溶解产物离心,保留上清液且将其
装载于苯基琼脂糖凝胶(phenyl Sepharose)疏水相互作用柱上。随后用1M硫酸铵、20mM
Tris-Cl(pH7.5)洗脱结合的物质,浓缩并对PBS(pH74)透滤。将经纯化重组SCP(rSCP)用
PBS(pH7.4)稀释到约10mg/mL,且使其通过伯斯蒂尼过滤器(Posidynefilter)以去除内毒
素,随后最终过滤(0.2mM)以使无菌且冷冻存储(-25℃)。
10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)或10mM Tris缓冲液(pH7.5);且将其填充于分开的BD海派
SCFTM注射器中。接着在2-8℃下,将注射器放于水平旋转式振荡器上,以180cpm振荡2天
且通过修正的洛瑞分析测定SCP蛋白浓度。
降低(例如大于90%)。然而,如图1B所示,在放于旋转式振荡器上达2天之前,将0.025%
吐温80添加到SCP缓冲液调配物中完全抑制图1A中所观察的SCP损失。
SCP(200μg):琥珀酸盐缓冲液(5mM,pH6.0)或磷酸盐缓冲液(15mM,pH7.4)、0.9%NaCl
和0.025%吐温80。通过尺寸排阻HPLC、修正的洛瑞总蛋白分析和沉淀的目视检查来分析
SCP/吐温80调配物的稳定性。在本研究中观察到,SCP/吐温80调配物(在任一缓冲液
中)在25℃和37℃下于整个稳定性研究中完全稳定(即,分别长达8周和6周)。
氏7025/65(合成异戊二烯溴丁基掺合物;西氏医药(West Pharmaceutical ),宾夕法尼
亚州市狮城(Lionville,PA))的立即可用(单剂量)贝克顿·迪金森(Becton Dickinson
,BD)海派1型硼硅酸盐玻璃注射器中时,13vPnC免疫原性组合物沉淀和/或聚集。在这
些实验中,在存在和不存在作为佐剂的0.25mg/mL磷酸铝的情况下,在含有0.85%NaCl和
4.4μg/ml肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F以及8.8μg/ml肺炎链球菌血清型6B的5mM琥珀酸盐缓冲液中调配13vPnC。观察到,在不存在AlPO4的情
况下,可易于观察到13vPnC微粒;而在存在AlPO4的情况下,13vPnC微粒明显减少且较难检测到。
用哈伯(Huber)或吉尔(Jar)方法使表3中所列的BD和西氏塞子硅化。哈伯硅化方法较易
控制且在塞子表面上产生30到60μg/cm2聚硅氧,而吉尔硅化方法在塞子表面上产生150
到300μg/cm2聚硅氧。根据理论计算,约15%塞子表面积暴露于注射器中的产物,表明对
于哈伯和吉尔方法,分别可从塞子提取出4.5到9μg和22.5到45μg聚硅氧。
在含有0.85%NaCl和4.4μg/ml肺炎链球菌血清型4、9、14、18C、19F和23F以及8.8μg/
ml肺炎链球菌血清型6B的5mM琥珀酸盐缓冲液中调配7vPnC。在存在和不存在0.25mg/mL
磷酸铝的情况下,在含有0.85%NaCl和4.4μg/ml肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、
14、18C、19A、19F和23F以及8.8μg/ml肺炎链球菌血清型6B的5mM琥珀酸盐缓冲液中调
配13vPnC。调配(在不存在磷酸铝的情况下,在含有0.85%NaCl的5mM琥珀酸盐缓冲液
中)浓度为61μg/ml的单价肺炎链球菌血清型6B,以模拟13vPnC调配物的总糖浓度。
博莱恩 旋转式振荡器上且以50rpm涡动整夜。结果概述于表3中。
组合物的等分试样离心且将离心块再悬浮于盐水中)。使用皮尔斯修正洛瑞蛋白质分析
(PierceModified Lowry protein assay)(目录号23240)以及牛血清白蛋白作为标准物来
进行分析。
的容器装置组分诱导形成白色微粒。相比之下,在存在未硅化大协(Daikyo )塞子(日
本大协精工株式会社(Daikyo Seiko,Ltd.,Japan))和肖特小瓶(北美肖特有限公司
(SchottNorth America Inc.);宾西法尼亚州莱巴嫩(Lebanon,PA))的情况下,未检测到微粒。
置组分的数量 (目视检查)
对照-在不存在AlPO4的情况下的13vPnC 无 无微粒
BD海派(Hypak)BSCF1-3ml4432/50灰色Si WWD塞 10 微粒
子
BD海派BSCF1-3ml4432/50灰色Si哈伯法处理的塞子 10 微粒
西氏890立即可用无菌塞 10 微粒
BD海派BSCF1-3ml W4416/50灰色Si1000WWD塞子 10 微粒
好威特(Helvoet)6213塞子 10 微粒
大协小瓶塞(D777-1B2-40F451塞子) 10 无微粒
BD海派BSCF1-3ml LLA EZGTC W7025/65注射管 4 微粒
海派NSCF1-3ml4023/50B2-40大协塞子 10 无微粒
注射器E-Z握把顶盖(Grip Tip Cap)W7025/65EZ IITC 10 无微粒
2ml、13mm肖特1型玻璃小瓶 4 无微粒
硅油(道氏化学品公司医药级360) 500μL(1.43%) 微粒
肖特拓普派克注射器 4 无微粒
到100ppm范围内的经调配单价6B的等分试样中。将混合物放于莱博莱恩旋转式振荡器上
以50rpm涡动2小时。如下表4所示,在所有聚硅氧(Si)浓度下观察到纤维状白色微粒。
2ppm(1μl Si比500mL调配物) 纤维状白色微粒
5ppm(2.5μl Si比500mL调配物) 纤维状白色微粒
10ppm(5μl Si比500mL调配物) 纤维状白色微粒
15ppm(7.5μl Si比500mL调配物) 纤维状白色微粒
20ppm(10μl Si比500mL调配物) 纤维状白色微粒
100ppm(2μl Si比20mL调配物) 纤维状白色微粒
己烷/异丙醇混合物提取。将提取液合并且蒸发。将残余物溶解且依据关于测定橡胶塞上
聚硅氧的现有方法加以测试。结果表明,可从各注射器提取出15.8到19.0μg聚硅氧。这
一量对应于2.7%到3.3%聚硅氧。
(资料未显示)。微粒的FTIR分析也表明,微粒是由蛋白质和聚硅氧组成(资料未显示)。
在这些实验中测定出,约85%13vPnC与AlPO4结合,其中剩余15%为在溶液中游离(未结
合AlPO4)的13vPnC。相比之下,观察到在用AlPO4调配的7vPnC为100%与AlPO4结合(资
料未显示)。
瓶中。将硅化塞(4432塞子)添加到各瓶且将其放于50rpm的旋转式振荡器中。小心目视
检查后,观察到7vPnC的上清液未形成微粒,因而保持澄清且无色。
度在25μg/ml到200μg/ml范围内的所述2种单价血清型。将硅化塞(4432塞子)放入
各调配物中,随后将其放于50rpm的旋转式振荡器上。如下表5中所示,在不存在AlPO4的
情况下,在所有蛋白质浓度下对两种单价血清型都观察到纤维状白色微粒。然而,在存在
AlPO4的情况下,相对于血清型6B(200μg/ml),血清型4(100μg/ml)在较低浓度时检测到
微粒,数据未显示。
19A、19F、23F和8.8μg/mL血清型6B的液体调配物,其也可在存在或不存在佐剂(例如,
铝佐剂)的情况下调配。也可在存在或不存在诸如每毫升磷酸铝(AlPO4)0.25mg铝的佐剂
的情况下调配13vPnC。在实例3中观察到,在不存在AlPO4的情况下调配且填充于BD海派
TM
SCF 注射器(盖有海派柱塞)中的13vPnC因观察到微粒而未通过目视检查,其中其它研究
揭示,所述微粒是部分由蛋白质-多糖与聚硅氧相互作用引起。在以下实例中,利用13vPnC调配物评估来自各种供应商的注射器(和柱塞),其中经由搅动模拟装运和处理条件(下文
所述)。
肺炎链球菌血清型连结物。接着在搅拌盘上小心地混合调配物且使其滤过0.22μm密理博
( )过滤元件。对于包含AlPO4的调配物,随后添加AlPO4(0.25mg/ml最终浓度)
且小心混合调配物。接着填充测试注射器(0.58ml/注射器)且用柱塞封盖。
保持在水平位置并在2-8℃下以500rpm暂停状态搅动24小时。
过添加1M柠檬酸立即中和溶液。对于不存在AlPO4的13vPnC来说,不进行溶解和中和程
序。所述分析使用贝克曼Array360散射浊度计(Beckman Array360nephelometer)测量由
样本中所形成的抗体-抗原复合物所引起的光散射强度的改变速率。
(L) (mg/mL) (μg/mL) 13vPnC体积(mL) 13vPnC体积(mL)
血清型1 2.000 0.506 4.4 17.39 17.39
血清型3 2.000 0.256 4.4 34.38 34.38
血清型4 2.000 0.530 4.4 16.60 16.60
血清型5 2.000 0.515 4.4 17.09 17.09
血清型6A 2.000 0.519 4.4 16.96 16.96
血清型6B 2.000 0.489 8.8 35.99 35.99
血清型7F 2.000 0.500 4.4 17.60 17.60
血清型9V 2.000 0.521 4.4 16.89 16.89
血清型14 2.000 0.518 4.4 16.99 16.99
血清型18C 2.000 0.509 4.4 17.29 17.29
血清型19A 2.000 0.511 4.4 17.22 17.22
血清型19F 2.000 0.520 4.4 16.92 16.92
血清型23F 2.000 0.511 4.4 17.22 17.22
0.85%盐水中的琥珀 2.000 50.0 5000 200.0 200.0
酸盐缓冲液,pH5.8
AlPO4 2.000 3.250 250 153.85 NA
盐水 2.000 NA NA 1387.62 154146
算搅动后抗原性损失(百分比)并绘示于图2到图7中。
条件以使抗原性损失在阳性对照中低,而在阴性对照中可检测到。这确保搅动不会太弱而
无法在注射器中产生沉淀,也不会太强以致沉淀可能是由除聚硅氧相互作用外的因素(例
如,剪切力)引起。因此,选择以500rpm(暂停状态)搅动24小时作为最适合的搅动条件,
同时使用2-8℃的温度和水平位置来模拟实时产品装运和处理条件。
射器(对照1)、BD贝克特注射器(注射器3;0.1mg聚硅氧)、BD高速(注射器5)和邦吉
PS4(BünderGlas PS4)注射器(注射器8,0.14mg聚硅氧)各自具有抗原性损失高于10%
的一种或多种13vPnC血清型。用AlPO4调配的13vPnC的最小抗原性损失出现于具有较低
聚硅氧含量的注射器中。举例来说,维特注射器(图4)和肖特拓普派克塑料注射器(图5)
与未经硅化的注射器(图2)最为相似,两者都展现用AlPO4调配的13vPnC的极小抗原性
损失。
贝克特低聚硅氧注射器(表6中的注射器4)和邦吉低聚硅氧PS2注射器(表6中的注射
器7)。BD贝克特低聚硅氧注射器(0.04mg聚硅氧/管)通常对于用AlPO4调配的13vPnC
血清型(图6A)具有小于10%的抗原性损失,而对于未用AlPO4调配的13vPnC血清型(图
6B)具有在从5%(血清型1)上至约50%(血清型23F)范围内的抗原性损失。邦吉低聚
硅氧PS2(0.056mg聚硅氧/管)注射器对于用AlPO4调配的13vPnC(图7A)具有小于5-8%
(视血清型而定)的抗原性损失,而对于未用AlPO4调配的13vPnC血清型(图7B)具有在
约5%到约30%(视血清型而定)范围内的抗原性损失。
存在AlPO4的13vPnC高的抗原性损失。
和随后的细胞溶解的大肠杆菌标准发酵方案。利用50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1%十二烷基
肌氨酸钠(sarcosyl)(pH8)自膜小球中纯化出重组脂化脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。将此十二
烷基肌氨酸钠提取物调节到1%两性洗涤剂3-14(Zwittergent3-14,Z3-14)中且对30倍
过量的50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1%Z3-14透析2次。将经透析rLP2086提取物用90%
乙醇沉淀以去除剩余十二烷基肌氨酸钠,并用50mM Tris-HCl/5mMEDTA/1%Z3-14(pH8)
溶解。通过离心去除不溶物质,使上清液通过阴离子交换色谱柱,且在未结合部分中收集
rLP2086。随后对30倍过量的25mM NaAc/1%Z3-14(pH4.5)透析未结合的物质2次,且使
其通过阳离子交换色谱柱。用0-0.3M NaCl梯度洗脱rLP2086且冷冻存储(-25℃)。
比较蛋白质与AlPO4佐剂的结合百分比。
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