用于控制植物寄生线虫的靶基因的鉴定和用途

摘要

本发明涉及鉴定和评估用于通过抑制一种或多种功能而控制植物寄生线虫的靶编码序列，及其用途。本发明提供了用于鉴定所述序列和用于控制植物寄生线虫群体的方法和组合物。通过使线虫摄食一种或多种本发明提供的重组双链RNA分子，可以通过抑制线虫基因表达获得疾病的减少。本发明也涉及用于制备表达双链RNA分子的转基因植物的方法，以及由其获得的植物细胞和植物。

权利要求

1.分离的双链核糖核苷酸，包含：

(a)与SEQ ID NO:1289的核苷酸931-1567互补的核苷酸序列，其足够抑制Cgh-1的表达；和(b)上述(a)的序列的互补序列，其中植物寄生线虫对所述双链核糖核苷酸的摄取抑制所述线虫的生长。

2.权利要求1的双链核糖核苷酸，定义为通过制备重组多核苷酸序列而产生，所述多核苷酸序列包含第一、第二和第三多核苷酸序列，其中第一多核苷酸序列包括足够抑制Cgh-1的表达的、与SEQ ID NO:1289的核苷酸931-1567互补的核苷酸序列，其中第三多核苷酸序列通过第二多核苷酸序列连接于第一多核苷酸序列，并且其中第三多核苷酸序列基本是第一多核苷酸序列的反向互补序列，使得当转录为核糖核酸时第一和第三多核苷酸序列杂交，形成由连接的第二核糖核苷酸序列稳定的双链核糖核苷酸分子。

3.包含多核苷酸的植物转化载体，其中所述多核苷酸与在植物细胞中起作用的异源启动子可操作性连接，所述多核苷酸选自：(a)与SEQ ID NO:1289的核苷酸931-1567互补的核苷酸序列；和(b)上述(a)的序列的互补序列。

4.用多核苷酸转化的细胞，所述多核苷酸选自：

(a)与SEQ ID NO:1289的核苷酸931-1567互补的核苷酸序列；和(b)上述(a)的序列的互补序列。

5.权利要求4的细胞，定义为原核细胞。

6.权利要求4的细胞，定义为真核细胞。

7.权利要求4的细胞，定义为植物细胞。

8.从多核苷酸转化的植物生产的农产品制品，所述多核苷酸选自：(a)与SEQ ID NO:1289的核苷酸931-1567互补的核苷酸序列；和(b)上述(a)的序列的互补序列，其中所述农产品制品包含可检测量的所述多核苷酸或由其表达的核糖核苷酸。

9.用于控制植物寄生线虫群体的方法，包括提供包含双链核糖核苷酸序列的试剂，其被线虫摄取后起作用，从而抑制所述线虫内的生物功能，其中所述试剂包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1289的核苷酸931-1567及其互补序列。

10.用于控制植物寄生线虫群体的方法，包括提供包含第一多核苷酸序列的试剂，所述第一多核苷酸序列在被病原体摄取后起作用，从而抑制所述线虫内的生物功能，其中所述多核苷酸序列在至少约19－约25个连续核苷酸上与来源于所述线虫的编码序列具有约95-约100％的核苷酸序列同一性，并且与第二多核苷酸序列杂交，所述第二多核苷酸序列与所述第一多核苷酸序列互补，并且其中来源于所述线虫的所述编码序列选自SEQ ID NO:1289的核苷酸931-1567及其互补序列。

11.权利要求10的方法，其中所述线虫是大豆异皮线虫。

12.用于控制植物寄生线虫群体的方法，包括在植物寄生线虫的宿主植物中提供转化的植物细胞，所述细胞表达权利要求1的双链核糖核苷酸，其中所述双链核糖核苷酸表达产生被植物寄生线虫摄取后起作用的双链核糖核酸，从而抑制所述线虫内靶序列的表达，并且导致相对于在缺乏转化的植物细胞的宿主上的生长，线虫的生长或线虫群体减少。

13.权利要求12的方法，其中所述线虫在感染宿主植物后表现出生长减少。

14.权利要求12的方法，其中所述靶序列编码蛋白，其预测的功能选自：DNA复制、细胞周期控制、转录、RNA加工、翻译、核糖体功能、tRNA合成、tRNA功能、蛋白运输、分泌、蛋白修饰、蛋白稳定性、蛋白降解、能量产生、线粒体功能、中间代谢、细胞结构、信号传导、胞吞作用、离子调节和转运。

15.权利要求12的方法，其中所述线虫选自异皮线虫、根结线虫、螺旋线虫、茎线虫、短体线虫、针线虫、盘旋线虫、小垫刃线虫、矮化线虫、纽带线虫、刺线虫、鳗线虫、亚鳗线虫和珍珠线虫。

16.权利要求15的方法，其中所述线虫是大豆异皮线虫。

17.权利要求12的方法，其中所述双链核糖核苷酸在被植物寄生线虫摄取后起作用，以抑制行使线虫存活或生长必须的功能的基因，所述功能选自：DNA复制、细胞周期控制、转录、RNA加工、翻译、核糖体功能、tRNA合成、tRNA功能、蛋白运输、分泌、蛋白修饰、蛋白稳定性、蛋白降解、能量产生、线粒体功能、中间代谢、细胞结构、信号传导、胞吞作用、离子调节和转运。

18.用于减少宿主植物的根组织中建立的异皮线虫摄食部位的数目的方法，包括在异皮线虫的宿主植物中提供转化的植物细胞，所述细胞表达权利要求1的双链核糖核苷酸，其中所述双链核糖核苷酸表达产生被异皮线虫摄取后起作用的双链核糖核酸，从而抑制所述线虫内靶序列的表达，并且导致相对于在缺乏转化的植物细胞的宿主上的生长，建立的摄食部位数目的减少。

19.控制植物中的植物线虫害虫侵袭的方法，包括在植物线虫害虫的食物中提供权利要求1的双链核糖核苷酸。

20.权利要求19的方法，其中所述食物包含经转化而表达所述双链核糖核苷酸的植物细胞。

21.用于改进从经受植物寄生线虫感染的作物产生的作物的产量的方法，所述方法包括以下步骤：a)将选自下组的多核苷酸导入所述作物植物：

(a)与SEQ ID NO:1289的核苷酸931-1567互补的核苷酸序列；和(b)上述(a)的序列的互补序列；

b)栽培所述作物植物以使得所述多核苷酸表达；

其中所述多核苷酸的表达抑制植物寄生线虫感染或生长以及由于植物寄生线虫感染导致的产量损失。

22.权利要求21的方法，其中所述作物植物是大豆(Glycine max)。

23.权利要求21的方法，其中所述多核苷酸的表达产生RNA分子，该RNA分子抑制与所述作物植物的一部分接触的植物寄生线虫中的至少第一靶基因，其中所述靶基因行使选自下组的至少一种必须功能：DNA复制、细胞周期控制、转录、RNA加工、翻译、核糖体功能、tRNA合成、tRNA功能、蛋白运输、分泌、蛋白修饰、蛋白稳定性、蛋白降解、能量产生、线粒体功能、中间代谢、细胞结构、信号传导、胞吞作用、离子调节和转运。

24.权利要求23的方法，其中所述植物寄生线虫是垫刃线虫。

25.权利要求24的方法，其中所述植物寄生线虫是异皮线虫。

26.权利要求25的方法，其中所述植物寄生线虫是大豆异皮线虫。

27.生产农产品制品的方法，包括获得用多核苷酸转化的植物或其部分，并且从所述植物或其部分制备商品，所述多核苷酸选自：(a)与SEQ ID NO:1289的核苷酸931-1567互补的核苷酸序列；和(b)上述(a)的序列的互补序列。

28.生产食物或饲料的方法，包括获得用多核苷酸转化的植物或其部分，并且从所述植物或其部分制备食物或饲料，所述多核苷酸选自：(a)与SEQ ID NO:1289的核苷酸931-1567互补的核苷酸序列；和(b)上述(a)的序列的互补序列。

29.权利要求28的方法，其中所述食物或饲料定义为油、粗粉、蛋白、淀粉、面粉或青贮饲料。

30.用于调节植物寄生线虫细胞中的靶基因表达的方法，该方法包括以下步骤：(a)用载体转化植物细胞，所述载体包含操作性连接于启动子和转录终止序列的、编码与SEQ ID NO:1289的核苷酸931-1567互补的dsRNA的核酸序列；

(b)在足够允许包含多个转化的植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养转化的植物细胞；

(c)选择已经将核酸序列整合到基因组中的转化的植物细胞；

(d)筛选转化的植物细胞中由核酸序列编码的dsRNA的表达；和(e)选择表达dsRNA的植物细胞。

31.权利要求30的方法，进一步包括从表达dsRNA的植物细胞再生植物；从而植物中的基因表达足以调节与转化的植物或植物细胞接触的植物寄生线虫的细胞中的靶基因表达。

32.权利要求12的方法，其中所述线虫是球异皮线虫。

说明书

用于控制植物寄生线虫的靶基因的鉴定和用途

[0001] 发明背景

[0002] 本申请要求2006年2月10日提交的美国临时专利申请60/772,265的利益和优先权，所述申请全文通过引用并入本文。

[0003] 1.发明领域

[0004] 本发明一般地涉及对植物寄生线虫导致的植物疾病的遗传控制。更具体地，本发明涉及靶编码序列的鉴定，并涉及用重组DNA技术进行植物寄生线虫的细胞中靶编码序列表达的转录后阻遏或抑制，以提供植物保护作用。

[0005] 2.相关领域的说明

[0006] 植物受到多种潜在致病剂的影响，所述致病剂包括植物寄生线虫，它们是生活在潮湿表面或液体环境，包括土壤中的水膜和其它生物中的潮湿组织中的活跃的、柔软的长形生物体。存在多种植物寄生线虫物种，包括多种孢囊线虫(如异皮线虫(Heterodera sp.))、根瘤线虫(如根结线虫(Meloidogyne sp.))、根腐线虫(如短体线虫(Pratylenchus sp.))、剑线虫(如剑线虫(Xiphinema sp))以及茎和球茎线虫(如茎线虫(Ditylenchus sp.))等。垫刃线虫(Tylenchid nematode)(垫刃线虫目的成员)，包括异皮线虫科、根结线虫科和短体线虫科，是植物寄生线虫的最大和经济上最重要的组。其它重要的植物寄生线虫包括矛线虫(如剑线虫)等。线虫物种经过一系列生命周期阶段和蜕皮而生长。典型地，存在5个阶段和4次蜕皮：卵阶段；J1(即第一幼虫阶段)；M2(即第一次蜕皮)；J2(第二幼虫阶段；有时从卵孵出)；M2；J3；M3；J4；M4；A(成虫)。幼虫(“J”)阶段有时称作幼虫(“L”)阶段。基因表达可能对一个或多个生命周期阶段是特异性的。

[0007] 一些线虫物种发展为非常成功的植物和动物两者的寄生虫，并且导致农业和畜牧业的严重经济损失，并且导致人的发病和死亡。植物的线虫寄生虫可以寄居在植物的所有部分，包括根、发育中的花芽、叶和茎。植物寄生虫根据它们的摄食习惯分类为以下大类：迁移性外寄生虫、迁移性内寄生虫和固着内寄生虫。固着内寄生虫，包括根瘤线虫(根结线虫)和孢囊线虫(球异皮线虫和异皮线虫)在根中诱导摄食部位(“合胞体(syncytia)”)并且建立长期感染，这对作物通常是非常有损害的。基于跨所有主要作物的估计每年平均12％的损失，估计寄生线虫使园艺和农业工业一年的花费超过780亿美元。例如，估计世界范围内线虫导致每年大约32亿美元的大豆损失(Barker et al.，1994)。

[0008] 已经以一些形式提供了控制线虫侵袭的组合物、方法和试剂。在多种情况下已经尝试了生物和培养控制方法，包括植物检疫。在一些作物中，已经鉴定了导致线虫抗性或耐受性的植物抗性基因。典型地将诸如杀线虫剂的化学组合物用于植物寄生线虫存在的土壤。但是，紧迫需要安全和有效的线虫控制。与目前控制策略的缺点相关的因素包括对农业的可持续性的考虑增加，以及可能阻止或严格限制使用很多可得到的农业化学抗杀虫剂的新的政府规章。

[0009] 化学试剂通常不是选择性的，并且将它们的作用施加在非靶生物上，有效破坏有益微生物群体，在施用试剂后的时间中持续。化学试剂可能在环境中持续存在，并且仅仅缓慢代谢。杀线虫的土壤熏蒸剂如三氯硝基甲烷和溴代甲烷和相关化合物是高度毒性的，并且已经将溴代甲烷鉴定为消耗臭氧的化合物。因此，其在美国的使用注册不能更新。这些试剂也可以在地下水位或食物链，以及在更高营养级的物种中积累。这些试剂也可以作为诱变剂和/或致癌剂，导致不可逆和有害的遗传修饰。因此，用于线虫控制的替代方法，如遗传方法的研究不断增加。

[0010] 生物秀丽新杆线虫(Caenorhabditis elegans)是一种食细菌的线虫，它是最广泛研究的线虫遗传模型。公共和私立数据库保有关于其遗传学和发育的大量信息，但是将这些信息实际用于控制植物寄生线虫仍然是一种挑战(McCarter et al.2003；McCarter 2004)。以前常规鉴定除秀丽新杆线虫外的线虫，如植物寄生线虫中的大量靶基因，用于随后例如通过RNAi分析进行功能分析是不实际的。因此，仍然需要用于鉴定靶基因的改进方法，所述靶基因的表达的抑制导致控制线虫侵袭。

[0011] 秀丽新杆线虫中的很多基因在后生动物，包括昆虫和脊椎动物以及其它线虫中具有直向同源物。近年中，已经从植物和动物的超过30种寄生线虫物种建立了广泛扩展的表达序列标签(EST)集合(Parkinson et al.，2004)。到2005年，在Genbank中有大约560,874种来自除新杆线虫物种外的线虫的核苷酸序列，并且正在进行公共项目，以建立北方根结线虫(Meloidogyne hapla)(根瘤线虫)，捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)(羊的寄生虫)，旋毛形线虫(Trichinella spiralis)(人和其它哺乳动物的寄生虫)(提交了430,000种序列痕迹)和Pristionchuspacificus(游离的活线虫)(提交了149,000种序列痕迹)的草稿序列。从大豆异皮线虫(Heterodera glycines)可以获得20,109种EST，代表大约9,000种基因的部分(参见例如2006年2月23日提交的美国申请序列号11/360,355)。预期保守序列通常在不同线虫中保持相同或非常相似的功能。通过用来自其它线虫的同源基因转化秀丽新杆线虫，在某些情况下已经证明了这种功能等同(Kwa et al.，1995；Redmond et al.2001)。已经在保守基因的跨门比较中显示了所述等同，并且预期在门内的物种之间更强。

[0012] RNA干扰(RNAi)是利用内源细胞途径的过程，从而双链RNA(dsRNA)特异性靶基因导致感兴趣的mRNA的降解。近年中，已经用RNAi在从线虫-秀丽新杆线虫到植物到昆虫胚的物种和实验系统中和组织培养物中的细胞中进行基因“击倒(knockdown)”(Fire et al.，1998；Martinez et al.，2002；McManus and Sharp，2002)。RNAi是通过内源途径起作用的，所述途径包括从原始dsRNA产生大约21个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)的切酶蛋白复合物和利用siRNA指导来识别和降解相应mRNA的RNA诱导的沉默复合物(RISC)。仅仅切割和降解了与siRNA互补的转录物，由此mRNA表达的击倒通常是序列特异性的。RNAi的基因沉默作用持续数日，并且，在实验条件下，可以导致靶定的转录物的丰度减少90％或更多，随后导致相应蛋白的水平降低。

[0013] 可以通过给线虫喂饲含有双链或小干扰RNA分子的溶液或将线虫浸入其中，并且通过注射dsRNA分子而在秀丽新杆线虫中实现通过RNAi进行的dsRNA介导的基因抑制(Kamath et al.，2001；Maeda et al.，2001)。已经进行了通过RNAi进行的一些大规模的秀丽新杆线虫基因的调查，使得可以对>90％的秀丽新杆线虫基因获得RNAi击倒信息(Gonczy et al.，2000；Fraser et al.，2000；Piano et al.，2000；Maeda et al.，2001；Kamath etal.，2003；Simmer et al.，2003；Ashrafi et al.，2003；Sonnichsen et al.，2005)。

[0014] 迄今为止，关于植物寄生线虫中的RNAi介导的基因抑制仅仅存在有限的公开技术或专利信息，其中从人工生长培养基(体外)或从植物组织(植物中)摄取双链(dsRNA)或小干扰(siRNA)分子。已经观察到RNAi在一些寄生线虫中起作用，包括植物寄生虫大豆异皮线虫和马铃薯白线虫(Globodera pallida)(Urwin et al.，2002；美国公开US2004/0098761；美国公开US2003/0150017；美国公开US2003/0061626；美国公开US2004/0133943；
Fairbairn et al.2005)、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)(WO2005/019408)，和哺乳动物寄生虫巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)(Hussein et al.，2002)、马来布鲁线虫(Brugia malayi)(Aboobaker et al.，2003)和旋盘尾丝虫
(Onchocercavolvulus)(Lustigman et al.，2004)。已经提示植物细胞中寄生虫特异性dsRNA的产生是用于控制植物寄生线虫的直接策略，所述线虫包括大豆孢囊线虫，即大豆异皮线虫(如Fire et al.，1998；美国公开US2004/0098761；WO 03/052110 A2；美国公开US2005/0188438)。美国公开US2006/0037101描述了用大豆异皮线虫序列，如来自pas5的大豆异皮线虫序列调节SCN基因表达。但是，还没有报道用于鉴定在所述策略中使用的靶线虫基因的系统方法，并且仅仅提出了有限数目的植物寄生线虫基因作为RNAi介导的基因抑制研究的潜在靶。

[0015] 附图简述

[0016] 图1：秀丽新杆线虫RNAi表型排序系统

[0017] 图2：秀丽新杆线虫P0RNAi喂饲研究的结果

[0018] 图3A-3D：基于秀丽新杆线虫直向同源物的前300个大豆异皮线虫基因靶的列表[0019] 发明概述

[0020] 本发明涉及用于控制植物寄生线虫导致的疾病的组合物和方法。本发明提供了示例性的核酸组合物，它们与靶植物寄生线虫中的一种或多种天然核酸序列的至少一部分是同源的。在某些实施方案中，线虫选自异皮线虫，根结线虫，球异皮线虫(Globodera sp.)，螺旋线虫(Helicotylenchus sp.)，茎线虫，短体线虫，针线虫(Paratylenchus sp.)，盘旋线虫(Rotylenchus sp.)，小垫刃线虫(Tylenchulus sp.)，矮化线虫(Tylenchorhynchus sp.)，纽带线虫(Hoplolaimus sp.)，刺线虫(Belonolaimus sp.)，鳗线虫(Anguina sp.)，亚鳗线虫(Subanguina sp.)和珍珠线虫(Nacobbus sp.)。具体地，线虫可以是异皮线虫，例如大豆异皮线虫。本发明提供的所述核酸的具体实例在所附序列表中表示为SEQ ID NOs:301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ IDNOs:1920-1929。但是，在某些实施方案中，本发明不包括SEQ IDNOs:525、569、797、1293或1516。

[0021] 因此，一方面，本发明提供了选自下组的分离的多核苷酸：(a)序列表所示SEQ ID NOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ IDNOs：1920-1929中任一个的核酸序列的至少21个连续核苷酸的片段，其中植物寄生线虫对包含至少一条与所述片段互补的链的双链核糖核苷酸序列的摄取，抑制所述线虫的生长；和(b)上述(a)的序列的互补序列。另一方面，本发明提供了这种分离的多核苷酸，进一步定义为与异源启动子可操作性连接。但是，在某些实施方案中，本发明不包括SEQ IDNOs：525、569、797、1293或1516。另一方面，本发明提供了这种分离的多核苷酸，进一步定义为包含在植物转化载体上。如本文用到的，植物寄生线虫的摄取包括线虫通过例如摄食而摄入一种或多种序列。在特定的非限制性实施方案中，摄取可通过使植物寄生线虫与包含一种或多种本发明的核酸的组合物接触而实现。例如，也可以通过用包含核酸的溶液浸泡植物寄生虫线虫而实现摄取。

[0022] 本发明也涉及从上述多核苷酸的表达产生的双链核糖核苷酸序列，其中植物寄生线虫对所述核糖核苷酸序列的摄取抑制所述所述线虫的生长。本发明进一步提供了通过制备重组多核苷酸序列而产生的双链核糖核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含第一、第二和第三多核苷酸序列，其中第一多核苷酸序列包括分离的多核苷酸，植物寄生线虫对其的摄取抑制所述线虫的生长、摄食或发育，其中第三多核苷酸序列通过第二多核苷酸序列连接于第一多核苷酸序列，并且其中第三多核苷酸序列基本是第一多核苷酸序列的反向互补序列，使得当转录为核糖核酸时第一和第三多核苷酸序列杂交，形成由连接的第二核糖核苷酸序列稳定的双链核糖核苷酸分子。可以通过抑制植物寄生线虫中与第一多核苷酸的序列基本互补的核苷酸序列的表达而实现线虫生长、摄食或发育的抑制。

[0023] 本发明进一步提供了包含上述核苷酸序列的植物转化载体，其中所述序列与在植物细胞中起作用的异源启动子可操作性连接，并且提供了用该载体转化的细胞。细胞可以是原核或真核细胞。具体地，它们可以是植物细胞。也涉及来源于所述转化的植物细胞的植物和种子。本发明进一步提供了从所述植物生产的农产品制品，其中所述农产品制品包含可检测量的权利要求1的多核苷酸或由其表达的核糖核苷酸。也涉及生产所述农产品制品的方法，该方法是通过获得所述转化的植物并且由其制备食物或饲料。具体地，食物或饲料定义为油、粗粉、蛋白、淀粉、面粉或青贮饲料。

[0024] 本发明也涉及用于控制植物寄生线虫，如大豆异皮线虫的群体的方法，包括提供包含双链核糖核苷酸序列的试剂，其被线虫摄取后起作用，以抑制所述线虫内的生物功能，其中所述试剂包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ IDNOs：1920-1929，及其互补序列。但是，在某些实施方案中，本发明不包括SEQ ID NOs：525、569、797、1293或1516。多核苷酸序列可以在至少约19-约25个连续核苷酸上与来源于所述线虫的靶编码序列具有约95-100％的核苷酸序列同一性。靶序列可以编码蛋白，所述蛋白的预测功能选自：DNA复制、细胞周期控制、转录、RNA加工、翻译、核糖体功能、tRNA合成、tRNA功能、蛋白运输、分泌、蛋白修饰、蛋白稳定性、蛋白降解、能量产生、线粒体功能、中间代谢、细胞结构、信号传导、胞吞作用、离子调节和转运。

[0025] 本发明进一步提供了用于减少宿主植物的根组织中建立的异皮线虫摄食部位的数目的方法，包括在异皮线虫的宿主植物中提供转化的植物细胞，所述细胞表达SEQ ID NOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929中任一个的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸表达产生被异皮线虫摄取后起作用的双链核糖核酸，以抑制所述线虫内靶序列的表达，并且导致相对于在缺乏转化的植物细胞的宿主上的生长，建立的摄食部位数目的减少。

[0026] 本发明也涉及用于改进从经受植物寄生线虫感染的作物植物产生的作物的产量的方法，所述方法包括以下步骤：a)将选自SEQ IDNOs:301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929的多核苷酸导入所述作物植物；b)栽培所述作物植物以使得所述多核苷酸表达，其中所述多核苷酸的表达抑制植物寄生线虫感染或生长以及由于植物寄生线虫感染导致的产量损失。但是，在某些实施方案中，本发明不包括使用选自SEQ ID NOs：525、569、797、1293或1516的多核苷酸。具体地，作物植物可以是大豆(Glycine max)，并且植物寄生线虫是垫刃线虫，如大豆异皮线虫。

[0027] 本发明还提供了用于调节植物寄生线虫细胞中的靶基因表达的方法，该方法包括以下步骤：(a)用载体转化植物细胞，所述载体包含操作性连接于启动子和转录终止序列的、选自SEQ ID NOs：301-1026、SEQ IDNOs:1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929的编码dsRNA的核酸序列；(b)在足够允许包含多个转化的植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养转化的植物细胞；(c)选择已经将核酸序列整合到基因组中的转化的植物细胞；(d)筛选转化的植物细胞中由核酸序列编码的dsRNA的表达；和(e)选择表达dsRNA的植物细胞。但是，在某些实施方案中，本发明不涉及使用SEQ ID NOs：525、569、797、1293或1516。植物也可以从所述植物细胞再生。具体地，“调节表达”可以包括抑制表达。

[0028] 本发明也涉及用于鉴定基因的方法，所述基因在靶线虫的生命周期中可能是必须的，该方法包括：(a)根据选自下组的一个或多个标准对秀丽新杆线虫基因排序：报道的RNAi表型的效能；报道的表型的置信水平；和RNAi在线虫生命周期中多个阶段的作用的可能性，从而获得表型评分，其中高排序指示出与较低排序的基因中展示可检测的RNAi表型的可能性相比，具有更高的展示所述表型的可能性的秀丽新杆线虫基因；(b)通过在蛋白或核酸数据库中进行序列相似性检索，鉴定靶线虫的基因组中秀丽新杆线虫基因的可能直向同源物，使得当与秀丽新杆线虫序列比较时，来自除秀丽新杆线虫外的线虫的、BLAST e-值的阈值为e-10的蛋白或核酸序列被认为是秀丽新杆线虫序列的可能的直向同源物；(c)在步骤(b)的可能的直向同源物中鉴定来自除秀丽新杆线虫外的线虫的、在步骤(a)中展示的表型评分在所有秀丽新杆线虫基因中位于前3.5％的那些基因。但是，在某些实施方案中，本发明不包括SEQ ID NOs：525、569、797、1293或1516的鉴定。

[0029] 发明详述

[0030] 下文是对本发明的详细描述，其被提供来协助本领域技术人员实践本发明。本领域普通技术人员可不离开本发明宗旨或范围的情况下在本文所述的实施方式中做出改良和变化。

[0031] 本发明提供了用于遗传控制植物寄生线虫侵袭的方法和组合物。也提供了用于鉴定基因的方法，所述基因对于植物寄生线虫的生命周期是必须的，用作对线虫群体的dsRNA介导的控制的靶。设计了编码dsRNA分子的DNA质粒载体，以抑制生长和发育必须的基因。例如，本发明提供了用于转录后阻遏或抑制植物寄生线虫中靶编码序列表达的方法和重组DNA技术，以便通过使植物寄生线虫摄入从靶编码序列的全部或一部分转录的一种或多种双链或小干扰核糖核酸(RNA)分子而提供保护作用，从而控制感染。因此，本发明涉及用双链RNA(dsRNA)，包括小干扰RNA(siRNA)对编码序列的表达进行序列特异性抑制，以实现预期的线虫控制水平。

[0032] 另一方面，本发明提供了用于评估基因可用作dsRNA介导的基因抑制的靶的可能性的方法，所述抑制是为了控制线虫群体。通过RNAi实现寄生虫控制的一个挑战是合适的基因靶的选择，所述基因靶在转录物击倒后将导致寄生虫生命周期的破坏。由于测试大豆异皮线虫中的候选基因的系统的通量是有限的，在测试前对靶进行优先化是重要的。基于RNAi的功能性基因组筛选是高度有效的滤器，其可以使靶选择缩窄一个数量级或更多。在某些实施方案中，线虫是植物寄生线虫。在另一实施方案中，线虫是植物寄生垫刃线虫。在另一实施方案中，线虫是异皮线虫。在另一实施方案中，线虫是大豆孢囊线虫(大豆异皮线虫)。

[0033] 本发明也提供了用于抑制植物病原体大豆孢囊线虫，即大豆异皮线虫中的靶基因功能的方法，并且可以通过RNA干扰实现，导致病原体生命周期的破坏。用于破坏的最优靶基因包括生命周期必须的基因，其中所述破坏通过以对植物的最小摄食损害阻断繁殖、减少建立的摄食部位的数目，以及最少的到达下一代的存活逃逸蠕虫，导致寄生虫群体的高外显率死亡或“遗传死亡”。本发明的另一方面提供了预测是大豆异皮线虫生长和/或发育必须的300种靶基因(图3)中每一个基因的核酸。用于预测所述靶的特征包括与具有强的和可再现的RNA干扰表型的已知秀丽新杆线虫基因的直向同源性，以及大豆异皮线虫中的表达模式。

[0034] 在本发明的另一方面，提供了一组分离和纯化的核苷酸序列，如SEQ ID NOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929所示。但是，在某些实施方案中，本发明不包括SEQ ID NOs：525、569、797、1293或1516。本发明提供了用于表达一种或多种抑制植物寄生线虫中靶基因表达的RNA的稳定化的dsRNA分子，所述dsRNA分子是从这些序列及其片段表达的。稳定化的dsRNA，包括dsRNA或siRNA分子，可以包含相对于至少一个启动子以有义和反义方向排列的至少两个编码序列，其中包含有义链和反义链的核苷酸序列是通过至少约5-约1000个核苷酸的间隔序列连结或连接的，其中有义链和反义链可以是不同的长度，并且其中两个编码序列中的每一个都与SEQ IDNOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-
1702和SEQ ID NOs：1920-1929所示的任意一个或多个核苷酸序列具有至少80％以上的序列同一性、至少90％以上、至少95％以上、至少98％以上或100％序列同一性。

[0035] 另一方面，本发明提供了重组DNA构建体，其包含本文描述的编码dsRNA分子的核酸分子。dsRNA可以通过从核苷酸序列转录dsRNA分子的一条链而形成，所述核苷酸序列与选自SEQ ID NOs：301-1026、SEQ IDNOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929的核苷酸序列具有至少约80％-约100％的同一性。所述重组DNA构建体可以定义为产生dsRNA分子，所述dsRNA分子在摄入后能够抑制植物寄生线虫细胞中内源靶基因的表达。该构建体可以包含本发明的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作性连接于在宿主细胞，如植物细胞中起作用的启动子序列。所述启动子可以是组织特异性的，并且可以例如对作为植物寄生线虫攻击对象的组织类型是特异的。例如，分别在根或叶病原体的情况下，可能需要分别采用提供根或叶优选的表达的启动子。

[0036] 本发明的核酸构建体可以包含至少一个非天然存在的核苷酸序列，其可以转录为单链RNA，所述单链RNA能够通过分子间杂交体内形成dsRNA分子。所述dsRNA序列自组装，并且可以提供在植物寄生线虫的营养源中，以实现需要的抑制。

[0037] 重组DNA构建体可以包含两个不同的非天然存在的序列，所述序列当体内表达为dsRNA序列并且提供在植物寄生线虫的宿主植物的组织中时，抑制植物寄生线虫中至少两种不同的靶基因的表达。在某些实施方案中，在细胞或包含细胞的植物中产生至少2、3、4、5、6、8或10种或更多种不同的dsRNA，其具有线虫抑制作用。可以从导入不同转化事件或可以导入在单个核酸分子上的多个构建体表达dsRNA。可以用单个启动子或多个启动子表达dsRNA。在本发明的一个实施方案中，产生单个dsRNA，其包含与植物寄生线虫内的多个基因座同源的核酸。

[0038] 另一方面，本发明提供了重组宿主细胞，其基因组中具有至少一种重组DNA序列，该序列转录产生至少一种dsRNA分子，所述dsRNA分子当被植物寄生线虫摄入时起作用，从而抑制线虫中靶基因的表达。该dsRNA分子可以由本文描述和序列表中所示的任何核酸编码。本发明也提供了转化的植物细胞，其基因组中具有至少一种本文描述的重组DNA序列。也提供了包含所述转化的植物细胞的转基因植物，包括任何世代的后代植物、种子和植物产品，它们均包含重组DNA。本发明的dsRNA分子可以存在于转基因植物细胞中，例如细胞质中。它们也可以存在于质外体间隙中。

[0039] 本发明也提供了一种或多种稳定序列，或“钳”，其可以与感兴趣的基因无关。钳优选包含富含GC的区域，其用于热动力学稳定dsRNA分子，并且可以增加基因沉默。

[0040] 本发明进一步提供了选自SEQ ID NOs：301-1026、SEQ IDNOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929的核酸序列的片段。所述片段可以定义为当表达为dsRNA并且被线虫摄入时，导致植物寄生线虫的死亡、生长抑制或感染或摄食停止。该片段可以例如包含SEQ IDNOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929或其互补序列中任意一个或多个序列的至少约19、21、23、25、40、60、80、100、125或更多个连续的核苷酸。但是，在某些实施方案中，本发明不包括SEQ ID NOs：525、569、797、1293或1516的片段或互补序列。用于本发明的一种有益的DNA片段的长度是至少约19个-约23个，或约23个-约100个核苷酸，但小于约2000个核苷酸。特别有用的将是包括约23个-约300个与线虫靶序列同源的核苷酸的dsRNA序列。本发明也提供了从任何所述序列表达的核糖核酸，包括dsRNA。选用于表达基因抑制剂的序列可以从单个序列构建，所述单个序列来源于一种或多种靶植物寄生线虫物种，并且意欲用于表达在抑制一种或多种靶病原体中单个基因或基因家族中起作用的RNA，或该DNA序列可以从多个DNA序列构建为嵌合体。

[0041] 在另一实施方案中，本发明提供了用于调节线虫细胞中靶基因的表达的方法，该方法包括：(a)用载体转化植物，所述载体包含操作性连接于启动子和转录终止序列的编码dsRNA的核酸序列；(b)在足够允许包含多个转化的植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养转化的植物细胞；(c)选择已经将所述载体整合到基因组中的转化的植物细胞；(d)筛选转化的植物细胞中由所述载体编码的dsRNA的表达；(e)选择表达dsRNA的植物细胞；(f)任选从表达dsRNA的植物细胞再生植物；从而植物中的基因表达足以调节接触转化的植物或植物细胞的植物寄生线虫的细胞中靶基因的表达。基因表达的调节可以包括所述表达的部分或完全抑制。

[0042] 另一方面，本发明提供了用于抑制植物寄生线虫中的基因表达的方法，包括在线虫宿主的组织中提供基因抑制量的至少一种从本文描述的核苷酸序列转录的dsRNA分子，所述核苷酸序列的至少一个片段与植物寄生线虫细胞中的mRNA序列互补。该方法可以进一步包括观察植物寄生线虫的死亡或生长抑制，以及宿主症候群的程度。由致病微生物摄入的本发明的dsRNA分子，包括其修饰形式，如siRNA分子，可以与从选自SEQ ID NOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ IDNOs：1920-1929的核苷酸序列转录的RNA分子具有至少约80、81、82、83、84、85、86、87、8889、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或约100％同一性。

[0043] 因此提供了用于转录本发明的dsRNA分子的分离和基本纯化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的核苷酸序列和重组DNA构建体，其当导入植物寄生线虫时，阻抑或抑制植物寄生线虫中内源编码序列或靶编码序列的表达。也涉及转基因植物，其(a)包含编码用于转录dsRNA的、分离和基本纯化的核酸分子和非天然存在的重组DNA构建体的核苷酸序列，所述dsRNA分子用于控制植物寄生线虫感染；和(b)展示对感染的抗性和/或增强的耐受性。也包括含有本发明的dsRNA核苷酸序列的组合物，其用于局部施用到植物上或动物上或动物的环境中，以实现植物寄生线虫感染的消除或减少。

[0044] 可以选择编码存活所必须的蛋白或蛋白的部分，如参与多种代谢或分解代谢生化途径、细胞分裂、繁殖、能量代谢、消化等的氨基酸序列的cDNA序列，用于制备要在植物寄生线虫的宿主植物中提供的双链RNA分子。如上文所描述的，靶生物摄入含有一种或多种dsRNA的组合物可以导致靶的死亡或其它抑制，所述dsRNA的至少一个片段相应于靶病原体细胞中产生的至少一个基本相同的RNA片段。这些结果表明，来源于植物寄生线虫的核苷酸序列，即DNA或RNA，可以用于构建抗线虫侵袭的植物细胞。例如，可以转化线虫的宿主植物，以含有一种或多种来源于本文提供的线虫的核苷酸序列。转化到宿主中的核苷酸序列可以编码在转化的宿主中的细胞或生物流体中形成dsRNA序列的一种或多种RNA，从而使得如果植物寄生线虫形成与转基因宿主的营养关系/当植物寄生线虫形成与转基因宿主的营养关系时，可以获得dsRNA。这可以导致植物寄生线虫细胞中一种或多种基因的表达，并且最终导致其死亡或其生长或发育的抑制。

[0045] 本发明一般涉及宿主生物中的植物寄生线虫的遗传控制。更具体地，本发明包括用于将线虫控制剂送递到植物寄生线虫的方法。所述控制剂直接或间接导致植物寄生线虫摄食、生长或其它方式导致靶宿主疾病的能力受损。本发明在一个实施方案中提供了一种方法，包括将稳定化的dsRNA分子送递到植物寄生线虫，作为抑制植物寄生线虫中被靶定的基因的工具，由此实现线虫宿主中植物疾病的所需控制。

[0046] 在实现前述内容的过程中，本发明提供了抑制植物寄生线虫中靶基因表达的方法，导致植物寄生线虫生长、发育、繁殖和/或摄食的停止，并且最终可能导致植物寄生线虫的死亡。在一个实施方案中，该方法包括将稳定化的双链RNA(dsRNA)核苷酸分子，包括其修饰形式，如小干扰RNA(siRNA)序列导入用于植物寄生线虫的营养组合物，并且使植物寄生线虫可以获得所述营养组合物或食物源。摄入含双链或siRNA分子的营养组合物导致线虫细胞摄取分子，导致线虫细胞中至少一种靶基因的表达的抑制。靶基因的抑制对线虫施加有害作用。所述方法和相关组合物可以通过在线虫宿主中提供包含本文描述的dsRNA分子的一种或多种组合物，限制或消除线虫存在的任何宿主组织或环境中或所述组织或环境上的线虫对植物或植物细胞的感染或寄生。

[0047] 在某些实施方案中，本发明提供的dsRNA分子包含与SEQ IDNOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929中任意一个所示的序列互补的核苷酸序列，植物寄生线虫中所述序列的抑制导致线虫生长和发育或其它生物功能所必须的蛋白或核苷酸序列试剂的减少或除去。选择的核苷酸序列可以与SEQ ID NOs：301-1026、SEQ IDNOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929所示的核苷酸序列，包括其互补序列之一具有约80％-约100％的序列同一性。但是，在某些实施方案中，本发明不包括与SEQ ID NOs：525、569、
797、1293或1516具有80-100％同一性的序列。所述抑制可以描述为特异性的，因为来自靶基因的一部分的核苷酸序列是从抑制性dsRNA或siRNA转录的序列中选择的。该方法可有效抑制至少一种靶基因的表达，并且可以用于抑制植物寄生线虫中很多不同类型的靶基因。

[0048] 鉴定为具有线虫防护作用的序列可以通过建立合适的表达构建体容易地表达为dsRNA分子。例如，通过以下步骤可以将所述序列表达为发夹以及茎和环结构：首先采用相应于选自SEQ ID NOs：301-1026、SEQID NOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929或其片段的序列的第一片段，将该序列连接于不与第一片段同源或互补的第二片段间隔区，并且将其连接于转录RNA的第三片段，其中第三片段的至少一部分是与第一片段基本互补的。所述构建体通过第一片段与第三片段的杂交体形成茎和环结构，并且形成包含第二片段的环结构(WO94/01550，WO98/05770，US2002/0048814A1和US2003/0018993A1)。可以例如以双链结构，如茎环结构(如发夹)的形成产生dsRNA，从而通过例如在额外的植物表达盒上共表达被靶定基因的片段而增强靶定线虫序列的siRNA的产生，所述表达盒导致增强的siRNA产生或减少甲基化，以防止dsRNA发夹启动子的转录基因沉默(如WO05/019408)。

[0049] 本发明的方法和组合物可以用于任何单子叶和双子叶植物，这取决于需要的病原体(如线虫)控制。所述植物的实例包括但不限于苜蓿、朝鲜蓟、芦笋、大麦、菜豆、甜菜、椰菜、卷心菜、卡诺拉(canola)、胡萝卜、木薯、花椰菜、玉米、棉花、黄瓜、葡萄、燕麦、洋葱、豌豆、花生、马铃薯、稻、黑麦、高粱、大豆、菠菜、南瓜、糖甜菜、甘蔗、向日葵、烟草、番茄、草坪草和小麦植物。

[0050] 通过本发明保护的植物所针对的示例性植物寄生线虫和它们的相应植物包括但不限于：苜蓿：起绒草茎线虫，北方根结线虫，南方根结线虫，爪哇根结线虫，短体线虫(Pratylenchus spp.)，Paratylenchus spp.，剑线虫；香蕉：相似穿孔线虫，Helicotylenchus multicinctus，南方根结线虫，花生根结线虫，爪哇根结线虫，咖啡短体线虫，肾形小盘旋线虫；菜豆和豌豆：根结线虫，异皮线虫，刺线虫，螺旋线虫，肾形小盘旋线虫，Paratrichodorus anemones，毛刺线虫；木薯：肾形小盘旋线虫，根结线虫；谷类：麦粒鳗线虫(二粒小麦，黑麦，斯佩耳特小麦)，Bidera avenae(燕麦，小麦)，起绒草茎线虫(黑麦，燕麦)，Subanguina radicicola(燕麦，大麦，小麦，黑麦)，Meloidogyne naasi(大麦，小麦，黑麦)，短体线虫(燕麦，小麦，大麦，黑麦)，Paratylenchus spp.(小麦)，矮化线虫(小麦，燕麦)；鹰嘴豆：Heterodera cajani，肾形小盘旋线虫，Hoplolaimusseinhorsti，根结线虫，短体线虫；柑橘：Tylenchulus semipenetrans，相似穿孔线虫，柑橘穿孔线虫，
Hemicycliophora arenaria，短体线虫，根结线虫，Bolonolaimus longicaudatus，毛刺线虫.，Paratrichodorus spp.，剑线虫；三叶草：根结线虫，Heterodera trifolii；玉米：短体线虫，Paratrichodorus minor，长针线虫，哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimuscolumbus)；棉花：南方根结线虫，Belonolaimus longicaudatus，肾形小盘旋线虫，Hoplolaimus galeatus，短体线虫，矮化线虫，Paratrichodorusminor；葡萄：剑线虫，伤残短体线虫，根结线虫，Tylenchulussemipenetrans，肾形小盘旋线虫；草：短体线虫，长针线虫，
Paratrichodorus christiei，剑线虫，茎线虫；花生：短体线虫，北方根结线虫，花生根结线虫，轮线虫，Belonolaimus longicaudatus；鸽子豆：Heterodera cajani，肾形小盘旋线虫，Hoplolaimus seinhorsti，根结线虫，短体线虫；马铃薯：马铃薯金线虫，Globodera pallida，根结线虫，短体线虫，Trichodorus primitivus，茎线虫，Paratrichodorus spp.，异常珍珠线虫；稻：贝氏滑刃线虫，窄小茎线虫，Hirchmanniella spp.，水稻异皮线虫，根结线虫；小水果：根结线虫；短体线虫，剑线虫，长针线虫，Paratrichodorus christiei，滑刃线虫；大豆：大豆异皮线虫，南方根结线虫，爪哇根结线虫，刺线虫，哥伦比亚纽带线虫；糖甜菜：甜菜异皮线虫，起绒草茎线虫，根结线虫，异常珍珠线虫，毛刺线虫，长针线虫，Paratrichodorus spp.；甘蔗：根结线虫，短体线虫，穿孔线虫，异皮线虫，纽带线虫，螺旋线虫，盾线虫，刺线虫，矮化线虫，剑线虫，长针线虫，Paratrichodorus spp.；烟草：根结线虫，短体线虫，克莱顿矮化线虫，烟草球异皮线虫，毛刺线虫，美洲剑线虫，起绒草茎线虫，Paratrichodorusspp.；和番茄：短体线虫，根结线虫。

[0051] 本发明也提供了用于控制植物寄生线虫感染的方法组合和组合物。一种方法提供了本文描述的用于保护植物抵抗植物寄生线虫的dsRNA方法，以及一种或多种具有与dsRNA方法和组合物不同的特征的化学试剂，并且可以干扰线虫生长或发育。

[0052] A.核酸组合物和构建体

[0053] 本发明提供了用于实现特定宿主靶的稳定转化的重组DNA构建体。转化的宿主靶可以表达有效水平的来自所述重组DNA构建体的优选dsRNA或siRNA分子。可以从cDNA文库和/或基因组文库信息提供成对的分离和纯化的核苷酸序列。核苷酸序列对可以来源于任何线虫，用作热扩增引物，以产生本发明的dsRNA和siRNA分子。

[0054] 本文中使用的术语“核酸”指从5’至3’末端读码的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单或双链聚合物。任选地，“核酸”还可含有非天然存在的或被改变的核苷酸碱基，其允许通过聚合酶的正确读码，并且不会减少该核酸编码的多肽的表达。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”指作为单独的单链存在或存在于双链体中的核酸的有义和反义链。术语“核糖核酸”(RNA)包括RNAi(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微RNA)、tRNA(转运RNA、被或未被相应的酰化氨基酸加上电荷的)以及cRNA(互补RNA)，术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA和基因组DNA以及DNA-RNA杂交体。词汇“核酸片段”、“核苷酸序列片段”或更常见的“片段”将被本领域技术人员理解为功能性术语，其包括基因组序列、核糖体RNA序列、转运RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列和更小的工程化的核苷酸序列，所述序列表达或可适于表达蛋白质、多肽或肽。

[0055] 根据本发明，提供了核苷酸序列，其表达得到与植物寄生线虫中的靶基因的RNA分子的全部或部分显著同源的RNA序列，所述线虫包含由线虫基因组中的核苷酸序列编码的RNA序列。因此，在摄入稳定化的RNA序列后，可以获得对植物寄生线虫细胞中靶基因的核苷酸序列的下调，导致对线虫的生长、存活力、增殖或繁殖的有害作用。

[0056] 本文中使用的术语“显著同源”或者“显著同源性”，在提到核酸序列时，包括在严格条件下与序列表中SEQ ID NOs：301-1026、SEQ IDNOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929中任意一个所示的编码序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。在严格条件下与序列表中SEQ IDNOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929的任意序列或其互补序列杂交的序列是允许两条序列间发生反向平行排列的序列，然后两条序列能在严格条件下与相反链上的对应碱基形成氢键，以形成双链体分子，其在严格条件下是足够稳定的，使用本领域公知方法能检测到。优选地，显著同源的序列与序列表中的SEQ IDNOs：301-
1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929中任意一个所示的参照核苷酸序列或其互补序列具有大约70％-大约80％的序列同一性，或者更优选地，大约80％-大约85％的序列同一性，或者最优选地，大约90％-大约95％的序列同一性，至大约99％的序列同一性。

[0057] 本文使用的术语“直向同源物”是指两种或多种物种中从共同的祖先核苷酸序列进化，并且可能在所述两种或多种物种中保留相同功能的基因。

[0058] 本文中使用的术语“序列同一性”、“序列相似性”或“同源性”被用于描述两条或多条核苷酸序列之间的关系。两条序列之间“序列同一性”的百分比是通过下述方法来测定的：在比较窗上比较两条最优比对的序列，其中，较之参照序列(不包含添加或缺失)，比较窗中序列的一部分可以包含添加或缺失(即，空位)，用于最优比对两条序列。通过下述方法来计算百分比：测定两条序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量，以产生匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗中的位置总数，将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。与参照序列比较时每个位置都相同的序列被认为与对照序列相同，反之亦然。如果第一条核苷酸序列展示出与第二条或参照序列的完全互补性，以5’至3’方向来观察时，第一条核苷酸序列被认为是以3’至5’方向来观察的第二条或参照核苷酸序列的“互补序列”或与其互补。在本文中，以5’至3’方向读码的序列之一中的每个核苷酸与以3’至5’方向读码的其它序列的每个核苷酸都互补的时候，认为核酸序列分子展示出“完全互补性”。与参照核苷酸序列互补的核苷酸序列将展示出与参照核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这些术语和描述在本领域中有明确的定义，是本领域普通技术人员易于理解的。

[0059] 本文中使用的“比较窗”指，至少6个连续位置的概念上的片段，通常大约50至大约100，更常见地，大约100至大约150个连续位置，其中，两条序列被最优比对之后，将一条序列与具有同样数量连续位置的参照序列相比。较之参照序列(不包含添加或缺失)，比较窗可以包含大约20％或更少的添加或缺失(即，空位)，用于两条序列的最优比对。本领域技术人员将参考Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，Wis.，USA)中用于序列比对的详细方法或参考Ausubel et al.(1998)中关于序列分析的详细讨论。

[0060] 本发明还提供了DNA序列，其能在细胞或微生物中表达为RNA，以便抑制植物寄生线虫细胞、组织或器官中靶基因的表达。该序列包含编码一种或多种不同核苷酸序列的DNA分子，其中，不同核苷酸序列中的每一种都包含有义核苷酸序列和反义核苷酸序列。所述序列可以由编码本发明的dsRNA分子的间隔序列连接。间隔序列可以构成有义核苷酸序列或反义核苷酸序列的部分，并且形成于有义和反义序列之间的dsRNA分子内。有义核苷酸序列和反义核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列或其衍生物或其互补序列基本相同。dsDNA分子被可操作地置于启动子序列的控制下，所述启动子序列在宿主的细胞、组织或器官中发挥作用，表达dsDNA，产生dsRNA分子。在一种实施方案中，DNA序列可以来源于序列表中SEQ ID NOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ IDNOs：1920-1929所示的核苷酸序列。

[0061] 本发明还提供了DNA序列，用于在植物细胞中表达，并且，随着DNA表达为RNA以及被植物寄生线虫摄入，能获得对植物寄生线虫细胞、组织或器官中靶基因的表达的抑制。dsRNA可以包含一种或多种结构基因序列，其中，每种结构基因序列都包含可以由间隔序列连接的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列，所述序列在互补和反义序列中形成环。有义核苷酸序列和反义核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列或其衍生物或其互补序列基本相同。一种或多种结构基因序列可以被可操作性地置于一种或多种启动子序列的控制下，其中至少一种在原核或真核生物，特别是植物细胞、组织或器官中是可操作的。在植物中表达基因抑制分子的方法是已知的(如WO06073727 A2；美国公开2006/0200878A1)，并且可以用于表达本发明的核苷酸序列。

[0062] 本发明的用于控制植物寄生线虫的基因序列或片段可被克隆到在转基因植物细胞中可操作的两种组织特异性启动子，例如两种根特异性启动子之间，所述基因序列或其片段可在植物细胞中表达，在转基因植物细胞中产生mRNA，其形成dsRNA分子。根特异性启动子的实例是本领域已知的(如线虫诱导的启动子RB7启动子；美国专利5,459,252；Opperman et al.1994)。植物组织中含有的dsRNA分子被植物寄生线虫摄入，从而获得对靶基因表达的预期抑制。

[0063] 花椰菜花叶病毒35S启动子，即转基因植物应用中常见的一种原始型强启动子，或相关启动子，如E35S或FMV启动子，可以用于驱动线虫抗性基因，特别是孢囊线虫(参见例如实施例8)。也已经鉴定了在植物中的线虫诱导的摄食结构中指导基因表达的启动子(如Gheysen andFenoll，2002)。因此，可以利用从在摄食部位可再现地表达的基因中鉴定启动子。由线虫形成的摄食部位(合胞体)中上调的基因的实例包括Hslpro-1(Thurau et al.2003)，正常情况下在伴胞中表达的AtSUC2(Juergensen et al.2003)，在血管组织和根尖中表达的At17.1(Mazarei etal.2004)，FGAM合酶(磷酸核糖基甲酰-甘氨脒合酶)(Vaghchhipawala etal.2004)和ABI3(De Meutter et al.2005)，以及其它。反应于孢囊线虫而形成的合胞体已经描述为合胞地分离的，缺乏对周围组织的胞间连丝(Bockenhoff and Grundler 1994；Bockenhoff et al.1996)，但是，已经显示最高达30kD的大分子可以从韧皮部伴胞转移到合胞体中(Hoth et al.2005)。因此，韧皮部中的基因表达也可以适用于将效应分子送递到摄食部位。

[0064] 本发明提供的核苷酸序列可以包含被“间隔序列”分离开的反向重复序列。间隔序列可以是包含下述任何核苷酸序列的区域，如果需要，所述核苷酸序列能促进每个重复序列之间二级结构形成。在本发明的一种实施方式中，间隔序列是mRNA的有义或反义编码序列的一部分。或者，间隔序列可以包含能与核酸分子共价连接的核苷酸或其同源物的任何组合。间隔序列可包含例如长度为至少大约10-100个核苷酸的核苷酸序列，或者长度为至少大约100-200个核苷酸，长度为至少大约200-400个核苷酸，或者长度为至少大约400-500个核苷酸。

[0065] 序列表中的核酸分子或核酸分子的片段或其它核酸分子能在某些条件下特异性地与其它核酸分子杂交。本文中，如果两个核酸分子能形成反向平行的双链核酸结构，就说两个核酸分子能互相特异性杂交。如果两个核酸分子展示出完全互补性，我们就说一个核酸分子是另一个核酸分子的互补序列。如果在至少传统的“低严格性”条件下，两个分子能以足够的稳定性互相杂交，允许它们保持为互相退火的状态，我们就说这两个分子是“最小互补的”。类似地，如果在传统的“高严格性”条件下，两个分子能以足够的稳定性互相杂交，允许它们保持为互相退火的状态，我们就说这两个分子是互补的。传统的严格条件在Sambrook，et al.(1989)，和Haymes et al.(1985)中有所描述。

[0066] 因此，与完全互补有背离是允许的，只要这种背离不会使分子形成双链结构的能力完全消失即可。因此，为使核酸分子或核酸分子的片段被用作为引物或探针，仅需要序列足够互补，能在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构即可。

[0067] 能促进DNA杂交的合适的严格条件是，例如，大约45℃下，6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着在50℃用2.0xSSC洗涤，这是本领域技术人员已知的，或者可在Current Protocols in Molecular Biology(1989)中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自：50℃下大约2.0xSSC的低严格性，至50℃下大约0.2xSSc的高严格性。此外，洗涤步骤的温度可以从室温，即约22℃下的低严格性条件至约65℃下的高严格性条件。温度和盐可都改变，或者，温度或者盐浓度可以保持恒定，而其它变量改变。用于本发明的核酸可以在所述条件下与来自线虫的一种或多种核酸分子或其互补序列特异性杂交。优选地，用于本发明的核酸将与序列表中SEQ ID NOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ IDNOs：1920-1929所示的一种或多种核酸分子具有至少大约80％，或者至少大约90％，或者至少大约95％，或者至少大约98％，或者甚至大约100％的序列同一性。

[0068] 本发明的核酸还可以是通过本领域已知的方法完全或部分合成的。因此本发明核酸的全部或部分可以是使用选择的宿主优选的密码子来合成的。物种优选的密码子可以通过，例如，从在特定宿主物种中表达的蛋白中使用最频繁的密码子来确定。对核苷酸序列的其它修饰可以得到具有轻微改变的活性的突变体。

[0069] dsRNA或siRNA核苷酸序列包含聚合的核糖核苷酸的双链，并且可以包含对磷酸-糖主链或核苷的修饰。RNA结构的修饰可以进行调整，以允许特异性遗传抑制。在一种实施方式中，可通过酶方法对dsRNA分子进行修饰，从而可以产生siRNA分子。siRNA可有效介导针对一些病原体中的一些靶基因的下调作用。这种酶方法可通过在真核RNAi途径中利用昆虫、脊椎动物、真菌或植物细胞中存在的RNAse III酶或DICER酶来完成(Elbashir et al.，2001；Hamilton and Baulcombe，1999)。该方法还可利用本领域技术人员容易了解的通过重组DNA技术引入到靶昆虫细胞中的重组DICER或RNAse III来进行。天然存在于病原体中的或通过重组DNA技术制造的DICER酶和RNAse III能将较大的dsRNA链切割为较小的寡核苷酸。DICER酶能特异性地将dsRNA分子切割为siRNA片段，其中，每个siRNA片段的长度为大约19-25个核苷酸，而RNAse III酶通常将dsRNA分子切割为12-15个碱基对的siRNA。通过上述任何酶产生的siRNA分子具有2至3个核苷酸的3’突出端和5’磷酸和3’羟基末端。通过RNAse III酶产生的siRNA分子与在真核RNAi途径中通过Dicer酶产生的那些相同，因此，然后可被靶定，并在随后松散之后被内在的细胞RNA降解机制降解，分离为单链RNA，并且与靶基因转录的RNA序列杂交。这种方法导致对病原体中靶基因的核苷酸序列编码的RNA序列进行有效降解或除去。结果就是病原体中被特别靶定的核苷酸序列的沉默。对酶方法的细节描述可在Hannon(2002)中找到。

[0070] 本发明的核苷酸序列可被记录到计算机可读介质上。本文中使用的“计算机可读介质”指：可通过计算机直接阅读和存取的任何有形表达介质。此类介质包括但不限于：磁性存储介质，例如软盘，硬盘，存储介质和磁带；光学存储介质，例如CD-ROM；电子存储介质，例如RAM和ROM；光学字符识别格式的计算机文档，以及上述种类的杂合体，例如，磁性/光学存储介质。本领域技术人员可以容易地认识到，目前任何已知的计算机可读介质可被用于制造下述产品，所述产品包含记录本发明的核苷酸序列的计算机可读介质。

[0071] 本文中使用的“记录”指，用于在计算机可读介质上存贮信息的方法。本领域技术人员可以容易地采用任何目前已知的方法来在计算机可读介质上记录信息，以产生包含本发明核苷酸序列信息的介质。对于本领域技术人员来说，多种数据存储结构是可获得的，用于制造记录本发明核苷酸序列的计算机可读介质。对数据存储介质的选择通常将基于选用来存取被存储信息的手段。此外，多种数据处理器程序和格式可用于将本发明核苷酸序列存储到计算机可读介质上。序列信息可展示于字处理文本文档中，以可通过商业途径获得的软件，例如WordPerfect和Microsoft Word的格式，或者其可展示为ASCII文本文档的形式，存储于数据库应用中，例如DB2、Sybase、Oracle等。本领域技术人员可以容易地改编任何数量的数据处理器结构化格式(例如，文本文档或数据库)，以获得记录有本发明核苷酸序列信息的计算机可读介质。

[0072] 允许本领域技术人员存取计算机可读介质中提供的序列信息的计算机软件是公众可获得的。在Sybase系统上执行BLAST(Altschul etal.，1990)和BLAZE(Brutlag et al.，1993)检索算法的软件可被用于鉴定序列中的读码框(ORF)，例如，本文提供的、含有与来自其它生物的ORF或蛋白的同源性的Unigene和EST。此类ORF是本发明序列中编码蛋白质的片段，可用于生产商业上重要的蛋白，例如，用于氨基酸生物合成、代谢、转录、翻译、RNA加工、核酸和蛋白降解、蛋白质修饰和DNA复制、限制、修饰、重组和修复的酶。

[0073] 本发明还提供了含有本文所述的序列信息的系统，特别是基于计算机的系统。此类系统被设计为：能鉴定出本发明的核酸分子中的商业上重要的片段。本文中使用的“基于计算机的系统”指用于分析本发明核苷酸信息的硬件设备、软件设备和数据存储设备。本发明的基于计算机的系统的最小硬件设备包含中央处理器单元(CPU)、输入设备、输出设备和数据存储设备。本领域技术人员可以容易地理解，目前可获得的基于计算机的系统中任何一种都适合用于本发明。

[0074] 本文中使用的“靶结构基序”或“靶基序”指，合理选出的任何序列或序列组合，其中，基于靶基序折叠时形成的三维构型来选择序列。本领域已知多种靶基序。蛋白靶基序包括但不限于，酶活性位点和信号序列。核酸靶基序包括但不限于，启动子序列、顺式作用元件、发夹结构以及诱导型表达元件(蛋白结合序列)。

[0075] B.重组载体和宿主细胞转化

[0076] 重组DNA载体可以是例如线性的或封闭的环状质粒。载体系统可以是单一载体或质粒，或两种或多种载体或质粒，它们一起含有将被引入细菌宿主基因组中的总DNA。此外，细菌载体可以是表达载体。SEQID NOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929所示的核酸分子或其片段可以，例如，合适地插入到载体中，所述载体处于合适启动子的控制之下，所述启动子在一种或多种微生物宿主中发挥作用，以驱动所连接的编码序列或其它DNA序列的表达。为此目的，很多载体都是可获得的，对合适载体的选择将主要取决于要插入到载体中的核酸的大小以及将用载体转化的特定宿主细胞。每种载体都含有多种组分，这取决于其功能(扩增DNA或表达DNA)以及与其相容的特定宿主细胞。用于细菌转化的载体组分通常包括但不限于下述组分中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种选择标记基因以及允许外源DNA表达的诱导型启动子。

[0077] 表达和克隆载体通常含有选择基因，其也被称为选择标记。该基因编码在选择性培养基中生长的转化的宿主细胞存活或生长所必需的蛋白。典型的选择基因编码下述蛋白，所述蛋白：(a)赋予对抗生素或其它毒素，例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，(b)补足营养缺陷，或(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养物，例如，编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。这些被异源蛋白或其片段成功转化的细胞能产生赋予药物抗性的蛋白，由此能在选择方案中存活。

[0078] 用于生产mRNA的表达载体还可含有下述诱导型启动子，所述启动子能被宿主细菌生物识别，并与核酸可操作性连接。适合用于细菌宿主的诱导型启动子包括β-内酰胺酶启动子，大肠杆菌λ噬菌体PL和PR启动子，以及大肠杆菌半乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子以及乳糖操纵子启动子及其变体和杂合启动子，例如，tac启动子。但是，其它已知的细菌诱导型启动子也是合适的。

[0079] 在提到调节序列和结构核苷酸序列时，术语“可操作性连接”指，调节序列导致相连的结构核苷酸序列的受调节的表达。“调节序列”或“控制元件”指位于结构核苷酸序列上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非翻译序列)的核苷酸序列，其能影响到相关结构核苷酸序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的时机和水平或数量。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、增强子、茎-环结构、阻遏物结合序列以及聚腺苷化识别序列等。

[0080] 对含有一种或多种上面列出的组分的合适载体的构建利用标准的重组DNA技术来进行。对经过分离的质粒或DNA片段加以切割，剪切，并重新连接为产生所需质粒想要的形式。可获得的细菌表达载体的例子包括但不限于，多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如，BluescriptTM(Stratagene，La Jolla，CA)，其中，例如，图3所示的核酸或其片段可以与β-半乳糖苷酶氨基末端Met和随后七个残基的序列符合读码框地连接到载体中，由此产生杂合蛋白；pIN载体(Van Heeke and Schuster，1989)等。

[0081] 本发明还考虑将本发明的核苷酸序列转化进植物，使得一种或多种dsRNA分子能以线虫抑制水平表达。使用本领域可获得的方法，可以容易地制备转化载体。转化载体包含一种或多种下述核苷酸序列，所述序列能被转录为RNA分子，并且与靶线虫基因组编码的一种或多种核苷酸序列显著同源和/或互补，使得靶植物寄生线虫摄取由一种或多种核苷酸序列转录的RNA时，会对线虫基因组中各个核苷酸序列中的至少一种的表达进行下调。

[0082] 转化载体还可称作dsDNA构建体，其还可被定义为重组分子、疾病控制剂、遗传分子或嵌合遗传构建体。本发明的嵌合遗传构建体可包含，例如，编码一种或多种反义转录物、一种或多种有义转录物、上述一种或多种物质的核苷酸序列，其中，来自其的转录物的全部或部分与下述RNA分子的全部或部分同源，所述RNA分子包含病原体基因组中核苷酸序列编码的RNA序列。

[0083] 在一种实施方式中，植物转化载体包含分离和纯化的DNA分子，其中包含与本发明的一种或多种核苷酸序列可操作地连接的异源启动子。核苷酸序列选自序列表中的SEQ ID NOs：301-1026、SEQ IDNOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929。核苷酸序列包括下述片段，其编码靶线虫RNA转录物中存在的RNA的全部或部分，并且可包含靶线虫RNA的全部或部分的反向重复序列。包含表达载体的DNA分子还可含有功能性内含子序列(其定位于编码序列的上游或者甚至在编码序列之中)，还可以含有五撇(5’)非翻译前导序列(即，UTR或5’-UTR)，其定位于启动子和翻译起始位点之间。

[0084] 植物转化载体可以含有来自一种以上基因的序列，由此允许一种以上的dsRNA产生，用于抑制靶线虫细胞中两种或多种基因的表达。本领域技术人员容易理解，具有相应于不同基因中存在的序列的序列的DNA片段可组合成单一的复合DNA片段，用于在转基因植物中表达。或者，可对已含有至少一种DNA片段的本发明质粒加以修饰，这是通过将额外DNA片段顺序插入到增强子和启动子和终止子序列之间来进行的。在设计用来抑制多种基因的本发明疾病控制剂中，待抑制基因可从同一植物寄生线虫物种中获得，以增强控制剂的有效性。在某些实施方式中，基因可从不同的植物寄生线虫获得，以拓宽试剂有效针对的线虫范围。当为了抑制或针对表达和抑制的组合而靶定多种基因时，可以按照美国公开号US2004-0029283所阐述和公开的，来制造多顺反子DNA元件。

[0085] 在不同植物物种中具有功能的启动子也是本领域公知的。可用于在植物中表达多肽的启动子包括，Odell et al.(1985)所述的诱导型、病毒、合成或组成型启动子，和/或被从时间上调节、空间上调节以及空间-时间调节的启动子。优选的启动子包括增强的CaMV35S启动子以及FMV35S启动子。具有根特异性的CaMV35S启动子的片段也可以是优选的。就本发明的目的而言，可以优选在植物根组织中获得这些基因的最高水平表达。大量的根增强启动子已被鉴定出来，它们是本领域已知的(如美国专利5,110,732；5,837,848；5,459,252；Hirel et al.1992)。

[0086] 本发明的重组DNA载体或构建体可以包含选择标记，其能在植物细胞上赋予选择表型。选择标记还可用于选出含有编码本发明多肽或蛋白的外源核酸的植物或植物细胞。标记可以编码杀生物剂抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、G418博来霉素、潮霉素等)或除草剂抗性(例如，草甘膦等)。选择标记的例子包括但不限于，编码卡那霉素抗性并且可以选择用于使用卡那霉素、G418等的neo基因；编码双丙氨膦抗性的bar基因；突变EPSP合酶基因，其编码草甘膦抗性；腈水解酶基因，其赋予对溴苯腈的抗性；突变乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其赋予对咪唑啉酮或磺脲的抗性；以及抗甲氨喋呤的DHFR基因。存在多种选择标记，其赋予对氨苄青霉素、博莱霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲喋呤、膦苏菌素(phosphinothricin)、嘌呤霉素、壮观霉素、立福平和四环素等的抗性。所述选择标记的实例说明于美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047。

[0087] 本发明的重组载体或构建体还可包括筛选标记。筛选标记可被用于监视表达。示例性的筛选标记包括，β-葡糖苷酸酶或uidA基因(GUS)，其编码已知有多种发色底物的酶(Jefferson，1987；Jefferson et al.，1987)；R-基因座基因，其编码能对植物组织中花青素色素(红色)的产生进行调节的产物(Dellaporta et al.，1988)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffeetal.，1978)，该基因编码已知有多种发色底物(例如，PADAC，发色头孢菌素)的酶；萤光素酶基因(Ow et al.，1986)；xylE基因(Zukowskyet al.，1983)，其编码儿茶酚加双氧酶，所述酶能转化发色的儿茶酚；α-淀粉酶基因(Ikatu et al.，1990)；酪氨酸酶基因(Katz et al.，1983)，其编码能将酪氨酸氧化为DOPA以及多巴醌的酶，多巴醌随后缩合为黑色素；α-半乳糖苷酶，其能催化发色的α-半乳糖底物。

[0088] 优选的植物转化载体包括来自根癌土壤杆菌的Ti质粒(例如，美国专利号4,536,475、4,693,977、4,886,937、5,501,967和EP0122791)。发根土壤杆菌质粒(或“Ri”)也可使用，它们是本领域已知的。其它优选的植物转化载体包括例如Herrera-Estrella(1983)、Bevan(1983)、Klee(1985)和EP 0 120516所公开的那些。

[0089] 通常，优选在植物基因组中非特异性位置引入功能性重组DNA。在特殊情况下，通过定点整合插入重组DNA构建体可能是有用的。存在一些已知能使植入物具有功能的多种定点重组系统，其包括美国专利4,959,317公开的cre-lox和美国专利5,527,695公开的FLP-FRT。

[0090] 用于本发明的转化宿主细胞的合适方法包括几乎任何可以将DNA引入细胞的方法(参见例如Miki et al.，1993)，例如通过原生质体转化(美国专利号5,508,184；Omirulleh et al.，1993)、干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus et al.，1985)、电穿孔(美国专利号5,384,253)、用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler et al.，1990；美国专利号5,302,523；和美国专利号5,464,765)、土壤杆菌介导的转化(美国专利号5,591,616和美国专利号5,563,055)和DNA包被的粒子加速(美国专利号5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,
861；6,403,865；Padgette et al.，1995)等。通过诸如上述的技术的应用，可以稳定转化几乎任何物种的细胞。在多细胞物种的情况下，可以使转基因细胞再生为转基因生物。

[0091] 用于将表达载体导入植物中的最广泛使用的方法是基于土壤杆菌的天然转化系统(例如Horsch et al.，1985)。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是植物致病土壤细菌，其遗传转化植物细胞。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。用于土壤杆菌介导的基因转移的土壤杆菌载体系统和方法的描述由许多参考文献提供，包括Gruber et al.1993；Miki et al.，1993，Moloney et al.，1989，和美国专利号：4,940,838和5,464,763。其它与植物天然相互作用的细菌，如中华根瘤菌、根瘤菌和中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)可以进行修饰，以介导基因转移到许多不同的植物。通过获得卸甲的Ti质粒和合适的二元载体(Broothaerts et al.2005)可以使这些植物相关合胞细菌成为基因转移的成分。

[0092] 建立转基因植物，特别是在植物中表达异源核酸的方法是已知的，并且可以用本文提供的核酸制备转基因植物，其对靶线虫的摄食的易感性降低。例如，通过将本文公开的产生dsRNA的核酸插入植物转化载体并且将其引入植物，可以制备植物转化载体。通过修饰根癌土壤杆菌的天然基因转移系统，得到了一种已知的载体系统。天然系统包含大Ti(肿瘤诱导)质粒，其含有称作T-DNA的大片段，其转移到转化的植物中。Ti质粒的另一个片段，即vir区，负责T-DNA转移。T-DNA区的边界是末端重复序列。在修饰的二元载体中，去除了肿瘤诱导基因，并且利用vir区的功能转移边界为T-DNA边界序列的外来DNA。T区也可以含有用于有效回收转基因植物和细胞的选择标记和多个克隆位点，所述位点用于插入一些序列，所述序列用于转移例如dsRNA编码核酸。

[0093] 典型地，使用土壤杆菌转化方法形成的转基因植物含有插入到一条染色体中的单个简单重组DNA序列，其被称为转基因事件。此类转基因植物可被称为对于插入的外源序列是杂合的。对于转基因体来说纯合的转基因植物可以通过使独立分离的转基因植物有性地与自身，例如F0植物交配(自交)产生F1种子而获得。产生的F1种子中的四分之一将是对于转基因来说纯合的。使F1种子发芽，就产生了可被测试杂合性的植物，典型地，使用SNP测定或热扩增测定来进行，所述测定允许杂合体和纯合体之间的区别(即，接合性测定)。杂合植物的自交或与另一种杂合植物的杂交仅仅得到杂合后代。

[0094] C.核酸表达和靶基因抑制

[0095] 作为实例，本发明提供了致病靶生物的转化的宿主植物、转化的植物细胞以及转化的植物和它们的后代。转化的植物细胞和转化的植物可以工程化，以在异源启动子的控制下表达本文公开的一种或多种dsRNA或siRNA序列，从而提供病原体防护作用。这些序列可以用于病原体中的基因抑制，从而减少受保护的转化宿主生物上病原体导致的疾病发生率水平。本文中使用的词汇“基因抑制”用来表示用于降低由于基因转录成mRNA和随后mRNA翻译而产生的蛋白的水平的任何公知方法。

[0096] 基因抑制还用来指来自基因或编码序列的蛋白表达的降低，包括转录后基因抑制和转录抑制。转录后基因抑制是从靶定用于抑制的基因或编码序列转录来的mRNA的全部或一部分与用于抑制的对应双链RNA之间的同源性介导的，其指在细胞中可获得的用于与核糖体结合的mRNA的量显著的和可测量到的降低。经过转录的RNA可以是有义方向的，发挥所谓的共抑制作用，或者可以是反义方向的，发挥所谓反义抑制作用，或者以两种方向产生dsRNA，发挥所谓的RNA干扰作用(RNAi)。

[0097] 转录抑制是细胞中dsRNA基因抑制剂的存在所介导的，所述dsRNA基因抑制剂展示出与启动子DNA序列或其互补序列的显著序列同一性，发挥被称为启动子反式抑制的作用。基因抑制可以针对与性状相关的天然植物基因发挥作用，例如，给植物提供具有降低水平的、由天然基因编码的蛋白，或者具有增加或降低水平的受影响的代谢物。基因抑制还可针对下述植物寄生线虫的靶基因发挥作用，所述植物寄生线虫能摄入或接触含有基因抑制剂的植物材料，所述基因抑制剂被特别设计为能抑制或阻抑线虫细胞中一种或多种同源序列或互补序列的表达。美国专利号5,107,065、5,759,829、5,283,184和5,231,020中公开了反义或有义定向的RNA进行转录后基因抑制，以调节植物细胞中的基因表达。dsRNA用于抑制植物中基因的用途被公开于WO99/53050、WO99/49029、美国专利申请公开号2003/0175965和2003/0061626、美国专利申请号10/465,800和美国专利号6,506,559以及6,326,193中。

[0098] 针对植物寄生线虫的转录后基因抑制的有益方法使用有义定向和反义定向的、稳定化的转录的RNA，例如，作为发夹和茎环结构。用于进行转录后基因抑制的优选DNA构建体是下述这样的，其中，第一片段编码展示出反义方向的RNA(其展示出与待抑制的靶基因片段之间的显著同一性)，所述第一片段与第二片段相连，第二片段编码展示出与第一段片段具有显著互补性的RNA。此类构建体会形成茎环结构(这是通过第一片段与第二片段杂交形成的)和来自连接两个片段的核苷酸序列的环结构(见WO94/01550、WO98/05770、US2002/0048814和US2003/0018993)。也可以采用如上文所指出的与其它靶基因片段的共表达(如WO05/019408)。

[0099] 根据本发明的另一种实施方式，提供了一种核苷酸序列，其体外表达导致稳定化RNA序列的转录，所述RNA序列与植物寄生线虫中靶基因的RNA分子显著同源，所述RNA分子包含线虫基因组中的核苷酸序列编码的RNA序列。因此，植物寄生线虫摄取稳定化的RNA序列之后，将导致靶线虫细胞中对应于靶基因的核苷酸序列被下调。

[0100] 在本发明的某些实施方案中，可以利用SEQ ID NOs：301-1026、SEQID NOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929中任何一个的核酸序列的至少21个连续核苷酸的片段的表达，包括最多21、36、60、100、550或1000个连续核苷酸的片段，或与所述序列展示出90-
100％同一性的序列、或它们的互补序列的表达。在特定实施方案中，本发明提供的核苷酸可以包括选自表4描述的组的序列，包括所述序列上跨表4描述的核苷酸的位置。在其它实施方案中，本发明提供的核苷酸可以描述为包含SEQ ID NOs：301-1026、SEQ ID NOs：1269-
1702和SEQ ID NOs：1920-1929中一个或多个序列的核苷酸1-21、22-50、51-100、101-150、
151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500、501-550、551-600、601-
650、651-700、701-750、751-800、801-850、851-900、901-950、951-1000、1001-1050、1051-
1100、1101-1150、1151-1200、1201-1250、1251-1300、1301-1350、1351-1400、1401-1450、
1451-1500、1501-1550、1551-1600、1601-1650、1651-1700、1701-1750、1751-1800、1801-
1850、1851-1900、1901-1950、1951-2000、2001-2050、2051-2100、23-75、76-125、126-175、
176-225、226-275、276-325、326-375、376-425、426-475、476-525、526-575、576-625、626-
675、676-725、726-775、776-825、826-875、876-925、926-975、976-1025、1026-1075、1076-
1125、1126-1175、1176-1225、1226-1275、1276-1325、1326-1375、1376-1425、1426-1475、
1476-1525、1526-1575、1576-1625、1626-1675、1676-1725、1726-1775、1776-1825、1826-
1875、1876-1925、1926-1975、1976-2025、2026-2075、2076-2125、1-550、200-750、300-850、
400-950、500-1050、600-1150、700-1250、800-1350、900-1450、1000-1550、1100-1650、
1200-1750、1300-1850、1400-1950、1500-2050、最多达序列全长中的一个或多个。但是，在某些实施方案中，本发明不包括SEQ ID NOs:525、569、797、1293或1516或其片段。选择作为siRNA介导的基因抑制的靶的特定亚序列的方法是本领域已知的(如Reynolds et 
al..2004)。

[0101] 利用本发明的稳定化dsRNA技术来抑制靶基因是序列特异性的，因为，与RNA的双链体区域对应的核苷酸序列是为了遗传抑制而被靶定。含有与靶基因的一部分相同的核苷酸序列的RNA被优选用于抑制。相对靶序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列也被发现能够有效抑制。在本发明的性能方面，优选地，抑制性dsRNA和靶基因的一部分具有至少大约80％以上的序列同一性，或者大约90％以上的序列同一性，或者大约95％以上的序列同一性，或者大约99％以上的序列同一性，或者甚至大约100％的序列同一性。或者，RNA的双链体区域可被功能性地定义为：能与靶基因转录物的一部分杂交的核苷酸序列。展示出更高的同源性的小于全长的序列可补偿较长却仅有较少同源性的序列。相同核苷酸序列的长度可以为至少大约25、50、100、200、300、400、500或者至少大约1000个碱基。通常，应当使用超过20-100个核苷酸的序列，但超过大约200-300个核苷酸的序列是优选的，超过大约500-1000个核苷酸的序列是尤其优选的，这取决于靶基因的大小。本发明具有如下优点：其能耐受序列变异，所述变异可能是由于遗传突变、株多态性或进化趋异造成的。相对于靶基因的初级转录产物或经过完全加工的mRNA，导入的核酸分子可能不需要绝对同源，可能不需要是全长的。因此，本领域技术人员需要认识到，如本文所公开的，RNA和靶基因之间的100％序列同一性对于实施本发明来说并非必须。

[0102] 对靶基因表达的抑制可被定量，这是通过测量内源靶RNA或靶RNA翻译所产生的蛋白来进行的，抑制的结果可以通过对细胞或生物外在性质的检查来验证。用于对RNA和蛋白定量的方法是本领域技术人员公知的。

[0103] 在某些实施方式中，基因表达被抑制了至少10％，优选地，至少33％，更优选地，至少50％，进一步更优选地，至少80％。在本发明的特别优选的实施方式中，病原体细胞内的基因表达被抑制了至少80％，更优选地，至少90％，更优选地，至少95％，或者至少99％，使得显著的抑制发生。显著的抑制被用来指足够的抑制，其导致可被检测到的表型(例如，生长、摄食、发育停止、死亡等)或被抑制的靶基因所对应的RNA和/或蛋白质的可检测到的减少。虽然在本发明的某些实施方式中，抑制在植物寄生线虫的基本所有的细胞中发生，但是在其它优选的实施方式中，抑制仅在表达该基因的细胞亚组中发生。

[0104] dsRNA分子可以体内或体外合成。dsRNA可以由单条自身互补的RNA链形成，或者可以由两条互补的RNA链形成。细胞的内源RNA聚合酶可以介导体内转录，或者克隆的RNA聚合物可被用于体内或体外转录。可以通过下述方法来靶定抑制：在器官、组织或细胞类型中的特异性转录；环境条件(例如，感染、胁迫、温度、化学诱导剂)的刺激；和/或在发育阶段或年龄进行的工程化转录。RNA链可以是或不是聚腺苷化的；RNA链可以能或不能被细胞的翻译装置翻译为多肽。

[0105] 本发明的RNA、dsRNA、siRNA或miRNA可以由本领域技术人员通过化学方法或酶方法来生产，这是通过人工或自动的反应或在另一生物体内来进行的。还可通过部分或完全的有机合成来制造RNA；可通过体外酶合成或有机合成引入任何经过修饰的核糖核苷酸。可以通过细胞内RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)来合成RNA。表达构建体的使用和制造是本领域已知的(见，例如，WO97/32016、美国专利号5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693)。如果通过化学合成或通过体外酶合成，可在导入细胞之前对RNA进行纯化。例如，可以通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱或其组合，从混合物中纯化出RNA。或者，可以在不纯化或仅进行最小限度的纯化的情况下来使用RNA，以避免由于样品加工导致的损失。RNA可被干燥以储存，或者溶解于水溶液中。溶液可以含有缓冲剂或盐，以促进双链体链的退火和/或稳定。

[0106] 为在体内从转基因或表达构建体进行转录，可使用调节区域(例如，启动子、增强子、沉默子和聚腺苷化)来转录一条(或多条)RNA链。因此，在一种实施方式中，用于制造RNA分子的核苷酸序列可与在微生物、真菌或植物宿主细胞中具有功能的一个或多个启动子序列可操作地相连。理想地，核苷酸序列被置于内源启动子的控制之下，所述内源启动子通常处于宿主基因组中。处于可操作性连接的启动子序列控制下的本发明核苷酸序列，侧翼还可以有额外的序列，所述额外的序列能有利地影响其转录和/或得到的转录物的稳定性。此类序列通常位于可操作性连接的启动子的上游，和/或表达构建体3’末端的下游，可以同时存在于启动子上游和表达构建体3’末端的下游，但也考虑仅仅有所述上游序列。

[0107] 本文中使用的“疾病控制剂”或“基因抑制剂”指特定的RNA分子，其由通过第三RNA片段连接的第一RNA片段和第二RNA片段组成。第一和第二RNA片段在RNA分子的长度内，并且基本是彼此的反向重复序列，并且通过第三RNA片段连接在一起。第一和第二RNA片段之间的互补性导致两个片段在体内或体外杂交形成双链分子，即茎的能力，其通过第三片段在第一和第二片段的每一片段的一个末端连接在一起，形成环，使得整个结构形成茎和环结构，或甚至更紧密杂交的结构可以形成茎-环打结(knotted)结构。第一和第二片段总是、并且并非分别地对应于靶RNA的有义和反义序列，所述靶RNA是靶病原体的靶基因转录来的，所述靶基因能被dsRNA分子的摄入所抑制。控制剂还可以是基本纯化(或分离)的核酸分子，更特别地，来自基因组DNA(gDNA)或cDNA文库的核酸分子或其核酸片段分子。或者，所述片段可以包含更小的寡核苷酸，其具有大约15至大约250个核苷酸残基，更优选地，大约15至大约30个核苷酸残基。

[0108] 本文中使用的术语“基因组”在用于植物寄生线虫或宿主细胞的时候，不仅包含核内发现的染色体DNA，其还包含在细胞的亚细胞组分中发现的细胞器DNA。因此，被导入到植物细胞中的本发明的DNA可以是染色体整合或者细胞器定位的。术语“基因组”应用到细菌的时候包括细菌宿主细胞中的染色体和质粒。因此，被引入到细菌宿主细胞中的本发明的DNA是染色体整合或者通过质粒定位的。

[0109] 本文用到的术语“植物寄生线虫”是指可能感染宿主植物材料、在所述材料上建群、寄生或导致疾病的线虫，所述植物材料经过转化以表达双链基因抑制剂或包被了双链基因抑制剂。本文中使用的“线虫抗性”是转基因植物、转基因动物、或其它转基因宿主的特征，其使得宿主对于线虫的攻击具有抗性，所述攻击典型地能对所述宿主造成损害或损失。此类抗性可能产生自天然突变，或者更为典型地，产生自赋予植物寄生线虫抗性的重组DNA的掺入。为使转基因植物具有线虫抗性，重组DNA可以例如转录为RNA分子，在重组植物的组织或流体中形成dsRNA分子。dsRNA分子部分地包含：与优选在宿主植物上导致疾病的植物寄生线虫中DNA序列编码的相应RNA片段相同的RNA片段。靶植物寄生线虫中基因的表达受dsRNA抑制，对靶植物寄生线虫中基因表达的抑制导致植物具有线虫抗性。Fire等人(美国专利号6,506,599)一般性地描述了对害虫侵袭的抑制，仅针对在线虫物种，即秀丽新杆线虫中具有抑制基因功能作用的若干种核苷酸序列提供了细节。类似地，US2003/0061626描述了dsRNA用于在多种线虫害虫中抑制基因功能的用途。US2003/0150017描述了：使用dsRNA序列转化宿主细胞，以表达与特定病原体中靶序列基本相同的相应dsRNA序列，并且特别描述了：构建重组植物，其表达这些dsRNA序列(被多种植物寄生线虫摄入)，促进对靶生物基因组中基因的下调，并且提高植物对植物寄生线虫的抗性。

[0110] dsRNA的调节作用适用于在植物寄生线虫中表达的多种基因，例如，负责细胞代谢或细胞转化的内源基因，包括管家基因、转录因子、蜕皮相关基因和其它编码涉及细胞代谢或正常生长和发育的多肽的其它基因。

[0111] 本文中使用的短语“基因表达的抑制”或“抑制植物寄生线虫细胞中靶基因的表达”指，靶基因的蛋白和/或mRNA产物水平不存在(或可观察到的降低)。特异性指：抑制靶基因而对细胞其它基因无作用并且对产生dsRNA分子的细胞内任何基因没有影响的能力。对植物寄生害虫中靶基因的基因表达的抑制可能导致线虫中的新表型性状。

[0112] 本发明的一部分提供了一种送递系统，用于送递线虫控制剂，这是通过摄入宿主细胞或细胞内容物。根据另一种实施方式中，本发明涉及制备转基因植物细胞或植物，其中含有能转录本发明的稳定化dsRNA分子的重组DNA构建体。本文用到的“摄取”是指试剂与靶生物，如线虫的细胞接触的过程。这可能例如通过线虫摄食、通过浸泡、或通过注射。本文中使用的短语“制备转基因植物细胞或植物”指下述方法，其使用本领域中易于获得的重组DNA技术(例如，见Sambrook，等人)，构建能转录本发明的稳定化dsRNA分子的植物转化载体，以转化植物细胞或植物，以及制备含有经过转录的、稳定化dsRNA分子的转基因植物细胞或转基因植物。

[0113] 预期本发明的组合物可被掺入植物物种的种子，其可以作为被掺入植物细胞基因组的重组基因的表达产物，或者被掺入在种植前施用到种子上的涂层或种子处理中。含有重组基因的植物细胞在本文中被认为是转基因事件。

[0114] 本发明一部分提供了一种送递系统，用于向植物寄生线虫送递疾病控制剂。本发明的稳定化dsRNA或siRNA分子可被直接导入植物寄生线虫的细胞。用于导入的方法可以包括：将RNA与植物寄生线虫的宿主组织直接混合，以及下述工程方法，其中，作为宿主的物种经过了工程改造，得以表达dsRNA或siRNA。在一种实施方式中，RNA可以喷雾在植物表面。在又一种实施方式中，可以由微生物表达dsRNA或siRNA，并且可以将微生物施用到植物表面，或者通过物理手段如注射导入根、茎。在另一实施方案中，可对植物进行遗传工程改造，使其表达足以杀死已知会侵袭植物的植物寄生线虫的量的dsRNA或siRNA。

[0115] 还可预见到，可用与常规农业实践一致的方式来配制通过化学或酶合成生产的dsRNA，将其用作为喷雾产品，以控制植物疾病。所述配方可以包括：有效叶片覆盖所需的合适的胶粘剂和润湿剂，以及用于保护dsRNA免受UV损害的UV防护剂。此类添加剂是生物杀昆虫剂工业中常用的，也是本领域技术人员公知的。此类应用可与其它喷雾杀昆虫剂应用(是或不是基于生物的)组合，以增强植物保护，抵抗植物寄生线虫。

[0116] 本发明还涉及用于在微生物中表达的重组DNA构建体。可使用本领域已知的方法，将可以转录得到感兴趣的RNA的外源核酸引入微生物宿主细胞，例如，细菌细胞或真菌细胞。

[0117] 本发明的核苷酸序列可被引入到广范围的原核和真核微生物宿主中，产生稳定化dsRNA或siRNA分子。术语“微生物”包括原核和真核微生物物种，例如细菌和真菌以及线虫。真菌包括酵母和丝状真菌等。示例性的原核生物，既有革兰氏阴性也有革兰氏阳性的，包括肠杆菌科，例如埃希氏菌属、欧文氏菌属和沙雷氏菌属；芽孢杆菌科；根瘤菌科，例如根瘤菌属；螺菌科，例如光细菌，即发酵单孢菌属；乳杆菌科；假单胞菌科，例如假单胞菌属和醋杆菌属；固氮菌科，放线菌科和硝化杆菌科。真核生物包括真菌，例如须霉属，和子囊菌，其包括糖酵母属和裂殖酵母属；以及担子菌，例如，红酵母属、短柄霉属等。

[0118] D.转基因植物

[0119] 本发明提供具有超过一种或多种转基因事件的种子和植物。所述事件的组合被称为“堆叠的”转基因事件。所述堆叠的转基因事件可以是针对同样的靶生物的事件，或者它们可以针对不同的靶病原体或害虫。在一种实施方式中，具有表达本文提供的核酸的能力的种子还具有表达至少一种其它试剂的能力，所述试剂包括但不限于下述RNA分子，所述RNA分子的序列来自在靶病原体如线虫中表达的RNA的序列，当其在种子或从种子长出的植物细胞中表达时形成双链RNA结构，其中，靶对植物的一个或多个细胞的摄入导致了对靶细胞中RNA表达的抑制。

[0120] 在某些实施方案中，具有表达下述dsRNA能力的种子还具有提供除草剂耐受性的转基因事件，所述dsRNA的序列来自靶植物寄生线虫。除草剂耐受性基因的一个有益的实例是提供对草甘膦，即N-(膦酰甲基)甘氨酸(包括此类除草剂的异丙胺盐形式)的抗性。

[0121] 本发明提供的优点可以包括但不限于：易于将dsRNA导入植物寄生线虫细胞，可使用低浓度的dsRNA，dsRNA的稳定性以及抑制的有效性。使用低浓度的、稳定化dsRNA的能力避免了反义干扰的很多缺点。本发明并不被限制为体外使用，或被限制为特殊的序列组合物，特定的靶基因的组，靶基因核苷酸序列的特定部分，或特定的转基因或特定的送递方法，这是与本领域已知的可获得的方法中的一些，例如，反义和共抑制相反。此外，遗传操纵在并非经典遗传模型的生物中也是可行的。

[0122] 为了实现在需要控制的植物寄生线虫物种中靶基因的选择性抑制，靶基因应当优选表现出与植物或脊椎动物中相应基因的低序列同一性程度。优选地，序列同一性程度小于大约80％。更优选地，序列同一性程度小于大约70％。最优选地，序列同一性程度小于大约60％。

[0123] 除了用重组DNA构建体对植物进行直接转化之外，可通过将具有重组DNA构建体的第一种植物与缺乏该构建体的第二种植物杂交来制备转基因植物。例如，用于基因抑制的重组DNA可被引入到第一种植物品系中，所述品系容易转化，产生可与第二种植物品系杂交的转基因植物，以将用于基因抑制的重组DNA渐渗到第二种植物品系中。

[0124] 在实践中，本发明可与植物中的其它疾病控制性状组合，以获得想要的用于增加对植物疾病的控制的性状。将利用不同作用模式的疾病控制性状组合，可以提供保护的转基因植物，其较之具有单一控制性状的植物具有出众的耐力，因为在田间发展出抗性的概率降低。

[0125] 本发明还涉及含有一种或多种本发明序列，并且从含有一种或多种本发明核苷酸序列的重组植物或种子制造的农产品制品，它们作为本发明的实施方式被特别包括。含有一种或多种本发明序列的农产品制品包括但不限于，植物的粗粉、油、碾碎的或整个的谷粒或种子，或者包含重组植物或种子的任何粗粉、油、碾碎的或整个的谷粒的任何食品，所述重组植物或种子含有一种或多种本发明的序列。在本文包括的一种或多种农产品或农产品制品中对本发明的一种或多种序列的检测用事实证明，农产品或农产品制品由转基因植物构成，所述转基因植物被设计为能表达本发明的一种或多种核苷酸序列，用于通过使用dsRNA介导的基因抑制方法来控制植物疾病的目的。

[0126] E.获得核酸

[0127] 本发明提供了方法，用于获得包含产生dsRNA或siRNA的核苷酸序列的核酸。在一种实施方式中，所述方法包括：(a)在线虫中进行dsRNA介导的基因抑制后，分析一种或多种靶基因的表达、功能和表型；(b)用杂交探针探测cDNA或gDNA文库，所述探针包含来自靶定的线虫的核苷酸序列或其同源物的全部或部分，所述线虫在dsRNA介导的抑制分析中展示改变的，例如减少的线虫生长或发育表型；(c)鉴定出能与杂交探针杂交的DNA克隆；(d)分离步骤(b)中鉴定的DNA克隆；以及(e)对包含在步骤(d)中分离的克隆的cDNA或gDNA片段进行测序，其中，测序的核酸分子能转录RNA核苷酸序列或其同源物的全部或主要部分。

[0128] 在另一种实施方式中，本发明的用于获得核酸片段(其中包含用于产生本发明dsRNA或siRNA的主要部分的核苷酸序列)的方法包括如下步骤：(a)合成第一和第二寡核苷酸引物，它们与来自靶定的病原体的核苷酸序列之一的一部分对应；以及(b)使用步骤(a)的第一和第二寡核苷酸引物，扩增克隆载体中存在的cDNA或gDNA插入片段，其中，扩增的核酸分子能转录本发明的dsRNA或siRNA的主要部分。

[0129] 在对本发明的实践中，靶基因可来源于大豆异皮线虫或其它线虫。本发明认为，若干种标准可被用于选择优选的靶基因。大豆异皮线虫基因可以是具有秀丽新杆线虫直向同源物的基因，可能在表达的RNAi击倒后具有强表型，包括P0表型。所述靶通常是具有参与核心细胞过程的蛋白产物的那些，所述过程例如DNA复制、细胞周期、转录、RNA加工、翻译、蛋白运输、分泌、蛋白修饰、蛋白稳定性和降解、能量产生、中间代谢、细胞结构、信号传导、通道和转运蛋白，以及胞吞作用。在某些实施方案中，有利的是选择一种基因，其表达水平的少量下降导致对病原体的有害作用。

[0130] 文中使用的术语“来源于”指，可从特定的特别来源或物种获得的特别的核苷酸序列，虽然无须直接来自该特别来源或物种。

[0131] 在一种实施方案中，选择实质上参与植物寄生线虫的生长和发育的基因。用于本发明的其它靶基因可以包括，例如，在线虫存活、生长、发育、感染力和建立摄食部位中起重要作用的那些。这些靶基因可以是管家基因、转录因子等之一。此外，用于本发明的核苷酸序列也可以来源于植物、病毒、细菌或昆虫基因的同源物，包括直向同源物，所述基因的功能已经从文献中确定，并且其核苷酸序列与靶线虫基因组中的靶基因具有显著相似性。根据用于线虫控制的本发明的一方面，靶序列可以基本上来源于靶定的植物寄生线虫。从编码与作为已知蛋白同源物的蛋白或其片段的线虫克隆的示例性靶序列可以参见序列表，例如SEQ IDNOs：301-1026，SEQ ID NOs：1269-1702和SEQ ID NOs：1920-1929。

[0132] 就本发明的目的而言，dsRNA或siRNA分子可以通过来源于gDNA或cDNA文库或其部分的靶基因的聚合酶链式(PCRTM)扩增而获得。可以用本领域普通技术人员已知的方法来制备DNA文库，并且可以提取DNA/RNA。可以将从靶生物产生的基因组DNA或cDNA文库用于PCRTM扩增，以生产dsRNA或siRNA。

[0133] 然后可使用本领域中容易获得的方法，对靶基因进行PCRTM扩增和测序。本领域技术人员可对PCRTM条件加以改动，以确保最优的PCRTM产物形成。经过验证的PCRTM产物可被用作为模板，用于体外转录，以产生具有被包括进来的最小启动子的有义和反义RNA。在一个实施方案中，本发明包括可以用作植物寄生线虫控制剂的分离和纯化的核苷酸序列。分离和纯化的核苷酸序列可以包含序列表中所示的那些。

[0134] 本文中使用的短语“编码序列”、“结构核苷酸序列”或“结构核酸分子”指，置于合适的调节序列控制下时，能被翻译为多肽的核苷酸序列，通常这是通过mRNA进行的。编码序列的边界是由5’末端的翻译起始密码子和3’末端的翻译终止密码子来确定的。编码序列可以包括但不限于，基因组DNA、cDNA、EST和重组核苷酸序列。

[0135] 术语“重组DNA”或“重组核苷酸序列”指，含有遗传工程修饰的DNA，所述修饰是通过诱变、限制酶等的操纵来进行的。

[0136] 对于是通过本发明加以控制的潜在靶的植物寄生线虫中的很多而言，关于大多数基因的序列和从对特定基因的突变得到的表型的信息可能是有限的。因此，本发明人考虑，选出合适的基因用于本发明的过程，可以通过使用可从对模式生物(例如秀丽新杆线虫)中相应基因的研究获得的信息来进行，所述生物的相应基因已根据实施例1-8描述的分析被表征。在一些情况下，可能通过使用来自例如线虫(其中已经克隆了基因)的基因名或序列，检索数据库，例如GenBank，来获得靶线虫相应基因的序列。一旦获得了序列，可以使用PCRTM来扩增合适地选出的靶线虫中的基因片段，用于本发明。可以基于克隆了基因的其它生物中发现的序列来设计PCRTM引物。引物被设计为：能扩增足够长度的DNA片段，用于本发明。DNA(基因组DNA或cDNA)制备自靶植物寄生线虫，用PCRTM引物来扩增DNA片段。扩增条件被选用为：即使在引物不能精确匹配靶序列的情况下，扩增也能得以进行。或者，可以使用已知的基因作为探针，从制备自植物寄生线虫物种的gDNA或cDNA文库，克隆出基因(或其部分)。
用于实施PCRTM和从文库中克隆的技术是已知的。基于以前其它物种中克隆出的基因序列，从靶植物寄生线虫物种中分离DNA片段的方法的进一步细节，在实施例中有所提供。本领域普通技术人员将认识到，多种不同的技术可用于从植物寄生线虫物种中分离出与以前从其它物种种分离的基因相对应的基因片段。

[0137] 实施例

[0138] 发明人在此已经鉴定出了用于通过提供双链核糖核酸分子给植物寄生线虫而控制植物寄生线虫的方法，以及选择编码这些双链核糖核酸分子的序列的手段。摄入后起作用，从而在线虫中抑制生物功能的双链核糖核酸分子可以导致例如以下一种或多种属性：线虫生长减少、线虫发育抑制，或存活力降低。这些属性的任意一种或其组合可以导致植物感染或建群的有效抑制，并且在植物致病线虫的情况下，抑制植物疾病，和/或减轻疾病症状的严重程度。

[0139] 实施例1

[0140] 靶基因选择的标准

[0141] 为了通过线虫生命周期中功能的可能必要性对基因排序，将可以获自wormbase.org的秀丽新杆线虫RAN干扰(RNAi)实验的信息与其它实验信息组合。采用wormbase中的>40,000个表型数据点，根据表型的效力、表型的置信水平和生命周期中多个阶段的效果的可能性，对所有大约20,000个秀丽新杆线虫基因进行排序。与大豆异皮线虫具有至少e-10的BLAST氨基酸同源性(参见下文的直向同源性测定)的715种秀丽新杆线虫基因在此表型评分系统中具有44或更好的评分，其中1是最好的。在下文中，仅仅对靶提供了表型统计值，最终得到了最前面的300种基因的列表(采用所有标准)。由于表型排序依赖于目前可获得的信息，并不打算捕获可作为良好靶的每个基因，而是提供了高质量靶的列表，所述靶可能能够基于现有信息，在大豆异皮线虫RNAi中成功。

[0142] 在最近公开的Sonnichsen等人的秀丽新杆线虫基因组RNAi调查(Sonnichsen et al.，2005)前，进行了在RNAi处理后明显的表型的以下分析。该研究小组通过将dsRNA注射到秀丽新杆线虫野生型株N2雌雄同体的性腺中并且观察对该动物及其后代的作用，测试了19,075种基因。它们仅仅发现了1,668种基因(8.7％)的作用。对前300种基因的列表(图3)提供了充分性的额外支持，其中293种属于Sonnichsen等人测试的基因，并且257种具有表型(87.7％)，包括176个Emb(胚致死)，34个Lva(停止在幼虫)，34个Ste(不育)，8个Lvl(幼虫死亡)，2个stp(不育后代)，1个Bmd(身体形态缺陷)，1个Dpy(短粗)，1个Egl(产卵异常)。36种基因具有野生型(WT)报道。野生型报道朝列表的底部增加：1-100中有7个WT报道，101-
200中有13个WT，201-300中有16个WT。

[0143] RNAi表型报道分类为4组。首先，将幼虫阶段致死性的报道(致死＝let，幼虫致死＝lvl，停止在幼虫阶段＝lva)放置在一起，并且得到最大权重。如果在大豆异皮线虫中模拟，这种表型将是有利的，因为从植物到线虫的dsRNA送递将随着第二阶段幼虫，即类似于持久期幼虫的阶段进入植物中而开始。送递将继续经过J2、J3和J4幼虫或摄食部位的幼虫阶段的发育。在这些幼虫阶段破坏线虫生理，能够阻止在P0代(原代)植物根中形成摄食部位。

[0144] 随后，将蜕皮(mlt)、起泡(bli)和破裂(rup)缺陷的报道放置在一起，并且给出第二最大权重。所述表型相对于其它较常见作用，如致死或不育是较不常见的。由胶原表皮覆盖线虫，包括秀丽新杆线虫和大豆异皮线虫两者。蜕皮缺陷能够阻断幼虫阶段之间(J2->J3，J3->J4，J4->A)的蜕皮和表皮重新形成，因此阻断发育过程。起泡表型通常也涉及表皮中的缺陷。秀丽新杆线虫中的破裂表型了解不够充分，但可能涉及身体完整性的丧失或渗透性改变。破裂表型对于SCN控制是特别感兴趣的，因为它们可能是不可逆的，蠕虫没有机会恢复(在临时阻断代谢或发育的情况下可能能够恢复)。

[0145] 第三，将不育(ste)和胚(emb)致死性表型放置在一起，并且给出第三最大权重。在秀丽新杆线虫中，种系组织(其中很多基因参与不育和胚发育(母体因素))对RNAi特别敏感。在SCN感染的情况下，对单独的生命周期的不育或胚胎致死性阻断能够阻止第二代形成，但仍然允许最初的摄食部位形成和植物根系破坏。第四，将生理学的其它主要缺陷，包括生长缺陷(gro)、生病(sck)、不协调(unc)、麻痹(prl、prz)表型放置在一起，并且给出第四最大权重。在雌性大豆异皮线虫中，一旦形成摄食部位，蠕虫不再移动，并且体壁肌肉组织在存活中起有限作用。但是，雄性蠕虫作为成虫变得可以移动，因此它们可以寻找、发现雌虫并且与其受精。因此，阻断对于正常移动重要的肌肉和神经系统结构，可以干扰受精和第二代的形成。为了该排序的目的，不包括其它非致死RNAi表型(短粗、短、长、身体外形缺陷等)。通过遗传突变观察到的表型也不用于该排序系统。

[0146] 为了基于wormbase RNAi信息对基因排序，相对于具有单一表型报道和单一表型的基因，有利于具有多个表型报道和多个不同表型的基因。表型的多个报道是有帮助的，因为它们给表型到基因的分配添加了可信度。基于来自多个组的实验，秀丽新杆线虫RNAi实验具有约10-15％的假阴性和假阳性率。来自一个以上报道的表型证据减少了在列表中引入假阳性的可能性。由于秀丽新杆线虫RNAi不导致完全的转录物消除(击倒估计是90％)并且在群体中通常是不均匀的，单个基因RNAi实验通常导致在生命周期过程中观察到多个表型。因此，作为“ste，emb，lvl”的给定基因表型的报道表明其是整个生命周期所需的，而单独的“emb”表型可能表明基因仅仅是胚胎发育中的一个步骤所需的。为了寄生虫控制的目的，多个步骤和生命周期中多个过程所需的基因与仅仅在一个阶段需要的那些基因相比是更有吸引力的靶，因为这为dsRNA提供了干扰生命周期和阻断感染的更多机会。

[0147] 在这四类的每一类，对秀丽新杆线虫RNAi报道进行汇总和加权。对于来自给定实验室的基因N2(野生型)背景中表型的第一个报道给出权重为1。来自同一实验室的表型的第二、第三等报道给出0.7的折扣权重。因此，来自两个实验室的独立报道(评分＝2)相对于来自相同实验室的两个报道(评分＝1.7)是有利的，后者易受系统误差的影响(例如选择错误克隆和使用两次)。rrf-3(-/-)遗传背景中表型的报道对RNAi比N2更敏感，对其给出0.6的折扣评分。

[0148] 采用这些分类和加权，基于在图1所示矩阵中的记分，以1-44或更高的评分标准对靶进行排序。例如，为了得到3分，靶必须具有≥2的let lvl lva评分，X≥1的mlt bli rup评分，≥2的ste emb评分，和≥1的其它表型评分。秀丽新杆线虫中的大多数基因具有差于44的评分。715种基因具有44或更好的评分，并且具有大豆异皮线虫中的潜在同源物。对于最前面的300个靶，在以所有标准排序后，平均表型评分是22±9。最高评分是3(6个靶)，仅仅10个靶具有小于10的评分。最常见的分类是评分为10(61个靶，let lvl lva评分≥2，mlt bli rup评分＝0，ste emb评分≥2，其它表型评分≥1)、15(23个靶)、24(26个靶)、26(93个靶)和33(19个靶)。每类中记分的平均值和标准差是let lvl lva评分＝1.9±1，mlt bli rup评分＝0.3±0.7，ste emb评分＝2.8±1.7，和其它表型评分＝1.6±1.3。mlt bli rup是最不常见的表型，仅仅56个靶的评分≥0。其它类中评分≥0的靶的总数对于let lvl lva是284，对于ste emb评分≥2是281，对于其它表型是258。

[0149] 除了来自wormbase的可见表型的报道，也记录了关于每个靶的野生型(即无表型)的报道。野生型发现被认为对于靶排序是阴性的，并且从前300个基因列表的考虑中排除最高数目的野生型报道。所有野生型报道给出的评分是1，除了来自Vidal等人的文献的那些(其给出0.3的评分)，因为该组的方法似乎导致比其它报道组更高百分比的野生型报道。除了总的野生型记分，也计算了相对于所有其它报道的％野生型。对于前300个靶，野生型记分和野生型百分比的平均值和标准差是0.14±0.41和1.9±5.1％。300个靶中的250个没有野生型报道。对于50个具有野生型报道的靶，野生型记分和百分比是0.85±0.65和11.3±7.3％。在仅仅24种情况下，野生型报道占所有报道的>10％，最高是33％。

[0150] 随后，将RNAi数据与wormbase中可获得的那些进行比较。在摄食测定中对超过1,500种感兴趣的秀丽新杆线虫基因进行了RNAi实验，其中采用和N2、rrf-3其它株。在用与大豆异皮线虫的BLAST氨基酸同源性和44或更好的wormbase表型评分考虑的715种秀丽新杆线虫基因中，可以获得约75种的信息。此外，在列表中加入了3种不存在于715种基因的列表上的、在测定中具有P0(第一代)作用的基因。最初715种中的10种靶基因在测定中没有显示表型(用构建体的序列证明进行多次重复)并且因此从前300种靶基因中排除。对于前300种靶基因，观察了39种种靶基因的表型，包括lvl，lva，rup，ste，emb，unc，sck和排序系统中不包括的额外表型，例如生长缺陷(gro)、不育后代(stp)、短粗(dpy)、和身体外形缺陷(bmd)。

[0151] 实施例2

[0152] 秀丽新杆线虫P-零(P0)RNAi筛选

[0153] 除了标准RNi测定，进行了额外的秀丽新杆线虫RNAi筛选。其中之一是P0致死筛选。

[0154] 秀丽新杆线虫中的P-零(P0)或迅速开始的RNAi作用

[0155] 为了通过从转基因大豆植物提供dsRNA而控制大豆异皮线虫，发现对迅速开始的RNAi作用敏感的基因可以是有用的。所述基因可能阻断由J2形成成熟摄食部位，而缓慢开始基因可能不能在下一代之前显示作用。在暴露的动物中显示作用，即所谓的P0(P-零)代作用的秀丽新杆线虫基因可能预测对RNAi具有高和迅速敏感性的大豆异皮线虫直向同源物。

[0156] 秀丽新杆线虫中的所有对RNAi作用的大规模筛选已经将初始蠕虫(L4)或成虫(遗传P0(P-零)代)暴露于dsRNA，并且在它们的后代，即F1和F2代中寻找表型。在很多情况下也观察到了最初P0动物的不育。显微注射筛选(Gonczy et al.，2000；Piano et al.2000；Piano et al.，2002)或摄食筛选(Fraser et al.，2000；Kamath et al.，2003)都没有注意到除不育之外的对P0动物的作用。同样，在通过从L4起始蠕虫摄食而进行的超过1,200种秀丽新杆线虫基因的筛选中，没有观察到除不育之外的P0表型。RNAi表型的wormbase
(www.wormbase.org)记录甚至没有注意到观察到作用的世代(P0，F1，F2，等)，所以从这些记录发现P0候选物是不可能的。Maeda et al.2000通过浸泡L4进行了对2,500种秀丽新杆线虫基因的RNAi。有趣的是，在伴随该出版物的补充在线材料中，Maeda等人注意到了26种情况，其中观察到了除不育之外的P0作用，从不健康到缓慢生长到死亡。实验研究了这些靶，以观察这些基因中的任何基因是否实际上使P0作用合理(图2)。

[0157] 在Maeda等人的26个条目中，21个相应于wormbase.org条目，而5个是不明来源的克隆。将19种基因成功克隆到了RNAi大肠杆菌摄食构建体，证实了序列，而两种基因具有克隆困难。19个完成的克隆中的17个目前为止已经测试了P0表型。正在进行实验，以完成测试另外两个克隆，并且重复测试另外6个(其仅仅测试了一次)来证实结果。此外，在同一测定中测试了7个感兴趣的靶，总共24个。从两个生命周期起始点采集数据。首先，进行P0L4起始，以模拟Maeda测定和标准大肠杆菌摄食测定。其次，进行P0卵起始，以便在发育过程中将P0动物暴露于dsRNA，这类似于大豆异皮线虫感染产生dsRNA的植物后可能遇到的情况。对于卵起始，假设是第一次dsRNA暴露在L1幼虫孵化并且开始摄食时发生。

[0158] 从17个测试的Maeda et al.(2001)的候选物和7个额外的靶，发现6个在摄食测定中从卵开始具有除不育之外的P0表型(3个来自Meada，3个来自额外的列表)。这些是来自Maeda的Y57G11C.15(sec61α)，C47E12.5(uba-1)和R07E4.6(kin-2)，以及来自额外列表的C34G6.6(pan-1)，F52B11.3(pan-2)和T25C8.2(act-5)。从L4开始，仅仅3个基因显示了除不育之外的P0表型。具有L4起始表型的基因是6个显示卵开始的表型的亚组：来自Maeda的Y57G11C.15(sec61α)和R07E4.6(kin-2)，以及来自额外列表的T25C8.2(act-5)。在迄今为止测试的来自Maeda候选物的其余基因中，4个具有较不严重的表型，如不育和停止在F1幼虫，而9个是完全野生型，并且在Maeda筛选中可能是假阳性的。但是，仍然可能的是，在细菌摄食测定中缺乏表型的基因将在浸泡测定中具有表型。

[0159] 除了用N2秀丽新杆线虫蠕虫(实验室标准株)研究，也对fog-2(q71)突变背景中的22种基因进行了研究。fog-2(q71)是使雌雄同体的种系雌性化的突变体，并且保持为雄/雌株。在受精前从雄性幼虫中挑出雌虫。所述未交配过的雌虫随它们长大能够保持多日，因为不存在F1代长得超过培养板，并且因此帮助在P0成虫中观察到晚开始的作用。在fog-2(q71)中观察到的P0结果与在N2中观察到的结果相同，没有检测到额外的表型。因此对后面的基因进行的fog-2测试没有继续。

[0160] 研究表明，在秀丽新杆线虫中，从L4开始获得除不育之外的P0表型是非常少见的事件，但该实例确实存在，如Y57G11C.15(sec61α)，R07E4.6(kin-2)，和T25C8.2(act-5)(图2)。证据表明，由Maeda等人在它们的补充材料中记录的除不育之外的大多数P0表型是假阳性的。这得到了其它证据的支持：除了目前的数据，由其它实验室测试了至少6种基因，并且发现在所有世代(P0，F1等)中仅仅具有野生型表型。推测从L4开始的除不育之外的P0表型是罕见的，因为成虫已经具有存活所必须的很多蛋白，并且RNAi的缓慢动力学需要时间来降解所有的转录物。在所述条件下显示作用的基因可能是这样的，其中蠕虫对它们的破坏特别敏感，并且因此在考虑的靶中排序高。卵开始的除不育之外的P0表型是较不罕见的，并且在已知具有严重表型(如pan-1，pan-2)的一些感兴趣的靶中可见。推测起来，用强表型进行的更大的靶调查可以发现更多。

[0161] 在证实了P0致死表型的6个靶中，所有都在大豆异皮线虫序列中具有合理强的直向同源物。已经证实了kin-2具有P0表型，并且因此排在前10。采用我们的wormbase RNAi表型排序系统(图1)，pan-1和pan-2都在前100中，也考虑额外的大豆异皮线虫序列信息。从EST中丢失的pan-1是基于基因组调查测序而在大豆异皮线虫中新鉴定的。采用wormbase RNAi表型排序系统，act-5、uba-1和sec61α没有在前几百个靶中，因为它们在wormbase中缺乏let，lvl，lva，mlt，bli和rup表型报道。这六个靶在前300中的最终排序位置是Y57G11C.15(sec61α)＝#2，C47E12.5(uba-1)＝#3，和R07E4.6(kin-2)＝#4，C34G6.6(pan-1)＝#7，F52B11.3(pan-2)＝#30，和T25C8.2(act-5)＝#21。

[0162] 实施例3

[0163] 秀丽新杆线虫肠特异性RNAi筛选

[0164] 也进行了第二个额外的筛选，以辅助选择靶基因(表1)。以前制备了仅仅在肠中对RNAi敏感的秀丽新杆线虫株。该株可以用于迅速筛选一组基因，所述基因以前通过RNAi证明对于存活和发育是必须的，以鉴定特别是在肠中是必须的那些基因。采用植物送递的大豆异皮线虫RNAi，这些基因可以是有利的靶，因为肠被认为是与进入的dsRNA接触的第一个组织。进一步，编码分泌的和跨膜蛋白的基因可能容易受到在植物中表达破坏这些基因产物功能的杀线虫蛋白造成的破坏的影响。

[0165] 通过将肠特异性启动子控制下的驱动野生型sid-1基因表达的转基因导入原本是sid-1-的背景中(HC75株)，产生秀丽新杆线虫肠特异性RNAi株。sid-1是秀丽新杆线虫中的系统性RNAi所必须的，并且编码作为推测的dsRNA转运蛋白的跨膜蛋白(Winston，et al.，2002)。已经测试了三个品系对RNAi的敏感性，其中每个品系驱动来自不同肠启动子的表达。采用的启动子是elt-2，ges-1和ile-1的5’区。来自unc-54(体壁肌肉)，dpy-7(真皮)，和act-1(多种组织)的摄食dsRNA在这些株中没有显示表型，但所有三种dsRNA都在野生型(N2)蠕虫控制中产生了预期的表型。另一方面，来自act-5，即一种肠特异性肌动蛋白和ile-1，即一种具有肠定位的基因的摄食dsRNA，在这些株中导致不育。这些观察结果支持以下结论，即这些株对肠中但不是许多其它组织中的RNAi敏感。选择ges-1::sid-1株，用于进行筛选。即使对于仅仅在肠中有作用的基因，该株中的表型比N2更弱，可能是因为ges-1表达不是均一的，或者比内源性SID-1肠表达弱，使得SID-1不总是以将在N2中存在的水平存在。但是，诸如50％不育的表型相对于对照容易评分，并且是可再现的。迄今为止在肠RNAi株中检验了130种基因，集中在分泌的和跨膜靶，观察到57种具有表型(表1)。在考虑用于前
300种基因的列表的715种基因靶中，24种在肠RNAi株中具有表型，而3种是野生型。在原本对靶进行相等加权的排序中，给予显示肠RNAi株表型的基因优先性，前300种基因的列表中有14种所述基因。10种不属于所述列表的基因或者具有弱的肠RNAi表型(如25％不育)或者具有其它缺陷(弱同源性、非直向同源性，等)。

[0166] 表1.秀丽新杆线虫肠RNAi株表型

[0167]  基因 肠RNAi表型 基因 肠RNAi表型
act-5 80％不育 C01G8.5 40％不育
Ile-1 80％不育 R13H4.4 30％不育
C16A3.3 20-70％不育 C25A11.4 40％不育
C47E12.5 40-99％不育 T26E3.3 15％不育
C48E7.6 20-40％不育 F54G8.3 20％不育
D1014.3 30-80％不育 ZK1058.2 50-80％不育
D1069.3 15-50％不育 K07D8.1 25％不育
T10H9.3 20-40％不育 H19M22.2 45％不育
T24H7.1 15-35％不育 F42C5.10 65％不育
ZK973.6 20-30％不育 T03E6.7 EMB
C01F1.2 15-40％不育 R03E1.2 75％不育
C54G4.8 50-80％不育 Y55H10A.1 LVA，80％不育
F10D7.5 15-40％不育 C23H3.4 80％不育
F11G11.5 15-50％不育 F43D9.3 55％不育
F32B5.8 20-25％不育 Y57G11C.15 80％不育
F33A8.1 60-97％不育 F49C12.13 55％不育
F34D10.2 20-30％不育 T01H3.1 60％不育
F39B2.11 20-25％不育 T04A8.9 20-80％不育
F54C9.2 15-25％不育 H19M22.2 45-55％不育
F55A11.2 10-15％不育 K02B12.3 20-50％不育
F55A12.7 50-60％不育 W04A4.5 25-50％不育
F55A12.8 20％不育 Y47G6A.23 25-50％不育
F55F10.1 20-25％不育 C16D9.2 30-35％不育
K07A12.3 15-25％不育 F52C6.3 35％不育
K07B1.5 25-30％不育 F53B8.1 65％不育
K07D8.1 25％不育 C49C3.11 35％不育
K12D12.2 40-70％不育 F41G3.4 35％不育
R04F11.2 40-70％不育 Y57G11C.31 25％不育
T01B11.3 10-30％不育

[0168] 实施例4

[0169] 关于秀丽新杆线虫基因直向同源物的信息—推定的分子功能

[0170] 除了表型，从wormbase提取的其它信息包括基因名称、wormpep蛋白ID、表达模式、亚细胞定位、显著基序、简短鉴定、简洁描述和基因本体论术语。相对于具有完全未知功能的基因，给予具有已知分子功能的靶基因排序优先性。我们观察到具有强表型的基因一般是具有参与核心细胞过程的蛋白产物的那些，所述过程如DNA复制、细胞周期、转录、RNA加工、翻译，包括核糖体和tRNA功能、蛋白运输、分泌、蛋白修饰、蛋白稳定性和降解、能量产生，包括线粒体功能、中间代谢、细胞结构、信号传导、通道和转运蛋白，以及胞吞作用。在300种选定的靶中，275种属于这些分类之一(表2)。在最前面的100种中，98种属于这些分类之一。在具有强表型的靶中最常观察到的分类是翻译/核糖体/tRNA、转录/RNA加工，和蛋白稳定性/降解/蛋白体。

[0171] 表2.通过推定的细胞功能对秀丽新杆线虫前300个靶的分类

[0172]

[0173] 对推定细胞功能的示踪确保了在前面的靶列表中保持合适的多样性，并且靶列表不变得过分依赖于一个或几个可能在大豆异皮线虫与秀丽新杆线虫中起不同作用的过程。在概念上，给认为在线虫中快速进化的发育过程，如性别确定赋予低优先性，因为所述过程在大豆异皮线虫与秀丽新杆线虫之间不太可能是保守的。在实践中，很少所述基因在RNAi表型中得到足够的分数以考虑在前300个基因的列表中。有趣的是，即使在引入关于序列保守的信息之前，考虑单独的秀丽新杆线虫表型的强度(1-44的评分和野生型报道)，高排位的靶显著过度代表了核心细胞过程，包括大的多亚基复合物，如核糖体和蛋白体。这可能简单地由翻译和蛋白降解对细胞存活的重要性而导致。该发现的一个额外的解释是大复合物的亚基倾向于在RNAi击倒后具有强表型，因为它们相对于在复合物中不起作用的蛋白来说对剂量更敏感。例如，尽管单体酶仅仅以其正常蛋白剂量的10％就可以在代谢途径中保留足够的流动，大复合物中亚基剂量之间的不平衡可能导致复合物错误组装或其它功能失败。最近在啤酒糖酵母中的发现支持该解释(Papp et al.，2003)。

[0174] 实施例5

[0175] 序列同源物、同一性和直向同源性分配

[0176] 为了鉴定表征的秀丽新杆线虫基因的大豆异皮线虫直向同源物，用BLAST程序组(Altschul et al.，1990)进行了同源性检索。采用秀丽新杆线虫基因(Wormpep)的预测蛋白序列，用TBLASTN检索大豆异皮线虫簇集的EST和可以获自Genbank的其它序列，以及最近得到的私有基因组调查序列。对Bitscore、e-值和同一性％进行示踪。对于考虑作为靶，秀丽新杆线虫必须与大豆异皮线虫中的直向同源物或同源物具有TBLASTN匹配，e值为至少e-10或更佳。排序为1-44的具有RNAi表型的715种秀丽新杆线虫基因(图1)满足这种最小标准。对于这715种基因，大豆异皮线虫匹配是：

[0177] BLAST          平均值±SD             范围

[0178] ％ID           56±18                 96-22

[0179] Bitscore       184±141               1031-52

[0180] E-值           e-48(中值)             0-e-11

[0181] 为了建立前300种基因的列表(图3)，秀丽新杆线虫和大豆异皮线虫之间相似的有利氨基酸水平序列是RNAi表型后排序的第二重要的因素。同一性％、bitscore和e-值分为四等分。除了具有强RNAi表型外的排序最高的靶也具有表明直向同源性的有利的同源性特征：bitscore(>100)，e-值(40％)。为了确保直向同源性分配，也检验了靶的交互BLAST匹配，使得当通过回到秀丽新杆线虫wormpep列表的BLAST(BLASTX)检验选择的大豆异皮线虫序列时，鉴定了最初的起始序列。25种原本应该进入前300的基因在此交互BLAST测试中失败，表明秀丽新杆线虫和大豆异皮线虫中的基因不太可能是直向同源物。在最终的300种基因的列表中，296种看起来是明确的直向同源物，两个方向上都具有交互BLAST最高匹配，1种的最高匹配持平(秀丽新杆线虫中的2个密切同源物)，3种基因在最高bitscore的5％范围内(保留了它们，这是因为所有最前面的秀丽新杆线虫同源物之间的强表型)。对于前300种基因，大豆异皮线虫匹配是：

[0182] BLAST             平均值±SD               范围

[0183] ％ID              65±15                   96-30

[0184] Bitscore          253±158                 1031-71

[0185] E-值              e-61(中值)               0-e-13

[0186] 在前面的300种靶中，63种看起来是由于基因组调查测序而特别鉴定的。EST或其它公众可得到的序列中的匹配丢失或具有非常弱的评分(大多数是旁系同源物)。前300种中这些基因的排序如下：

[0187] 前100中的23种：1，5，7，9，15，33，35，37，38，40，44，51，53，58，60，67，68，75，80，82，83，88，96

[0188] 第二个100中的15种：102，115，134，142，148，151，152，156，163，164，191，193，199，200

[0189] 第3个100中的26种：206，208，211，219，226，231，237，241，242，247，251，254，256，258，260，261，263，267，271，272，280，281，289，292，298，300。

[0190] 实施例6

[0191] 大豆异皮线虫和其它垫刃线虫中的基因表达

[0192] 也监测了靶基因在大豆异皮线虫和其它垫刃线虫植物寄生线虫中的表达。即使在大豆异皮线虫中，该过程也是不精确的，因为从前300种基因的列表中鉴定的转录物可能是所述情况下的实际感兴趣的基因，其中最高命中是EST(300种中的237种)或相关同源物，其中最高匹配是与基因组序列序列的匹配(300种中的63种)。同样，相关垫刃线虫中的匹配可能是直向同源物或同源物。然而，该信息提供了用于观察表达阶段的起点。J2、J3和J4中的表达是特别有吸引力的，因为在这些阶段通过摄食部位，双链RNA送递应该是可能的，同时形成孢囊。在大豆异皮线虫的具有EST表示的基因中，47％由单EST表示。53％的基因由两个或多个EST表示。64％在J2、J3或J4阶段中有表示。300种靶的165种在EST中具有直向同源物或同源物和其它可以从其它垫刃线虫植物寄生线虫中获得的测序，所述线虫包括：甜菜异皮线虫，马铃薯金线虫，马铃薯白线虫，南方根结线虫，爪哇根结线虫，花生根结线虫，北方根结线虫，奇特伍德根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)，Meloidogyne paranaensis，伤残短体线虫，穿刺短体线虫(Pratylenchuspenetrans)，相似穿孔线虫(表3)。

[0193] 表3：前300种靶在大豆异皮线虫和其它垫刃线虫物种中表达的证据

[0194]

[0195] 实施例7

[0196] 大豆异皮线虫RNAi的靶列表

[0197] 可以通过RNA干扰破坏植物病原体大豆孢囊线虫，即大豆异皮线虫中的靶基因功能，并且可以导致病原体生命周期的破坏。用于破坏的最优靶基因包括生命周期必须的基因，其中破坏导致寄生虫群体的高外显率死亡或“遗传死亡”，这是通过阻断繁殖，而对植物的破坏最少，并且最少的可存活逃逸线虫达到下一代。发明人提供了用于选择RNAi靶的过程和预测对大豆异皮线虫繁殖是必须的300种靶基因的列表。用于预测靶的关键特征包括与具有强的和可再现的RNA干扰表型的秀丽新杆线虫已知基因的直向同源性。完整的前300种靶的列表提供在图3。表4列出了用于在植物组织中进行测定的选择的基因靶。

[0198] 表4：用于大豆发根和植物内测定的选择的基因靶

[0199]核苷酸序列上的
基因名称 匹配核苷酸序列 位置 肽序列
Bli-3 SeqID_1304 12-552 SeqID_1889
Bli-3 SeqID_1487 12-552 SeqID_1889
C23H3.4 SeqID_510 925-735 SeqID_1056
C23H3.4 SeqID_814 SeqID_1056
SeqID_814 586-776 SeqID_1056
C26E6.4 SeqID_539 2836-3029 SeqID_1051
C34G6.6 SeqID_511 3917-3429 SeqID_1233
C34G6.6 SeqID_790 244-732 SeqID_1233
Cct-4 SeqID_1318 193-568 SeqID_1741
Cct-4 SeqID_1537 193-568 SeqID_1741
Cgh-1 SeqID_1289 319-795 SeqID_1722
Cgh-1 SeqID_1513 280-756 SeqID_1722
Cgh-1 SeqID_1289 1587-1761 SeqID_1722
Crs-1 SeqID_535 1783-1487 SeqID_1035
Crs-1 SeqID_792 1353-1649 SeqID_1035
Cyc-1 SeqID_513 1375-1154 SeqID_1046
Cyc-1 SeqID_804 529-750 SeqID_1046
F01G10.1 SeqID_509 3122-3454 SeqID_1055
F01G10.1 SeqID_813 690-1022 SeqID_1055
F52B11.3 SeqID_508 3280-3088 SeqID_1053
F52B11.3 SeqID_811 1036-1228 SeqID_1053
F54B3.3 SeqID_524 2457-2222 SeqID_1058
F54B3.3 SeqID_816 266-501 SeqID_1058

[0200]Kin-2 SeqID_506 1310-1023 SeqID_1032
Kin-2 SeqID_787 79-366 SeqID_1032
Kin-2 SeqID_1921 15-464 SeqID_1931
Kin-2 SeqID_1921 465-714 SeqID_1931
Kin-2 SeqID_1926 211-460 SeqID_1931
Kin-2 SeqID_787 265-514 SeqID_1032
Kin-2 SeqID_787 514-663 SeqID1032
Kin-2 SeqID_1921 340-586 SeqID_1931
Kin-2 SeqID_1926 86-332 SeqID_1931
Kin-2 SeqID_787 140-386 SeqID_1032
Let-767 SeqID_1306 328-687 SeqID_1735
Let-767 SeqID_1528 295-654 SeqID_1735
Pas-4 SeqID_1292 564-894 SeqID_1724
Pas-6 SeqID_1290 314-859 SeqID_1723
Ran-1 SeqID_1307 550-777 SeqID_1736
Rpt-1 SeqID_1310 328-581 SeqID_1737
Rpt-1 SeqID_1531 328-581 SeqID_1737
Rpt-1 SeqID_523 1356-1609 SeqID_1047
Rpt-1 SeqID_805 668-921 SeqID_1047
Sec61α SeqID_1330 93-488 SeqID_1751
Sec61α SeqID_1548 93-488 SeqID_1751
Top-1 SeqID_1298 1-449 SeqID_1729
Top-1 SeqID_1521 1-449 SeqID_1729
Top-1 SeqID_1920 1569-2017 SeqID_1930
Top-1 SeqID_1925 1565-2013 SeqID_1930
Uba-1 SeqID_1923 1977-2184 SeqID_1933
Uba-1 SeqID_1928 1715-1922 SeqID_1933
Uba-1 SeqID_505 2500-2708 SeqID_1031
Uba-1 SeqID_786 1562-1770 SeqID_1031
Vab-10 SeqID_542 2871-3759 SeqID_1028
Vab-10 SeqID_788 444-1332 SeqID_1028

[0201]Vha-12 SeqID_1303 44-496 SeqID_1733
Vha-12 SeqID_1526 1-453 SeqID_1733
Vha-12 SeqID_793 1-453 SeqID_1036
Vha-13 SeqID_1312 16-255 SeqID_1906
Vha-13 SeqID_1533 16-255 SeqID_1906
Vha-13 SeqID_514 1979-2218 SeqID_1048
Vha-13 SeqID_806 707-946 SeqID_1048
Vha-15 SeqID_519 1318-1137 SeqID_1033
Vha-15 SeqID_789 997-1178 SeqID_1033
Y48B6A.3 SeqID_1302 1755-2384 SeqID_1732
Y48B6A.3 SeqID_1525 1697-2326 SeqID_1732
Y55H10A.1 SeqID_1327 524-830 SeqID_1748
Y55H10A.1 SeqID_1545 524-830 SeqID_1748
ZK1127.5 SeqID_538 285-535 SeqID_1050
ZK1127.5 SeqID_808 50-300 SeqID_1050

[0202] 实施例8

[0203] 在阻断大豆的大豆孢囊线虫感染中显示效力的选择的大豆异皮线虫基因

[0204] 浸泡测定的结果显示，pas-4(如存在于SEQ ID NO：1292的核苷酸1-544)、pas-5(例如存在于SEQ ID NOs：525，569，797，SEQ ID NO：1293的核苷酸1-672，或SEQ ID NO：1516)、pas-6(例如存在于SEQ ID NO：1290的核苷酸314-859)和cgh-1(例如存在于SEQ ID NO：1289的核苷酸931-1567)等的直向同源物(和所述直向同源物的片段，证明在阻断大豆孢囊线虫(SCN)繁殖中的效力。这些基因中的每一个都存在于图3的前16个条目中。

[0205] 在大豆发根测定(如Narayanan et al.，1999)和植物组织中也测试了选择的基因或基因片段，证明对SCN的抗性，如表5所示：

[0206] 表5.证明SCN抗性活性的发根测定结果

[0207]基因名称 基因座 I类 II类 III类 IV类 总Exp
Sec61α Y57G11C.15 2 1 2 0 7
Uba-1 C47E12.5 8 2 2 0 16
Kin-2 R07E4.6 20 8 3 4 32
Vab-10 ZK1151.1 1 1 2 0 7
Vha-15 T14F9.1 4 2 1 0 8
C34G6.6 C34G6.6 1 2 0 1 7
Y48B6A.3 Y48B6A.3 0 1 0 0 2
Crs-1 Y23H5A.7 1 0 0 0 2
Vha-12 F20B6.2 0 1 0 0 4
Pas-4 C36B1.4 2 0 0 0 6
Bli-3 F56C11.1 3 0 0 0 3
Cgh-1 C07H6.5 1 0 0 1 9
Let-767 C56G2.6 3 0 1 0 4
Pas-6 CD4.6 2 5 0 1 7
Ran-1 K01G5.4 2 2 0 0 5
Cyc-1 C54G4.8 1 0 0 0 2
Rpt-1 C52E4.4 2 0 0 0 6
Vha-13 Y49A3A.2 3 2 1 0 8
Top-1 M01E5.5 18 8 2 4 26
ZK1127.5 ZK1127.5 0 2 0 0 2
C26E6.4 C26E6.4 1 1 1 0 3
F52B11.3 F52B11.3 2 1 1 0 3
F01G10.1 F01G10.1 6 1 3 1 10
C23H3.4 C23H3.4 2 1 0 0 5
Cct-4 K01C8.10 3 1 0 0 4
F54B3.3 F54B3.3 0 1 0 0 2
Y55H10A.1 Y55H10A.1 3 1 1 0 6

[0208] 表5的效力分类

[0209] IV类：相对于转基因空载体野生型对照的平均孢囊数目，平均孢囊数目的减少大于或等于50％；

[0210] III类：相对于转基因空载体野生型对照的平均孢囊数目，平均孢囊数目减少35-49％；

[0211] II类：相对于转基因空载体野生型对照的平均孢囊数目，平均孢囊数目减少20-34％；

[0212] I类：具有各个转化事件，具有比用转基因空载体野生型对照观察到的最高事件更高的效力

[0213] 制备转基因大豆植物，其表达编码例如Pas-4，Pas-5，Cgh-1或Pas-6的基因片段，测试这些植物的SCN抗性。结果示于表6，证明在减少SCN感染和/或繁殖中的效力。

[0214] 表6.SCN抗性的转基因植物分析

[0215]

[0216] 表6的效力分类：

[0217] I类：相对于Lee74或A3244的平均孢囊数目，平均孢囊数目减少10-20％；

[0218] II类：相对于Lee74或A3244的平均孢囊数目，平均孢囊数目减少20-35％；

[0219] III类：相对于Lee74或A3244的平均孢囊数目，平均孢囊数目减少36-50％；

[0220] IV类：相对于Lee74或A3244的平均孢囊数目，平均孢囊数目减少>50％

[0221] * * * * * * * * * * * * * *

[0222] 根据本公开内容，可以制备和实施本文公开和要求保护的所有组合物和方法，而不需要过度实验。尽管已经根据上述示例性实施方案描述了本发明的组合物和方法，本领域技术人员可以明确，在不背离本发明的真实概念、精神和范围的前提下，可以对本文描述的组合物、方法和步骤或方法的步骤的顺序进行变化、改变、修饰和变更。更具体地，可以明确，某些化学和生理相关的试剂可以取代本文描述的试剂，而能够获得相同或相似的结果。本领域技术人员可以明确的所有这些相似的取代和修饰都认为包含在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。

[0223] 参考文献

[0224] 以下文献通过引用结合到本文中：

[0225] 美国专利4,536,475；美国专利4,693,977；美国专利4,886,937；美国专利4,940,838；美国专利4,959,317；美国专利5,015,580；美国专利5,107,065；美国专利5,110,732；
美国专利5,231,020；美国专利5,283,184；美国专利5,302,523；美国专利5,384,253；美国专利5,464,763；美国专利5,464,765；美国专利5,501,967；美国专利5,508,184；美国专利
5,527,695；美国专利5,538,880；美国专利5,459,252；美国专利5,550,318；美国专利5,
563,055；美国专利5,591,616；美国专利5,593,874；美国专利5,633,435；美国专利5,693,
512；美国专利5,698,425；美国专利5,712,135；美国专利5,759,829；美国专利5,780,708；
美国专利5,789,214；美国专利5,804,693；美国专利5,824,877；美国专利5,837,848；美国专利5,981,840；美国专利6,118,047；美国专利6,160,208；美国专利6,326,193；美国专利
6,384,301；美国专利6,399,861；美国专利6,403,865；美国专利6,506,559

[0226] 美国专利申请系列号10/465,800；美国专利申请系列号11/360,355

[0227] 美国公开2002/0048814；美国公开2003/0018993；美国公开2003/0061626；美国公开2003/0150017；美国公开2003/0175965；美国公开2004-0029283；美国公开2004/0098761；美国公开2004/0133943；美国公开2005/0188438；美国公开2006/0037101；美国公开2006/0200878 A1

[0228] Aboobaker and Blaxter，Mol.Biochem.Parasitol.，129：41-51，2003.

[0229] Altschul et al.，J.Mol.Biol.，215：403-410，1990.

[0230] Ashrafi et al.，Nature，421：268-72，2003.

[0231] Ausubel et al.，In：Current Protocols in Molecular Biology，John，Wiley & Sons，Inc，New York，1998.

[0232] Barker et al.，In：Plant and Soil Nematodes：Societal Impact andFocus for the Future，Comm.Natl.Needs Priorities Nematol.，CooperativeState Research Service，US Dept.Arig.Soc.Nematologists，1994.

[0233] Bevan et al.，Nature，304：184-187，1983.

[0234]  and Grundler Parasitology 109：249-254，1994

[0235]  et al.Plant Physiol 112：1421-7，1996.

[0236] Broothaerts et al.，Nature，433：629-633，2005.

[0237] Brutlag et al.，Computers and Chemistry，17：203-207，1993.

[0238] De Meutter et al.Mol Plant Path 6：321-325，2005.

[0239] Dellaporta et al.，In：Chromosome Structure and Funotion：Impactof New Concepts，18th Stadler Genetics Symposium，11：263-282，1988.

[0240] Elbashir et al.，Genes Dev.，5(2)：188-200，2001.

[0241] EP 0 120 516

[0242] EP 0 122 791

[0243] Fairbairn et al.，“Plant Delivered RNAi(PD-RNAi)：A novel strategyto control plant parasitic nematodes by inactivating nematode genes inplanta”，(Annual Meeting Abstract #372)American Society for PlantBiology，2005.

[0244] Fire et al.，Nature，391(6669)：806-811，1998.

[0245] Fraser et al.，Nature，408：325-330，2000.

[0246] Gheysen and Fenoll，Annu.Rev.Phytopathol.40：191-219，2002.

[0247] Gonczy et al.，Nature，408：331-336，2000.

[0248] Gruber et al.，In：Vectors for Plant Transformation，Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，Glick and Thompson(Eds.)，CRCPress，Inc.，Boca Raton，89-119，1993.

[0249] Hamilton and Baulcombe，Science，286：950-952，1999.

[0250] Hannon，Nature，418：244-251，2002

[0251] Haymes et al.，In：Nucleic acid hybridization，a practical approach，IRL Press，Washington，DC，1985.

[0252] Herrera-Estrella et al.，Nature，303：209-213，1983.

[0253] Hirel et al.，Plant Molecu larBiology，20：207-218，1992.

[0254] Horsch et al.，Science，227：1229，1985.

[0255] Hoth et al.Plant Physiol 138：383-392，2005.

[0256] Hussein et al.，Mol.Biochem.Parasitol.，122：91-94，2002.

[0257] Ikatu et al.，Bio/Technol.，8：241-242，1990.

[0258] Jefferson et al.，EMBOJ.，6：3901-3907，1987.

[0259] Juergensen et al.Plant Physiol 131：61-69，2003.

[0260] Kaeppler et al.，Plant Cell Rep.，8：415-418，1990.

[0261] Kamath et al.，Genome Biol.，2：R02，2001.

[0262] Kamath et al.，Nature，421：231-237，2003.

[0263] Katz et al.，J.Gen Microbiol.，129：2703-2714，1983.

[0264] Klee et al.，Bio/Technol.，3：637-642，1985.

[0265] Kwa et al.，J.Mol.Biol.，3：246：500-510，1995.

[0266] Lustigman et al.，Mol.Biochem.Parasitol.，138：165-70，2004.

[0267] Maeda et al.，Curr.Biol.，11：171-176，2001.

[0268] Mazarei et al.Mol Plant Path 5：409-423，2004.

[0269] Martinez et al.，Cell，110：563-574，2002.

[0270] McCarter et al.，Genome Biology，4：R26，1-19，2003.

[0271] McCarter，Trends in Parasitology，20：462-468，2004.

[0272] McManus and Sharp，Nat.Rev.Genet.，3：737-47，2002.

[0273] Miki et al.，In：Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick andThompson(Eds.)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，67-88，1993.

[0274] Moloney et al.，Plant Cell Reports，8：238，1989.

[0275] Narayanan et al.，Crop Sci.39：1680-1686，1999.

[0276] Odell et al.，Nature，313：810-812，1985.

[0277] Omirulleh et al.，Plant Mol.Biol.，21：415-428，1993.

[0278] Opperman et al.，Science 263：221-223，1994.

[0279] Ow et al.，Science，234：856-859，1986.

[0280] Padgette et al.，Crop Sci.，35：1451-1461，1995.

[0281] Papp et al.，Nature，424：194-197，2003.

[0282] Parkinson et al.，Nature Genetics，36：1259-1267，2004.

[0283] PCT申请W O06/073727

[0284] PCT申请WO 05/019408

[0285] PCT申请WO 03/052110 A2.

[0286] PCT申请WO 97/32016

[0287] PCT申请WO 99/49029

[0288] PCT申请WO 99/53050

[0289] PCT申请WO 94/01550

[0290] PCT申请WO 98/05770

[0291] Piano et al.，Curr Biol.，10：1619-1622，2000.

[0292] Piano et al.，Curr Biol.，12：1959-64，2002.

[0293] Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.，199：183-188，1985.

[0294] Redmond et al.，Mol.Biochem.Parasitol.，112：125-31，2001.

[0295] Reynolds et al..Nat Biotechnol.22：326-330，2004.

[0296] Sambrook et al.，(ed.)，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989.

[0297] Simmer et al.，PLoS Biol.，1：E12，2003.

[0298] Sonnichsen et al.，Nature，434：462-469，2005.

[0299] Sutcliffe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：3737-3741，1978.

[0300] Thurau et al.Plant Mol Biol 52：643-660，2003.

[0301] Urwin et al.，Mol.Plant Microbe.Interact.，15：747-752，2002.

[0302] Vaghchhipawala et al.Genome 47：404-413，2004.

[0303] Van Heeke and Schuster，J.Biol.Chem.，264：5503-5509，1989.

[0304] Winston et al.，Science，295：2456-2459，2002.

[0305] Zukowski et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：1101-1105，1983.