一种去除流感病毒原液中内毒素的方法

摘要

本发明提供一种从流感病毒原液中去除内毒素的方法，包括萃取分离，其特征在于在流感病毒原液中加入终浓度为0.5-5％(体积百分浓度)的介质——聚乙二醇单辛基酚醚，用于萃取分离流感病毒原液中的蛋白质和内毒素。可在不改变流感病毒原液原有性质的条件下，有效去除流感病毒原液中的内毒素，使内毒素含量降低到＜0.25EU/mL，并保留流感病毒原液中的有效成分，达到优化质量的效果，本发明操作简单，内毒素去除率高，蛋白质总量回收率高达85％以上，血凝效价不变，血凝素含量回收率达99％以上，所得流感病毒原液安全、可靠。

权利要求

1.一种从流感病毒原液中去除内毒素的方法，其特征在于经过下列步骤：A、在流感病毒原液中加入终浓度为0.5～5％体积百分浓度的聚乙二醇单辛基酚醚表面活性剂-Triton X-114，混匀；

B、置于温度为37±0.5℃的水浴中孵育5～10分钟，使聚乙二醇单辛基酚醚表面活性剂Triton X-114介质与流感病毒原液形成一相，20～30分钟溶液明显分层后取出；

C、于室温、10000rpm～15000rpm条件下离心分离3～8分钟，吸取上清液；

D、在步骤C的上清液中，加入终浓度为1％体积百分浓度的聚乙二醇单辛基酚醚表面活性剂Triton X-114介质，并重复A步骤-C步骤2～3次，收集所得上清液，即为去除内毒素的流感病毒原液。

说明书

一种去除流感病毒原液中内毒素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种去除内毒素的方法，尤其是一种在流感病毒原液生产过程中，从流感病毒原液中去除内毒素的方法，属于生物技术领域。

[0002] 技术背景

[0003] 随着对生物制品安全性的重视，对其热原的控制越来越严格。在生物制品的生产过程中，常会因原辅材料、生产环境以及个人操作等因素而造成内毒素污染，因此产生环节是内毒素产生的一大来源，而要防止内毒素污染，必须在生产环节中采取有效的工艺控制及严格的预防措施。

[0004] 现有的方法大多根据内毒素分子的特性来破坏或去除内毒素。具体包括用常规的超滤膜、离子交换色谱或亲和色谱等。其中：

[0005] 由于内毒素分子通常以聚合状态存在，具有较大的相对分子质量，因此可选用超滤膜去除内毒素。Czermak P等人(Czermak P，EbrahimiM，Catapano G.New generation ceramic membranes have the potential ofremoving endotoxins from dialysis water and dialysate[J].Int J ArtifOrgans.2005 Jul，28(7)：694-700.)发现疏水合成的超滤膜能有效地去除内毒素，但是反复的除菌会破坏膜的分离性，限制其使用，且在去除蛋白制品中的内毒素时，由于超滤过程中的压力较高，会导致蛋白损坏，因此超滤膜不适合于从蛋白中去除内毒素。

[0006] 内毒素分子的pK1值约为1.3，在生理条件下带有部分负电荷，根据内毒素的这一性质，可用阴离子交换色谱去除蛋白制品中的内毒素。欧洲专利(EP0800862)采用含有磺酸基的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，利用离子交换的原理，来去除重组蛋白质肿瘤坏死因子或白介素中的内毒素的，它主要是吸附重组蛋白质。但在离子交换中，遇到碱性蛋白时，有可能与内毒素一起被洗脱而引起蛋白的损失，而遇到酸性蛋白时，则其能和内毒素形成复合物将其从柱上脱离，从而不能达到蛋白质与内毒素的完全分离。(Friedrich Birger Anspach and Oliver Hilbeck.Removal of endotoxinsby affinity sorbents[J].Journal of Chromatography A，1995September：81-92)。

[0007] 另外，使用亲和色谱体系来选择性去除内毒素，就载体费用而言，这些体系中载体价格昂贵，且难于再生，造成载体的寿命短，同时色谱体系中存在着容量小的问题。美国专利(US4885168)采用低分子量壳聚糖，利用壳聚糖上带正电荷的氨基来与带负电荷的核酸与内毒素作用，达到除去核酸与内毒素的目的，但壳聚糖的利用率低。D.Pet sch，T.C.Beeskow等(1997，Journal of Chromatography B.693，79-91)采用去氧胆酸钠，或已二胺作为亲和配基，以微孔尼龙膜为介质，制成亲和膜；采用单张亲和膜，可以去除缓冲液或牛血清白蛋白中的内毒素；但是流速低，阻力高，处理量少，不易放大。

[0008] 由于内毒素固有的如带电性与部分蛋白相同，双性分子以及易形成微囊结构等特性，使得上述常用的从蛋白质溶液中去除内毒素的方法，很难将其与蛋白质彻底分离，且操作繁琐，成本高。

[0009] 流感裂解灭活病毒疫苗是通过鸡胚培养法获得病毒尿囊液，再经过一系列病毒裂解灭活和纯化过程制得的一种用于预防流感的发生和传播的生物制品，其病毒原液由于鸡胚带有潜在的病原菌，而SPF鸡胚的获得较为困难，以及后处理分离纯化过程复杂，易造成内毒素的污染。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于提供一种从流感病毒原液中去除内毒素的方法，且该方法既可去除内毒素，又能最大限度地保持病毒原液质量。

[0011] 本发明通过下列技术方案完成：一种从流感病毒原液中去除内毒素的方法，包括萃取分离，其特征在于在流感病毒原液中加入终浓度为0.5～5％(体积百分浓度)的介质——聚乙二醇单辛基酚醚，用于萃取分离流感病毒原液中的蛋白质和内毒素。

[0012] 所述聚乙二醇单辛基酚醚介质是一种聚乙二醇单辛基酚醚表面活性剂——Triton X-114。

[0013] 所述流感病毒原液为流感病毒疫苗制备过程中的半成品，属公知公用产品。

[0014] 本发明提供的一种从流感病毒原液中去除内毒素的方法，具体经过下列步骤：

[0015] A、在流感病毒原液中加入终浓度为0.5～5％(体积百分浓度)的聚乙二醇单辛基酚醚表面活性剂-Triton X-114，混匀；

[0016] B、置于温度为37±0.5℃的水浴中孵育5-10分钟，使聚乙二醇单辛基酚醚表面活性剂Triton X-114介质与流感病毒原液形成一相，20～30分钟溶液明显分层后取出；

[0017] C、于室温、10000rpm～15000rpm条件下离心分离3～8分钟，吸取上清液；

[0018] D、在步骤C的上清液中，加入终浓度为1％(体积百分浓度)的聚乙二醇单辛基酚醚表面活性剂Triton X-114介质，并重复A步骤-C步骤2～3次，收集所得上清液，即为去除内毒素的流感病毒原液。

[0019] 本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，可在不改变流感病毒原液原有性质的条件下，有效去除流感病毒原液中的内毒素，使内毒素含量降低到＜0.25EU/mL，并保留流感病毒原液中的有效成分，达到优化质量的效果，本发明操作简单，内毒素去除率高，蛋白质总量回收率高达85％以上，血凝效价不变，血凝素含量回收率达99％以上，所得流感病毒原液安全、可靠。

具体实施方式

[0020] 下面结合实施例对本发明做进一步描述。

[0021] 实施例1

[0022] A、在装有50ml的流感病毒原液的离心管中加入终浓度为1％的聚乙二醇单辛基酚醚表面活性剂Triton X-114介质0.5ml，混匀；

[0023] B、置于温度为37±0.5℃的水浴锅内孵育10分钟，使聚乙二醇单辛基酚醚表面活性剂Triton X-114介质与流感病毒原液形成一相，30分钟溶液明显分层后取出；

[0024] C、于室温、15000rpm条件下离心分离8分钟，吸取上清液转至另一离心管中；

[0025] D、再步骤C的离心管中，加入终浓度为1％的聚乙二醇单辛基酚醚表面活性剂Triton X-114介质，并重复A步骤-C步骤3次，收集所得上清液，即为去除内毒素的流感病毒原液。