一种甲硝唑的快速检测方法、检测试剂盒和在检测化妆品、消毒剂中添加甲硝唑上的应用

摘要

本发明公开一种甲硝唑的快速检测方法、检测试剂盒和在检测化妆品、消毒剂中添加甲硝唑上的应用，该检测方法是先对待测样品进行酸溶解富集然后有机溶剂进一步纯化分离，最后用碱显色，根据颜色变化来判断样品中是否含有甲硝唑。本发明的检测方法可针对化妆品、消毒剂中是否添加有甲硝唑进行快速检测，检测方法操作简便，不需要大型仪器，检测成本低。本发明的方法采用酸和有机溶剂两步纯化，使得甲硝唑浓浓缩富集保证了碱显色的正确率。本发明的碱显色反应采用氢氧化钠固体，利用氢氧化钠溶解所释放的热量达到显色反应的温度，省去了水浴设备，更加有利于基层现场的流动性检测。

权利要求

1.一种甲硝唑的快速检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)向待测化妆品或消毒剂中加入酸液，混匀；所述酸液为硫酸、醋酸或盐酸；

(2)向上述混合液中加入有机溶剂，振摇萃取，静置使分层；所述有机溶剂为石油醚或氯仿；

(3)取上述萃取液的下层酸液，向其中加入氢氧化钠固体，根据溶液的颜色变化判断待测样品中是否含有甲硝唑。

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于步骤(1)中，所述酸液的用量为2～3ml。

3.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于所述酸液为3体积％硫酸溶液。

4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述有机溶剂为石油醚II。

5.一种检测试剂盒，其特征在于该试剂盒是利用权利要求1所述检测方法检测甲硝唑，该试剂盒包含3体积％硫酸溶液、石油醚II和固体氢氧化钠。

说明书

一种甲硝唑的快速检测方法、检测试剂盒和在检测化妆品、

消毒剂中添加甲硝唑上的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及甲硝唑的检测方法，具体涉及一种甲硝唑的快速检测方法、检测试剂盒和在检测化妆品、消毒剂中添加甲硝唑上的应用。

背景技术

[0002] 甲硝唑(英文名称为Metronidazole，MNZ)，商品名为灭滴灵、甲硝哒唑、甲硝基羟乙唑、灭滴唑。甲硝唑的化学名称为2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙醇，分子式为C6H9N3O3。它是一种硝基咪唑类药物，其硝基在无氧环境中还原成氨基而显示广谱抗厌氧菌和抗原虫的作用，临床主要用于预防和治疗厌氧菌引起的感染，如呼吸道、消化道、腹腔及盆脓感染，皮肤软组织、骨和骨关节等部位的感染以及脆弱拟杆菌引起的心内膜炎、败血症及脑膜炎等，同时还广泛应用于预防和治疗口腔厌氧菌感染。此外，甲硝唑对疥螨有较好的杀灭作用，可治疗疥疮，可杀灭引起炎症性痤疮的棒状杆菌，故对痤疮有效。

[0003] 当前许多除痘、祛螨类化妆品、用于阴道炎等妇科炎症的消毒剂、动物性食品以及口腔类医药用品中均违法添加有甲硝唑，虽然甲硝唑具有抗菌消炎的作用，但是长期使用会引起皮肤糜烂、瘙痒等，还可能引起过敏性休克、哮喘等呼吸系统症、泌尿道的不良反应、白细胞和血小板减少、疱疹性皮炎、孕妇早产、癫痫发作和抑郁症等，严重时可危及患者的生命，此外甲硝唑还会导致对抗生素的耐药性，造成健康隐患。

[0004] 目前我国《化妆品卫生规范2002年版》制定的化学指标分析方法只有22个标准仅涉及57项，很多添加到化妆品的物质由于缺乏系统的成分、毒性、功效检测方法及评价要求，使得目前化妆品的卫生质量仅仅是现行标准规定的“合格”，不能有效反映化妆品的真实卫生质量，特别是化妆品中药物非法添加正受到越来越多的关注。我国《化妆品卫生规范》、欧盟化妆品规程规定甲硝唑、氯霉素、林可霉素等抗生素类物质禁止在化妆品中使用。

[0005] 北京市疾病预防控制中心环境卫生所对在北京、江苏、江西地区销售的122件祛痘除螨类化妆品进行了检测，122件样品检出甲硝唑14件，超标率11.5％，最大添加量达到3.9％，其中广东28件中检出甲硝唑5件，超标率达17.9％。

[0006] 目前对于违法添加甲硝唑的检测，主要是采用高效液相色谱、液相色谱质谱联用、薄层层析等方法。高效液相色谱法是常用的现代分析方法，它具有色谱分离效率高、灵敏度高等优点，在相同的色谱条件下，甲硝唑对照品溶液和样品提取所得的供试品溶液分别进样，根据色谱保留时间可判断待测样品是否含有甲硝唑。

[0007] 市面上出售的一种硝基咪唑类检测试剂盒，是采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的甲硝唑和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗甲硝唑抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其残留物甲硝唑的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中甲硝唑的含量。

[0008] 边疆、杨立延等人【边疆.杨立延.陈奕桦.王艳秋，双波长线性回归测定醋酸氯己定和甲硝唑.中华预防医学杂质.2000(34)1：54-55】采用双波长线性回归法测定复方消毒剂中的甲硝唑，通过建立标准曲线以及分光光度计测量，得到甲硝唑的含量。

[0009] 上述的色谱法、ELISA方法和双波长线性回归法等，虽然都能检测出化妆品或消毒剂中的甲硝唑，但是这些方法都存在操作复杂、样品处理时间长、对于大批量待检测样品无法做到快速筛查，检测工作量大等问题，此外色谱法还存在仪器价格昂贵，色谱柱易受污染、分析成本高和不适合做流动性大的现场检测等问题。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种不需贵重分析仪器、分析成本低、对甲硝唑检测的专属性强、灵敏度高且试验现象明显、检验结果正确率高、适用于现场快速检测样品中是否违法添加有甲硝唑的快速检测方法。

[0011] 本发明的另一个目的在于提供一种利用上述方法检测甲硝唑的检测试剂盒。

[0012] 本发明的另一个目的在于提供上述快速检测方法在检测化妆品、消毒剂中是否添加有甲硝唑上的应用。

[0013] 本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

[0014] 一种甲硝唑的快速检测方法，该方法是利用甲硝唑的如下两个性质对其实现快速检测：

[0015] (1)甲硝唑在不同溶剂中的溶解性是有差异的，它可溶于酸，但在石油醚、乙醚等有机溶剂中是极微弱溶解的；

[0016] (2)芳香族硝基化合物易于被还原，因此当甲硝唑被碱还原后会生成桔红色的偶氮苯和无色的氢化偶氮苯。

[0017] 利用甲硝唑的上述两个性质，本发明设计出先对待测样品进行酸溶解富集然后有机溶剂进一步纯化，最后用碱显色的方法，该方法包括如下步骤：

[0018] (1)向待测样品中加入酸液，混匀；这一步的酸液可以将甲硝唑以及其它溶于酸的物质从待测样品中提取，分离出来，实现了甲硝唑的初步富集；

[0019] (2)向上述混合液中加入有机溶剂，振摇萃取，静置使分层；因为甲硝唑极微弱溶解于有机溶剂，所以混合液中能溶于有机溶剂的成分被有机溶剂萃取分离出去，而甲硝唑依然保持在酸液中；

[0020] (3)向上述萃取液的下层酸液中加入氢氧化钠固体，氢氧化钠固体溶解释放出热量，正好可用于显色反应需要，根据溶液的颜色变化判断待测样品中是否添加有甲硝唑；如果溶液的颜色变为紫红色或粉红色则说明该待测样品中添加有甲硝唑，如果溶液的颜色无变化则说明该待测样品中未添加有甲硝唑。

[0021] 上述步骤(1)中，所述酸液可以采用本领域常用的任何一种酸液，如硫酸、醋酸、盐酸等，所述酸液的加入体积可优选2～3ml，这样就可以将甲硝唑浓缩于2～3ml的酸中，增大甲硝唑的富集浓度。

[0022] 上述步骤(1)中，酸液的浓度一般选择大于3体积％就可以，酸浓度过高会有强的腐蚀性，优选3体积％硫酸溶液。

[0023] 上述步骤(2)中，所述有机溶剂可以采用本领域中任何一种常用的有机溶剂，如石油醚、氯仿等。由于氯仿等有机溶剂毒性比较大，所以优选低毒的有机溶剂，如石油醚，石油醚分为三种，分别为石油醚I(30～60℃)、石油醚II(60～90℃)和石油醚III(90～120℃)，优选石油醚II(60-90℃)。

[0024] 对于一些液体类的样品，因为液体类相对于膏类、栓剂和乳剂来说，其添加剂相对较少，成分也不太复杂，所以可以选择省去步骤(2)，直接加入酸液后再加氢氧化钠固体进行显色反应。

[0025] 碱对甲硝唑的显色反应是需要一定温度的，一般需要在60℃以上，氢氧化钠固体溶于水后会释放热量从而使得溶液的温度上升，一般可达到60℃，正好符合显色反应所要求的温度，因此本发明在步骤(3)中直接使用氢氧化钠固体，无需另外的加热设备(如水浴锅等)就可以进行显色反应，并且根据显色结果判断样品中是否添加有甲硝唑。

[0026] 上述步骤(3)中，对于氢氧化钠固体的用量可以选择25～40mg，优选30mg。

[0027] 利用本发明的快速检测方法，制备针对甲硝唑的检测试剂盒，如可将3体积％硫酸、石油醚和氢氧化钠固体分别装入容器中，组装成试剂盒，使用的时候只需要根据样品的量取用试剂盒中的试剂，按照本发明的方法就可以判断待测样品中是否添加有甲硝唑。

[0028] 本发明的快速检测方法可用于检测化妆品、消毒剂中是否添加有甲硝唑，如妇女经期卫生用品卫生栓(内置棉条)、皮肤或粘膜卫生用品、抗(抑)菌洗剂等，此外，本发明的方法还可以用于动物性食品、口腔类医药用品等产品中是否添加有甲硝唑的检测。

[0029] 本发明的快速检测方法主要是针对化妆品、消毒品等中是否违法添加了甲硝唑进行的初筛，只要是利用本发明方法进行显色后，出现粉红色或紫红色的化妆品，则可初步判断该化妆品中可能添加有甲硝唑，如果显色反应为无变化，则说明该化妆品中肯定没有添加甲硝唑，然后将可能添加有甲硝唑的化妆品再进行质谱、色谱等更加精细的检测。虽然只是初筛，但是本发明的方法采用了酸和有机溶剂两步纯化，使甲硝唑在样品中得到了富集，因此显色反应时排除了很多的杂质干扰，检测结果准确率较高，本发明人通过对大批量样品进行本发明方法的检测，并同时进行色谱和质谱验证，发现本发明的方法，其准确率可以达到99％，假阴性率为0。此外，本发明的检测方法操作简便，所用时间短，一般2分钟内即可完成检查，而且结果直观通过看颜色就可以从大批量的待测化妆品中挑出少量的可疑样品，大大简化了检测的步骤，而且只需要对少量可疑的样品再进行质谱、色谱等精细检测，这也使得检测成本大大降低，适合于监管部门快速检查的需要，对提高监管部门的运作效率、快速打击不法分子有着重大的社会效益。

[0030] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0031] 1.本发明的快速检测方法利用酸进行初提，对甲硝唑进行第一次富集，接着利用有机溶剂对甲硝唑进行第二次纯化，使得用于碱液显色时的底物-甲硝唑在样品中具有一定的较高浓度，从而保证了显色反应结果正确率高于99％，假阴性率为0，虽然可能会出现假阳性，但是本发明主要是作为初筛的，而且可以快速地将可疑样品缩小到很小的范围内，最后只需要对这些极少的可疑样品再进行色谱、质谱等精确检测，既可以检测出违法含有甲硝唑的样品；

[0032] 2.本发明的快速检测方法不需要使用贵重分析仪器，尤其是最后的碱液显色部分，利用氢氧化钠固体溶解时候释放的热量，达到显色反应所需要的温度，不需要传统显色反应中水浴设备加热，更加方便流动性大的检测需要；

[0033] 3.本发明的快速检测方法其专属性强、灵敏度高、试验现象明显、检验结果正确率高、操作简便，适用于现场快速筛查样品中是否违法添加了甲硝唑，尤其符合监管现场快速检查的需要，可极大地提高监管部门的运作效率；

[0034] 4.本发明的快速检测方法及其检测试剂盒能满足基层药品、化妆品监督检验的需要。

具体实施方式

[0035] 下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

[0036] 实施例1新肤螨灵霜

[0037] 本实施例的新肤螨灵为霜剂，规格为15g。

[0038] 本实施例对该新肤螨灵中是否含有甲硝唑进行快速检测，其具体步骤如下：

[0039] (1)取新肤螨灵霜0.5g加入10ml一次性注射器中，用注射器吸取3％硫酸溶液2ml，用0.45μm有机相滤头替换针头，用力振摇使混匀；

[0040] (2)取石油醚II 4ml加入上述混匀后的液体中，用力振摇萃取，静置使分层；

[0041] (3)取下层酸液作为供试液置试管中，加入氢氧化钠固体试剂30mg，溶液立即有紫红色出现，则可判断本实施例新肤螨灵中含有甲硝唑。

[0042] 实施例2雨森痘痘怕排毒祛痘精华液

[0043] 本实施例的雨森痘痘怕排毒祛痘精华液为水剂，规格为30ml。

[0044] 本实施例对该雨森痘痘怕排毒祛痘精华液中是否含有甲硝唑进行快速检测，其具体步骤如下：

[0045] (1)取雨森痘痘怕排毒祛痘精华液3ml加入10ml一次性注射器中，用注射器吸取3％硫酸溶液2ml，用0.45μm有机相滤头替换针头，用力振摇使混匀；

[0046] (2)取上述混匀后的液体作为供试液置试管中，加入氢氧化钠固体试剂30mg，溶液立即有紫红色出现，则可判断本实施例雨森痘痘怕排毒祛痘精华液中含有甲硝唑。

[0047] 实施例3妇科千金栓

[0048] 本实施例的妇科千金栓为消毒品，规格为6枚/盒。

[0049] 本实施例对该妇科千金栓中是否含有甲硝唑进行快速检测，其具体步骤如下：

[0050] (1)取1粒妇科千金栓于试管中，加入3％硫酸溶液3ml，水浴加热至栓剂溶解，吸取溶液于10ml一次性注射器中，用0.45μm有机相滤头替换针头，用力振摇使混匀；

[0051] (2)取石油醚II4ml加入上述混匀后的液体中，用力振摇萃取，静置使分层；

[0052] (3)取下层酸液作为供试液置试管中，加入氢氧化钠固体试剂30mg，溶液立即有紫红色出现，则可本实施例的妇科千金栓中含有甲硝唑。

[0053] 实施例4彩琳止痘活肤洁面乳

[0054] 本实施例的彩琳止痘活肤洁面乳为乳剂，规格为20g。

[0055] 本实施例对该彩琳止痘活肤洁面乳中是否含有甲硝唑进行快速检测，其具体步骤如下：

[0056] (1)取彩琳止痘活肤洁面乳0.5g加入10ml一次性注射器中，用注射器吸取3％硫酸溶液2ml，用0.45μm有机相滤头替换针头，用力振摇使混匀；

[0057] (2)取石油醚II 4ml加入上述混匀后的液体中，用力振摇萃取，静置使分层；

[0058] (3)取下层酸液作为供试液置试管中，加入氢氧化钠固体试剂30mg。溶液无颜色