一种蛹虫草中虫草素提取纯化方法

摘要

本发明提供了一种蛹虫草中虫草素提取纯化方法，属于农产品深加工技术领域。包括：将蛹虫草原料粉碎后以料水比1∶20比例加水混合，进行超声波提取，将提取液离心过滤上大孔树脂柱，吸附流速1.8BV/hr；以15％甲醇水溶液为洗脱剂洗脱树脂柱，用旋转蒸发器在温度60℃下减压浓缩洗脱液，制得蛹虫草虫草素浓缩物。本发明可以实现蛹虫草原料中的虫草素在低温条件下水溶液提取，提取率达到85％；利用大孔树脂分离纯化后可去除提取物中的多糖和蛋白成分，使提取物中的虫草素含量达到10％。产品蛹虫草中虫草素活性高，既可以作为生产虫草素单体的原料，也可以直接作为保健品和功能食品的添加剂，具有广阔的市场发展前景。

权利要求

1.一种蛹虫草中虫草素提取纯化方法，包括：

1)蛹虫草中虫草素的提取：蛹虫草原料粉碎，过40～100目筛，然后以料液质量比

1∶20比例与提取液去离子水混和，在超声频率90kHz下进行超声波提取，提取温度60℃，提取时间30-60分钟，将提取液以4000转/分离心过滤，制得棕黄色蛹虫草提取液；

2)蛹虫草中虫草素的分离纯化：将提取液上大孔树脂柱，树脂型号为AB-8，PH值为

5～5.5，上样液量为5～6倍树脂柱体积，吸附流速1.8BV/hr；待吸附饱和后用冲洗液去离子水冲柱，当流出液澄清后，以体积比15％甲醇水溶液为洗脱剂洗脱树脂柱，洗脱液为2～

2.5倍树脂柱体积，流速1BV/hr时；

3)减压浓缩洗脱液：用旋转蒸发器在温度60℃，真空度0.09MP下减压浓缩洗脱液，制得蛹虫草虫草素浓缩物。

说明书

一种蛹虫草中虫草素提取纯化方法

一、技术领域

[0001] 本发明提供了一种蛹虫草中虫草素提取纯化方法，属于农产品深加工技术领域。二、背景技术

[0002] 蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草，与我国名贵中药材冬虫夏草(Cordyeeps sinensis)为同属异种，其虫草素(cordycepin)含量为(3.089±0.046)‰，较冬虫夏草中的虫草素高大约3到6倍.虫草素是虫草中的一种腺苷类结构类似物，分子式C10H13O3N5.虫草素已证明具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等作用，具有细胞毒性及免疫调节作用。目前，在国际市场上虫草素的纯品价格为25000美元/g。我国蛹虫草栽培普遍，但多以菌丝体或子实体的形式入药，因此，研究虫草素的提取工艺具有重要的经济价值和广阔的市场应用潜力。

[0003] 大孔吸附树脂是近年来国内外新发展的分离技术，并在医药领域(特别是天然药物精制)中广为应用，适合工业化生产，但将这一技术应用在虫草素的分离纯化方面还未见报道，本发明采用大孔吸附树脂分离技术分离三、发明内容

[0004] 技术问题

[0005] 本发明的目的在于提供一种蛹虫草中虫草素提取纯化方法，分离纯化后虫草素含量可达10％.通过大孔树脂可以使蛹虫草中的虫草素得到富集，具有生产成本低，技术成熟等特点。

[0006] 技术方案本发明提供的蛹虫草中虫草素提取纯化方法，包括：

[0007] 1)蛹虫草中虫草素的提取：蛹虫草原料粉碎，过40～100目筛，然后以料水比1∶20比例加去离子水混合，在超声频率90kHz下进行超声波提取，温度60℃，提取时间
30-60分钟，将提取液以4000转/分离心过滤，制得棕黄色蛹虫草提取液。

[0008] 2)蛹虫草中虫草素的分离纯化：将提取液上大孔树脂柱，树脂型号为AB-8，PH值为5～5.5，上样液量为5～6倍树脂柱体积，吸附流速1.8BV/hr；待吸附饱和后用去离子水冲柱，当流出液澄清后，以15％甲醇水溶液为洗脱剂洗脱树脂柱，洗脱液为2.0～2.5倍树脂柱体积，流速1BV/hr时.

[0009] 3)减压浓缩洗脱液：用旋转蒸发器在温度60℃，真空度0.09MP下减压浓缩洗脱液，制得蛹虫草虫草素浓缩物。

[0010] 上述一种蛹虫草中虫草素提取纯化方法，所用树脂为沧州宝恩化工有限公司生产，型号为AB-8；所用洗脱剂为15％甲醇水溶液；用去离子水作为提取剂和冲洗液。

[0011] 有益效果本发明可以将蛹虫草原料中的虫草素低温提取，最大限度地保持了虫草素的生物活性；利用大孔树脂分离纯化后可去除提取物中的多糖和蛋白成分，使提取物中的虫草素含量达到10％以上。产品蛹虫草中虫草素浓缩物杂质少，活性高，如作为分离虫草素单体的原料可以降低分离难度，提高分离效率，降低分离成本；如作为添加剂也可以直接添加到保健品和功能食品里，具有广阔的市场发展前景。

[0012] 本发明的主要优点和积极效果如下：

[0013] 1.本发明采用低温超声波水提法提取虫草素，最大限度地保持了虫草素的生物活性，提取率达到85％；

[0014] 2.利用大孔树脂分离纯化后可去除提取物中的多糖和蛋白成分，使提取物中的虫草素含量达到10％以上。

[0015] 3.产品蛹虫草中虫草素浓缩物杂质少，活性高，如作为分离虫草素单体的原料可以降低分离难度，提高分离效率，降低分离成本；产品蛹虫草中虫草素浓缩物杂质少，活性高，

[0016] 4.如作为分离虫草素单体的原料可以降低分离难度，提高分离效率，降低分离成本；如作为添加剂也可以直接添加到保健品和功能食品里，具有广阔的市场发展前景。四、附图说明

[0017] 图1虫草素标样的液相色谱图五、具体实施方式

[0018] 蛹虫草中虫草素的提取：蛹虫草原料苏科蛹1号(市售)粉碎，过40～100目筛，然后以料液比1∶20比例与提取液去离子水混和，在KQ5200E型超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司)上以超声频率90kHz进行超声波提取，提取温度60℃，提取时间30分钟，温度60℃，将提取液用TD5A-WS型离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)以4000转/分离心过滤离心，制得棕黄色蛹虫草提取液。本发明采用低温超声波水提法提取虫草素，最大限度地保持了虫草素的生物活性，提取率达到85％。

[0019] 蛹虫草中虫草素的分离纯化：将提取液上大孔树脂柱，树脂型号为AB-8(沧州宝恩化工有限公司)，PH值为5～5.5，上样液量为5～6倍树脂柱体积，吸附流速1.8BV/hr；待吸附饱和后用去离子水冲柱，当流出液澄清后，以15％甲醇水溶液为洗脱剂洗脱树脂柱，洗脱液为2～2.5倍树脂柱体积，流速1BV/hr时.

[0020] 减压浓缩洗脱液：用RE52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)在温度60℃，真空度0.09MP下将洗脱液浓缩到10ml，制得蛹虫草虫草素浓缩物。

[0021] 测定方法：利用高效液相色谱法进行虫草素含量的测定.测定方法如下：

[0022] 1试剂和材料

[0023] 磷酸二氢钾：分析纯。磷酸氢二钾：分析纯。四氢呋喃：色谱纯.无水乙醇：分析纯。4实验用水：应符合GB/T 6682-1992一级水的要求。虫草素标准品：纯度≥98％。

[0024] 2虫草素标准储备液：精确称取虫草素标准品15mg，用50％乙醇水溶液超声波振荡溶解，定溶至100mL，置于-18℃冰箱中保存，保存期为2个月。

[0025] 3流动相：精确称取1.36gKH2PO4、2.28gK2HPO4·3H2O于1L容量瓶中，加水溶解、定容，再加入10mL四氢呋喃，混匀备用。

[0026] 4仪器和设备

[0027] 液相色谱仪，带有紫外检测器，0.22μm滤膜。超声波仪高速离心机，转速不低于10000rpm。鼓风干燥箱。

[0028] 5测试步骤

[0029] 5.1试样的制备

[0030] 将样品用60℃低温烘干1小时，粉碎后过孔径为60目筛备用。精密称取粉末0.1g，放入试剂瓶中，加10.00mL蒸馏水，超声提取30分钟，0.22μm微孔滤膜滤过，提取液作为供试品溶液。

[0031] 5.2色谱条件

[0032] 5.2.1标准曲线

[0033] 用水稀释标准储备液，配制系列浓度的标准工作溶液：3μg/mL、6μg/mL、30μg/mL、75μg/mL、150μg/mL。0.22μm膜过滤，取滤液，在色谱条件下用微量进样器依次吸取10μL进样检测(n＝3)。以峰面积为纵坐标，相应的标准工作溶液浓度为横坐标。虫草素标样的高效液相色谱图(图1)，本发明利用大孔树脂分离纯化后可去除提取物中的多糖和蛋白成分，使提取物中的虫草素含量达到10％以上。

[0034] 5.2.2色谱柱：

[0035] C18柱(3.9mm×300mm，4μm)。

[0036] 5.2.3流动相：

[0037] KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH＝6.86，0.01mol/L)，等度洗脱；流速：1.00mL/min。

[0038] 5.2.4检测波长：260nm。

[0039] 5.3进样分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。用峰面积在标准曲线上计算试样溶液中大蒜素的浓度。

[0040] 结果计算：

[0041] 按(1)式计算结果。

[0042]

[0043] 式中：

[0044] X——试样中虫草素含量，单位为克每千克(mg/g)；

[0045] C——试样溶液中虫草素的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

[0046] V——试样溶液体积，单位为毫升(mL)；

[0047] m——试样质量，单位为克(g)。

[0048] 计算结果保留两位有效数字。

[0049] 5精密度

[0050] 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

[0051] 结果

[0052] 利用大孔树脂分离纯化后可去除提取物中的多糖和蛋白成分，使提取物中的虫草素含量达到10％以上。