1.一种纯化莫匹罗星钙的方法，其特征在于，包括：将莫匹罗星制备物吸附至疏水吸附树脂，以生成结合莫匹罗星；将所述结合莫匹罗星暴露于可溶性含钙剂，以生成莫匹罗星钙；洗涤所述结合莫匹罗星钙；并从所述疏水吸附树脂洗脱纯化的莫匹罗星钙。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述莫匹罗星制备物经下述步骤制得：对产莫匹罗星的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)培养物进行发酵；获取由此生成的发酵液；并任选地通过过滤澄清所述发酵液。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述树脂选自由改性二氧化硅、聚苯乙烯和丙烯酸材料组成的组。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述树脂选自由丙烯酸吸附剂XAD7HP、以及聚苯乙烯二乙烯基苯吸附剂XAD1600和XAD4组成的组。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述莫匹罗星钙通过结晶进一步纯化。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述莫匹罗星钙纯化到至少50％。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述莫匹罗星钙纯化到至少65％。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述莫匹罗星钙纯化到至少90％。
9.如权利要求1所述的方法，其中，将盐基加至所述莫匹罗星制备物，以帮助吸附至所述疏水吸附树脂。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述含钙剂为醋酸钙、氯化钙、硝酸钙或丙酸钙。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述莫匹罗星制备物为假单胞菌酸盐的形式，将硫酸铵溶液加至所述莫匹罗星制备物以帮助所述莫匹罗星吸附至所述疏水吸附树脂，所述疏水吸附树脂为XAD7HP或XAD1600，所述含钙剂为醋酸钙，且所述纯化的莫匹罗星钙用有机溶剂洗脱。
12.如权利要求1所述的方法，其中，所述莫匹罗星制备物为莫匹罗星酸的形式，将硫酸铵溶液加至所述莫匹罗星制备物以帮助所述莫匹罗星吸附至所述疏水吸附树脂，所述疏水吸附树脂为XAD4，所述含钙剂为氯化钙，且所述纯化的莫匹罗星钙用有机溶剂洗脱。
13.一种制备莫匹罗星钙的方法，其特征在于，包括：a.将纯化的莫匹罗星吸附至疏水吸附树脂；
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述含钙溶液选自由氯化钙、醋酸钙、硝酸钙和丙酸钙组成的组。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述含钙溶液为醋酸钙。
16.如权利要求14所述的方法，其中，所述含钙溶液为氯化钙。
17.如权利要求13～16中任一项所示的方法，其中，所述莫匹罗星钙是用有机溶剂从所述疏水吸附树脂洗脱的。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述有机溶剂包含甲醇。
19.如权利要求13所述的方法，其中，所述树脂选自由改性二氧化硅沉淀物、聚苯乙烯和丙烯酸材料组成的组。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述树脂选自由丙烯酸吸附剂XAD7HP、以及聚苯乙烯二乙烯基苯吸附剂XAD1600和XAD4组成的组。
21.如权利要求13～16中的任一项所述的方法，其中，所述莫匹罗星钙通过结晶进一步纯化。
22.如权利要求13～16中的任一项所述的方法，其中，所述莫匹罗星钙纯化到至少
23.如权利要求13～16中的任一项所述的方法，其中，所述莫匹罗星钙纯化到至少
24.如权利要求13～16中的任一项所述的方法，其中，所述莫匹罗星钙纯化到至少
25.如权利要求13～16中的任一项所述的方法，其中，将盐基加至所述纯化的莫匹罗星，以帮助吸附至所述疏水吸附树脂。
26.如权利要求13所述的方法，其中，所述纯化的莫匹罗星为假单胞菌酸盐形式，将硫酸铵溶液加至所述纯化的莫匹罗星，以帮助所述莫匹罗星吸附至所述疏水吸附树脂，所述疏水吸附树脂为XAD7HP或XAD1600，且所述莫匹罗星钙用有机溶剂洗脱。
27.如权利要求13所述的方法，其中，所述纯化的莫匹罗星为莫匹罗星酸形式，将硫酸铵溶液加入所述纯化的莫匹罗星，以帮助所述莫匹罗星吸附至所述疏水吸附树脂，所述疏水吸附树脂为XAD4，所述含钙溶液为氯化钙，且所述莫匹罗星钙用有机溶剂洗脱。
莫匹罗星钙的制备和纯化
技术领域
[0001] 本发明涉及莫匹罗星钙的制备和纯化的改进方法。技术背景
[0002] 莫匹罗星是一种由荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)的发酵生产的抗菌剂假单胞菌酸A。其对金黄色葡萄球菌和化脓链球菌的敏感菌株具有抗菌活性，且通常以外用溶液的形式使用。莫匹罗星的分子式为C26H44O9(分子量＝500.63)，化学名称为(E)-(2S，3R，4R，5S)-5-[(2S，3S，4S，5S)-2，3-环氧基-5-羟基-4-甲基己基]四氢-3，4-二羟基-(β)-甲基-2H-吡喃-2-丁烯酸与9-羟基壬酸的酯。莫匹罗星的化学结构式如下所示：
[0003]
[0004] 莫匹罗星
[0005] 假单胞菌酸A的钙盐，即莫匹罗星钙或假单胞酸钙，具有更高的热稳定性，尤其是晶体状态时(US 5,191,093)。该稳定性在涉及较高温度的剂型中特别有利。
[0006] 在现有技术中已知一些纯化莫匹罗星及其衍生物的方法。例如，US5,191,093记载了一种制备结晶形假单胞酸钙或其水合物的方法，该方法包括：使假单胞酸根离子与钙离子在水溶剂的溶液中反应；从溶液中回收结晶形假单胞酸钙水合物，然后任选地除去结晶水。该方法提供了一种讲莫匹罗星酸转化为钙盐的简单手段。然而，该操作的纯化效果有限，且需要纯的起始材料来获得适合药用的产品。US 3,977,943涉及通过安伯莱特(Amberlite)XAD-2聚苯乙烯树脂色谱法从培养液中纯化，并使用一系列低分子量的酸洗脱。德国专利2227739和US 4,289,703涉及一种利用钠钡和甲基异丁酮(MIBK)的纯化方法。比利时专利870,855涉及一种包括利用MIBK和碳酸氢钠从发酵液萃取莫匹罗星，并且从MIBK-正庚烷混合物中结晶的方法。US 4,222,942涉及一种包括在与水不互溶的极性有机溶剂中萃取，并且稀释于非极性溶剂以实现结晶的方法。US 6,254,921涉及一种用氯代脂肪烃或醋酸异丁酯萃取并蒸发有机溶剂的方法。
[0007] 如同US 5,191,093，、WO03/065975 A2提供一种这样的方法：通过使用有机羧酸酯，在双相体系中从莫匹罗星制备莫匹罗星钙，并且从水相分离固体莫匹罗星钙，或者通过从C1-C4醇中首先沉淀出无定形莫匹罗星钙，然后将该无定形产物转化为晶形。
[0008] 在现有技术，例如US 4,222,942(如上面提及的)中，已知一些莫匹罗星酸的纯化方法，这些方法通常涉及在酸性/碱性水溶液和与水不互溶的极性有机溶剂(例如甲基异丁酮(MIBK)和醋酸异丁酯等)中分离莫匹罗星，然后从如MIBK之类的有机溶剂中结晶。根据US 4,289,703 A，将可溶性钡盐加入发酵液中，然后通过离心分离微生物细胞和不溶的惰性剂，最后用MIBK萃取抗生素。然后用碱性水从甲基异丁酮萃取液中移走抗生素，再通过MIBK重萃取对所得碱性水相萃取物进行清洗。对获得的粗品进行色谱分离，从该假单胞酸抗生素复合物制备酯衍生物，并用制备薄层色谱纯化。通过水解得到酸型纯抗生素。
[0009] 这些方法涉及大量的有害化学药剂，因此还需要一种制造莫匹罗星钙的新方法，将莫匹罗星的纯化和转化成钙盐的过程组合在一起。这样的新方法，可缩短生产过程，并且在商业和环保方面更具吸引力。
[0010] 现有技术中需要更有效的方法来生产纯化的莫匹罗星衍生物制品，如莫匹罗星钙。如下所述，本文提供了这样的方法和由此制得的产品。
发明内容
[0011] 本发明涉及莫匹罗星钙的制备和纯化方法。在一实施方式中，所述方法包括：将除去细胞的莫匹罗星制备物(可溶性盐或酸，优选以可溶性盐的形式，例如假单胞菌盐)吸附至固态载体；将所述结合莫匹罗星暴露于含钙溶液；从所述固态载体洗去杂质；并从所述固态载体洗脱纯化的莫匹罗星钙。还提供了使用所述方法制备及纯化得到的莫匹罗星钙制品。
[0012] 在另一实施方式中，在将假单胞酸盐吸附至固态载体后，制得不含细胞的莫匹罗星制备物。然后将该结合的假单胞菌酸盐与含钙溶液接触，从而在所述固态载体上形成莫匹罗星钙。洗去杂质后，从所述固态载体选择性洗脱目标分子。令人惊奇的是，被吸附的假单胞菌酸盐实现了所有的盐交换成钙，且得到了莫匹罗星与钙之间的正确的分子当量。
[0013] 由于在处理过程中选择性地去除了杂质，所述方法提供了高的纯化效率。
具体实施方式
[0014] 莫匹罗星，即假单胞菌酸A，是一种由荧光假单胞菌发酵生产的抗菌剂。其对金黄色葡萄球菌和化脓链球菌的敏感菌株具有抗菌活性，且通常以外用溶液的形式使用。莫匹罗星的分子式为C26H44O9(分子量＝500.63)，化学名称为(E)-(2S，3R，4R，5S)-5-[(2S，3S，4S，5S)-2，3-环氧基-5-羟基-4-甲基己基]四氢-3，4-二羟基-(β)-甲基-2H-吡喃-2-丁烯酸与9-羟基壬酸的酯。莫匹罗星的化学结构式如下所示：
[0015]
[0016] 莫匹罗星
[0017] 本文所用的术语“莫匹罗星”可以指假单胞菌酸A、莫匹罗星酸、莫匹罗星钙、假单胞菌酸盐或任意的莫匹罗星衍生物。本文描述的所述方法特别适合于制备和纯化莫匹罗星钙。本文描述的所述方法特别适合于制备和纯化莫匹罗星钙。
[0018] 在本申请中，提供了一种制备莫匹罗星钙的方法，包括：将莫匹罗星(以可溶性盐或酸，优选可溶性盐，例如假单胞菌酸盐的形式)吸附于固态载体，通常是疏水吸附树脂；将结合的莫匹罗星暴露于含钙溶液中；从所述固态载体洗去杂质；并从所述固态载体洗脱纯化的莫匹罗星钙。
[0019] 一种方法包括：将假单胞菌酸盐吸附于通常是吸附树脂的固态载体；将结合的假单胞菌酸盐与含钙溶液接触；洗去杂质；并从所述固态载体洗脱纯化的莫匹罗星钙。然后，使洗脱的产品结晶，并用现有技术中的已知方法(譬如，如US 5,191,093描述的方法)分离纯的莫匹罗星钙。
[0020] 利用除去细胞的莫匹罗星制备物。这种制备物按下述过程制得：对产莫匹罗星荧光假单胞菌培养物进行发酵，得到其发酵液，并过滤去除生物质(澄清发酵液)。溶液的pH值调节至确保莫匹罗星全部去质子化，即为假单胞菌酸盐。可在莫匹罗星制备物吸附到固态载体之前将硫酸铵添加到莫匹罗星制备物中，以增加分子和吸附剂之间的疏水作用，并由此增加树脂对假单胞菌酸盐的结合量。
[0021] US 3,977,943记载了一种制备莫匹罗星制备物的方法。简要地说，适当的荧光假单胞菌菌株，如菌株NCIB 10586，在含有基础盐溶液中的玉米浆和葡萄糖的培养基中，在30℃深层培养，生长约24小时。在现有技术中已知一些适合于本文使用的制备发酵液的方法。
[0022] 固态载体可以是能可逆吸附莫匹罗星酸的任意材料。所述固态载体是一种莫匹罗星通过疏水作用与之结合的材料，其结合方式为：使得莫匹罗星的酸基可与其它试剂、化合物或一部分，如钙离子相结合。固态载体的另一重要性质是，经本领域技术人员的选择，莫匹罗星与载体的结合是可逆的。在某些实施方式中，所述固态载体是树脂，在某些其它实施方式中它是疏水吸附树脂。适当的吸附树脂包括但不限于改性琼脂糖、改性二氧化硅、聚苯乙烯或丙烯酸/甲基丙烯酸材料。吸附树脂的例子包括但不限于，丙烯酸吸附剂 (Rohm&Haas)或 (Diaion)，以及聚苯乙烯二乙烯基苯吸附剂(两者均来自Rohm&Haas)或 (Diaion)。
[0023] 适当的疏水吸附树脂包括但不限于，改性二氧化硅、聚苯乙烯或丙烯酸材料，包括，例如，丙烯酸吸附剂XAD7HP(Rohm&Haas)或HP2MG(Diaion)，以及聚苯乙烯二乙烯基苯吸附剂XAD1600、XAD4。
[0024] 在第一方法中，使莫匹罗星(例如，假单胞菌酸或莫匹罗星酸，较好地为假单胞菌酸)吸附至固态载体，暴露于含钙剂中，并自柱洗脱，从而提供莫匹罗星钙溶液。在优选实施方式中，所述含钙剂为钙基可溶性盐。含钙剂的例子包括但不限于氯化钙、醋酸钙、硝酸钙和丙酸钙。洗脱可使用有机溶剂例如甲醇进行。洗脱也可用其它合适的试剂进行，其它合适的试剂包括但不限于乙醇、异丙醇和乙腈或它们的混合物，也包括含水混合物。
[0025] 上述方法还包括，在吸附到所述固态载体前，将硫酸铵添加至莫匹罗星制备物。硫酸铵在吸附前加入，以增加莫匹罗星分子和吸附剂之间的疏水作用，并由此增加结合量。在其它实施方式中，莫匹罗星酸的制备物为纯化的莫匹罗星。
[0026] 上述方法可用于制备纯化的莫匹罗星钙。在某些实施方式中，纯化的莫匹罗星钙纯化到至少50％、至少65％、至少70％、至少80％或至少90％。
[0027] 使用本技术领域的标准工艺，可将利用本文所述的方法纯化的莫匹罗星钙制成用于哺乳动物治疗的组合物形式。所述组合物可根据现有的制药方法进行加工，以生产施用于包括人和其它哺乳动物的患者的药剂(即，“药物组合物”)。所述药物组合物最好制成剂量单位的形式，所述剂量单位包含通常与制药学上可接受的载体在一起的特定量的、单独的或与其它活性剂组合的纯化莫匹罗星。术语“制药学上可接受的载体”指的是一种或多种适合于实现或加强作为药物组合物的莫匹罗星的释放的制剂材料。所述药物组合物也可进行如灭菌之类的常规制药操作，并且含有/或可含有常规的辅料，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。
[0028] 根据患者病情和其它因素，对人或其它动物适宜的日剂量会有很大的变化，但是可用本领域的技术人员已知的常规方法来确定。对于外部用药，可每天施用适宜外用剂量的组合物1至4次，最好为2次或3次。所述剂量，也可采取中间停药几天的方法来施用。合适的组合物包括占制剂0.001％～10％、小于5％、1～2％、或0.1～1％的莫匹罗星。合适的外部用药的制剂包括，例如，液态或半液态的适合于渗透皮肤的制剂(例如，搽剂、洗剂、软膏、霜剂或糊剂)。本技术领域已知有其它给药方式，并均为本文记载的实施方式所涵盖。
[0029] 通过对下述实施例的阐述，可以更好地理解本发明及其许多优点。
[0030] [实施例]
[0031] 实施例1
[0032] 去除细胞的莫匹罗星水溶液
[0033] 通过采用在本质上基本已知的，即与US 3,977,943中实施例1的方法一致的方式，进行产莫匹罗星荧光假单胞菌培养物的发酵，获得含有莫匹罗星酸的发酵液。将来自实验室发酵罐的5升含莫匹罗星的全培养物发酵液调节至pH＝8.3(通过添加3M NaOH)，并在室温下经144μm的金属筛网过滤，然后进行超滤(Millipore公司的Pellicon-2Biomax-5)。存在于发酵液中的约70％的莫匹罗星被回收到最后的清液中。任选地，对含莫匹罗星的渗透液通过纳滤(Osmonic Desal公司的DK膜)进行浓缩。
[0034] 实施例2
[0035] 吸附假单胞菌酸至固态载体并转化成莫匹罗星钙
[0036] A.在实施例1中得到的滤液(363ml，1.3g莫匹罗星)中加入(NH4)2SO4(24g)。通过添加1M的NaOH将pH调节至pH 7.5。将丙烯酸吸附剂 (Rohm&Haas)填入色谱柱(24ml)，将准备好的莫匹罗星溶液(假单胞菌酸溶液形式)加入到该色谱柱(1ml/min)。
用含0.5M(NH4)2SO4、pH为7.5的0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-buffer)(120ml)洗涤该色谱柱。然后将0.1M醋酸钙溶液加至所述色谱柱(72ml)，再加入水(48ml)。用80％的甲醇从色谱柱洗脱莫匹罗星钙。0.9g莫匹罗星钙被回收至洗脱池内(60ml，收率70％)。
[0037] B.在实施例1中获得的滤液(293ml，1.5g莫匹罗星)中加入(NH4)2SO4(19g)。通过添加1M的NaOH将pH调节至pH 7.5。将聚苯乙烯二乙烯基苯吸附剂
(Rohm&Haas)填入色谱柱(22ml)，将准备好的莫匹罗星溶液(假单胞菌酸溶液形式)加入该色谱柱(1ml/min)。用含0.5M(NH4)2SO4、pH为7.5的0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(110ml)洗涤该色谱柱。然后将0.1M醋酸钙溶液加至所述色谱柱(66ml)，再加入水(66ml)。
用80％的甲醇从色谱柱洗脱莫匹罗星钙。1.3g莫匹罗星钙被回收至洗脱池内(55ml，收率
87％)。
[0038] C.在实施例1中获得的滤液(1035ml，5.8g莫匹罗星)中加入(NH4)2SO4(68g)。通过添加1M的NaOH将pH调节至pH 7.5。将丙烯酸吸附剂 (Rohm&Haas)填入色谱柱(191ml)，将准备好的莫匹罗星溶液(假单胞菌酸溶液形式)加入该色谱柱(1.9ml/
