含多肽细胞生长因子的药物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种含多肽细胞生长因子的药物及其制备方法。包括表面带有氨基(-NH2)基团，粒径为1～100nm的二氧化钛粒子，在二氧化钛粒子表面附着有多肽细胞生长因子。可发挥纳米二氧化钛光催化杀抑菌作用的同时，发挥对多肽细胞生长因子的缓释作用，从而使生长因子持续稳定地作用于创口/创面细胞，在恰当的时间内维持有效的作用浓度，同时，脱落了生长因子的纳米二氧化钛又能增强其杀抑菌作用，并将创口/创面的分泌物、酶及细菌毒素等有机物分解为二氧化碳和水，促进创口/创面更快的修复并降低不良反应。

权利要求

1.一种含多肽细胞生长因子的药物，其特征在于，包括表面带有氨基(-NH2)基团，粒径为1～100nm的纳米二氧化钛粒子，在二氧化钛粒子表面附着有多肽细胞生长因子。

2.根据权利要求1的含多肽细胞生长因子的药物，其特征在于，所述多肽细胞生长因子附着在二氧化钛粒子表面是通过物理吸附、静电吸附以及通过羧基(-COOH)和二氧化钛粒子表面的氨基(-NH2)基团发生键合反应而结合。

3.根据权利要求1的含多肽细胞生长因子的药物，其特征在于，所述的多肽细胞生长因子是重组人表皮生长因子(rhEGF)、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、人及鼠表皮生长因子(hEGF及mEGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGFs)、类胰岛素生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)，结缔组织生长因子(CTGF)，角质细胞生长因子(KGF)，多效生长因子(Ptn)、淋巴管生长因子(VEGF-C及VEGF-D)之中的一种或多种。

4.一种含多肽细胞生长因子的药物的制备方法，其特征在于，包括(1)将粒径在1～

100nm的表面氨基修饰的纳米二氧化钛分散在蒸馏水中，最终浓度10ppm～10000ppm，分散

2～12小时，调节pH值为5.0～8.0；(2)向上述溶液里面加入多肽细胞生长因子冻干粉剂或者多肽细胞生长因子溶液，使生长因子的最终浓度为0.01μg/ml～100μg/ml，再次调节pH值至5.0～8.0，控制温度在0℃～60℃下进行复合反应，反应时间为0.5小时～ 24小时，生成含多肽细胞生长因子的药物纳米二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物溶液。

5.根据权利要求4的含多肽细胞生长因子的药物的制备方法，其特征在于，在所述二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物溶液里加入保护剂、防腐剂、表面活性剂中的一种或者多种并混合均匀。

6.根据权利要求5的含多肽细胞生长因子的药物的制备方法，其特征在于，所述保护剂，为人血白蛋白或者甘露醇，加入量的重量百分比为0.01％～5％，所述表面活性剂，为吐温80或者卵磷脂，加入量的重量百分比为0.01％～5％。

7.根据权利要求5的含多肽细胞生长因子的药物的制备方法，其特征在于，所述防腐剂，为尼泊金丁醋，苯甲酸钠，山梨酸，尼泊金乙醋，尼泊金甲醋，尼泊金丙醋中的任意一种或多种，加入量的重量百分比为0.01％～5％。

8.根据权利要求4的含多肽细胞生长因子的药物的制备方法，其特征在于，所述二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物溶液在-100℃～60℃及真空条件下抽干成冻干粉。

9.根据权利要求8的含多肽细胞生长因子的药物的制备方法，其特征在于，所述二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物冻干粉在存在分散剂聚乙烯醇(PVA)的条件下，加入聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸—乙醇酸共聚物(PLGA)、明胶、壳聚糖、多聚赖氨酸，聚烯丙基胺之中的一种或多种，使二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物的最终浓度达到重量百 分比0.01％～10％，再采用超声乳化-溶剂挥发法对复合物包封形成纳米缓释微球。

10.根据权利要求8的含多肽细胞生长因子的药物的制备方法，其特征在于，将所述纳米二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物冻干粉加入到药用成膜材料中，使二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物的最终浓度达到重量百分比0.01％～10％，制备成二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物的缓释膜剂。

说明书

含多肽细胞生长因子的药物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种含多肽细胞生长因子的药物及其制备方法。

背景技术

[0002] 细胞生长因子是调节细胞增殖和分化的一类蛋白质多肽类物质，其分子量从几百到几万不等，也常称之为多肽细胞生长因子。与经典的多肽和蛋白质激素相比，多肽生长因子并没有特定的内分泌腺和内分泌细胞，而是通过一些细胞的旁分泌和自分泌释放并扩散到靶细胞，从而协调机体自身的统一以及对外界的反应。近年来有关生长因子的鉴定、结构和基因工程的研究进展很快，部分多肽生长因子类药物已广泛应用于临床，并取得了较好的临床疗效，但是这类药物普遍存在着如下的缺点：1、药物稳定性差，易变性失活和被清除。特别在感染创口/创面上，创口/创面的分泌物、酶及细菌毒素等促进了生长因子的分解、变性和失活。这严重影响了多肽类生长因子药物与创口/创面新生组织的接触，从而严重影响了生物学效用的发挥。2、直接将多肽类生长因子涂布/喷晒于创口/创面时很难达到足够的持续作用时间，因为多肽在室温下是非常不稳定的，特别是有水存在时更是如此，它的半衰期小于1小时，远远短于在伤口部位诱导细胞DNA合成所需的迟滞时间(约为8～12小时)。3、在生长因子应用的短时间内，生长因子只能对一部分细胞发挥促增殖作用。在增生的组织当中处于增生的细胞只占有一定的比例，而且只是一个相对平衡的状态，生长因子对细胞的增殖作用主要是作用于处于细胞增殖间期的细胞，直接将多肽类生长因子作用于创面只在短时间内仅作用于分裂间期的细胞。4、目前多肽类生长因子制备过程复杂，价格较昂贵，反复多次给药造成了药物的大量浪费，加重了患者的经济负担。而缓释生长因子制剂能持续有效地作用于小部分处于分裂间期的不同细胞，从而改变了增生细胞的平衡状态，也就是让处于增生期的细胞比例上调，这样的结果使得增生组织持续稳定快速地生长。综上所述，如何将含有生长因子的药物制成缓释制剂使之能持续稳定、安全、有效作用于创口/创面，已成为生物医学工程和药剂学领域中一个极富挑战性和具有实用价值的研究热点。纳米颗粒复合物药物在有效控制药物剂量、降低药物毒副作用、提高药物稳定性和有效利用率、实现药物靶向输送及减轻患者痛苦等方面的功能备受关注。目前国内外一般是将游离的多肽生长因子埋植入高分子凝胶等材料中，使之呈缓释状态，以延长其作用时间。多数纳米缓释药物一味追求缓释，药效长达半个月至半年不等，并多采用静脉给药方式，而创面用药物缓释时间一般以12～48小时为适宜，所以现阶段已经研制出的缓释复合药物不能有效应用于创面。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种含多肽细胞生长因子的药物及其制备方法，使得该药物能有效应用于创口/创面。

[0004] 为了达到上述目的，本发明含多肽细胞生长因子的药物的技术方案为，包括表面带有氨基(-NH2)基团，粒径为1～100nm的纳米二氧化钛粒子，在二氧化钛粒子表面附着有多肽细胞生长因子。

[0005] 所述多肽细胞生长因子附着在二氧化钛粒子表面是通过物理吸附、静电吸附以及通过羧基(-COOH)和二氧化钛粒子表面的氨基(-NH2)基团发生键合反应而结合。

[0006] 所述的多肽细胞生长因子是重组人表皮生长因子(rhEGF)、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、人及鼠表皮生长因子(hEGF及mEGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGFs)、类胰岛素生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)，结缔组织生长因子(CTGF)，角质细胞生长因子(KGF)，多效生长因子(Ptn)、淋巴管生长因子(VEGF-C及VEGF-D)之中的一种或多种。

[0007] 本发明的含多肽细胞生长因子的药物的制备方法的技术方案包括，包括(1)将粒径在1～100nm纳米的表面氨基修饰的二氧化钛分散在蒸馏水中，最终浓度10ppm～10000ppm，分散2～12小时，调节pH值为5.0～8.0；(2)向上述溶液里面加入多肽细胞生长因子冻干粉剂或者多肽细胞生长因子溶液，使生长因子的最终浓度为0.01μg/ml～
100μg/ml，再次调节pH值至5.0～8.0，控制温度在0℃～60℃下进行复合反应，反应时间为0.5～24小时，生成含多肽细胞生长因子的药物纳米二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物溶液。

[0008] 作为本发明的改进，在所述二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物溶液里加入保护剂、防腐剂、表面活性剂中的一种或者多种并混合均匀。

[0009] 所述保护剂，为人血白蛋白或者甘露醇，加入量为重量百分比0.01％～5％，所述表面活性剂，为吐温80或者卵磷脂，加入量为重量百分比0.01％～5％。

[0010] 所述防腐剂，为尼泊金丁醋，苯甲酸钠，山梨酸，尼泊金乙醋，尼泊金甲醋，尼泊金丙醋中的任意一种，加入量为重量百分比0.01％～5％。

[0011] 作为本发明的另一改进，所述二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物溶液在-100℃～60℃及真空下抽干成冻干粉。

[0012] 作为本发明的进一步改进，所述二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物冻干粉在存在分散剂聚乙烯醇(PVA)的条件下，加入聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸一乙醇酸共聚物(PLGA)、明胶、壳聚糖、多聚赖氨酸，聚烯丙基胺之中的一种或多种，再采用超声乳化-溶剂挥发法对复合物包封形成纳米缓释微球。

[0013] 作为本发明的进一步改进，所述将二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物冻干粉加入到药用成膜材料中，使二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物的最终浓度达到重量百分比0.01％～10％，制备成二氧化钛-多肽细胞生长因子复合物的缓释膜剂。

[0014] 由于当二氧化钛颗粒尺寸进入纳米量级时，尺寸限域引起的小尺寸效应、量子限域效应和表面效应显著增强，使其杀菌能力大大增强，产生了质的飞跃。只用极少量的纳米二氧化钛即可产生强力的杀菌作用。纳米二氧化钛能有效杀灭多种病原体(包括细菌、霉菌、滴虫、支原体、衣原体、病毒等)。纳米二氧化钛的杀菌机理主要是：纳米二氧化钛是一种光催化抗菌剂，在光照条件下，产生羟基自由基(·OH)和原子氧(·O)。羟基自由基和原子氧具有强氧化性，能迅速有效地分解构成病原体的有机物，最终产物为二氧化碳和水，从而起到抗菌作用。同时，还能将创口/创面的分泌物、酶及细菌毒素等有机物也分解为二氧化碳和水，加速创口/创面的愈合。有效降解细菌残骸释放出的有毒复合物，其杀菌效果迅速彻底。而且，其杀菌特点不受细菌的类别限制，具有广谱抑杀菌作用，对抗生素赖药的细菌也具有同样作用，不产生赖药性，并具有安全无毒副作用以及相对环保等优点。本发明的含多肽细胞生长因子的药物在应用过程中，纳米二氧化钛在发挥光催化杀抑菌作用的同时，发挥对多肽细胞生长因子的缓释作用，使生长因子缓慢从纳米二氧化钛颗粒上脱落下来，从而使生长因子持续稳定地作用于创口/创面细胞，在恰当的时间内维持有效的作用浓度，同时，脱落了生长因子的纳米二氧化钛又能增强其杀抑菌作用，并将创口/创面的分泌物、酶及细菌毒素等有机物分解为二氧化碳和水，促进创口/创面更快的修复并降低不良反应。此外，本发明的含多肽细胞生长因子的药物的制备方法简单，各种参数易于控制，所制备的药物质量稳定，便于工业化生产，生产成本较低。

具体实施方式

[0015] 实施例1

[0016] 1、二氧化钛-人重组表皮细胞生长因子缓释复合体(TiO2-rhEGF)的制备[0017] 依照下列步骤，可得到TiO2-rhEGF复合体溶液

[0018] (1)纳米二氧化钛溶液配制：将粒径在100nm的表面氨基修饰的纳米二氧化钛2mg分散在蒸馏水中，使其最终浓度为10ppm，超声分散10个小时。磷酸盐缓冲液调节pH值后，使之pH值为7.0。

[0019] (2)向上述纳米二氧化钛溶液里面加入人重组表皮生长因子(rhEGF)，使生长因子的最终浓度为10μg/ml，再次调节pH值至7.0，温度在60℃进行超声分散24小时。

[0020] (3)在-100℃及用真空抽干机抽干成冻干粉，-20℃保存。

[0021] (4)配置成溶液时可加入保护剂、防腐剂、稳定剂及盐溶液(NaCl)混合。

[0022] 具体配方可如下：

[0023]

[0024] 实施例2

[0025] 纳米二氧化钛-碱性成纤维细胞生长因子缓释复合体(TiO2-bFGF)的制备[0026] (1)纳米二氧化钛溶液配制：将粒径在30nm的表面氨基修饰的纳米二氧化钛粉2mg分散在蒸馏水中，使其最终浓度为10000ppm，超声分散10个小时。磷酸盐缓冲液调节pH值后，使之pH在5.0。

[0027] (2)向上述纳米二氧化钛溶液里面加入人成纤维细胞生长因子(bFGF)，使生长因子的最终浓度为100μg/ml，再次调节pH值至5.0，在0℃下进行超声分散10个小时。

[0028] (3)在60℃及用真空抽干机抽干成冻干粉，-20℃保存。

[0029] (4)配置成溶液时可加入保护剂、防腐剂、稳定剂及盐溶液(NaCl)混合。

[0030] 具体配方可如下：

[0031]

[0032] 实施例3

[0033] 含有纳米硅溶胶的纳米二氧化钛-人成纤维细胞生长因子缓释复合体的制备：

[0034] (1)纳米二氧化钛溶液配制：将粒径在1nm的表面氨基修饰的纳米二氧化钛粉2mg分散在蒸馏水中，使其最终浓度为5000ppm，超声分散10个小时。磷酸盐缓冲液调节pH值后，使之pH在8.0。

[0035] (2)向上述纳米二氧化钛溶液里面加入人成纤维细胞生长因子(bFGF)，再次调节pH值至8.0，在10℃下进行超声分散0.5个小时。

[0036] (3)向(2)制得的溶液里加入纳米硅溶胶，使生长因子的最终浓度为0.1μg/ml，超声分散4小时。

[0037] (4)在20℃及用真空抽干机抽干成冻干粉，-20℃保存。

[0038] (5)配置成溶液时可加入适量保护剂、防腐剂、稳定剂及盐溶液(NaCl)混合反应。

[0039] 具体配方可如下：

[0040]

[0041] 实施例4

[0042] 缓释微球胶体溶液制剂的制备

[0043] (1)纳米二氧化钛溶液配制：将粒径在30nm表面氨基修饰的纳米二氧化钛粉分散在蒸馏水中，使其最终浓度为2000ppm，超声分散10个小时。磷酸盐缓冲液调节pH值后，使之pH在6.0。

[0044] (2)向上述溶液里面加入多肽生长因子或者多肽生长因子溶液，使多肽生长因子终浓度在2μg/ml，再次调节pH值至6.0，在20℃下超声分散3个小时。

[0045] (3)室温轻度振荡或者静置反应8小时。

[0046] (4)在10℃及用冷冻真空抽干机抽干成冻干粉，按重量份称取各组分，将冻干粉溶于蒸馏水中，制成浓度为0.1～3％(重量)的水相溶液；将聚乳酸溶于二氯甲烷∶甘油＝3～6∶1的混合溶剂中，制成浓度为10～60％(重量)的油相溶液。

[0047] (5)将上述水相溶液、油相溶液混合，制备油包水型乳液，然后加入到由重均分子量为3～25万的聚乙烯醇树脂与缓冲液制成10～20％的溶液中，超声分散45分钟，制成微乳液。

[0048] (6)将步骤(5)得到的微乳液在室温下低速搅拌4小时，通过自然挥发或抽提，除去有机溶剂二氯甲烷，即得纳米二氧化钛-细胞生长因子稳定复合体纳米微球胶体溶液。

[0049] 实施例5

[0050] 缓释膜剂的制备

[0051] 一种细胞生长因子与纳米二氧化钛复合体膜剂，包括：①、有效伤口治疗剂量纳米二氧化钛-细胞生长因子冻干粉0.01％～1％(重量)，②、可药用的成膜材料10％～90％(重量)，③、药用辅料0％～40％(重量)，与所述hEGF同属一类的多肤生长因子重组人表皮生长因子(rhEGF)、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、酸性成纤维细胞生长因子(a FGF)、鼠表皮生长因子(mEGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGFs)、类胰岛素生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)，结缔组织生长因子(CTGF)，角质细胞生长因子(KGF)，多效生长因子(Ptn)、淋巴管生长因子(VEGF-C及VEGF-D)，人生长激素(GH)，均可作为生长因子替代bEGF制成相应的膜剂。

[0052] 其更为具体的配比如下

[0053] (1)由本实施例三提供的纳米二氧化钛-细胞生长因子冻干粉0.01％～1％(重量)

[0054] (2)可药用的成膜材料PVA 10％～90％(重量)

[0055] (3)生长因子保护剂及药用填充剂甘露醇 0～10％(重量)

[0056] (4)药用增塑剂甘油 0～15％(重量)

[0057] (5)药用防腐剂山梨酸 0.05～0.2％(重量)

[0058] (6)药用表面活性剂卵磷脂 0～2％(重量)

[0059] 下述三试验所指的纳米二氧化钛-细胞生长因子缓释复合体溶液均为由实施例1制得的。

[0060] 实验1纳米二氧化钛-人重组表皮细胞生长因子复合体抗菌效果的实验。

[0061] 本研究所采用的纳米二氧化钛溶液是经过微生物学实验检测的，其抗抑菌性对各种病原微生物作用效果24小时达到99.9％以上，本实验主要验证纳米二氧化钛-人重组表皮细胞生长因子复合体的抗抑菌效应，具体实验方法采取在铺满细菌的培养皿表面贴无菌滤纸片法，细菌株采用中南大学湘雅三医院检验科提供的质控细菌株，种类覆盖革兰氏阳性，阴性菌，真菌、厌氧菌、球菌、杆菌、支原体、衣原体等，实验分5组，分别为纳米二氧化钛-表皮细胞生长因子缓释复合体组，纳米二氧化钛与表皮细胞生长因子联合应用组，单纯纳米二氧化钛组，单纯表皮生长因子组，单纯生理盐水对照组，每两小时在滤纸片上滴各组对应试验品两滴保持湿润，37℃孵育箱孵育24小时后用大分规和游标卡尺测量抑菌环2
大小(mm)，孵育箱内保持紫外线强度100μw/cm。其结果详见附表1。

[0062] 附表1纳米二氧化钛-细胞生长因子缓释复合体抗病原微生物效果对照观察[0063]

[0064] 从附表1中研究结果表明，纳米二氧化钛-表皮细胞生长因子缓释复合体组，纳米二氧化钛与表皮细胞生长因子联合应用组，单纯纳米二氧化钛组均对以上八种病原体有较强抑制作用，且对易产生赖药的金葡球菌，绿脓杆菌等也有良好的抑制作用，而单纯表皮生长因子组和单纯生理盐水对照组对细菌无抑制作用。经过统计分析表明，前三组在抗菌性能上明显优于后两组(P＜0.01)，纳米二氧化钛-表皮细胞生长因子缓释复合体组与纳米二氧化钛与表皮细胞生长因子联合应用组和单纯纳米二氧化钛组，虽在统计学上未出现明显差异，但从数据上仍可以看到复合体组优于联合应用组和纳米二氧化钛组。由此可见，纳米二氧化钛经过和生长因子复合反应形成复合体后对纳米二氧化钛本身的抗菌性有很大改善，其抗菌效果可能得到了加强。

[0065] 实验2纳米二氧化钛-细胞生长因子缓释复合体的促细胞增殖实验

[0066] MTT法观察纳米二氧化钛-生长因子复合体溶液对人真皮成纤维细胞增殖作用。4
取Hacat细胞按4x10/ml接种96孔板，每孔100μl，每组设9孔，设计5组，分别为纳米二氧化钛-表皮细胞生长因子缓释复合体组，纳米二氧化钛与表皮细胞生长因子联合应用组，单纯纳米二氧化钛组，单纯表皮生长因子组，单纯生理盐水对照组，首先将所有细胞常规培养基DMEM+10％NBS在37℃和5％CO2条件下培养6小时，去培养基后分别加入20μl各组对应液体，再加入80μl不含血清培养基DMEM培养，分别于12h、24h和36h时各取出三个孔的细胞做MTT检测，所有检测空去培养基加入80μl新鲜培养基、20μl MTT(浓度
5mg/ml)培育4小时，去液体加DMSO液100μl，温育5分钟，振荡使蓝色甲坎产物溶解，于酶标仪570nm波长下测定OD值，以每3孔均值表示各组细胞生长。所得数据用SPSS13.0统计软件包进行方差分析和两两比较。其中复合体组、联合应用组和表皮生长因子组中的生长因子浓度为50μg/L。实验结果如下：

[0067] (1)6h时候复合体组与其余各组无显著性差异(P＞0.05)(2)12h时纳米二氧化钛-表皮细胞生长因子缓释复合体组、纳米二氧化钛与表皮细胞生长因子联合应用组和单纯表皮生长因子组的OD值高于单纯纳米二氧化钛组和单纯生理盐水对照组(P＜0.05)，而纳米二氧化钛-表皮细胞生长因子缓释复合体组、纳米二氧化钛与表皮细胞生长因子联合应用组和单纯表皮生长因子组之间比较无统计学意义(P＞0.05)；(3)24h和36h时，纳米二氧化钛-表皮细胞生长因子缓释复合体组、纳米二氧化钛与表皮细胞生长因子联合应用组和单纯表皮生长因子组的OD值明显高于单纯纳米二氧化钛组和单纯生理盐水对照组(P＜0.01)，而纳米二氧化钛-表皮细胞生长因子缓释复合体组亦明显高于纳米二氧化钛与表皮细胞生长因子联合应用组和单纯表皮生长因子组(P＜0.05)。由以上的实验结果可见：纳米二氧化钛-表皮细胞生长因子缓释复合体组能更好更有效地促进细胞分裂增殖，结合和吸附在纳米二氧化钛粒子表面的生长因子能以一定速度缓慢从其表面脱离下来发生生物学效应，起到了缓释的作用，从而增强了药物的疗效。

[0068] 实验3动物创面愈合实验观察纳米二氧化钛-细胞生长因子稳定复合体的促愈合作用

[0069] 取Wistar大鼠40只，随机分为5组，分别为纳米二氧化钛-表皮细胞生长因子缓释复合体组，纳米二氧化钛与表皮细胞生长因子联合应用组，单纯纳米二氧化钛组，单纯表皮生长因子组，单纯生理盐水对照组，所有含有表皮生长因子的组别中的表皮生长因子浓度为2,000IU/ml，每组10只，先涂上硫化钠糊剂，5min后用玻璃棒轻轻刮去脱毛剂，再用清水将脱毛区洗净擦干即可。肌注速眠新麻醉后，常规消毒铺巾后在背部脊柱两侧对称部位做皮肤全层切口，去除两椭圆形皮肤块及筋膜，制成短径2cm，长径3cm的创面，用无菌纱布压迫止血，各组创面每天喷滴相应试剂一次。伤后7天进行创面测量和大体观察，主要观察肉芽组织填充率；伤后14天进行创面测量和大体观察，主要观察残余创面百分比例；最后纪录创面完全愈合时间。具体数据见附表2。

[0070] 附表2纳米二氧化钛-细胞生长因子缓释复合体促创面愈合疗效对照观察