一类分子检测系统

摘要

本发明涉及分子检测领域，具体地，本发明提供了一类分子检测系统。根据本发明的分子检测系统包括：a)化学或生物分子；b)聚合物；c)交联分子；以及d)图像传感器，其中，所述聚合物与所述光电传感器共价连接，所述化学或生物分子与所述聚合物横向连接，所述聚合物通过交联分子在分子内、分子间共价和/或非共价连接。使用本发明的分子检测系统可以直接检测多种形式粗略样品中的核酸，而不需要核酸的抽提和扩增环节，这种全新的发明可能会改变或替代目前针对临床核酸样品或其它核酸样品应用领域的基因分型、基因突变和基因表达图谱的应用现状。另一项应用是以一种超敏感的方式改变或替代以蛋白免疫为基础的现有多种形式的ELISA检测。

权利要求

1.分子检测系统，其特征在于，所述检测系统包括：a)化学或生物分子，所述化学或生物分子为共联探针中与靶分子特异性结合的捕获分子，或者为共联报告物中具有识别和产生信号功能的信号分子；

b)聚合物，所述聚合物为线性或支链的多聚糖、寡核苷酸、分支DNA、水凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多肽、肽核酸、蛋白聚糖、糖蛋白、糖脂、抗体、或甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物；

c)交联分子，所述交联分子是交联剂接到聚合物骨架分子内或分子间的联结；以及d)图像传感器，其中，所述聚合物与所述图像传感器共价连接，所述聚合物通过多个位点的反应基团直接或通过连接体间接的结合所述化学或生物分子的功能或反应基团。

2.如权利要求1所述的分子检测系统，其特征在于，在所述图像传感器之上设有透明盖玻片，所述聚合物布于透明盖玻片上。

3.如权利要求1或2所述的分子检测系统，其特征在于，所述图像传感器为CMOS图像传感器。

4.如权利要求1所述的分子检测系统，其特征在于，所述抗体为抗体的片段。

5.共联聚合物，其特征在于，所述共联聚合物包括：a)化学或生物分子，所述化学或生物分子为共联探针中与靶分子特异性结合的捕获分子，或者为共联报告物中具有识别和产生信号功能的信号分子；

b)聚合物，

所述聚合物为线性或支链的多聚糖、寡核苷酸、分支DNA、水凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多肽、肽核酸、蛋白聚糖、糖蛋白、糖脂、抗体、或甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物；以及c)交联分子，所述交联分子是交联剂接到聚合物骨架分子内或分子间的联结；

其中，所述聚合物通过多个位点的反应基团直接或通过连接体间接的结合所述化学或生物分子的功能或反应基团。

6.如权利要求5所述的共联聚合物，其特征在于，所述抗体为抗体的片段。

7.如权利要求5所述的共联聚合物，其特征在于，所述线性的多聚糖为右旋糖酐。

8.如权利要求5所述的共联聚合物，其特征在于，所述支链的多聚糖为支链淀粉糖酐。

9.如权利要求5所述的共联聚合物，其特征在于，所述生物分子为蛋白质、DNA、RNA、抗体。

10.如权利要求9所述的共联聚合物，其特征在于，所述抗体为抗体的片段。

11.一种制备权利要求5所述共联聚合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)用高碘酸钠氧化多糖，形成含有大量的醛基团的直链或分支聚合物；

2)添加具有氨基反应基的化学或者生物分子；

3)与NaCNBrBH3同步还原结合完成耦合反应。

12.一种检测分析物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)将权利要求1的分子检测系统接触分析物样本；

2)然后加入共联聚合物，接触阵列；

3)加入阵列的底物；以及

4)在不需要外在扫描器的情况下直接从光学传感器得到数据。

13.一种传感器设备，其特征在于，包括权利要求1所述的分子检测系统。

14.一种生物传感器系统，其特征在于，包括权利要求1所述的分子检测系统。

说明书

一类分子检测系统

技术领域

[0001] 本发明涉及分子检测领域，具体地，本发明提供了一类分子检测系统。

背景技术

[0002] 生物分子和其他待检物可以通过能与其反应的选择性或特异性探针所检测，已经有基于生物传感器阵列技术原理，将探针点排列在基质或芯片上的策略，以实施上述检测，例如M.Schena和R.W.Davis在DNA Microarrays：A Practical Approach(M.Schena ed.，0xford University Press1999)一书中阐述了多种策略，阵列用于检测和发现基因序列，以选择和测试候选药物分子、研究毒理和药理反应以及其他用途。靶点可以通过多种相互作用方式与探针结合，包括核酸碱基配对或杂交、蛋白与蛋白的相互作用、蛋白与配基的相互作用、酶和底物的相互作用、受体与配基的相互作用和其他化学反应。

[0003] 生物传感器允许同时检测大量的生物分子间的反应，如用微阵列检测蛋白或者核酸，这种技术成为利用来自于人类基因组计划和其他物种基因组测序的大量序列的有力工具。

[0004] 来自于待检物的信号通常很小，同时因为各种来源的背景造成此类检测方法信噪比相对较低，低信号导致低信噪比和待检物难以检出。一种解决方法是加强待检物的信号以提高其固有的检测信噪比，提高信噪比有利于降低对待检物的检测局限，使检到更低浓度待检物和开拓新的分子检测应用成为可能。

发明内容

[0005] 本发明的目的之一为提供一类分子检测系统，其包括：

[0006] a)化学或生物分子；

[0007] b)聚合物；

[0008] c)交联分子；以及

[0009] d)图像传感器，

[0010] 其中，所述聚合物与所述光电传感器共价连接，所述化学或生物分子与所述聚合物横向连接，所述聚合物通过交联分子在分子内、分子间共价和/或非共价连接。

[0011] 优选地，所述图像传感器为CMOS图像传感器。

[0012] 优选地，在所述光电传感器之上设有透明薄层支持物，所述聚合物布于透明薄层支持物。

[0013] 本发明的目的之一是提供一种使用传感器检测待测物用的共联聚合物。

[0014] 根据本发明的共联聚合物包括：a)化学或生物分子；b)聚合物，以及c)交联分子，所述化学或生物分子与所述聚合物横向连接，所述聚合物通过交联分子在分子内、分子间共价和/或非共价连接，其中所述聚合物为天然或合成的聚合物，优选地，所述天然聚合物为可以线性或支链的多聚糖、分支DNA或水凝胶，所述线性多聚糖为右旋糖酐，所述支链多聚糖为支链淀粉糖酐，所述合成聚合物为甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物。

[0015] 本发明的共联聚合物中所包含的聚合物可以是固体、胶体和非定型等状态，片状、珠状、盘状或以上的混合形式，也可以由线状、枝状、侧链枝状、梳状、星状或者树枝状等同种或异种组成，多聚物分枝包括长枝和短枝，是由化学合成或者从天然物质中提取出来而获得的。例如此类多聚物包括碳水化合物、糖类、同多糖、杂多糖、琼脂糖、直链淀粉、支链淀粉、糖原、葡聚糖、纤维素、几丁质、脱乙酰几丁质、肽聚糖和粘多糖等，具体的说如高度分枝的葡聚糖、水合葡聚糖或琼脂糖，就像水凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，此类用于构成共联物的多聚物也包括寡核苷酸、多肽、肽核酸、蛋白聚糖、糖蛋白、糖脂，甚至还包括抗体或抗体的片段。

[0016] 用于构成共联物的多聚物还包括含有二醇基团的多聚物，如含有gam-diol和邻二醇基团的多聚物，也包括含有临近的羟基和酯基的多聚物，如RNA内的磷酸二酯键。

[0017] 此类共联物还包括含有多个羟基的多聚物，本发明的描述包括以上多种多聚物的各种组合。

[0018] 合成的多聚物可以用于共联聚合物的骨架，如聚(甲基乙烯基醚共聚马来酐)，单体为 其带有的酐基易于和蛋白或衍生寡核苷酸带有的氨基形成共联探针，又如甲醛与(氯甲基)环氧乙烷和2-甲基苯酚的聚合物，其重复单体为其带有的环氧基在碱性pH下首先开环形成邻二醇基，然
后被NaIO4氧化成醛基，氧化后的多聚物就可以通过还原氨基化连接带有一位氨基的分子。

[0019] 本发明的共联聚合物(Meshed Polymer)是一种多聚衍生物，由一种或几种化学或生物分子交联在这一多聚骨架上形成。

[0020] 当根据本发明的共联聚合物中交联的化学或生物分子是捕获分子，能选择性地、特异地结合到靶分子时，所述共联聚合物为共联探针(Mesh Probe)。

[0021] 另一方面，所述化学或生物分子可以是捕获分子，具有识别和产生信号的功能，可以是化学或自然的生物分子，交联在多聚骨架上，因此以物理方式紧密联结，识别分子可特异地、选择性地结合“分子标签”(tag)，这一标签常与靶分子相联；信号分子的功能是产生信号，用以检测，可以是直接或间接产生信号，如：荧光或化学发光，从而此时本发明的共联聚合物为共联报告物(Mesh Reporter)。

[0022] 交连分子是交联剂介导多聚骨架分子内或分子间的联结。它们通常是双功能的交联剂，其功能基团只对多聚骨架或被引入的衍生基团起反应，当然也有例外，如：在一端具有反应基团的G-丰富的寡核苷酸，此端可交联在多聚骨架上，寡核苷酸内由此产生的Hoogsteen碱基配对，使其在多聚物内或多聚物之间形成非共价的交联。

[0023] 本发明的另一目的是提供一种制备上述共联聚合物的方法，该方法包括以下步骤：

[0024] 1)用高碘酸钠氧化多糖，形成含有大量的醛基团的直链或分支多聚物；

[0025] 2)添加具有氨基反应基的化学或者生物分子；

[0026] 3)与NaCNBrBH3同步还原结合完成耦合反应。

[0027] 本发明的共联聚合物是通过把多聚物和化学或生物分子耦联制备而成，很多时候这种耦联依靠于化学或生物分子上的功能或反应基团，例如醛基、羟基、胺基、氨基、羧基、巯基以及以上的组合。

[0028] 当化学或生物分子与多聚物耦联或反应来制备共联聚合物时，多聚物可以通过多个位点的反应基团直接或通过连接体间接的结合化学或生物分子的功能或反应基团，这种反应基团包括醛基、羟基、胺基、氨基、羧基、巯基、硫氰酸基、N—羟基琥珀酰亚胺酯基、酮基、乙二醛基、环氧基、环氧乙烷基、酰亚胺酯基、碳二亚胺基、烷磷酸基、酐基、马来酰亚胺基、氮杂环丙烷、丙烯酰基、氟苯基、重氮乙酰基、N-羧酰咪唑基、琥珀酰亚胺基碳酸酯基、羧甲基、异氰酸基、酰肼基以及以上的组合。

[0029] 多聚物可以带有一个氨基反应基团，如脱乙酰几丁质带有的氨基，也可以带有硫酸基、羧基和磷酸基等功能反应基团，如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、硫酸角质素带有的硫酸基，和从多糖衍生出的唾液酸、醛糖酸、糖醛酸、氧代醛糖酸、抗坏血酸带有的羧基。

[0030] 带有磷酸基的多聚物如DNA和RNA，这类多聚物可以通过具有不同功能的连接物与化学或生物分子连接，如一个多聚核苷酸和另一个多聚核苷酸形成的共联探针，或一个RNA被氧化提供出醛基以与化学或生物分子形成共联物。

[0031] 多种化学或生物分子可以与多聚物连接形成能结合多种靶物质的共联探针，换句话说就是一个多聚物链可以连接多种化学或生物分子而形成一个共联探针，这种混合共联探针也是本发明的一种应用。

[0032] 例如，为连接多聚物和化学或生物分子的氨基使用二硫代二(丙酸琥珀酰亚胺酯)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯或戊二酸二琥珀酰亚胺酯，为连接化学或生物分子的巯基和多聚物的氨基使用N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺-M-马来酰亚胺基苯甲酸酯，为连接化学或生物分子的巯基和多聚物的醛基使用4-(N-马来酰亚胺基甲酯)环己烷-1-羧基-酰肼或3-(2-嘧啶二硫)丙酰肼，为连接化学或生物分子的巯基和多聚物的羧基使用4-(p-叠氮水杨酰胺)丁胺。

[0033] 化学或生物分子和多聚物的氨基也可以用异种交联物连接，如N-5-叠氮基-2-氧琥珀酰亚胺硝基苄酯或N-羟基硫代琥珀酰亚胺-4-叠氮苯甲酸。

[0034] 有时候多聚物带有的羟基可以与羰基化试剂反应，如N，N’-羰基二咪唑，变成中间体氨基甲酸二氮杂茂酯，然后可以与N-亲核试剂如胺、带氨基的如多肽和蛋白，而形成N-氨基甲酸烷酯连接物。

[0035] 带有羟基的多聚物还可以与N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应，然后和一个带氨基的如一个寡核苷酸上的一个氨基反应，这个氨基可以是在寡核苷酸一端的，也可以是接近末端的。这种多聚物还可以与3-马来酰亚胺基丙酸反应，然后与寡核苷酸上的氨基反应。这种多聚物还可以与化学或生物分子的末端卤化烷基团反应通过醚基构成共联聚合物。

[0036] 当多聚物在相邻碳原子上带有羟基如多糖或糖蛋白，可以与高碘酸钠反应产生醛基官能团，从而与带有氨基的化学或生物分子形成Schiff’s键构成共联探针，Schiff’s键通过如硼氢化钠或硼氢化氰钠等还原剂产生在多聚物和化学或生物分子之间的仲胺或叔胺连接。

[0037] 共联聚合物可以通过光反应交联，如多聚物和化学或生物分子的氨基即可通过光反应交联，从而形成一个连接基团，例如多聚物的氨基连接于N-羟基琥珀酰亚胺-4-叠氮水杨酸，然后化学或生物分子的氨基通过光分解与其形成共联。

[0038] 又如，化学或生物分子的巯基能与1-(p-叠氮水杨酰胺)-4-(碘代乙酰胺)丁胺连接，然后多聚物的氨基通过光分解与其形成共联。

[0039] 又如，多聚物的醛基能与p-叠氮苯甲酰肼连接，然后化学或生物分子的氨基通过光分解与其形成共联。

[0040] 为了实际应用，有必要甚至可能是必须引入一些多聚物本身分子间和分子内的物理连接，由于大小的原因共联聚合物本身可能受到移液管或搅拌器等产生的机械剪切力而被破坏骨架结构，对应线状骨架结构的多聚物这种破坏尤其显著，通过给多聚物骨架引入物理连接(包括分子内连接)可以减轻这一问题。实际上物理连接可以是共价的也可以是非共价的，同种双功能交联例子如：4，7，10-三恶-1，13-十三烷二胺可以产生共价连接.另一例类似的互连分子是常用的乙酰基二胺。其他强的分子相互作用可以产生非共价连接，如：鸟嘌呤之间的Hoogsteen碱基对导致4条链状的DNA形成。基于多聚物这种特性，其在水溶液中形成相当紧密的随机线团，其骨架连接更主要体现于分子间而非分子内。但在碳水化合物参与的许多情况下，分子力如：氢键(分子间和分子内)能帮助稳定基片的探针连接。

[0041] 本发明的另一目的是提供一种检测分析物用的具有图像传感器的阵列，该阵列包括上述的共联探针。所述图像传感器可以是CMOS图像传感器。所述共联探针布于所述图像传感器表面上，或者布于与所述图像传感器相邻的基底上。

[0042] 本发明的另一种体现是共联探针交联点样于很薄而且透明的支持物上，这一基质可以是多孔的渗水物质也可以是致密的固体。如：透明的盖玻片。这一透明的支持物可以与数字化传感器直接接触的或固定在其表面，固定可以通过机械原理或透明粘合实现，这种薄的支持物易碎，不大可能用于芯片技术为基础的实际应用，然而，这种潜在的超薄易碎特性可以被紧贴在数字化传感器表面而得以改善，在这一设计中，用新的置换用过的透明支持物。实际应用中，这一设计非常有益，数字化传感器并非耗材的一部分可重复使用，因此，此发明中利用超薄透明的支持物是很关键的。光感应点(pixels)和光源(共联探针)之间的距离增加或采用厚一些的物体，会降低这一系统的功能，因为，被光感应点(pixels)收集的光信号与它们之间距离的立方成反比。常规的玻片由于太厚，而被排斥在此应用之列。

[0043] 通常阵列中的探针用于捕获和结合待检物质，探针所捕获的或者与其一部分结合的靶点包括有核酸、多聚核苷酸、蛋白、肽核酸、小分子以及很大范围内的生物分子，靶点部分结合探针包括抗体等。例如，链酶亲和素可以用来检测带有生物素标记的分子。

[0044] 从一方面看，本发明通过合成可以增加捕获待检物数量的共联探针而提高阵列中的每个点检测待检物的数量。这类共联探针包括如多糖共联物，此类可以用于放大微阵列中的点携带待检物数量的分子。

[0045] 例如，由一个多聚物连接有化学或生物分子所形成的多糖共联物，其化学或生物分子作为一个探针或不同的探针，从而构成一个共联物探针，作为探针的化学或生物分子通过共价键或如离子相互作用或弱电结合力等非共价化学相互作用与多聚物连接，多聚物可能是线状的或分枝状的，如线状或分枝状的多糖或寡核苷酸。

[0046] 将共联探针结合在传感器表面可以通过多种途径实现，例如可以在表面引入环氧基团，以与共联探针的羟基或氨基反应，还可以将表面用多聚赖氨酸处理，以结合点在表面上的共联探针或生物分子，紫外照射可以将探针或生物分子结合在如载玻片或电子设备临近的钝化层等基质上，共联探针或寡核苷酸可以被结合在引入醛基、氨基或异硫氰酸酯基的传感器表面。阵列的制造机制可以是针点、喷点或芯片上直接合成。

[0047] 本发明的另一目的是提供一种传感器设备，该传感设备包括光学数字图像传感器、低光罩和共联探针阵列。

[0048] 本发明描述了通过数字图象或者说“机器视觉”传感技术来读取阵列上结合的待检物信号，其具有低背景和相对高信噪比的特点，是一种强化的检测待检物的生物传感器系统。具体的说这种生物传感器系统应用了包括有子板上的数字图象传感器、具有共联探针的阵列、带有传感器降温装置的低光外壳和待检物信号的积分方法等的信号传感技术。

[0049] 带有共联探针的阵列所产生的光学信号可以被数字图象传感器检测，其中数字图象传感器包括光敏元件的矩阵，点制的共联探针通过共价或非共价结合于数字图象传感器的表面形成阵列。用另一种方式，共联探针可以点制在可以靠近数字图象传感器的载玻片上，而在载玻片和传感器直接存在有光纤耦合器。

[0050] 阵列上单个探针点的局部区域可以大于数字图象传感器的单个光敏元件。

[0051] 同样探针点大小可以与单个光敏元件一致。

[0052] 数字图象传感器可以是CMOS活性像素传感器，其每个像素对应连接有数字转换器、放大器和寄存器的光敏二极管。CMOS活性像素传感器的顶层是钝化层，如可以充分透光的二氧化硅，以作为隔绝阵列检测的待检物溶液和半导体线路的屏障。

[0053] 另外，本发明涉及通过直接把阵列构建在数字图象传感器上以增强其检测的信号，这是通过检测形成在数字图象传感器顶部薄的钝化层上的阵列所发射的化学发光来实现的，信号可以被接近于阵列的数字图象传感器感光原件方便的增强。

[0054] 本发明通过紧密接触图象传感器与探测器而降低了本底辐射，从而提高了阵列上被待检物光学信号测量的信噪比。如附图1所示，低光外壳100包容了光学图象传感器和阵列，其具有一个顶盖160和一个底盖180，底盖180承载着光学图象传感器的印刷电路板、可选的传感器冷却元件，并与顶盖160机械连接。图1中光学图象传感器的印刷电路板上包括有第二层外壳150与连接器360相连。当顶盖160扣在底盖180上时，形成一个围绕阵列120的为密闭屏障200所界定的低光区域300，液体受屏障200界定在这个低光区域中接触阵列。

[0055] 在顶盖160上有一个液体入口通道240，操作时通过液体入口通道240注射含有靶分子的液体并转运到阵列120，并汇集到低光区域300，待检物是通过加工在外壳100内的毛细结构或液体通道从液体入口通道240传送到阵列120的，液体入口通道240包括有一个导入液体的隔膜，并能屏障液体和光。

[0056] 有时候在底盖180上装有一个可选的液体入口通道320，一个可选的液体通道340连接可选的液体入口通道320和低光区域300。

[0057] 屏障200粘附在载玻片底窗280上，当顶盖160扣在底盖180上时，接近于图象传感器，液体也汇集于载玻片底窗280上，同时阵列也是加工在低光区域300中的载玻片底窗280上。

[0058] 外壳100连接在读取工作站400上从而可以保持充分的水平，外壳可以连接在读取工作站上也可以在任何重力方向上操作，这种情况下液体入口通道和外壳可以在任何方向上通过表面张力和毛细管作用密闭待检物液体，从而是待检物阵列信号可以被读取。

[0059] 如图1、2所示，支持有光学图象传感器140的印刷线路板380通过电路连接器360与读取工作站400进行电路连接，底盖180上也可以有开口220以连接光学图象传感器140的电子线路。

[0060] 生物传感器系统通过积分待检物信号而提高其检测的信噪比，积分是通过增加检测来自于阵列的光的收集时间和降低图象传感器以外的信号数据传输比率来实现的。为了积分待检物信号所采用的数据传输方法是使用CMOS活性像素传感器，典型的CMOS活性像素传感器就是可以用于摄影机的快速帧频设备。CMOS活性像素传感器可以以非常慢速的状态来整合(积分)紧密接触在传感器上的阵列信号，积分信号存入存储器，然后重复积分，观察待检物信号随时间的变化率。CMOS活性像素传感器的帧频可以控制，例如在零时间点上清空所有芯片记录，然后收集固定时段的待检物发射的信号，图象传感器的单个光敏元件可以同时积分不同的周期。待检物信号的积分增加了其信噪比，从而增强了对待检物的检测，而允许更低浓度的待检物可以被检测。

[0061] 待检物信号可以通过冷却低光外壳中CMOS活性像素传感器降低其固有的“暗电流”噪声来加强，传感器可以用热电元件、喷口扩展、制冷、冷液浸泡等途径进行冷却。一般来说，将传感器冷却7℃可减少一半“暗电流”噪声。因此将传感器冷却到4℃则可以把这种噪声降低至室温水平的1/10，含有或者不含有待检物的液体注入到低光外壳中时也可以冷却传感器。

[0062] 适用的光学检测包括检测荧光、化学发光、生物发光和量子点等方法，标记物或信号分子附着在多聚物或共联探针或靶混合物中的待检物上，包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、化学发光体、生物发光剂、酶、抗体、颗粒如磁珠和量子点。附着有荧光染料的带有氨基的短寡核苷酸也用于标记物，其氨基可以和共联报告物的多聚物连接。用于检测待检物的信号分子包括放射性同位素，荧光染料如Cy3、Cy5、AlexaFluor488、荧光素、罗丹明、得克萨斯红、玫瑰红、丹磺酰氯、溴化乙啶、萘胺、pyrenes、卟啉，化学发光系统如鲁米诺、发光氨、吖啶苯酯、钌盐、生色团，和比色探针如胶体金、偶氮染料、喹啉染料、花青染料。

[0063] 标记物包括拮抗剂和对抗剂、毒素、抗原决定基、激素、抗体、多肽、酶、寡核苷酸、肽核酸、凝集素、碳水化合物、蛋白和药物，例如用于ELISA检测的酶可以用来进行荧光检测，另外，荧光标记的抗生物素或链酶亲和素。

[0064] 对一种特定的待检物可以通过多种标记物形成多种检测方法，例如共联报告物的多聚物可以连接多种荧光或化学发光标记物，此外，共联报告物也能够结合多种靶点，因此共联探针的多聚物可以连接多种靶点结合分子和多种不同的标记物。

[0065] 对于荧光检测，荧光物的激发光可以由靠近阵列或者靠近CMOS传感器外壳的LED面板提供，在阵列附近阵列点与光敏二极管之间的窄带滤光片可以从阵列的读取信号中去除激发信号，而对发射光进行检测。

[0066] 另一种方法是待检物信号可以通过光学检测化学发光来读取测定信息。化学发光来自于化学反应产生的光，可以被没有滤光片的宽带探测器所检测，如CMOS活性像素传感器，阵列点发出的光直接被检测，背景信号主要来自于“暗电流”。待检物可以标记上化学发光标签用于化学发光检测，如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。检测效率一部分依赖于对标记的选择性或特异性附着效率，标记识别物可以是生物素或地高辛抗体此类的能被酶检测系统识别的物质，然后发生化学发光反应通过化学键断裂释放能量产生离散波长的光子。

[0067] 在共联报告物上，信号分子或染料分子相对与标记识别分子的数量比例可以是多种多样的，有时至少是3、4、5，通常至少是6、7、8、9，也有时至少需要10、20、30、40、50、60、70、80、90或者100，不同的组合方式来构成。

[0068] 本发明中的阵列信号检测可以使用数字图象传感器，也可以使用电荷耦合装置(CCD)、光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管来完成，待检物的检测也可以通过，例如电导检测来完成不同的阵列方案。

[0069] 本发明涉及到共联探针在工业、环境、生物医学和生物技术领域的应用，这项发明的共联探针可以应用于分析诊断以及检测液体、气体或固体形态中的待检物，共联探针可以与生物传感器组合应用于对待检物或液相、非液相、气相中的有机、无机或环境颗粒进行检测。

[0070] 本发明的再一目的是提供一种生物传感器系统，其包括读取工作站、包括有图象传感器的便携外壳。

[0071] 如图4所示，生物传感器系统包括在低光外壳100中的数字图象传感器600、高数据通量的读取工作站400和一台通用计算机700，读取工作站400至少有一个供带有CMOS数字图象传感器600的低光外壳100插入的插座，以形成传感器外壳与读取工作站的电路和机械连接，读取工作站可以通过通用串行总线(USB)454、并行端口接口设备452或以太网接口456与计算机相连。

[0072] 根据图4，在读取工作站400的主板上有一个可编程的逻辑设备460，如：与个人计算机的通用计算机700相连接，可编程的逻辑设备460也和数字图象传感器600相连，通过监测开始和结束的图象信号，包括帧、线和时钟脉冲线，同步读取数字图象传感器的待检物数据。可编程的逻辑设备460管理图象数据从图象传感器600传入本地FIFO存储器，直到计算机700要求数据传送。可编程的逻辑设备460一个典型的循环包括：计算机700命令传感器输出一个图象，捕捉图象并传入读取工作站400主板上的本地FIFO存储器里，传送捕捉的图象至计算机700。图形用户界面(GUI)可以让使用者简便的实现急射的图象捕捉显示循环或连续的动态显示方式。滤光片和图象处理工具可以让使用者在低光条件下操作传感器，包括使来自传感器的弱信号提升的图象处理程序、图象重复增强软件程序、扣除背景或“全黑”图象程序和滤除噪声程序。GUI还可以让使用者控制调节传感器本身的参数设置，如积分时间、增益和模拟转换数字的范围。

[0073] 读取工作站包括一个匹配图象传感器和低光外壳的连接器，这样安排是为了让数字图象传感器待检物探测器与读取工作站方便的分开以提高该生物传感器系统的工作通量，轻便的数字图象传感器外壳构成低光外壳。该生物传感器系统即插即用的特点允许其使用轻便可抛弃的数字图象传感器外壳，当然生物传感探测器的外壳也可以再生应用于其他阵列。

[0074] 读取工作站包括一个USB微型计算机接口，也可以包括一个微软扩展容量接口(ECP)界面并带有一个决定主动连接的使用者控制开关，读取工作站主板可以由USB线缆供电，但对于ECP则需要9V的直流供电。一个手控开关可以重启生物传感器主板和可编程的逻辑设备。

[0075] 本发明涉及了通过时间积分来增强待检物信号检测的方法，靶物质中待检物参数的数据产生和测量受限于数字图象传感器阵列检测产生的光所固有的信噪比。信噪比可以通过积分待检物信号几毫秒或更长时间的积分，通常是10毫秒至大约2分钟，有时是30至大约1000毫秒，有时是50至大约600毫秒，这个时间也可以通过储存一系列阵列信号帧(画面)来实现，每一帧也是通过一个时段的待检物信号积分(整合)而来的。

[0076] USB微型计算机接口为图象传感器和可编程的逻辑设备提供了主时钟，图象传感器输出像素数据和线帧脉冲，通过连接器传至主板，存入FIFO存储器，帧脉冲用于复位FIFO指针，线脉冲用于许可写入FIFO，FIFO中储存的像素数据安排为以上面左边的像素作为起始零位置。

[0077] 一旦图象存入FIFO，即可通过两种接口之一被读取。如图4所示，ECP允许阵列图象数据通过每次读一个像素的方式读入并口(PP)452，当PP452发送一个反向请求时，可编程的逻辑设备460许可其向PP452的输出驱动程序，而开始读取，然后可编程的逻辑设备460发送一次时钟，PP452就相应一次应答，时钟应答顺序进行直到计算机700读取完一帧像素，可编程的逻辑设备460用PP452的数据位O和1分别作为I2C总线的SDA和SCL。

[0078] 另外，FIFO中的图象数据还可以通过USB接口读取，相对于常规的USB传输来讲提高串行数据传输的带宽可以提高生物传感器的使用，而常规的USB传输中从FIFO读取两个数据包之间存在有一个间隔时间。例如，当从FIFO读取一个63像素的数据包并通过常规的USB微型计算机接口的一条数据线传输，在FIFO里指定2个终点以建立2个缓存，实际运行上一个缓存可以在另一个满了的情况下读取并通过USB的数据线传输，因此比普通串行总线提高了100％的传输带宽。第一个缓存数据传输即将结束之前，如1个或几个时钟脉冲之前，第二个缓存开始通过通用串行总线的数据线开始传输，而当第二个缓存数据传输接近完成的同时，第一个缓存也用了同样的时间加载数据，这样的步骤反复进行直至要传输的数据完成，因此比传统的USB提高了传输率。

[0079] 本发明主要包括几个关键因素：传感器直接对探针检测、共联探针、及配对报告物。此外，共联探针和共联报告物通过共价或非共价交联于聚合物骨架。通过这些过程的结合使用，本发明能够建立一种超敏感、高速、低成本、高度便携的分子检测系统，在其众多潜在的应用中，突出例子就是直接检测多种形式粗略样品中的核酸，而不需要核酸的抽提和扩增环节，这种全新的发明可能会改变或替代目前针对临床核酸样品或其它核酸样品应用领域的基因分型、基因突变和基因表达图谱的应用现状。另一项应用是以一种超敏感的方式改变或替代以蛋白免疫为基础的现有多种形式的ELISA检测。

附图说明

[0080] 图1示例一个读取工作站上的低光图象传感器外壳；

[0081] 图2示例侧视低光图象传感器外壳；

[0082] 图3示例用CMOS图象传感器检测一个探针点的荧光；

[0083] 图4a～c示例生物传感器系统对一个待检物进行检测及其阵列检测数据的显示，其中a为单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，b为流感杆菌(Hemophilus influenzae)，c为3、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)。

具体实施方式

[0084] 实施例1

[0085] 线性葡聚糖(Sigma)用于耦联带氨基的寡核苷酸：

[0086] 线性葡聚糖(Sigma)溶于去离子水，终浓度1％，高压灭菌，室温暗环境下每0.4毫升葡聚糖溶液被44微升0.5M的高碘酸钠氧化，摇床过夜，氧化的葡聚糖用0.3M的NaOAC和2倍体积的乙醇沉淀洗涤两次，沉淀空气干燥后重溶于0.4毫升5mM pH7.2的磷酸钠缓冲液。

[0087] 在离心管中加入1微升氧化葡聚糖、7微升10mM的Na2CO3(pH9.0)和2微升寡核苷酸(2uM水溶液)，寡核苷酸长度是25—45mer，并在合成时在3’或5’端引入首位氨基，37℃水浴过夜，加入NaBH4室温孵育30分钟，然后用0.3M的NaOAC和2倍体积的乙醇沉淀，沉淀用TE重溶，并取一部分进行1％的琼脂糖凝胶电泳，EtBr染色，游离的寡核苷酸泳动至很接近盐前端，而与葡聚糖耦联的寡核苷酸泳动的非常慢。

[0088] 实施例2

[0089] 高分子量分枝多糖、糖原(Sigma)和支链淀粉(Sigma)用于交联带氨基的寡核苷酸。

[0090] 这些聚合物的二醇键通过NaIO4氧化成醛基，0.4毫升1％多糖水溶液中加入高碘酸钠，对于糖原和支链淀粉分别终浓度为25mM和20mM，室温暗环境摇床氧化过夜，用0.3M的NaOAC和2倍体积的乙醇沉淀两次去除过量的NaIO4，沉淀空气干燥后重溶于0.4毫升5mM pH7.2的磷酸钠缓冲液，耦联带氨基的寡核苷酸及耦联产物的凝胶分析与实施例1中葡聚糖相同。

[0091] 共联聚合物的制备交联密度为每10个葡萄糖单体交联1个寡核苷酸，平均大约每个糖原分子交联1000个寡核苷酸分子。

[0092] 实施例3

[0093] 信号分子5’-ACTGCT-3’(BP001)的5’末端带有氨基，3’末端带有Cy5荧光燃料，5’末端带有氨基的识别探针寡核苷酸分子AKH108(5’-CCGTGCAGATCTTAATGTGCCAGTAAAA G-3’)与同一多糖交联，AKH108能与流感嗜血杆菌基因组中编码3-磷酸甘油酸激酶基因片段的引物5’-CCGTGCAGATCTTAATGTGC-3’和5’-GCGCTGTACCAAAGGCATC-3’扩增的PCR产物杂交，PCR产物以微阵列的形式点在包被有多聚赖氨酸的玻璃载玻片上。所谓交联反应即：
在装有20nmol氧化糖原、10mM Na2CO3的离心管中加入0.2nmolAKH108和2nmol BP001，终体积10微升，37℃过夜。

[0094] 在管中加入终浓度4mM的NaBH4，室温孵育90分钟，终产物用乙醇沉淀，离心，交联产物和游离AKH108处在沉淀中，游离的BP001处在上清中弃去，用10微升3×SSPE/0.1％SDS/1.0mg/ml BSA溶解沉淀并加到微阵列表面，室温杂交5小时，用10微升的新鲜的0.1×SSPE/0.1％SDS清洗载玻片3次，用激光扫描仪进行扫描，观测PCR产物的斑点图谱。

[0095] 实施例4

[0096] 能特异性杂交来自以粪肠球菌的RecA基因的PCR扩增产物的寡核苷酸5’-NH2-CCGATGCC TTAGTTTCAAGTGGTGCGATTGACATCGTTGTCAT-3’，与糖原或支链淀粉交联，多糖氧化同实施例2。交联反应即，20nmol氧化糖、2nmol带氨基的寡核苷酸与10mM的Na2CO3缓冲液(pH9.0)混合，终体积10微升，37℃孵育过夜，交联反应结束后加入终浓度
4mM的NaBH4室温孵育60分钟。

[0097] 终产物用0.3M的NaOAC和2倍体积的乙醇沉淀，然后溶解于10mM的Na2CO3(pH9.0)。一部分交联的寡核苷酸点在环氧处理的玻璃载玻片上，等量的寡核苷酸和未氧化的多糖混合也点在同一张载玻片上作为对照。芯片上杂交即：标记有AlexaFluor546(Molecular Probes Inc)的RecA的PCR产 物溶 解于3×SSPE/0.1 ％SDS/1.0mg/ml BSA，并加在玻璃载玻片表面上，室温杂交3小时，0.1×SSPE/0.1％SDS清洗，用激光扫描仪进行扫描，与糖原交联的寡核苷酸点信号相对于非氧化糖原对照点5.86倍，与支链淀粉交联的寡核苷酸点信号相对于非氧化支链淀粉对照点5.63倍。

[0098] 实施例5

[0099] 二咪唑羰(CDI)活化的过程即：4微升0.5M CDI(溶于DMSO)与10微升0.5％溶于DMSO的多糖、6微升DMSO混合，室温孵育3小时，偶尔蜗旋振荡，每管加入1毫升n-丁醇，蜗旋振荡彻底混匀，离心，去除丁醇空气干燥沉淀后，用10微升的DMSO溶解。对于寡核苷酸交联，2.2nmol带氨基的寡核苷酸与5微升0.5％活化CDI多糖混合，终体积20微升，室温孵育5天，偶尔蜗旋振荡，反应结束后加入1微升10％氨基乙醇，孵育30分钟，乙醇沉淀，产物溶于10微升TE缓冲液，凝胶电泳分析。

[0100] 实施例6用CMOS图象传感器直接在芯片上检测杂交信号

[0101] 模块裸露的PB0330单色图象传感器(Photobit)通过插头座连接于子板，连接线用环氧树脂封闭固定，模块表面用灭菌蒸馏水冲洗3次，空气干燥。为环氧化表面，用2％溶于甲醇的(3-丙氧基缩水甘油)三丙氧基-硅烷加到模块表面，室温孵育10分钟，用甲醇洗2次，空气干燥。

[0102] 四种不同的探针(100pmol/ml溶于50mM Na2CO3缓冲液，pH10.5)人工点在环氧处理过的模块表面，均点复点。

[0103] 点干燥后，用1％溶于50mM Na2CO3的氨基乙醇快速洗一次，然后用同样的封闭液室温孵育10分钟，然后用灭菌蒸馏水冲洗表面4次。

[0104] 芯片上杂交，模块表面用3×SSPE/50％甲酰胺/1.0mg/ml BSA室温孵育20分钟，然后和溶于20毫升的3×SSPE/50％甲酰胺/1.0mg/ml BSA的PCR产物(末端标记有生物素，如后详述)杂交(此前于沸水浴加热2分钟，迅速冷却至4℃)，30℃湿盒中杂交过夜，完成后室温用0.1×SSPE清洗4次，每次5分钟。用链酶亲和素-碱性磷酸酶结合杂交的PCR产物上的生物素，首先模块表面用溶于TBS的1mg/ml BSA室温孵育20分钟，然后用TBS/1mg/ml BSA1：100稀释的Avidx-AP(Tropix)室温孵育2小时，再用TBS室温清洗5次，每次5分钟。

[0105] 检测芯片上杂交信号，模块表面带有TBS的子板插入读取工作站闭光外壳的连接器里，安装在PC上的授权软件接收“暗图象”(即背景图象，Idark)，子板插在读取工作站上，TBS被换成化学发光底物溶液，包括依据供货说明制备的CDP-star和增强剂Emerald II(均来自Tropix)。

[0106] 大约0.1秒积分时间的图象帧(I)被从传感器接收，I-Idark作为真实信号快照，软件具有一个把连续处理的快照加在一起并作为一幅图像显示结果的子程序，因此更加延展了积分时间。

[0107] 以下的传感器寄存器设置最优：增益(寄存器53、43—46)，最大；积分时间(寄存器9、10)，每帧0.1秒；相似负偏移(寄存器32、57)，最大；增益级(寄存器62)，74；其他寄存器保持默认设置。

[0108] 实施例7用TOTDA涂布合成多聚物

[0109] 在一个Eppendorff管中加入8微升溶于5mM磷酸缓冲液(pH7.2)的1％氧化葡聚糖-500，1微升1mM5’带有氨基的寡核苷酸衍生物，2微升0.2M的Na2BO3(pH9.0)，2微升20mM的NaBH3CN，1微升0.3mM的TOTDA和6微升的水。混匀在4℃温育过夜。然后加入4微升的水和6微升的DMSO，转到微量滴定板上，转印到GeneMachineOmniGrid Accent arrayer的芯片表面。涂布的交联剂与捕获的分子比例在10：1到1：1000之间。应该注意在这一还原氨化反应中，靠NaBH3CN形成的shift’s键的同步还原反应帮助偶联反应完成。

[0110] 实施例9 G四联体共联报告物

[0111] 一个富含G寡聚核苷酸TP(TGGACCAGACCAGCTATGGGGGAGCTGGGGAAGGTGGGAATGTGA)可以从含有一个通过鸟嘌呤间的Hoogsteen型碱基对而形成的四链G4-DNA结构的免疫球蛋白基因转换区中获得。报道于Sen and Gilbert(1988)Nature334：364-366，Sen and Gilbert(1990)Nature344：410-414.一个截断的TP如寡聚核苷酸Q3(5’-CACGTATGGGGGAGCTGGGGTAT-3’).被用来制各纯化G4-DNA特殊核酸酶的G4-DNA亲和矩阵，报道于Liu and Gilbert(1994)Cell77：1083-1092.在钠和钾离子存在的条件下，四链结构是非常稳定的。

[0112] 在一个Eppendorff管中加入，2mM HRP25微升，0.3mM浓度5’尾端带有一个氨基的Q3寡核苷5微升，20mM浓度NaCNBrH310微升，0.1mm浓度的抗生物素蛋白5微升，1％的氧化葡聚糖-50040微升和水5微升。在4℃孵育过夜。然后过柱，柱子是Bio-Gel P-50介质。收集过柱的小部分碎片，然后用包含40％甘油，200mM氯化钠，和100mM氯化钾的缓冲液1：1混匀。-20℃保存。这个试剂能够监测分子包含有生物素标签的样品，它能增强其灵敏度。相比于直接的HRP聚合，目前方法得到的多聚HRP有具多优势。这是因为在HRP之间有更多的间距，这种多聚HRP的形成浮力密度很小，因此不太可能由于沉淀而与检测的表面黏着在一起，减少没有非特异结合的噪声信号。另外，HRP之间更好的间距能够减小底物损耗和底物扩散这些限速的可能性可减少发光信号的收集。碱性磷酸酶或者荧光染料能容易地替代HRP做其它共联报告物。

[0113] 葡聚糖骨架中的Q3寡聚核苷主要是提供一个机械的稳定性，能够减轻由于机械剪切导致的骨架损伤。众所周知，在Na和K离子存在的情况下，富含G的寡聚核苷酸能够通过Hoogsteen碱基配对形成一个稳定的四级结构(称为G4DNA或者G四聚体)。

[0114] Q3寡聚核苷在葡聚糖中的作用是提供某个物理连接(或连接桥)这个物理连接是非共价的，在聚合体骨架中间，在自然情况下既能在分子内部又能在分子之间。

[0115] 当然，带氨基的Q3寡核苷酸同样也能用来制备共联探针，例如替代TOTDA，正如在例8中所描述的，将产生一个稳定，非共价的聚合体骨架物理连接，从而提供更好的机械稳定性。

[0116] 实施例9Watson-Crick碱基配对稳定共联报告物

[0117] 有其它的方法建立聚合体骨架的非共价连接，一个例子，利用互补的寡核苷酸之间的特异的碱基配对。可以合成一个17-mer随机序列寡核苷酸，在3’端带有氨基基团，然后合成他的互补核苷酸，在3’端也带有氨基。正如实施例8所描述的准备共联报告物的过程，结合使用这2个寡核苷酸能替代Q3寡聚核苷酸。

[0118] 实施例10寡聚核苷杂交的敏感滴定

[0119] 在直接探针感应器的方法中，联合使用共联探针和共联报告物的重要原因是此举能够在很大程度上改良其敏感性。本实施例评估这个结合系统的敏感性。

[0120] 如实施例5所述，2个不同的寡聚核苷酸A105和D207，各自与氧化葡聚糖交叉结合。每个共联探针都以2.2矩阵印在CMOS传感器上，总共7个芯片被印记。印记之后，芯片在70％湿度的小室中干燥2小时，然后再80℃真空烘烤过夜，然后用PBS或相应的溶液漂洗。在含有被生物素化的互补寡聚核苷：BC-A105和BC-D207的杂交溶液，加入了上述芯-17片。对于所有7个芯片，每个芯片(或杂交反应)BC-A105数量维持在10 摩尔，寡聚核苷-16 -21
BC-D207的数量降低10倍，约为10 到10 摩尔之间。第7个芯片是省略BC-D207的杂交反应。杂交之后，用0.1X SSPE完全洗脱芯片，然后，用含有Straptavidin-Poly HRP和
1％BSA的TBS缓冲液中温育1小时，再用TBS洗脱芯片数次，HRP发光的底物就被加在芯片上，杂交结果经过USB阅读器，直接还原在个人电脑的桌面上。

[0121] 重复的数据反复证实这套系统的敏感度是500分子(也就是总量既包括未结合态也包括杂交后结合态化合物)当没有BC-D207的时候，在D207共联探针的“点”上没有杂交信号。为了评估这套系统的动态范围，来自D207的杂交信号数量被A105的杂交信号数量除后或者数量化修饰之后，这些数据相对BC-D207的浓度作图，双对数图中，其线性范围显示出至少有4.5的对数数量级。

[0122] 实施例11血清中基因的无扩增检测

[0123] 将10毫升人类病人血液离心。从离心管中提出血清的白色细胞层加入到装有3毫升细玻璃珠和6毫升PBS缓冲液的15毫升离心管中。然后，用台式超声破碎机破碎一分钟，重复4次以上。将20微升未经处理的融胞产物加在含有人类CYP450基因捕获探针的CMOS传感器芯片上，然后加入1微升末端含有生物素标签并能与捕获探针杂交的报告探针。经过两个小时的杂交，并在严格的条件下漂洗。然后加入含有Straptavi din和poly-HRP(多聚辣根过氧化物酶)的共联报告物在室温下焙育一小时。再用PBS缓冲液漂洗数次并将化学发光底物(LMA-6，Lumigen)加到芯片上。杂交结果通过一个便携USB读取装置传送到笔记本电脑上。

[0124] 每十微升血液中含有一百二十万个白细胞。假定检测特殊的CYP450单倍体，通过上述程序回收的样品总量将达到70％，每20微升未处理的融胞产物就有10,000份CYP基因拷贝用于芯片杂交检测。当前的系统比检测特异杂交灵敏度更高，因此可以绕过前面对目标序列的扩增。

[0125] 实施例12微生物病原体的非扩增检测

[0126] 在活细胞中，核糖体RNA是一种大量存在的核酸，估计每个细胞中含有大约10,000个。虽然这种RNA在序列上十分保守，但通过特异核酸杂交，种间序列上的差异足以进行物种鉴定。下面是一个微生物病原体检测的例子。

[0127] 举例说明大体上检测原理。将沙眼衣原体溶液浓缩到10，000cfu/ml备用。在一个EP管中将0.3毫升CT溶液与0.3毫升含有2％SDS的PBS缓冲液和0.3毫升(体积)的玻璃珠混合。然后用最高速度在漩涡器上旋转混匀。在10微升上清液加入10微升含有
90％甲酰胺和6XSSPE的溶液并加入1微升生物素指示探针，然后转到含有通过多聚骨架结合了捕获探针(合为共联探针)的感受芯片上杂交一小时。在此例，共联探针是点在一个透明薄层上，然后再固定到CMOS光电传感器表面上的(组成感受芯片)。指示探针和捕获探针在规定的杂交条件下与同一个核糖体RNA接合。这个长度在17到45个核苷酸残基。
杂交后芯片的处理过程与上面的例子相同。做这种临床检测，需要包括芯片阳性和阴性对照。而且，可能需要同一种检测的另外一种病原体如淋球菌的捕获和指示探针。

[0128] 假如玻璃珠漩涡造成的CT细胞溶菌破裂率大约是10％，那么对于任何给定的核糖体RNA，可以计算出目标分子出现在每个杂交反应中的数量正如上面描述的是大约150000。虽然这仅仅是下限，但是对于没有任何酶扩增的系统这个数值已经足够用于检测。

[0129] 在对于最常见的性传染疾病CT/NT进行临床检测时，一般是用棉花球插入阴道取样。取样后的棉花球可用PBS缓冲液将大部分细胞清洗下来，然后重悬在1毫升的PBS中。CT/NC呈阳性的病人，以这种方式收集到的细胞至少可以达到10000个细胞每毫升。这样上面所描述的检测法就完全可以适用了。这儿揭示的原理可以应用于通过水或食物传播的病原体的非扩增检测。