提高假单胞菌生产D-甘露糖异构酶产量的方法

摘要

提高假单胞菌CGMCC No.2120生产D-甘露糖异构酶产量的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明提供一株产D-甘露糖异构酶的菌株，其分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)JN18，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2120。通过单因子实验、Plackett-Burman实验设计、响应面分析法对假单胞菌CGMCC No.2120产D-甘露糖异构酶的培养基进行优化，确定发酵优化条件为：果糖1.5％-1.6％，牛肉膏2％，酵母膏0.2％，K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，NaCl 0.05％，Tween-80 0.15％-0.16％。采用优化配方酶活可以达到68.28U/mL，较初始发酵酶活力38.91U/mL提高了1.75倍。

权利要求

1.一株产D-甘露糖异构酶的菌株JN18，其分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2120。

2.一种优化发酵培养基提高假单胞菌CGMCC No.2120生产D-甘露糖异构酶产量的方法，其特征在于：菌种：假单胞菌CGMCC No.2120；

优化后的产酶发酵培养基以g/L计为：果糖15-16，牛肉膏20，酵母膏2，K2HPO4

2，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，Tween-80 1.5-1.6；

发酵培养：吸取种子发酵液至装有发酵培养基的250mL三角瓶中，接种量为4％体积分数，30℃振荡培养48h；

粗酶液的制备：发酵液4℃、10000r/min离心10min，弃去上清液，向沉淀中加入pH7.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液，洗涤2次，再用原发酵液4倍体积的磷酸盐缓冲液悬浮，然后在冰浴条件下进行400W、5min超声波破碎，4℃、15000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。

说明书

提高假单胞菌生产D-甘露糖异构酶产量的方法

[0001] 优化发酵培养基提高假单胞菌CGMCC No.2120生产D-甘露糖异构酶产量的方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

[0002] D-甘露糖异构酶(D-甘露糖酮醇-异构酶，EC5.3.1.7)催化可逆的D-甘露糖与D-果糖的异构化反应。 D-甘露糖是许多多糖和糖蛋白的成分，可用于合成药物，它还能抑制鼠伤寒沙门氏菌生长，可以用作家禽饲料添加剂防止细菌污染。 甘露糖及其衍生物被广泛应用于食品工业、医药等行业。尽管D-甘露糖的需求量逐渐增加，市场上昂贵的价格使之不能广泛的应用。因此，用甘露糖异构酶将蔗糖，D-果糖转化为一种昂贵的D-甘露糖将会有利于降低产品成本。

[0003] 目前，关于D-甘露糖异构酶的研究多见于外国报道，国内尚未见报道。1993年，Takasaki等[Takasaki Y，Hinoki K，Kataoka Y，Fukuyama S，NishimuraN，Hayashi S，Imada K(1993)Enzymatic production of D-mannose from D-fructoseby mannose isomerase.J.Ferment.Bioeng.76：237～239]利用新近从土壤中分离到的假单胞菌MI产生耐热甘露糖异构酶。2003年，Jun Hirose，Takasaki等[JunHirose，Yuka Kinoshita，Seijiro Fukuyama，Sachio Hayashi，Haruhiko YokoiYoshiyuki & Takasaki(2003)：Continuous isomerization of D-fructose to D-mannoseby immobilized Agrobacterium radiobacter.cells Biotechnology Letters.25：349～352.]用固定化放射土壤杆菌细胞将D-果糖连续异构化成D-甘露糖。 Ann Hey-Ferguson等[ANNHEY FERGUSON，ALAND.ELBEIN(1969).
Purification of aD-Mannose Isomerase from Mycobacterium smegmatis.JOURNAL
OFBACTERIOLOGY.101：777～780.]使耻垢分枝杆菌M.Smegmatis细胞在甘露糖做唯一
碳源的培养基上生长，其细胞产出甘露糖异构酶。 但是在这些文献中都没有提到过发酵培养基及发酵条件的优化。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提出一种优化发酵培养基提高假单胞菌CGMCC No.2120生产D-甘露糖异构酶产量的方法，首次报道了采用单因子实验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡路径实验、响应面中心组合设计等统计学方法对假单胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCC No.2120产D-甘露糖异构酶发酵培养基进行优化。

[0005] 本发明的技术方案：一株产D-甘露糖异构酶的菌株，其分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)JN18，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号为CGMCC No.2120。

[0006] 一种优化发酵培养基提高假单胞菌CGMCC No.2120生产D-甘露糖异构酶产量的方法：

[0007] 菌种：假单胞菌(Pseudomonas sp.)CGMCC No.2120；

[0008] 培养基以g/L计为：

[0009] 斜面培养基：牛肉膏3，蛋白胨5，琼脂15，pH7.0；

[0010] 种子培养基：葡萄糖1，酵母膏3，pH7.0；

[0011] 初始发酵培养基：葡萄糖5，酵母膏3，K2HPO42，pH7.0；

[0012] 优化后的产酶发酵培养基：果糖15-16(最优为15.26)，牛肉膏20，酵母膏2，K2HPO42，MgSO4·7H2O0.5，NaCl0.5，Tween-801.5-1.6(最优为1.54)；

[0013] 培养方法

[0014] 种子培养：取生长良好的斜面菌种5环，接种于装有种子培养基床培养24h。 [0015] 发酵培养：吸取种子发酵液至装有适当发酵培养基的250mL三角瓶中，接种量为4％体积分数，30℃振荡培养48h。

[0016] 粗酶液的制备：发酵液4℃、10000r/min离心10min，弃去上清液，向沉淀中加入pH7.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液，洗涤2次，再用约原发酵液4倍体积的磷酸盐缓冲液悬浮，然后在冰浴条件下进行400W、5min超声波破碎，4℃、15000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。

[0017] 酶活测定方法：半胱氨酸咔唑法[Dische，Z.，and E.Borentreund(1951)：Anew spectrophotometric method for the detection and determination of ketosugars and trioses.J.Biol.Chem.192：583～587.](根绝实验具体情况做了改进)。 吸取0.1mLD-甘露糖(0.1mol/L，用pH7.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液配制)于试管中，加入0.1mL粗酶液，50℃反应
30min，加入0.8mL0.5mol/L的HClO4终止反应，再经适当稀释，测定果糖的质量浓度。
在相同条件下，以加入相同体积的pH7.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液作对照。

[0018] D-甘露糖异构酶酶活定义：以D-甘露糖为底物，每毫升酶液每分钟转化生成1μg果糖所需的酶量为一个酶活力单位，以U/mL计。

[0019] 本发明的有益效果：通过单因子实验、Plackett-Burman实验设计、响应面分析法对假单胞菌CGMCC No.2120产D-甘露糖异构酶的培养基进行优化，优化条件为：果糖1.5％-1.6％，牛肉膏2％，酵母膏0.2％，K2HPO40.2％，MgSO4·7H2O0.05％，NaCl
0.05％，Tween-80 0.15％-0.16％。 用优化配方酶活可达到68.28U/mL。 生物材料样品保藏

[0020] 一株产D-甘露糖异构酶的菌株，其分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)JN18，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏
日期为2007年7月25日，保藏编号为CGMCC No.2120。

附图说明

[0021] 图1不同碳源对产酶的影响

[0022] 图2不同氮源对产酶的影响

[0023] 图3无机离子对产酶的影响

[0024] 图4Tween-80对产酶的影响

[0025] 图5响应面分析图

具体实施方式

[0026] 摇瓶培养基的优化

[0027] 实施例1：最适碳源的选择

[0028] 改变初始产酶培养基中碳源的种类，分别以1％(w/v)的D-甘露糖，葡萄糖，果糖，蔗糖，可溶性淀粉，乳糖，麦芽糊精作为碳源进行最适碳源的筛选。 实验结果见图1，以D-甘露糖为碳源时，产酶量最大，其次是果糖，原因可能是D-甘露糖异构酶为诱导酶，D-甘露糖和果糖为产生D-甘露糖异构酶的诱导物，而D-甘露糖比果糖诱导效
果好。 但是D-甘露糖价格较贵，为了节约成本则选择果糖作下一步实验。

[0029] 实施例2：最适氮源的选择

[0030] 以黄豆粉，蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，尿素，硫酸铵，氯化铵7种有机和无机氮源进行最佳氮源的筛选。结果见图2，假单胞菌CGMCC No.2120几乎不利用无机氮源硫酸铵，氯化铵，尿素；牛肉膏和0.2％的酵母膏做氮源时酶活较高。 因此，选用2％的牛肉膏和0.2％的酵母膏作为最佳氮源。

[0031] 实施例3：最适无机盐的选择

[0032] 金属离子有的是组成细胞的化学元素，有的是酶活性部位的组成部分，它们是微生物生长的必要物质。一部分通过无机盐的方式提供。 以果糖为碳源，牛肉膏和尿素复合物为氮源，分别以0.05％的MgSO4·7H2O，MnSO4，CaSO4，NaCl，FeSO4·7H2O2+ +
作为无机盐进行筛选。结果见图3，与未添加金属离子的酶活比较，Mg ，Na 对酶活有
2+
较大促进作用，而Fe 对酶活有强烈的抑制作用。

[0033] 实施例4：Tween-80对产酶的影响

[0034] 分别调整Tween-80浓度0％，0.1％，0.15％，0.2％，0.3％。 Tween-80是一种胞内促进剂，通过改善细胞的通透性或保护酶的表面失活提高酶的产量[俞俊棠，唐孝宣，邬行彦等.新编生物工艺学(上)[M].北京：化学工业出版社，2003.]。 结果如图4，0.2％浓度的Tween-80对产酶有一定的促进作用，可以看出浓度低时产酶较低，随Tween-80浓度升高产酶量也升高，但Tween-80作为一种表面活性剂，浓度过高会破坏细胞膜，抑制细胞生长。

[0035] 实施例5：Plackett-Burman设计筛选影响产酶的主效因子

[0036] 根据单因素试验选取对产酶有影响的6个因素，每一个因素取-1和+1两个水平，但对某个因素两水平的差值不能过大，以隐盖了其他因素的重要性。 +1水平取-1水平的1.25倍，以D-甘露糖异构酶的酶活作为响应值(Y)。 运用StatisticalAnalysis System(SAS)软件分别计算各因素的效应值，并对各因素效应进行t检验，选择置信度较高的因素作为显著因素作进一步考察。 实验设计及结果如表1所示，各因素所代表的参数，水平及分析结果见表2。

[0037] 表1 Plackett-Burman试验设计与结果

[0038]

[0039] 表2 Plackett-Burman试验分析结果

[0040]

[0041] 由表2可知，对产酶有显著影响(置信度大于95％)的因素有果糖和Tween-80。其中果糖对产酶呈现出正效应；Tween-80则呈现出较负效应。

[0042] 要提高产酶量，应适当提高果糖的浓度，降低Tween-80的浓度。

[0043] 实施例6：最陡爬坡实验研究最大响应值的响应区域

[0044] 从表2可知，在影响产酶的各主要因素中，果糖有显著正效应，Tween-80有显著负效应。 根据这2个因素效应大小的比例设定它们的变化方向和步长，进行最陡爬坡实验设计，寻找最大产酶区域。 其他各因素分别取各自的低水平进行试验，试验设计及结果见表3。

[0045] 由结果可知，最大产酶区在第3次试验附近，故以试验3的条件为响应面实验因素水平的中心点。

[0046] 表3 最陡爬坡实验设计及其结果

[0047]

[0048] 响应面实验设计筛选重要因素的最优水平。

[0049] 逼近最大产酶区后，进行响应面中心组合实验设计，以实验结果拟合建立描述响应量(产酶量)与自变量(影响产酶的显著因素)关系的多项式回归模型，运用SAS软件程序对实验数据进行回归拟合，并对拟合方程作显著性检验及方差分析。 再对拟合方程进行规范形分析，寻找回归模型的稳定点，得到最大产酶量时显著因素的最优水平。
以果糖和Tween-80两个重要因素为自变量，各因素编码水平如表4所示。响应面实验设计及试验结果如表5所示。

[0050] 表4 响应面分析因素水平表

[0051]

[0052] 表5 响应面设计及试验结果

[0053]

[0054] 对实验数据进行多项式回归，可以得到如下二次多项式方程：Y＝2 2
68.606+0.803326X1-0.455895X2-0.858001X1-0.53X1X2-1.393001X2

[0055] 表6 回归方程系数显著性检验表

[0056]

[0057] 表7 回归模型的方差分析

[0058]

[0059] 表6和表7分别是该回归方程的方差分析和模型的可信度分析。 从这2个表格2
可以看出，大于F值的概率为0.000308，决定系数R ＝94.36％，表明94.36％的酶活力变化可以由此模型解释，说明此模型的可信度较高，可以选择。 回归方程的一次项和二次项显著，而交互相不显著，表明这2个因素之间的相互影响很小。

[0060] 响应面分析图如图5所示。

[0061] 岭脊分析：脊岭分析的原理是在以原始设计中心点为球心，r为半径的超球面与响应面的交点形成的轨迹范围内找出最佳响应值，即最佳工艺条件。 岭脊分析结果见表8。

[0062] 表8 脊岭分析

[0063]

[0064] 从表8可以看出，最大响应值的编码半径为0.7时，此时果糖X1＝0.63，Tween-80X3＝-0.30，Y的最大估计值为68.88，即果糖和Tween-80浓度分别为1.526％，
0.154％，预测的最高酶活力为68.883U/mL。

[0065] 为了进一步验证实验结果，在优化的培养基条件下重复实验3次，得到的D-甘露糖异构酶的平均酶活为68.28U/mL，说明该模型可以较好地预测该实验发酵情况。 [0066] 结论：影响微生物产酶主要有3个方面的因素：即微生物菌种自身优劣，微生物的培养基组成和微生物的培养条件。 为有效地发挥假单胞菌属产D-甘露糖异构酶的潜力，在进行培养基优化时分别通过单因素实验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡实验和响应面分析法，获得了最佳产酶培养基：果糖1.526％，牛肉膏2％，酵母膏0.2％，K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，NaCl 0.05％，Tween-800.154％，优化后的酶活力达到68.28U/mL，较初始发酵酶活力38.91U/mL提高了1.75倍。