一种筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法

摘要

本发明公开了一种筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法。系采用改进的异步对峙培养方法，待测细菌4～6点点接，培养2～3天，再喷雾弥散烟草野火病菌悬浮液，无菌风干表面水后，继续对峙培养2～3天，观察有无抑菌圈，有抑菌圈的为筛选获得的目标细菌。本发明能显著提高筛选效率，丰富异步对峙培养方法，加快植物细菌病害的生物防治。

权利要求

1.一种筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法，其特征在于：采用改进的异步对峙培养方法，待测细菌4～6点点接，培养2～3天，再喷雾弥散烟草野火病菌悬浮液，无菌风干表面水后，继续对峙培养2～3天，观察有无抑菌圈，有抑菌圈的为筛选获得的目标细菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的烟草野火病菌悬浮液喷雾弥散的方法是将制备的烟草野火病菌悬浮液转移至消毒、灭菌的小型喷雾装置内，在已经灭菌的超净工作台上打开培养好的待测细菌平板，于通风状态下，向平板上方喷雾烟草野火病菌悬浮液，借助风力，病菌就均匀弥散到平板上，继续通风10～15分钟，风干平板表面水份。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的烟草野火病菌悬浮液的制备方法是取0.1％的吐温80灭菌水溶液10～15ml加入到培养好的烟草野火病菌平板上，刮下菌

4～5

苔，转移至灭菌三角瓶中，用0.1％的吐温80灭菌水溶液调节细菌浓度为10 cfu/ml，即可得烟草野火病菌悬浮液。

说明书

一种筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物防治技术，更具体地说，本发明涉及一种筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法。

背景技术

[0002] 烟草野火病是由烟草假单胞杆菌(pseudomonas syringae pv.tabaci)引起的一种细菌性病害，最早于1917年在美国的佛吉尼亚和北卡罗来纳州发现，现已广泛分布于世界26个产烟国家和地区，是烟草上重要的细菌性病害之一。我国早在20世纪50年代就于辽宁烟区发现该病，但一直危害不大。20世纪80年代以来，该病在云南、贵州、河南、山东、湖北、辽宁和吉林等烟区均有大面积发生，并有逐年加重的趋势，造成了较为严重的经济损失。

[0003] 野火病菌可随病株残体在田间越冬，也可在其他多种作物和杂草根系存活，还可以借助烟草种子传播。因此，采用轮作、田间消除病残体等栽培措施预防该病的发生有相当的难度；药剂防治以利用农用链霉素为主，但链霉素属于成分单一的抗生素，长期连续施用易使病原物产生抗药性，在一些烟区已存在不同的抗药性，表现为施用浓度不断提高。在当前缺乏抗病品种的情况，为有效防治该病，有必要寻找有益细菌，既可以抑制野火病，又可以延缓病菌的抗药性。因此，筛选高效和稳定的拮抗菌是保证生物防治获得成功的条件之一，而筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法则是其基础。

[0004] 筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法主要有平板对峙培养法或代谢产物活性检测法。由于代谢产物活性检测法中去除活体细菌、获得初提或精提产物的操作步骤相对较为复杂、烦琐一些，故通常采用此方法不多。目前以平板对峙培养法筛选为主，有同步与异步两种对峙培养方法。同步对峙培养时可采用在培养基中混病原细菌倒平板再点接接种待筛选细菌，也可采用夹心平板；异步对峙培养时通常先培养待筛选细菌至产生抗生素后，再接种病原细菌，一般可采用夹心平板，也可采用翻转平板，还可清除待筛选细菌、再涂布病原细菌。同步对峙培养适合于待筛选产生抗生素比病原细菌生长更快的拮抗细菌；而产生抗生素与比病原细菌生长同步或滞后的待筛选细菌，则适宜采用异步对峙培养，且往往适合于产生抗生素比病原细菌生长更快的待筛选拮抗细菌。因此，采用异步对峙培养较多。但是这些异步对峙培养方法筛选效率较低，有待提高。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种改进的筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法。该方法能提高筛选效率，丰富异步对峙培养的方法，加快植物细菌病害的生物防治。

[0006] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

[0007] *除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

[0008] 本发明提供了一种筛选烟草野火病菌拮抗细菌的方法，所述的方法采用以下步骤：

[0009] (1)待测细菌、烟草野火病菌的培养

[0010] 待测细菌、烟草野火病菌分别置于NA或KB平板上培养，其中待测细菌采用4～6点点接，烟草野火病菌采用划线接种，28±1℃培养2～3天；

[0011] (2)烟草野火病菌悬浮液的制备

[0012] 取0.1％的吐温80灭菌水溶液10～15ml加入到培养好的烟草野火病菌平板上，4～5
刮下菌苔，转移至灭菌三角瓶中，用0.1％的吐温80灭菌水溶液调节细菌浓度为10 cfu/ml，即可得烟草野火病菌悬浮液；

[0013] (3)烟草野火病菌悬浮液的喷雾弥散

[0014] 将制备的烟草野火病菌悬浮液转移至消毒、灭菌的小型喷雾装置内，在已经灭菌的超净工作台上打开培养好的待测细菌平板，于通风状态下，向平板上方喷雾烟草野火病菌悬浮液，借助风力病菌就均匀弥散到平板上，继续通风10～15分钟，风干平板表面水份；

[0015] (4)对峙培养

[0016] 盖好皿盖，收取平板，28±1℃继续培养2～3天，观察有无抑菌圈，有抑菌圈的为筛选获得的目标细菌。

[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：

[0018] 1.可显著提高筛选效率。采用改进的异步对峙培养方法，待测细菌4～6点点接，培养2～3天，再喷雾弥散烟草野火病菌悬浮液。这种对峙培养接种病原细菌采用喷雾弥散的方法，可以批量进行，在100个以上的待测细菌以上时能提高20％～30％的效率；

[0019] 2.本发明除适用于烟草野火病菌拮抗细菌筛选外，也可适用于其它细菌病原拮抗细菌的筛选，适应范围广。

附图说明

[0020] 图1显示待测细菌有抑菌圈；

[0021] 图2显示待测细菌无抑菌圈。

具体实施方式

[0022] 通过下面给出的具体实施例和应用实施例，可以进一步清楚地了解本发明。但它们不是对本发明保护范围的限定。

[0023] 实施例

[0024] (1)待测细菌、烟草野火病菌的培养

[0025] 待测细菌菌株040239、050117共2株菌株，烟草野火病菌pst05菌株，均分离自烟草病叶。2株待测细菌菌株5点点接于NA或KB平板上(本例中同皿5点为同一菌株，具体实施上可用5株不同的菌株)，烟草野火病菌pst05采用划线接种，28±1℃培养2～3天；

[0026] (2)烟草野火病菌悬浮液的制备

[0027] 取0.1％的吐温80灭菌水溶液10～15ml加入到培养好的烟草野火病菌平板上，4～5
刮下菌苔，转移至灭菌三角瓶中，用0.1％的吐温80灭菌水溶液调节细菌浓度为10 cfu/ml，即可得烟草野火病菌悬浮液；

[0028] (3)烟草野火病菌悬浮液的喷雾弥散

[0029] 将制备的烟草野火病菌悬浮液转移至消毒、灭菌的小型喷雾装置内，在已经灭菌的超净工作台上打开培养好的待测细菌平板，于通风状态下，向平板上方喷雾烟草野火病菌悬浮液，借助风力病菌就均匀弥散到平板上，继续通风10～15分钟，风干平板表面水份；

[0030] (4)对峙培养

[0031] 盖好皿盖，收取平板，28±1℃继续培养2～3天，观察有无抑菌圈，有抑菌圈的为筛选获得的目标细菌。菌株040239有抑菌圈(图1)，菌株050117无抑菌圈(图2)。因此，菌株040239为筛选获得的目标细菌菌株。

[0032] 应用实施例1

[0033] ——拮抗烟草野火病菌的叶围细菌筛选

[0034] 1.材料与方法

[0035] 1.1烟草叶片样品的采集

[0036] 样品具体地点以采样县(市)最大面积成片的2个密集种植区为采样点，采样点有零星野火病发生，以整片地为样本，按五点取样法采样，选取10株，每株取叶片1片，每株叶位不得相同，合并10片叶作为1个样本，常温保存，保存期不得超过7天。

[0037] 1.2鲜烟叶样等样品细菌的分离

[0038] 每叶按5点取样法剪取1cm2大小叶组织5～10块，称1g置于100ml 0.85％吐温80灭菌水的500ml三角瓶内(加有沙粒)150r/min振荡30min，稀释10、100倍，涂布，28±1℃恒温培养，挑取单菌落，划线纯化，编号标识、保存。

[0039] 1.3拮抗细菌的筛选

[0040] 采用本发明筛选方法进行。

[0041] 2.结果与分析

[0042] 采集烟叶样品27份，分离细菌1451株，筛选得到拮抗野火病菌的菌株42株，占总测定菌株的2.89％；抑菌圈直径大于0.5mm仅有6株，占0.41％。

[0043] 应用实施例2

[0044] ——拮抗烟草野火病菌的根际细菌筛选

[0045] 1.材料与方法

[0046] 1.1烟草根际土样样品的采集

[0047] 样品具体地点以采样县(市)最大面积成片的2个密集种植区为采样点，采样点有零星野火病发生，以整片地为样本，按五点取样法采样。采集根际土样时，5点每点2株共10株的根围带土挖取侧须根数条，并轻轻抖动去浮土，仅留下与根紧密结合的土粒，即为根际土，合并10株带有侧须根的根际土样作为1个样本。保鲜袋封存置于4℃冷藏箱中，保存的样品最多7天。

[0048] 1.2根际土样细菌的分离

[0049] 将根际土样截成1cm长的小段，称1g置于100ml 0.85％吐温80灭菌水的500ml三角瓶内(加有10粒玻璃株)150r/min振荡30min，稀释100、1000、10000倍，分别吸取0.2ml稀释液涂布于NA平板，选取菌落清晰、菌落数在30～100个的平板，小心挑取所有的单菌落，划线纯化，保存于NA斜面，编号标识、保存。

[0050] 1.3拮抗细菌的筛选

[0051] 采用本发明筛选方法进行。

[0052] 2.结果与分析

[0053] 从烟草根际采集土样27份，分离细菌1393株，初步筛选得到拮抗野火病菌的菌株33株，拮抗筛选率占2.37％；抑菌圈直径大于0.5mm仅有8株，占0.57％。